ISO 15788-1:1999

Animal and vegetable fats and oils — Determination of stigmastadienes in vegetable oils — Part 1: Method using capillary-column gas chromatography (Reference method)

Corps gras d'origines animale et végétale — Dosage des stigmastadiènes dans les huiles végétales — Partie 1: Méthode par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire (Méthode de référence)

La présente partie de l'ISO 15788 spécifie une méthode de dosage des stigmastadiènes dans les huiles végétales vierges contenant de faibles concentrations de ces hydrocarbures, et notamment dans l'huile d'olive vierge. Cette méthode est applicable à toutes les huiles végétales bien que les mesurages ne soient fiables que lorsque la teneur en hydrocarbures se situe entre 0,01 mg/kg et 4,0 mg/kg. Elle permet de détecter la présence d'huiles végétales raffinées (d'olive, de grignon d'olive, de tournesol, de palme, etc.) dans les huiles d'olive vierges, dans la mesure où les huiles raffinées renferment des stigmastadiènes, alors que les huiles vierges obtenues par pression à froid n'en renferment pas.

Rastlinske in živalske maščobe in olja - Določevanje stigmastadienov v rastlinskih oljih - 1. del: Metoda uporabe kapilarno-kolonske plinske kromatografije (Referenčna metoda)

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 27-Oct-1999
• ICS: 67.200.10 - Animal and vegetable fats and oils
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 16-Jun-2020
• Ref Project: SIST ISO 15788-1:2001 - Animal and vegetable fats and oils -- Determination of stigmastadienes in vegetable oils -- Part 1: Method using capillary-column gas chromatography (Reference method)

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15788-1
First edition
1999-10-15
Animal and vegetable fats and oils —
Determination of stigmastadienes in
vegetable oils —
Part 1:
Method using capillary-column gas
chromatography (Reference method)
Corps gras d'origines animale et végétale — Dosage des stigmastadiènes
dans les huiles végétales —
Partie 1: Méthode par chromatographie en phase gazeuse sur colonne
capillaire (Méthode de référence)
A
Reference number
ISO 15788-1:1999(E)

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© ISO
ISO 15788-1:1999(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard ISO 15788-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Agricultural food products,
Subcommittee SC 11, Animal and vegetable fats and oils.
ISO 15788 consists of the following parts, under the general title Animal and vegetable fats and oils —
Determination of stigmastadienes in vegetable oils:
 Part 1: Method using capillary-column gas chromatography
 Part 2: Method using high-performance liquid chromatography
Annex A of this part of ISO 15788 is for information only.
©  ISO 1999
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means, electronic
or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Switzerland
Internet [e-mail]
Printed in Switzerland
ii

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© ISO
ISO 15788-1:1999(E)
Introduction
Significant amounts of hydrocarbons are formed in vegetable oils as a consequence of thermal treatments during
the refining processes [1]. Among these hydrocarbons, 3,5-stigmastadiene, a steroidal compound, is the most
abundant in all refined vegetable oils since it is derived from b-sitosterol by dehydration [2]. The 3,5-stigmastadiene
is produced together with minor amounts of the 2,4-isomer and both substances give a single well-defined gas-
chromatographic peak when the hydrocarbon fraction is analysed on a low polar column [3]. Therefore, the sum of
both isomers can be easily quantified by gas-chomatographic analysis of the steroidal hydrocarbon fraction [2], [4].
For instance, for virgin olive oils, the usual oil production processes (pressure or centrifuging) do not produce
measurable amounts of stigmastadienes (less than 0,01 mg/kg). In crude olive residue oil, small concentrations of
stigmastadienes are found (ranging between 0,2 mg/kg and 3 mg/kg) due to the high temperatures applied during
the drying of the raw olive residue.
In the refining processes, stigmastadienes are formed in all the steps involving high temperatures, such as
bleaching and deodorizing, but more amounts are formed in the first step using acid bleaching earth than in the
second [2]. Depending on the conditions applied during the refining process, commercial refined vegetable oils
show stigmastadiene concentrations ranging between 1 mg/kg and 120 mg/kg and, therefore, the assessment of
stigmastadienes allows not only the identification of thermally treated oils but also the detection of minor amounts of
refined vegetable oils in virgin oils.
A method for the determination of stigmastadienes and the results of a collaborative study carried out under the
auspices of the International Olive Oil Council were presented to the International Union of Pure and Applied
Chemistry (IUPAC) Commission on Oils, Fats and Derivatives. The stigmastadiene content has been adopted as an
identity criterion for virgin olive oils and the resulting analytical method has been adopted as an international
standard method.
iii

