ISO 18744:2016
(Main)Microbiology of the food chain — Detection and enumeration of Cryptosporidium and Giardia in fresh leafy green vegetables and berry fruits
Microbiology of the food chain — Detection and enumeration of Cryptosporidium and Giardia in fresh leafy green vegetables and berry fruits
ISO 18744:2016 specifies a method that is applicable for the detection and enumeration of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts on or in food products that are described herein as fresh leafy green vegetables and berry fruits. With suitable controls, it may also be applicable for the examination of other fresh produce. The microscopy descriptions are for Cryptosporidium spp. oocysts and Giardia duodenalis cysts of size ranges which include those species (Cryptosporidium) or assemblages (Giardia) known to be pathogenic to humans. This method does not include any molecular analysis and therefore is not suitable for the determination of the species or genotypes/assemblages of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts. The method will detect all species and genotypes/assemblages that are known to be pathogenic for humans and also others that are not. For further identification, molecular typing assays are required. However, these cannot be reliably performed if process positive controls have been spiked into the samples, as the result of molecular typing assays will be obfuscated. This method does not allow the determination of viability or infectivity of any Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts which may be present.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Recherche et dénombrement de Cryptosporidium et Giardia dans les légumes verts frais à feuilles et les fruits à baies
ISO 18744:2016 spécifie une méthode applicable à la détection et au dénombrement des oocystes de Cryptosporidium et aux kystes de Giardia sur ou dans des produits alimentaires qui sont décrits ici comme étant des légumes verts frais à feuilles et des fruits à baies. Grâce à des contrôles appropriés, elle peut être également applicable à l'examen d'autres produits frais. Les descriptions faites au microscope concernent les oocystes de Cryptosporidium spp. et les kystes de Giardia duodenalis dont la taille inclut les espèces (Cryptosporidium) ou assemblages (Giardia) connus pour être pathogènes pour l'homme. Cette méthode n'inclut pas l'analyse moléculaire et n'est donc pas applicable à la détermination des espèces ou des génotypes/assemblages d'oocystes de Cryptosporidium et de kystes de Giardia. La méthode permettra de détecter toutes les espèces et tous les génotypes/assemblages connus pour être pathogènes pour l'homme ainsi que d'autres qui ne le sont pas. Pour mieux les identifier, des essais de typage moléculaire sont requis. Toutefois, ceux-ci ne peuvent pas être effectués de manière fiable si des contrôles de processus positifs ont été ajoutés aux échantillons, car le résultat des essais de typage moléculaire sera erroné. Cette méthode ne permet pas de déterminer la viabilité ou l'infectivité des oocystes de Cryptosporidium et des kystes de Giardia qui peuvent être présents.
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DRAFT INTERNATIONAL STANDARD
ISO/DIS 18744
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2013-11-07 2014-04-07
Microbiology of the food chain — Detection and
enumeration of Cryptosporidium and Giardia in fresh leafy
green vegetables and berry fruits
Microbiologie de la châine alimentaire — Recherche et dénombrement des Cryptosporidium et Giardia
dans les légumes verts frais à feuilles et les fruits à baies
ICS: 07.100.30
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This draft has been developed within the International Organization for
Standardization (ISO), and processed under the ISO lead mode of collaboration
as defined in the Vienna Agreement.
This draft is hereby submitted to the ISO member bodies and to the CEN member
bodies for a parallel five month enquiry.
Should this draft be accepted, a final draft, established on the basis of comments
received, will be submitted to a parallel two-month approval vote in ISO and
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FOR COMMENT AND APPROVAL. IT IS
THEREFORE SUBJECT TO CHANGE AND MAY
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STANDARD UNTIL PUBLISHED AS SUCH.
To expedite distribution, this document is circulated as received from the
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BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL,
composition will be undertaken at publication stage.
