ISO 20976-2:2022
(Main)Microbiology of the food chain — Requirements and guidelines for conducting challenge tests of food and feed products — Part 2: Challenge tests to study inactivation potential and kinetic parameters
Microbiology of the food chain — Requirements and guidelines for conducting challenge tests of food and feed products — Part 2: Challenge tests to study inactivation potential and kinetic parameters
This document specifies the protocols for conducting microbiological challenge tests for inactivation studies on vegetative bacteria and bacterial spores in the raw materials and ingredients, intermediate or end products. The use of this document can be extended to yeasts which do not form mycelium.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences et lignes directrices pour la réalisation des tests d'épreuve microbiologiques — Partie 2: Tests d’inactivation pour étudier le potentiel d’inactivation et les paramètres de la cinétique d’inactivation
Le présent document spécifie les protocoles de mise en œuvre de tests d’inactivation microbiologique pour les études d’inactivation sur les bactéries végétatives et les spores bactériennes dans les matières premières et les ingrédients, les produits intermédiaires ou finis. L’utilisation du présent document peut être étendue aux levures qui ne forment pas de mycélium.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20976-2
First edition
2022-10
Microbiology of the food chain —
Requirements and guidelines for
conducting challenge tests of food and
feed products —
Part 2:
Challenge tests to study inactivation
potential and kinetic parameters
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences et lignes
directrices pour la réalisation des tests d'épreuve microbiologiques —
Partie 2: Tests d’inactivation pour étudier le potentiel d’inactivation
et les paramètres de la cinétique d’inactivation
Reference number
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ISO 20976-2:2022(E)
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Published in Switzerland
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ISO 20976-2:2022(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 5
5 Apparatus . 7
6 Culture media and reagents .7
7 Study design and sampling . 7
7.1 General . 7
7.2 Setting target reduction level for the inactivation study . 8
7.3 Number of batches. 8
7.4 Preparation of the test units . 8
7.5 Number of control units and test units . 9
8 Selection of strains . 9
9 Preparation of the inoculum . 9
9.1 General . 9
9.2 Preparation of the vegetative cells . 10
9.3 Preparation of the spores . 10
10 Inoculation of the test units .10
11 Controls . .12
11.1 Uninoculated controls .12
11.2 Inoculated controls . 12
12 Treatment of the test units .12
13 Analysis . .12
14 Expression of the results .13
14.1 General .13
14.2 Inactivation potential .13
14.3 Inactivation kinetics parameters. 14
14.3.1 General . 14
14.3.2 Primary inactivation kinetics parameters . 14
14.3.3 Secondary inactivation kinetics parameters . 15
14.4 Simulation of inactivation .15
15 Test report .16
15.1 General . 16
15.2 Aim of the study, type of challenge test and target reduction level . 16
15.3 Experimental protocol . . 17
15.4 Sample analysis . . 17
15.5 Results . . 17
15.6 Conclusions . 18
15.7 Reference documents . 18
Annex A (informative) Selection of the type and the location of inactivation study .19
Annex B (normative) Minimum number of units to prepare for the inactivation studies .20
Annex C (informative) Examples of inoculation techniques .21
Bibliography .23
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ISO 20976-2:2022(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 463, Microbiology of the food chain, in accordance with the Agreement on technical
cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
A list of all parts in the ISO 20976 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
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ISO 20976-2:2022(E)
Introduction
Under the general principles of the Codex Alimentarius on food hygiene, it is the responsibility of the
food business operators (FBOs) to control microbiological hazards in foods and to manage microbial
risks. Therefore, FBOs implement validated control measures, within the hazard analysis and critical
control point (HACCP) system, and conducts studies in order to investigate compliance with the food
safety criteria throughout the food chain.
In the framework of microbial risk assessment (MRA), several complementary approaches are developed
to estimate risks posed by pathogens or spoilage microorganisms in the food chain. MRA is adopted by
regulators under the auspices of the international agency for setting food standards. Challenge testing
is one of the recognized approaches used to validate control measures within the HACCP system, as
well as to assess microbiological safety and quality of food, food production processes, food storage
conditions, and food preparation recommendations dedicated to consumers.