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INTERNATIONAL STANDARD  © ISO ISO 15788-1:1999(E)
Animal and vegetable fats and oils — Determination of
stigmastadienes in vegetable oils —
Part 1:
Method using capillary-column gas chromatography (Reference
method)
1 Scope
This part of ISO 15788 specifies a method for the determination of stigmastadienes in virgin vegetable oils
containing low concentrations of these hydrocarbons, particularly in virgin olive oil.
This method is applicable to all vegetable oils although measurements are reliable only where the content of these
hydrocarbons lies between 0,01 mg/kg and 4,0 mg/kg. The method is suited to detecting the presence of refined
vegetable oils (olive, olive pomace, sunflower, palm, etc.) in virgin olive oils, since refined oils contain stigmasta-
dienes and cold-extracted oils do not.
2 Principle
Unsaponifiable matter is isolated. The steroidal hydrocarbon fraction is separated by column chromatography on
silica gel and analysed by capillary gas chromatography.
3 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled or demineralized water or
water of equivalent purity.
3.1  Hexane, or mixture of alkanes of boiling point from 65 °C to 70 °C, distilled with a rectifying column.
The hexane shall be redistilled to remove impurities.
3.2  Ethanol, 96 % (volume fraction).
3.3  Anhydrous sodium sulfate.
3.4  Alcoholic potassium hydroxide solution, of concentration 50 g per 500 ml.
Add 10 ml of water to 50 g potassium hydroxide, stir, and then dilute the mixture with ethanol to 500 ml.
Alcoholic potassium hydroxide solution turns brown on standing. It should be prepared freshly each day and kept in
well-stoppered dark glass bottles.
1

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1)
, for column chromatography, 70 to 230 mesh.
3.5 Silica gel 60
Usually, silica gel can be used directly from the container without any treatment. However, some batches of silica
may show low activity resulting in poor chromatographic separations. Under these circumstances, the silica gel
should be treated in the following way.
Activate the silica gel by heating for at least 4 h at 550 °C. After heating, place the silica gel in a desiccator while the
gel is cooling and then transfer the silica gel to a stoppered flask. Add 2 % of water and shake until no lumps can be
seen and the powder flows freely.
If batches of silica gel result in chromatograms with interfering peaks, the silica gel should be treated as above. An
1)
alternative would be the use of extra pure silica gel 60 .
2)
3.6  3,5-Cholestadiene , 99 % purity (mass fraction), stock solution in hexane, of concentration 10 mg per 50 ml.
3.7  3,5-Cholestadiene, standard solution in hexane, of concentration of 1 mg per 50 ml, obtained by dilution of the
stock solution (3.6).
NOTE If kept at a temperature of below 4 °C, solutions (3.6) and (3.7) will not deteriorate over a period of at least
4 months.
3.8  n-Nonacosane, solution in hexane, of concentration approximately 10 mg per 100 ml.
3)
(24-ethylcholesta-3,5-diene), solution in hexane, of concentration approximately 10 mg
3.9 3,5-Stigmastadiene
per 100 ml.
3.10  Carrier gas, for chromatography: helium or hydrogen of 99,9990 % purity (mass fraction).
3.11  Auxiliary gases, for flame ionization detector: hydrogen of 99,9990 % purity (mass fraction), and purified air.
4 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
4.1  Flasks, of 250 ml capacity, suitable for use with a reflux condenser.
4.2  Separating funnel, of 500 ml capacity.
4.3  Round-bottomed flasks, of 100 ml capacity.
4.4  Rotary evaporator.
4.5  Glass chromatography column of 1,5 cm i.d. and 50 cm length, with Teflon tap and a plug of glass wool fibre
or sintered glass disc at the bottom.
To prepare a silica gel column, pour hexane into the chromatography column to a depth of approximately 5 cm and
then fill with a slurry of silica gel in hexane (15 g in 40 ml) with the help of hexane portions. Allow to settle and finish
the settling by applying slight vibration. Add anhydrous sodium sulfate (3.3) to a height of approximately 0,5 cm.
Finally elute the excess hexane.