TECHNOLOGICAL, COMMERCIAL AND
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BE CONSIDERED IN THE LIGHT OF THEIR
POTENTIAL TO BECOME STANDARDS TO
WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
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RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED
TO SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS,
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PROVIDE SUPPORTING DOCUMENTATION. ISO 2013
ISO/DIS 18744:2013(E)
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This ISO document is a Draft International Standard and is copyright-protected by ISO. Except as
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ISO/DIS 18744
Contents Page
Foreword . iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle. 2
5 Reagents. 2
6 Apparatus . 4
7 Sampling and transport . 5
7.1 Sampling. 5
7.2 Transport . 5
7.3 Receipt of samples . 5
7.4 Storage . 5
7.5 Preparation of test sample . 5
8 Procedure . 5
8.1 Removal of parasites from leafy green vegetables . 5
8.2 Removal of parasites from berry fruits . 6
9 Immunomagnetic separation (IMS) . 7
10 Sample staining . 8
11 Microscopy . 9
11.1 General comments . 9
11.2 Examination of sample preparations using epifluorescence microscopy . 9
11.3 Examination of sample preparations using DIC microscopy . 12
12 Quality control procedures. 13
12.1 General . 13
12.2 Inclusion and interpretation of controls . 13
12.3 Equipment cleaning . 14
13 Reporting of results . 14
13.1 Expression of results . 14
13.2 Test report . 14
Annex A (normative) Preparation of reagents . 16
A.1 General reagents . 16
A.2 Reagents for elution of parasites from fresh produce . 16
A.3 Reagents used in concentration, fixing, staining, detection and QC . 16
Annex B (normative) Preparation of positive process control suspensions . 18
B.1 General . 18
B.2 Determination of the concentration of oocysts or cysts in a stock suspension . 18
B.3 Performance data for the positive control suspensions . 18
Annex C (informative) Percentage recoveries achieved by the methods . 20
Bibliography . 21
ISO/DIS 18744
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 18744 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical Committee
CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods in accordance with the Agreement on technical
cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
iv © ISO 2013 – All rights reserved
ISO/DIS 18744
Introduction
Cryptosporidium spp. and Giardia duodenalis (syn. G. lamblia, G. intestinalis) are protozoan parasites that can
cause enteric illness in humans. Both organisms are characterized by a robust transmission stage,
Cryptosporidium oocyst and Giardia cyst, which can survive in moist environments (dehydration is lethal) for
prolonged periods. As these transmission stages, hereafter referred to as (oo)cysts, are highly resistant to
chemical and physical pressures, chlorine at the concentrations used in the treatment of drinking
waters,disinfectants used for produce. , the absence of vegetative bacteria on fresh produce as indicators of
faecal contamination does not necessarily indicate the absence of (oo)cysts. No practical method exists to
culture these agents for the purpose of detection, and therefore direct removal from the food sample must be
performed, followed by visualisation of the (oo)cysts by microscopy. The methods described in this document
are for determining whether Cryptosporidium and/or Giardia (oo)cysts are present on the surfaces of fresh
produce, and for their enumeration. This standard is based on the only published methods which have been
tested in a multicenter collaborative trial. Alternative methods can be used following a demonstration of their
equivalence with this standard following the protocol described in ISO 16140.
DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/DIS 18744
Microbiology of the food chain — Detection and enumeration of
Cryptosporidium and Giardia in fresh leafy green vegetables
and berry fruits
1 Scope
This International Standard specifies a method that is applicable for the detection and enumeration of
Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts on or in food products that are described herein as fresh leafy
green vegetables and berry fruits. With suitable controls, it may also be applicable for the examination of other
fresh produce.
The microscopy descriptions are for Cryptosporidium spp. oocysts and Giardia duodenalis cysts of size
ranges which include those species or assemblages known to be pathogenic to humans.
This method is not applicable for the determination of the species or genotypes/assemblages of
Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts. The method will detect all species and genotypes / assemblages
that are known to be pathogenic for humans and also others that are not. For further identification, molecular
typing assays are required, but these may not be applicable if process positive controls have been spiked into
the samples.
This method does not allow the determination of viability or infectivity of any Cryptosporidium oocysts and
Giardia cysts which may be present.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 7218:2007, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations.