Therefore, this document provides technical rules, calculations and approaches to investigate the ability
of an inoculated microorganism of concern to grow, survive or be inactivated in the raw materials,
intermediate or end products under reasonably foreseeable food processes, storage and use conditions.
The objective and the scope of the study are to determine the experimental design and the selection
of the study conditions, and to assess the extent of microbial inactivation. Regulatory authorities can
have different recommendations, and these differences have been included as much as possible. It is,
however, possible that specific requirements need to be incorporated to get a regulatory approval of
the challenge test.
As the growth and inactivation studies are clearly different, the ISO 20976 series consists of two parts,
under the general title Microbiology of the food chain — Requirements and guidelines for conducting
challenge tests of food and feed products:
— Part 1: Challenge tests to study the growth potential, lag time and the maximum growth rate;
— Part 2: Challenge tests to study inactivation potential and kinetic parameters.
The use of the ISO 20976 series involves expertise in relevant areas such as food microbiology, food
science, food processing and statistics. The statistical expertise encompasses an understanding of
sampling theory and design of experiments, statistical analysis of microbiological data, and overview of
scientifically recognized and available mathematical concepts used in predictive modelling.
For practical reasons, the term “food” includes feed.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 20976-2:2022(E)
Microbiology of the food chain — Requirements and
guidelines for conducting challenge tests of food and feed
products —
Part 2:
Challenge tests to study inactivation potential and kinetic
parameters
1 Scope
This document specifies the protocols for conducting microbiological challenge tests for inactivation
studies on vegetative bacteria and bacterial spores in the raw materials and ingredients, intermediate
or end products.
The use of this document can be extended to yeasts which do not form mycelium.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
bacterial spore
resistant form of bacteria which is dormant until the germination (3.9) step
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.1]
1
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ISO 20976-2:2022(E)
3.2
batch
group or set of identifiable food obtained through a given process under practically identical
circumstances and produced in a given place within one defined production period
Note 1 to entry: The batch is determined by parameters established beforehand by the organization and may be
described by other terms, e.g. lot.
[10]
[SOURCE: Commission Regulation (EC) No 2073/2005, Article 2 (e) , modified — “food obtained
through” has replaced “products obtained from” and Note 1 to entry has been added.]
3.3
bulk products
products that are not separated into individual items or units
[SOURCE: ISO/TS 17728:2015, 3.3.1]
3.4
challenge test
study of the growth or inactivation of microorganism(s) artificially inoculated in a food
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.5]
3.5
control unit
unit of food identical to the test unit (3.34) but not artificially inoculated (used as a blank)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.4, modified — “inoculated” has replaced “contaminated”.]
3.6
D value
decimal reduction
time or dose required to achieve reduction of 90 % of the tested microorganism under stated conditions
(e.g. temperature, pH or chemical composition) in case of log linear inactivation kinetics (3.10)
3.7
δ value
first decimal reduction
time or dose required to achieve the first reduction of 90 % of the tested microorganism under stated
conditions (e.g.: temperature, pH or chemical composition) in case of non-log linear inactivation kinetics
(3.10)
3.8
experimental datapoint
result of analysis of a test unit (3.34) per unit mass, per unit volume, or per unit area
Note 1 to entry: The enumeration results may be expressed in log or most probable number (MPN).
10
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.6, modified — In the definition, “mass” has replaced “weight” and the
units have been deleted. In Note 1 to entry, “for specific cases” has been deleted and “or most probable
number (MPN)” has replaced “MPN”.]
3.9
germination
mechanism in which a bacterial spore (3.1) initiates its transformation into a vegetative cell (3.36)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.9, modified — “initiates its transformation into” has replaced “starts
becoming”.]
3.10
inactivation kinetics
change over time in the concentration of the target microorganism subjected to an inactivation process
2
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ISO 20976-2:2022(E)
3.11
inactivation parameter
mathematical estimate that describes the resistance/sensitivity of the target organism to the treatment
(3.35), obtained by fitting primary models (3.18) and secondary models (3.24)
Note 1 to entry: Examples of these parameters are D, δ and p for the primary models and z for the secondary
models.