1)
Product supplied by Merck, ref. 7734 or similar and ref. 7754 (for extra pure silica gel 60).
2)
Product supplied by Sigma.
3)
Product supplied by Chiron A.S., Heimdal, Norway.
1) 2) 3)
, and This information is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an
endorsement by ISO of these products. Equivalent products may be used if they can be shown to lead the same results.
2

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ISO 15788-1:1999(E)
, with a flame ionization detector, split or on-column injector, and oven programmable to
4.6 Gas chromatograph
within ± 1 °C.
4.7  Fused silica capillary columns, for gas chromatography (0,25 mm or 0,32 mm i.d. by 25 m length) coated
with 5 % phenylmethylsilicone phase, 0,25 mm film thickness.
NOTE Other columns of similar or lower polarity can be used.
4.8  Integrator-recorder, with possibility of valley-valley integration mode.
4.9  Microsyringe, of 5 ml to10 ml capacity, for gas chromatography, with cemented needle.
4.10  Electrical heating mantle, or hot plate.
5 Procedure
5.1 Preparation of unsaponifiable matter
5.1.1  Weigh 20 g ± 0,1 g of oil into a 250 ml flask (4.1). Add 1 ml of the internal standard solution of 3,5-
cholestadiene (containing 20 mg) and 75 ml of alcoholic potassium hydroxide (3.4). Fit a reflux condenser and heat
the solution to slight boiling for 30 min. Remove the flask containing the sample from the heat and allow the solution
to cool slightly (do not allow it to cool completely or the sample will set). Add 100 ml of water and transfer the
solution to a separating funnel (4.2) with the aid of 100 ml of hexane. Shake the mixture vigorously for 30 s and
allow it to separate.
If an emulsion is produced which does not rapidly separate, add small quantities of ethanol.
5.1.2  Transfer the lower aqueous phase to a second separating funnel and extract a
...

SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 15788-1:2001
01-februar-2001
5DVWOLQVNHLQåLYDOVNHPDãþREHLQROMD'RORþHYDQMHVWLJPDVWDGLHQRYYUDVWOLQVNLK
ROMLKGHO0HWRGDXSRUDEHNDSLODUQRNRORQVNHSOLQVNHNURPDWRJUDILMH
5HIHUHQþQDPHWRGD
Animal and vegetable fats and oils -- Determination of stigmastadienes in vegetable oils -
- Part 1: Method using capillary-column gas chromatography (Reference method)
Corps gras d'origines animale et végétale -- Dosage des stigmastadiènes dans les huiles
végétales -- Partie 1: Méthode par chromatographie en phase gazeuse sur colonne
capillaire (Méthode de référence)
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 15788-1:1999
ICS:
67.200.10 5DVWOLQVNHLQåLYDOVNH Animal and vegetable fats
PDãþREHLQROMD and oils
SIST ISO 15788-1:2001 en
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.