ISO 16140, Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Protocol for the validation of alternative methods.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
Cryptosporidium oocysts
transmission stages of Cryptosporidium spp.; their detection is based on reaction with specific anti-
Cryptosporidium antibodies and typical morphological characteristics as described in Section 11 of this
International Standard
3.2
Giardia cysts
transmission stages of Giardia spp.; their detection is based on reaction with specific anti-Giardia antibodies
and typical morphological characteristics as described in 11 of this International Standard
ISO/DIS 18744
3.3
fresh leafy green vegetables
plant leaves eaten as a vegetable, which have not been subjected to any process, except cutting and washing
3.4
fresh berry fruits
derived from a variety of plants having small fruit characterized by a high surface : weight ra
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 18744
First edition
2016-04-01
Microbiology of the food chain —
Detection and enumeration of
Cryptosporidium and Giardia in fresh
leafy green vegetables and berry fruits
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Recherche et
dénombrement de Cryptosporidium et Giardia dans les légumes verts
frais à feuilles et les fruits à baies
Reference number
©
ISO 2016
© ISO 2016, Published in Switzerland
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
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ii © ISO 2016 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents . 2
6 Apparatus . 3
7 Sampling and transport . 4
7.1 Sampling . 4
7.2 Transport . 4
7.3 Receipt of samples . 4
7.4 Storage . 4
7.5 Preparation of test sample . 4
8 Procedure. 5
8.1 Removal of parasites from leafy green vegetables . 5
8.2 Removal of parasites from berry fruits . 6
8.3 Immunomagnetic separation (IMS) . 7
8.4 Sample staining . 7
8.5 Microscopy . 8
8.5.1 General comments . 8
8.5.2 Examination of sample preparations using epifluorescence microscopy . 9
8.5.3 Examination of sample preparations using DIC microscopy .11
9 Quality control procedures.12
9.1 General .12
9.2 Inclusion and interpretation of controls .12
9.3 Equipment cleaning .13
10 Reporting of results .13
10.1 Expression of results .13
10.2 Test report .13
Annex A (normative) Preparation of reagents .15
Annex B (normative) Preparation of positive process control suspensions .17
Annex C (informative) Percentage recoveries achieved by the methods .19
Bibliography .20
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical
Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology.
iv © ISO 2016 – All rights reserved
Introduction
Cryptosporidium spp. and Giardia duodenalis (syn. G. lamblia, G. intestinalis) are protozoan parasites
that can cause enteric illness in humans. Both organisms are characterized by a robust transmission
stage, the Cryptosporidium oocyst and the Giardia cyst, which can survive in moist environments
for prolonged periods. These transmission stages are hereafter referred to collectively as (oo)cysts.
Cryptosporidium oocysts in particular are highly resistant to chlorine at the concentrations used in
the treatment of drinking water, and chemical disinfection of leafy green vegetables and berry fruits,
where performed during processing, may also be ineffective. Consequently, the absence of vegetative
bacteria on fresh produce as indicators of faecal contamination does not necessarily indicate the
absence of (oo)cysts. No practical method exists to culture Cryptosporidium spp. and Giardia duodenalis
for the purpose of detection, and therefore, in order to detect contamination with these parasites,
direct removal of the (oo)cysts from the food sample must be performed, followed by visualization of
the (oo)cysts by microscopy. The methods described in this International Standard are for determining
whether Cryptosporidium and/or Giardia (oo)cysts are present on the surfaces of fresh produce and for
their enumeration. This International Standard is based on published methods that have been tested in
a multicentre collaborative trial. Alternative methods can be used following a demonstration of their
[1]
equivalence with this International Standard following the protocol described in ISO 16140.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 18744:2016(E)
Microbiology of the food chain — Detection and
enumeration of Cryptosporidium and Giardia in fresh leafy
green vegetables and berry fruits
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal
laboratory practice. This International Standard does not purport to address all of the
safety problems, if any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish
appropriate safety and health practices and to ensure compliance with any national regulatory
conditions.
1 Scope
This International Standard specifies a method that is applicable for the detection and enumeration of
Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts on or in food products that are described herein as fresh leafy
green vegetables and berry fruits. With suitable controls, it may also be applicable for the examination
of other fresh produce.
The microscopy descriptions are for Cryptosporidium spp. oocysts and Giardia duodenalis cysts of size
ranges which include those species (Cryptosporidium) or assemblages (Giardia) known to be pathogenic
to humans.