3.12
inactivation potential
Δ value
log kill
log reduction
2
difference in the log concentration (log cfu/g or ml or cm ) of the target microorganism between an
10
earlier and a later time point expressed as log
10
Note 1 to entry: In this document, the term “inactivation potential” refers to the type of inactivation study, and
the terms “log kill” and “log reduction” refer to the result obtained.
3.13
inactivation treatment
process used to kill or inactivate the target microorganism
3.14
inoculum
microbial suspension at the desired concentration used to contaminate test units (3.34)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.12]
3.15
k value
slope of the inactivation curve
3.16
p value
parameter describing the shape of the inactivation curve
3.17
pH value
measure of the concentration of acidity or alkalinity of a material in an aqueous solution
[SOURCE: ISO 5127:2017, 3.12.2.29, modified — The notes to entry have been deleted.]
3.18
primary model
mathematical model describing the changes of microbial counts as a function of time
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.16]
3.19
organizing laboratory
laboratory with responsibility for managing the challenge tests (3.4)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.17]
3.20
pilot facility
manufacturing location used to run an experiment or test before introducing more widely
3.21
processing facility
location where products are made on a larger scale
3
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ISO 20976-2:2022(E)
3.22
sampling
selection of one or more units or portions of food such that the units or portions selected are
representative of that food
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.18]
3.23
sampling point
time at which the test units (3.34) are taken for analyses
Note 1 to entry: When assessing inactivation kinetics (3.10), these are represented as experimental datapoints
(3.8) on the inactivation graph.
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.19, modified — “taken for analyses” has replaced “analysed and which
are represented as experimental datapoints on the kinetics graph” and Note 1 to entry has been added.]
3.24
secondary model
mathematical model describing the effects of the inactivation process factors (e.g. temperature, pH, a )
w
on the parameters of the primary model (3.18) (e.g. D, δ)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.20, modified — “inactivation process” has replaced “environmental” and
“(e.g. D, δ)” has replaced “(e.g. growth rate)”.]
3.25
sporulation
mechanism by which vegetative cell (3.36) forms spore
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.21]
3.26
surrogate
non-pathogenic microorganism that has similar or more robust survival (3.27) capability compared to
the pathogen of concern both in the matrix and under the processing conditions being studied
3.27
survival
state of continuing to live or exist without significant increase or decrease in viability
3.28
target reduction level
target inactivation level expressed in log
10
3.29
t
0
time at which the treatment starts
3.30
t
end
time at which the treatment is finished
3.31
t
inoc
time at which the microorganism is inoculated in the food
3.32
t
xD
time of treatment needed for x log reduction of the target microorganism
4
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ISO 20976-2:2022(E)
3.33
test portion
measured (volume or mass) representative sample taken from the test unit (3.34) for use in the analysis
[SOURCE: ISO 6887-1:2017, 3.5, modified — “test unit for use in the analysis” has replaced “laboratory
sample for use in the preparation of the initial suspension” and Note 1 to entry has been deleted.]
3.34
test unit
measured (volume or mass) amount of the food used for inoculation, subsequent treatment (3.35) and
analysis
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.24, modified — “subsequent treatment and analysis” has been added.]
3.35
treatment
any process, formulation or product characteristics, or a combination thereof, intended to inactivate
the target microorganism
3.36
vegetative cell
state of microbial form that is capable of growing under favourable environmental conditions
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.25]
3.37
water activity
a
w
ratio of the water-vapour pressure in the foodstuff to the vapour pressure of pure water at the same
temperature
[SOURCE: ISO 18787:2017, 3.1 modified — “water-vapour pressure in the foodstuff to the vapour
pressure of pure water at” has replaced “partial water-vapour pressure in equilibrium with the product
analysed to the water-vapour saturation pressure in equilibrium with”, and the formula and the notes
to entry has been deleted]
3.38
z value
change in treatment (3.35) (e.g. temperature, pH, a ,) that induces a 10-fold change in the D value (3.6)
w
Note 1 to entry: Temperature, pH and a can be indexed to the z value to denote the treatment being assessed.
w
4 Principle
Inactivation studies are designed to determine the changes in the concentration of the target
microorganism during the challenge test. These studies can be used to assess whether there is significant
microbial inactivation in a foodstuff and to quantify the decrease in the target microorganism under a
given set of processing conditions and/or formulation of the food product. The scope and the aim of
the study shall be clearly specified (e.g. assessment/validation of the food process efficacy as a control
measure, assessment of microbial stability and survival) including the target reduction level and the
decision criteria. The experimental design shall be in accordance with that purpose and shall take
into account the steps of the process and the food chain for which microbial inactivation is assessed.