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SIST ISO 15788-1:2001

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SIST ISO 15788-1:2001
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15788-1
First edition
1999-10-15
Animal and vegetable fats and oils —
Determination of stigmastadienes in
vegetable oils —
Part 1:
Method using capillary-column gas
chromatography (Reference method)
Corps gras d'origines animale et végétale — Dosage des stigmastadiènes
dans les huiles végétales —
Partie 1: Méthode par chromatographie en phase gazeuse sur colonne
capillaire (Méthode de référence)
A
Reference number
ISO 15788-1:1999(E)

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ISO 15788-1:1999(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard ISO 15788-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Agricultural food products,
Subcommittee SC 11, Animal and vegetable fats and oils.
ISO 15788 consists of the following parts, under the general title Animal and vegetable fats and oils —
Determination of stigmastadienes in vegetable oils:
 Part 1: Method using capillary-column gas chromatography
 Part 2: Method using high-performance liquid chromatography
Annex A of this part of ISO 15788 is for information only.
©  ISO 1999
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means, electronic
or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from the publisher.
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Printed in Switzerland
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© ISO
ISO 15788-1:1999(E)
Introduction
Significant amounts of hydrocarbons are formed in vegetable oils as a consequence of thermal treatments during
the refining processes [1]. Among these hydrocarbons, 3,5-stigmastadiene, a steroidal compound, is the most
abundant in all refined vegetable oils since it is derived from b-sitosterol by dehydration [2]. The 3,5-stigmastadiene
is produced together with minor amounts of the 2,4-isomer and both substances give a single well-defined gas-
chromatographic peak when the hydrocarbon fraction is analysed on a low polar column [3]. Therefore, the sum of
both isomers can be easily quantified by gas-chomatographic analysis of the steroidal hydrocarbon fraction [2], [4].
For instance, for virgin olive oils, the usual oil production processes (pressure or centrifuging) do not produce
measurable amounts of stigmastadienes (less than 0,01 mg/kg). In crude olive residue oil, small concentrations of
stigmastadienes are found (ranging between 0,2 mg/kg and 3 mg/kg) due to the high temperatures applied during
the drying of the raw olive residue.
In the refining processes, stigmastadienes are formed in all the steps involving high temperatures, such as
bleaching and deodorizing, but more amounts are formed in the first step using acid bleaching earth than in the
second [2]. Depending on the conditions applied during the refining process, commercial refined vegetable oils
show stigmastadiene concentrations ranging between 1 mg/kg and 120 mg/kg and, therefore, the assessment of
stigmastadienes allows not only the identification of thermally treated oils but also the detection of minor amounts of
refined vegetable oils in virgin oils.
A method for the determination of stigmastadienes and the results of a collaborative study carried out under the
auspices of the International Olive Oil Council were presented to the International Union of Pure and Applied
Chemistry (IUPAC) Commission on Oils, Fats and Derivatives. The stigmastadiene content has been adopted as an
identity criterion for virgin olive oils and the resulting analytical method has been adopted as an international
standard method.
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INTERNATIONAL STANDARD  © ISO ISO 15788-1:1999(E)
Animal and vegetable fats and oils — Determination of
stigmastadienes in vegetable oils —
Part 1:
Method using capillary-column gas chromatography (Reference
method)
1 Scope
This part of ISO 15788 specifies a method for the determination of stigmastadienes in virgin vegetable oils
containing low concentrations of these hydrocarbons, particularly in virgin olive oil.
This method is applicable to all vegetable oils although measurements are reliable only where the content of these
hydrocarbons lies between 0,01 mg/kg and 4,0 mg/kg. The method is suited to detecting the presence of refined
vegetable oils (olive, olive pomace, sunflower, palm, etc.) in virgin olive oils, since refined oils contain stigmasta-
dienes and cold-extracted oils do not.
2 Principle
Unsaponifiable matter is isolated. The steroidal hydrocarbon fraction is separated by column chromatography on
silica gel and analysed by capillary gas chromatography.
3 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled or demineralized water or
water of equivalent purity.
3.1  Hexane, or mixture of alkanes of boiling point from 65 °C to 70 °C, distilled with a rectifying column.
The hexane shall be redistilled to remove impurities.
3.2  Ethanol, 96 % (volume fraction).
3.3  Anhydrous sodium sulfate.
3.4  Alcoholic potassium hydroxide solution, of concentration 50 g per 500 ml.
Add 10 ml of water to 50 g potassium hydroxide, stir, and then dilute the mixture with ethanol to 500 ml.
Alcoholic potassium hydroxide solution turns brown on standing. It should be prepared freshly each day and kept in
well-stoppered dark glass bottles.
1