This method does not include any molecular analysis and therefore is not suitable for the determination
of the species or genotypes/assemblages of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts. The method will
detect all species and genotypes/assemblages that are known to be pathogenic for humans and also
others that are not. For further identification, molecular typing assays are required. However, these
cannot be reliably performed if process positive controls have been spiked into the samples, as the
result of molecular typing assays will be obfuscated.
This method does not allow the determination of viability or infectivity of any Cryptosporidium oocysts
and Giardia cysts which may be present.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 7218:2007, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
Cryptosporidium oocyst
transmission stage of Cryptosporidium spp.
Note 1 to entry: Its detection is based on reaction with specific anti-Cryptosporidium antibodies and morphological
characteristics as described in Clause 8.
3.2
Giardia cysts
transmission stage of Giardia spp.
Note 1 to entry: Its detection is based on reaction with specific anti-Giardia antibodies and typical morphological
characteristics as described in Clause 8.
3.3
fresh leafy green vegetable
plant leaves eaten as a vegetable, which have not been subjected to any process, except perhaps cutting
and washing
3.4
fresh berry fruit
small, round or oblong, fleshy and juicy fruit, which
...
PROJET
NORME ISO/FDIS
FINAL
INTERNATIONALE 18744
ISO/TC 34/SC 9
Microbiologie de la chaîne
Secrétariat: AFNOR
alimentaire — Recherche et
Début de vote:
2015-12-10 dénombrement des Cryptosporidium
et Giardia dans les légumes verts frais
Vote clos le:
2016-02-10
à feuilles et les fruits à baies
Microbiology of the food chain — Detection and enumeration of
Cryptosporidium and Giardia in fresh leafy green vegetables and
berry fruits
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT
INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSER-
Veuillez consulter les notes administratives en page iii
VATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT
CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMEN-
TATION EXPLICATIVE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS
INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET COM-
Numéro de référence
MERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
ISO/FDIS 18744:2015(F)
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR POSSI-
BILITÉ DE DEVENIR DES NORMES POUVANT
SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA RÉGLEMENTA-
©
TION NATIONALE. ISO 2015
ISO/FDIS 18744:2015(F)
TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
Le présent projet final a été élaboré dans le cadre de l’Organisation internationale de normalisation (ISO) et
soumis selon le mode de collaboration sous la direction de l’ISO, tel que défini dans l’Accord de Vienne. Le
projet final a été établi sur la base des observations reçues lors de l’enquête parallèle sur le projet.
Le projet final est par conséquent soumis aux comités membres de l’ISO et aux comités membres du CEN en
parallèle à un vote d’approbation de deux mois au sein de l’ISO et à un vote formel au sein du CEN.
Les votes positifs ne doivent pas être accompagnés d’observations.
Les votes négatifs doivent être accompagnés des arguments techniques pertinents.
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l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ii © ISO 2015 – Tous droits réservés
ISO/FDIS 18744:2015(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 3
7 Échantillonnage et transport . 4
7.1 Échantillonnage . 4
7.2 Transport . 4
7.3 Réception des échantillons . 4
7.4 Conservation . 4
7.5 Préparation de l’échantillon pour essai . 4
8 Mode opératoire. 5
8.1 Récupération des parasites sur des légumes verts à feuilles . 5
8.2 Récupération des parasites sur des fruits à baies . 6
8.3 Séparation immunomagnétique (IMS) . 7
8.4 Coloration de l’échantillon . 7
8.5 Examen au microscope . 8
8.5.1 Commentaires généraux . 8
8.5.2 Examen des préparations d’échantillons au microscope à épifluorescence . 9
8.5.3 Examen des préparations d’échantillons au microscope CID .11
9 Procédures de contrôle qualité .13
9.1 Généralités .13
9.2 Inclusion et interprétation des contrôles .13
9.3 Nettoyage de l’équipement .13
10 Compte-rendu des résultats .13
10.1 Expression des résultats .13
10.2 Rapport d’essai .14
Annexe A (normative) Préparation des réactifs .15
Annexe B (normative) Préparation des suspensions de contrôle de processus positives .17
Annexe C (informative) Pourcentages de rendement obtenus avec les méthodes .19
Bibliographie .21
ISO/FDIS 18744:2015(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer
un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 9, Microbiologie.