Knowledge from the FBO (e.g. on their products characteristics and production process) shall be
combined with the expertise in food microbiology and analytical sciences to ensure the robustness of
the study (see 14.3.2). Ideally, inactivation studies employ the target microorganism. In the challenge
tests studies conducted within food production facilities, a validated surrogate shall be used in place of
[26]
the target pathogen .
5
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ISO 20976-2:2022(E)
The organizing laboratory shall have knowledge and skills in food microbiology, food science and
technology, and statistics to design and conduct the studies, interpret the results and draw the
conclusions. The analyses shall be conducted under a quality assurance system (e.g. ISO/IEC 17025).
To conduct an inactivation challenge study, the inoculum should be prepared such that the microbial
cells or spores have been adapted to the environmental conditions that mimic the food processing
environment, thereby encouraging natural microbial response once inoculated into the food.
[14]
The same microbial strain could exhibit various shapes as a function of the treatment (see Figure 1) .
The heterogeneous shapes of microbial inactivation curves are the results of the microbial resistance
[16]
or adaptive response or cell heterogeneity .
Key
X inactivation treatment (time or dose)
Y log (N)
10
a
Log-linear.
b
Concave.
c
Convex or with a shoulder.
d, e
With a tail or biphasic.
f
Sigmoïdal curve.
Figure 1 — Examples of microbial inactivation curve types
There are two types of inactivation study: the inactivation potential and the inactivation kinetics of a
target microorganism.
The inactivation potential studies are most appropriate for process validation and/or product
formulation. Inactivation potential results are specific to the conditions and matrix under study. To
extrapolate to other conditions, inactivation kinetic parameters shall be used, or a new inactivation
potential study conducted.
The inactivation kinetics studies are used to characterize the inactivation of the microorganism
through the determination of inactivation parameters such as D, δ and z values. Those studies are more
complex in terms of study design, execution, results interpretation and exploitation, particularly in the
6
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ISO 20976-2:2022(E)
case of nonlinearity (see Figure 1) but allow to extrapolate the results to non-tested conditions within
the range of the study.
5 Apparatus
Routine microbiology labware specified in ISO 7218 shall be used. Specific labware, including the
following, can also be needed to prepare the test portions, to store them under suitable conditions, or
monitor how their characteristics change during the challenge test study.
5.1 Apparatus for packaging the samples under air, under vacuum or under a protective modified
atmosphere.
5.2 Climate-control chamber, able to reach and hold setpoint temperature to ± 1 °C and to adjust
relative humidity to ± 10 %.
5.3 pH meter, able to perform measurements to a tolerance of ± 0,1 pH units. pH meters shall give
readings to a resolution of 0,01 pH units.
5.4 a meter, meeting the requirements of ISO 18787.
w
5.5 Headspace gas analyser, to measure gas composition (e.g. O , CO ).
2 2
5.6 Logger for measuring temperature conditions of the test unit.
5.7 Logger for measuring relative humidity conditions of the test unit.
5.8 Device for measuring the inactivation treatment (e.g. dosimeter for irradiation treatment,
probe for heat treatment) of the test unit.
5.9 Apparatus (pilot facility or equipment in a laboratory) to run the inactivation treatment, which
mimic foreseeable conditions of production leading to microbial inactivation.