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© ISO
ISO 15788-1:1999(E)
1)
, for column chromatography, 70 to 230 mesh.
3.5 Silica gel 60
Usually, silica gel can be used directly from the container without any treatment. However, some batches of silica
may show low activity resulting in poor chromatographic separations. Under these circumstances, the silica gel
should be treated in the following way.
Activate the silica gel by heating for at least 4 h at 550 °C. After heating, place the silica gel in a desiccator while the
gel is cooling and then transfer the silica gel to a stoppered flask. Add 2 % of water and shake until no lumps can be
seen and the powder flows freely.
If batches of silica gel result in chromatograms with interfering peaks, the silica gel should be treated as above. An
1)
alternative would be the use of extra pure silica gel 60 .
2)
3.6  3,5-Cholestadiene , 99 % purity (mass fraction), stock solution in hexane, of concentration 10 mg per 50 ml.
3.7  3,5-Cholestadiene, standard solution in hexane, of concentration of 1 mg per 50 ml, obtained by dilution of the
stock solution (3.6).
NOTE If kept at a temperature of below 4 °C, solutions (3.6) and (3.7) will not deteriorate over a period of at least
4 months.
3.8  n-Nonacosane, solution in hexane, of concentration approximately 10 mg per 100 ml.
3)
(24-ethylcholesta-3,5-diene), solution in hexane, of concentration approximately 10 mg
3.9 3,5-Stigmastadiene
per 100 ml.
3.10  Carrier gas, for chromatography: helium or hydrogen of 99,9990 % purity (mass fraction).
3.11  Auxiliary gases, for flame ionization detector: hydrogen of 99,9990 % purity (mass fraction), and purified air.
4 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
4.1  Flasks, of 250 ml capacity, suitable for use with a reflux condenser.
4.2  Separating funnel, of 500 ml capacity.
4.3  Round-bottomed flasks, of 100 ml capacity.
4.4  Rotary evaporator.
4.5  Glass chromatography column of 1,5 cm i.d. and 50 cm length, with Teflon tap and a plug of glass wool fibre
or sintered glass disc at the bottom.
To prepare a silica gel column, pour hexane into the chromatography column to a depth of approximately 5 cm and
then fill with a slurry of silica gel in hexane (15 g in 40 ml) with the help of hexane portions. Allow to settle and finish
the settling by applying slight vibration. Add anhydrous sodium sulfate (3.3) to a height of approximately 0,5 cm.
Finally elute the excess hexane.

1)
Product supplied by Merck, ref. 7734 or similar and ref. 7754 (for extra pure silica gel 60).
2)
Product supplied by Sigma.
3)
Product supplied by Chiron A.S., Heimdal, Norway.
1) 2) 3)
, and This information is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an
endorsement by ISO of these products. Equivalent products may be used if they can be shown to lead the same results.
2