iv © ISO 2015 – Tous droits réservés
ISO/FDIS 18744:2015(F)
Introduction
Cryptosporidium sp. et Giardia duodenalis (syn. G. lamblia, G. intestinalis) sont des parasites protozoaires
pouvant causer des maladies entériques chez l’homme. Ces organismes sont tous les deux caractérisés
par un stade de transmission résistant, l’oocyste de Cryptosporidium et le kyste de Giardia, qui peuvent
survivre dans des environnements humides pendant de longues périodes. Ces stades de transmission
sont ci-après appelés collectivement (oo)cystes. Les oocystes de Cryptosporidium en particulier sont très
résistants au chlore aux concentrations utilisées dans le traitement de l’eau potable, et la désinfection
chimique des légumes verts à feuilles et fruits à baies, lorsqu’elle est effectuée pendant le traitement,
peut également être inefficace. Par conséquent, l’absence de bactéries végétatives sur les produits frais
en tant qu’indicateurs de contamination fécale, n’est pas forcément synonyme d’absence d’(oo)cystes. Il
n’existe aucune méthode de culture de Cryptosporidium spp. et Giardia duodenalis à des fins de détection
et, par conséquent, pour détecter une contamination par ces parasites, il faut isoler directement les
(oo)cystes sur l’échantillon alimentaire puis les observer au microscope. Les méthodes décrites dans la
présente Norme internationale servent à déterminer si des (oo)cystes de Cryptosporidium et/ou Giardia
sont présents à la surface des produits frais et à les dénombrer. La présente Norme internationale
repose sur les méthodes publiées qui ont été soumises à essai lors d’une étude multicentrique
interlaboratoires. D’autres méthodes peuvent être utilisées s’il est démontré qu’elles sont équivalentes
[1]
à la présente Norme internationale, suivant le protocole décrit dans l’ISO 16140.
PROJET FINAL DE NORME INTERNATIONALE ISO/FDIS 18744:2015(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Recherche et
dénombrement des Cryptosporidium et Giardia dans les
légumes verts frais à feuilles et les fruits à baies
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale connaisse
bien les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n’a pas pour but de
traiter de tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe
à l’utilisateur de la présente norme d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et
de sécurité et de s’assurer de la conformité à la réglementation nationale en vigueur.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode applicable à la détection et au dénombrement
des oocystes de Cryptosporidium et aux kystes de Giardia sur ou dans des produits alimentaires qui
sont décrits ici comme étant des légumes verts frais à feuilles et des fruits à baies. Grâce à des contrôles
appropriés, elle peut être également applicable à l’examen d’autres produits frais.
Les descriptions faites au microscope concernent les oocystes de Cryptosporidium spp. et les kystes de
Giardia duodenalis dont la taille inclut les espèces (Cryptosporidium) ou assemblages (Giardia) connus
pour être pathogènes pour l’homme.
Cette méthode n’inclut pas l’analyse mol
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 18744
Première édition
2016-04-01
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Recherche et
dénombrement de Cryptosporidium et
Giardia dans les légumes verts frais à
feuilles et les fruits à baies
Microbiology of the food chain — Detection and enumeration of
Cryptosporidium and Giardia in fresh leafy green vegetables and
berry fruits
Numéro de référence
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ISO 2016
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 3
7 Échantillonnage et transport . 4
7.1 Échantillonnage . 4
7.2 Transport . 4
7.3 Réception des échantillons . 4
7.4 Conservation . 4
7.5 Préparation de l’échantillon pour essai . 4
8 Mode opératoire. 5
8.1 Récupération des parasites sur des légumes verts à feuilles . 5
8.2 Récupération des parasites sur des fruits à baies . 6
8.3 Séparation immunomagnétique (IMS) . 7
8.4 Coloration de l’échantillon . 7
8.5 Examen au microscope . 8
8.5.1 Commentaires généraux . 8
8.5.2 Examen des préparations d’échantillons au microscope à épifluorescence . 9
8.5.3 Examen des préparations d’échantillons au microscope CID .11
9 Procédures de contrôle qualité .12
9.1 Généralités .12
9.2 Inclusion et interprétation des contrôles .13
9.3 Nettoyage de l’équipement .13
10 Compte-rendu des résultats .13
10.1 Expression des résultats .13
10.2 Rapport d’essai .14
Annexe A (normative) Préparation des réactifs .15
Annexe B (normative) Préparation des suspensions de contrôle de processus positives .17
Annexe C (informative) Pourcentages de rendement obtenus avec les méthodes .19
Bibliographie .21
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 9, Microbiologie.