5.10 Industrial piece of equipment to conduct the inactivation study at the factory level.
6 Culture media and reagents
Follow cu
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 20976-2
Première édition
2022-10
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Exigences et lignes
directrices pour la réalisation des
tests d'épreuve microbiologiques —
Partie 2:
Tests d’inactivation pour étudier
le potentiel d’inactivation et
les paramètres de la cinétique
d’inactivation
Microbiology of the food chain — Requirements and guidelines for
conducting challenge tests of food and feed products —
Part 2: Challenge tests to study inactivation potential and kinetic
parameters
Numéro de référence
ISO 20976-2:2022(F)
© ISO 2022
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ISO 20976-2:2022(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
© ISO 2022 – Tous droits réservés
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ISO 20976-2:2022(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 6
5 Appareillage . 7
6 Milieux de culture et réactifs .8
7 Plan de l’étude et échantillonnage .8
7.1 Généralités . 8
7.2 Définition du niveau cible de réduction pour l’étude d’inactivation . 9
7.3 Nombre de lots . 9
7.4 Préparation des unités pour essai . 9
7.5 Nombre d’unités témoins et d’unités pour essai . 10
8 Choix des souches.10
9 Préparation de l’inoculum .10
9.1 Généralités . 10
9.2 Préparation des cellules végétatives . 11
9.3 Préparation des spores . 11
10 Inoculation des unités pour essai .11
11 Témoins .13
11.1 Témoins non inoculés . 13
11.2 Témoins inoculés . 13
12 Traitement des unités pour essai .13
13 Analyse .13
14 Expression des résultats .14
14.1 Généralités . 14
14.2 Potentiel d’inactivation .15
14.3 Paramètres de la cinétique d’inactivation . 15
14.3.1 Généralités .15
14.3.2 Paramètres primaires de la cinétique d’inactivation .15
14.3.3 Paramètres secondaires de la cinétique d’inactivation . 16
14.4 Simulation de l’inactivation . 17
15 Rapport d’essai .17
15.1 Généralités . 17
15.2 Objectif de l’étude, type de test d’inactivation et niveau cible de réduction . 17
15.3 Protocole expérimental . 18
15.4 Analyse d’échantillon . 19
15.5 Résultats . 19
15.6 Conclusions . 19
15.7 Documents de référence .20
Annexe A (informative) Choix du type et du lieu de l’étude d’inactivation .21
Annexe B (normative) Nombre minimal d’unités à préparer pour les études d’inactivation .22
Annexe C (informative) Exemples de techniques d’inoculation .24
Bibliographie .26
iii
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ISO 20976-2:2022(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 9, Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la chaîne
alimentaire, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération
technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Une liste de toutes les parties de la série ISO 20976 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
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ISO 20976-2:2022(F)
Introduction
Selon les principes généraux du Codex Alimentarius sur l’hygiène alimentaire, il est de la responsabilité
des exploitants du secteur alimentaire de maîtriser les dangers microbiologiques dans les aliments et
de gérer les risques microbiens. Par conséquent, les exploitants du secteur alimentaire mettent en place
des mesures de maîtrise validées, au sein du système HACCP (analyse des dangers et points critiques
pour leur maîtrise), et conduisent des études afin d’évaluer la conformité aux critères de sécurité
alimentaire tout au long de la chaîne alimentaire.
Dans le cadre de l’évaluation des risques microbiens, plusieurs approches complémentaires sont
développées afin d’estimer les risques posés par les microorganismes pathogènes ou d’altération
dans la chaîne alimentaire. L’évaluation des risques microbiens est adoptée par les organismes de
réglementation sous les auspices de l’agence internationale chargée des normes alimentaires. Les tests
d’épreuve microbiologique font partie des approches reconnues utilisées pour valider les mesures de
maîtrise au sein du système HACCP, ainsi que pour évaluer la sécurité microbiologique et la qualité
des aliments, les procédés de production alimentaire, les conditions de stockage des aliments et les
recommandations relatives à la préparation des aliments destinées aux consommateurs.