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SIST ISO 15788-1:2001
© ISO
ISO 15788-1:1999(E)
, with a flame ionization detector, split or on-column injector, and oven programmable to
4.6 Gas chromatograph
within ± 1 °C.
4.7  Fused silica capillary columns, for gas chromatography (0,25 mm or 0,32 mm i.d. by 25 m length) coated
with 5 % phenylmethylsilicone phase, 0,25 mm film thickness.
NOTE Other columns of similar or lower polarity can be used.
4.8  Integrator-recorder, with possibility of valley-valley integration mode.
4.9  Microsyringe, of 5 ml to10 ml capacity, for gas chromatography, with cemented needle.
4.10  Electrical heating mantle, or hot plate.
5 Procedure
5.1 Preparation of unsaponifiable matter
5.1.1  Weigh 20 g ± 0,1 g of oil into a 250 ml flask (4.1). Add 1 ml of the internal standard solution of 3,5-
cholestadiene (containing 20 mg) and 75 ml of alco
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 15788-1
Première édition
1999-10-15
Corps gras d'origines animale et
végétale — Dosage des stigmastadiènes
dans les huiles végétales —
Partie 1:
Méthode par chromatographie en phase
gazeuse sur colonne capillaire (Méthode de
référence)
Animal and vegetable fats and oils — Determination of stigmastadienes in
vegetable oils —
Part 1: Method using capillary-column gas chromatography (Reference
method)
A
Numéro de référence
ISO 15788-1:1999(F)