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Introduction
Cryptosporidium spp. et Giardia duodenalis (syn. G. lamblia, G. intestinalis) sont des parasites protozoaires
pouvant causer des maladies entériques chez l’homme. Ces organismes sont tous les deux caractérisés
par un stade de transmission résistant, l’oocyste de Cryptosporidium et le kyste de Giardia, qui peuvent
survivre dans des environnements humides pendant de longues périodes. Ces stades de transmission
sont ci-après appelés collectivement (oo)cystes. Les oocystes de Cryptosporidium en particulier sont très
résistants au chlore aux concentrations utilisées dans le traitement de l’eau potable, et la désinfection
chimique des légumes verts à feuilles et fruits à baies, lorsqu’elle est effectuée pendant le traitement,
peut également être inefficace. Par conséquent, l’absence de bactéries végétatives sur les produits frais
en tant qu’indicateurs de contamination fécale, n’est pas forcément synonyme d’absence d’(oo)cystes. Il
n’existe aucune méthode de culture de Cryptosporidium spp. et Giardia duodenalis à des fins de détection
et, par conséquent, pour détecter une contamination par ces parasites, il faut isoler directement les
(oo)cystes sur l’échantillon alimentaire puis les observer au microscope. Les méthodes décrites dans la
présente Norme internationale servent à déterminer si des (oo)cystes de Cryptosporidium et/ou Giardia
sont présents à la surface des produits frais et à les dénombrer. La présente Norme internationale
repose sur les méthodes publiées qui ont été soumises à essai lors d’une étude multicentrique
interlaboratoires. D’autres méthodes peuvent être utilisées s’il est démontré qu’elles sont équivalentes
[1]
à la présente Norme internationale, suivant le protocole décrit dans l’ISO 16140.
NORME INTERNATIONALE ISO 18744:2016(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Recherche et
dénombrement de Cryptosporidium et Giardia dans les
légumes verts frais à feuilles et les fruits à baies
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale connaisse
bien les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n’a pas pour but de
traiter de tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe
à l’utilisateur de la présente norme d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et
de sécurité et de s’assurer de la conformité à la réglementation nationale en vigueur.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode applicable à la détection et au dénombrement
des oocystes de Cryptosporidium et aux kystes de Giardia sur ou dans des produits alimentaires qui
sont décrits ici comme étant des légumes verts frais à feuilles et des fruits à baies. Grâce à des contrôles
appropriés, elle peut être également applicable à l’examen d’autres produits frais.
Les descriptions faites au microscope concernent les oocystes de Cryptosporidium spp. et les kystes de
Giardia duodenalis dont la taille inclut les espèces (Cryptosporidium) ou assemblages (Giardia) connus
pour être pathogènes pour l’homme.
Cette méthode n’inclut pas l’analyse moléculaire et n’est donc pas applicable à la détermination des
espèces ou des génotypes/assemblages d’oocystes de Cryptosporidium et de kystes de Giardia. La
méthode permettra de détecter toutes les espèces et tous les génotypes/assemblages connus pour être
pathogènes pour l’homme ainsi que d’autres qui ne le sont pas. Pour mieux les identifier, des essais de
typage moléculaire sont requis. Toutefois, ceux-ci ne peuvent pas être effectués de manière fiable si
des contrôles de processus positifs ont été ajoutés aux échantillons, car le résultat des essais de typage
moléculaire sera erroné.
Cette méthode ne permet pas de déterminer la viabilité ou l’infectivité des oocystes de Cryptosporidium
et des kystes de Giardia qui peuvent être présents.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 7218:2007, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions suivants s’appliquent.
3.1
oocyste de Cryptosporidium
stade de transmission de Cryptosporidium spp.
Note 1 à l’article: Sa détection est basée sur la réaction avec des anticorps anti-Cryptosporidiu
...
Questions, Comments and Discussion
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