C’est pourquoi le présent document fournit les règles techniques, calculs et approches pour l’évaluation
de la capacité d’un microorganisme inoculé à croître, survivre ou être inactivé dans les matières
premières, les produits intermédiaires ou produits finis pendant toute la durée de conservation des
produits, soit dans des conditions de transformation, de distribution, d’entreposage et d’utilisation des
aliments raisonnablement prévisibles. L’objectif et le champ de l’étude consistent à déterminer le plan
expérimental et à sélectionner les conditions de l’étude, ainsi qu’à évaluer l’importance de l’inactivation
microbienne. Les autorités réglementaires peuvent avoir des recommandations différentes et ces
différences ont été incluses dans la mesure du possible. Toutefois, il peut parfois s’avérer nécessaire
d’intégrer des exigences spécifiques pour obtenir l’approbation réglementaire du test d’épreuve
microbiologique.
Les études de croissance et d’inactivation étant clairement différentes, la série ISO 20976 est constituée
de deux parties, publiées sous le titre général Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences et lignes
directrices pour la réalisation des tests d’épreuve microbiologique:
— Partie 1: Tests de croissance pour étudier le potentiel de croissance, le temps de latence et le taux de
croissance maximal;
— Partie 2: Tests d’inactivation pour étudier le potentiel d’inactivation et les paramètres de la cinétique
d’inactivation.
L’utilisation de la série ISO 20976 nécessite une expertise dans les secteurs pertinents tels que la
microbiologie des aliments, la science des aliments, la transformation des aliments et les statistiques.
L’expertise statistique englobe la compréhension de la théorie d’échantillonnage et des plans
d’expérience, l’analyse statistique des données microbiologiques et une vue d’ensemble des concepts
mathématiques scientifiquement reconnus et disponibles employés en microbiologie prévisionnelle.
Pour des raisons pratiques, le terme «aliment» inclut les aliments pour animaux.
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NORME INTERNATIONALE ISO 20976-2:2022(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences et
lignes directrices pour la réalisation des tests d'épreuve
microbiologiques —
Partie 2:
Tests d’inactivation pour étudier le potentiel d’inactivation
et les paramètres de la cinétique d’inactivation
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie les protocoles de mise en œuvre de tests d’inactivation microbiologique
pour les études d’inactivation sur les bactéries végétatives et les spores bactériennes dans les matières
premières et les ingrédients, les produits intermédiaires ou finis.
L’utilisation du présent document peut être étendue aux levures qui ne forment pas de mycélium.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
spore bactérienne
forme de résistance prise par certaines bactéries qui reste en état de dormance jusqu’à l’étape de
germination (3.9)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.1]
1
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ISO 20976-2:2022(F)
3.2
lot
groupe ou série de produits identifiables obtenus par un procédé donné dans des conditions
pratiquement identiques et produits dans un endroit donné et au cours d’une période de production
déterminée
Note 1 à l'article: Le lot est déterminé par des paramètres établis au préalable par l’organisation et il peut être
décrit par d’autres termes.
o [10]
[SOURCE: Règlement (CE) n 2073/2005 de la Commission, Article 2 (e) , modifié — La Note 1 à
l’article a été ajoutée et, dans la version anglaise de la norme, «food obtained through» remplace
«products obtained from».]
3.3
produits en vrac
produits qui ne sont pas séparés en individus ou en unités
[SOURCE: ISO/TS 17728:2015, 3.3.1]
3.4
test d’épreuve microbiologique
étude de la croissance ou étude de l’inactivation d’un ou plusieurs microorganismes inoculés
artificiellement dans un aliment, la première s’effectuant lors d’un test de croissance, la seconde lors
d’un test d’inactivation
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.5]
3.5
unité témoin
unité d’aliment identique à l’unité pour essai (3.34), mais qui n’est pas inoculée artificiellement (utilisée
comme blanc)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.4, modifié — «inoculée» remplace «contaminée».]
3.6
valeur D
réduction décimale
temps ou dose nécessaire pour obtenir une réduction de 90 % du microorganisme soumis à essai dans
les conditions indiquées (par exemple: température, pH ou composition chimique) dans le cas d’une
cinétique d’inactivation (3.10) log-linéaire
3.7
valeur δ
première réduction décimale
temps ou dose nécessaire pour obtenir la première réduction de 90 % du microorganisme soumis à
essai dans les conditions indiquées (par exemple: température, pH ou composition chimique) dans le
cas d’une cinétique d’inactivation (3.10) non log-linéaire
3.8
point expérimental
résultat d’analyse d’une unité pour essai (3.34) par unité de masse, par unité de volume ou par unité de
surface
Note 1 à l'article: Les résultats de dénombrement peuvent être exprimés en log ou nombre le plus probable (NPP).