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ISO 15788-1:1999(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 15788-1 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits agricoles
alimentaires, sous-comité SC 11, Corps gras d’origines animale et végétale.
L’ISO 15788 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Corps gras d’origines animale et
végétale — Dosage des stigmastadiènes dans les huiles végétales:
 Partie 1: Méthode par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire
 Partie 2: Méthode par chromatographie liquide à haute performance
L'annexe A de la présente partie de l'ISO 15788 est donnée uniquement à titre d’information.
©  ISO 1999
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
Internet [e-mail]
Imprimé en Suisse
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© ISO
ISO 15788-1:1999(F)
Introduction
Les traitements thermiques qu'impliquent les processus de raffinage entraînent la formation de quantités
significatives d'hydrocarbures dans les huiles végétales [1]. Le plus abondant des hydrocarbures trouvés dans
toutes les huiles végétales raffinées est le 3,5-stigmastadiène, stérène dérivé du b-sitostérol par déshydratation [2].
Le 3,5-stigmastadiène est formé en même temps que de petites quantités de 2,4-isomère, les deux substances
pouvant se confondre sous un même pic, bien défini sur le chromatogramme obtenu lors de l'analyse de la fraction
hydrocarbonée sur une colonne à faible polarité [3]. Il est donc possible de quantifier la somme des deux isomères
par analyse chromatographique en phase gazeuse de la fraction hydrocarbonée stéroïdale [2] [4].
Alors que pour l'huile d'olive vierge par exemple, les processus habituels de production (sous pression ou par
centrifugation) ne donnent pas de quantités mesurables de stigmastadiènes (moins de 0,01 mg/kg), dans les
résidus d'huile d'olive brute, on en trouve en petites concentrations (entre 0,2 mg/kg et 3 mg/kg), par suite du
chauffage à haute température subi par ces résidus pendant le séchage.
Les stigmastadiènes se forment pendant le processus de raffinage, à tous les stades impliquant une forte montée
en température, tels que la décoloration ou la désodorisation; le premier stade, dû à l'emploi de terre à blanchir
acide, en génère toutefois davantage que le second [2]. Selon les conditions rencontrées pendant le processus de
raffinage, les concentrations en stigmastadiènes des huiles végétales raffinées disponible dans le commerce seront
comprises entre 1 mg/kg et 120 mg/kg. L'évaluation des stigmastadiènes permet donc non seulement d'identifier les
huiles qui ont subi un traitement thermique, mais également de détecter de petites quantités d'huiles végétales
raffinées dans les huiles vierges.
Une méthode de dosage des stigmastadiènes ainsi que les résultats d'une étude interlaboratoires effectuée sous
les auspices du Conseil international de l'huile d'olive ont été présentés à la Commission huiles, corps gras et
dérivés de l'Union internationale de chimie pure et appliquée (UICPA). La teneur en stigmastadiènes a été adoptée
comme critère d'identification des huiles d'olive vierges et la méthode d'analyse pertinente a été adoptée comme
méthode normalisée internationale.
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NORME INTERNATIONALE  © ISO ISO 15788-1:1999(F)
Corps gras d'origines animale et végétale — Dosage des
stigmastadiènes dans les huiles végétales —
Partie 1:
Méthode par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire
(Méthode de référence)
1 Domaine d’application
La présente partie de l'ISO 15788 spécifie une méthode de dosage des stigmastadiènes dans les huiles végétales
vierges contenant de faibles concentrations de ces hydrocarbures, et notamment dans l'huile d'olive vierge.
Cette méthode est applicable à toutes les huiles végétales bien que les mesurages ne soient fiables que lorsque la
teneur en hydrocarbures se situe entre 0,01 mg/kg et 4,0 mg/kg. Elle permet de détecter la présence d'huiles
végétales raffinées (d'olive, de grignon d'olive, de tournesol, de palme, etc.) dans les huiles d'olive vierges, dans la
mesure où les huiles raffinées renferment des stigmastadiènes, alors que les huiles vierges obtenues par pression
à froid n'en renferment pas.
2 Principe
Isolation de l'insaponifiable. Séparation de la fraction hydrocarbonée stéroïdale par chromatographie sur colonne
remplie de gel de silice et analyse de celle-ci par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire.
3 Réactifs
N'utiliser que des réactifs de qualité analytique reconnue et, sauf indication contraire, de l'eau distillée ou
déminéralisée ou de l'eau de pureté équivalente.
3.1  Hexane, ou mélange d'alcanes dont le point d'ébullition est compris entre 65 °C et 70 °C, distillé sur colonne
rectificatrice.
L'hexane doit être redistillé pour éliminer les impuretés.
3.2  Éthanol, 96 % (fraction volumique).
3.3  Sulfate de sodium anhydre.
3.4  Hydroxyde de potassium alcoolique, concentration 50 g par 500 ml.
Ajouter 10 ml d'eau à 50 g d'hydroxyde de potassium, agiter, puis diluer le mélange à 500 ml avec de l'éthanol.
La solution d'hydroxyde de potassium alcoolique vire au brun lorsqu'on la laisse reposer. Il convient de la préparer
extemporanément chaque jour et de la conserver dans des flacons en verre sombre bien bouchés.
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1)
3.5  Gel de silice 60 , pour chromatographie sur colonne, 70 à 230 mesh.
En général il est possible d'utiliser le gel de silice directement au sortir de son conditionnement sans aucun
traitement. Certains lots de silice peuvent toutefois présenter une faible activité entraînant une mauvaise séparation
chromatographique. Dans ce cas il est recommandé de traiter le gel de silice de la manière suivante.
Activer le gel de silice en le chauffant à 550 °C pendant au moins 4 h. Après chauffage, placer le gel de silice dans
un dessiccateur pendant qu'il refroidit, puis le transférer dans un flacon bouché. Ajouter 2 % d'eau et agiter jusqu'à
disparition des grumeaux et écoulement libre de la poudre.
Si les chromatogrammes obtenus avec les lots de gel de silice donnent des pics qui interfèrent les uns avec les
autres, il convient de traiter le gel de la manière indiquée ci-dessus. Il est possible également d'utiliser du gel de
1)
silice extra pur 60 .
2)
3.6  3,5-Cholestadiène , de pureté 99 % (fraction massique), solution mère dans de l'hexane, concentration
10 mg par 50 ml.
3.7  3,5-Cholestadiène, solution étalon dans de l'hexane, concentration 1 mg par 50 ml, obtenue par dilution de la
solution mère (3.6).
NOTE Lorsqu'elles sont maintenues à une température inférieure à 4 °C, les solutions (3.6) et (3.7) ne se détériorent pas
avant un délai de 4 mois au moins.
3.8  n-Nonacosane, solution dans de l'hexane, concentration d'environ 10 mg par 100 ml.
3)
3.9  3,5-Stigmastadiène (24-éthyl-cholesta-3,5-diène), solution dans de l'hexane, concentration d'environ 10 mg
par 100 ml.
3.10  Gaz vecteur, pour la chromatographie: hélium ou hydrogène de pureté 99,9990 % (fraction massique).
3.11  Gaz auxiliaires, pour détecteur à ionisation de flamme: hydrogène de pureté 99,9990 % (fraction massique)
et air purifié.
4 Appareillage
Appareillage courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
4.1  Ballon, de 250 ml de capacité, utilisable avec un réfrigérant à reflux.
4.2  Ampoules à décanter, de 500 ml de capacité.
4.3  Ballons à fond rond, de 100 ml de capacité.
4.4  Évaporateur rotatif.

1)
Produit fourni par Merck, réf. 7734 ou similaire et réf. 7754 (pour le gel de silice extra pur 60). Cette information est donnée à
l'intention des utilisateurs de la présente partie de l'ISO 15788 et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande
l'emploi exclusif des produits ainsi désignés. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent
aux mêmes résultats.
2)
Produit fourni par Sigma. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente partie de l'ISO 15788 et ne
signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents
peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent aux mêmes résultats.
3)
Produit fourni par Chiron A.S., Heimdal, Norvège. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente
partie de l'ISO 15788 et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent aux mêmes résultats.
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ISO 15788-1:1999(F)
4.5  Colonne en verre pour chromatographie, de 1,5 cm de diamètre intérieur sur 50 cm de longueur, avec
robinet en téflon et tampon en fibres de laine de verre ou bien disque en verre fritté faisant office de fond.
Pour préparer la colonne remplie de gel de silice, y verser de l'hexane sur une hauteur de 5 cm environ, puis la
remplir par petites portions d'un mélange de gel de silice dans de l'hexane (15 g pour 40 ml). Laisser reposer et
terminer la préparation en agitant légèrement. Ajouter du sulfate de sodium anhydre (3.3) sur une hauteur d'environ
0,5 cm et éluer finalement avec de l'hexane en excès.
4.6  Chromatographe, pour chromatographie en phase gazeuse, équipé d'un détecteur à ionisation de flamme,
d'un injecteur diviseur ou «on column» et d'un four programmable à ± 1 °C près.
4.7  Colonnes capillaires en silice fondue, pour chromatographie en phase gazeuse, de 0,25 mm ou 0,32 mm
de diamètre intérieur sur 25 m de longueur, revêtues d'une phase de phénylméthylsilicone à 5 % d'une épaisseur
de film de 0,25 μm.
NOTE D'autres colonnes de polarité similaire ou inférieure peuvent également être utilisées.
4.8  Enregistreur-intégrateur, avec possibilité de mode d'intégration vallée à vallée.
4.9  Microseringue, à aiguille fixe, de 5 μl à 10 μl de capacité, pour chromatographie en phase gazeuse.
4.10  Manchon électrique chauffant, ou plaque chauffante.
5 Mode opératoire
5.1 Préparation de l'insaponifiable
5.1.1  Peser 20 g ± 0,1 g d'huile dans un ballon de 250 ml (4.1). Ajouter 1 ml de solution étalon interne de
3,5-cholestadiène (3.7) (contenant 20 μg) et 75 ml d'hydroxyde de potassium alcoolique (3.4). Monter un réfrigérant
à reflux et chauffer jusqu'à légère ébullition pendant 30 min. Enlever le ballon contenant l'échantillon de la source de
chaleur et laisser la solution refroidir lentement (ne pas laisser refroidir complètement sous peine de prise de
l'échantillon). Ajouter 100 ml d'eau et transvaser la solution dans une ampoule à décanter
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