10
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.6, modifié — Dans la définition, «masse» remplace «poids» et les unités
ont été supprimées. Dans la Note 1 à l’article, «Pour des cas spécifiques» a été supprimé et «ou nombre
le plus probable (NPP)» remplace «NPP».]
2
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ISO 20976-2:2022(F)
3.9
germination
mécanisme dans lequel une spore bactérienne (3.1) commence sa transformation en cellule végétative
(3.36)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.9, modifié — «commence sa transformation en» remplace «germe pour
devenir une».]
3.10
cinétique d’inactivation
variation dans le temps de la concentration du microorganisme cible soumis à un procédé d’inactivation
3.11
paramètre d’inactivation
estimation mathématique qui décrit la résistance/sensibilité de l’organisme cible au traitement (3.35),
obtenue par l’ajustement de modèles primaires (3.18) et de modèles secondaires (3.24)
Note 1 à l'article: Des exemples de ces paramètres sont les valeurs D, δ et p pour les modèles primaires et z pour
les modèles secondaires.
3.12
potentiel d’inactivation
valeur Δ
destruction logarithmique
réduction logarithmique
2
différence dans la concentration logarithmique (log ufc/g, ou ml, ou cm ) du microorganisme cible
10
entre un point de temps antérieur et un point de temps postérieur, exprimée en log
10
Note 1 à l'article: Dans le présent document, le terme «potentiel d’inactivation» fait référence au type d’étude
d’inactivation et les termes «destruction logarithmique» et «réduction logarithmique» font référence au résultat
obtenu.
3.13
traitement d’inactivation
procédé utilisé pour détruire ou inactiver le microorganisme cible
3.14
inoculum
suspension microbienne à la concentration souhaitée utilisée pour contaminer les unités pour essai
(3.34)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.12]
3.15
valeur k
pente de la courbe d’inactivation
3.16
valeur p
paramètre décrivant la forme de la courbe d’inactivation
3.17
valeur de pH
mesure de la concentration d’acidité ou de basicité d’un matériau en solution aqueuse
[SOURCE: ISO 5127:2017, 3.12.2.29, modifié — Les notes à l’article ont été supprimées.]
3
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ISO 20976-2:2022(F)
3.18
modèle primaire
modèle mathématique décrivant les changements du dénombrement de la population microbienne en
fonction du temps
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.16]
3.19
laboratoire organisateur
laboratoire ayant la responsabilité de gérer les tests d’épreuve microbiologique (3.4)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.17]
3.20
installation pilote
lieu de fabrication utilisé pour réaliser une expérience ou un essai avant de la ou le reproduire à plus
grande échelle
3.21
installation de production
lieu où les produits sont fabriqués à grande échelle
3.22
échantillonnage
sélection d’une ou plusieurs unités ou portions d’aliment, de telle sorte que les unités ou portions
sélectionnées sont représentatives de cet aliment
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.18]
3.23
point d’échantillonnage
moment auquel les unités pour essai (3.34) sont prélevées pour analyses
Note 1 à l'article: Lors de l’évaluation de la cinétique d’inactivation (3.10), ces points sont représentés comme des
points expérimentaux (3.8) sur le graphique d’inactivation.
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.19, modifié — «prélevées pour analyses» remplace «analysées et qui est
représenté en tant que point expérimental sur le graphique de cinétique» et la Note 1 à l’article a été
ajoutée.]
3.24
modèle secondaire
modèle mathématique décrivant les effets des facteurs du procédé d’inactivation (par exemple,
température, pH, a ) sur les paramètres du modèle primaire (3.18) (par exemple, la valeur D, δ)
w
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.20, modifié — «du procédé d’inactivation» remplace «environnementaux»
et «(par exemple, la valeur D, δ)» remplace «(par exemple, le taux de croissance)».]
3.25
sporulation
mécanisme par lequel une cellule végétative (3.36) forme une spore
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.21]
3.26
substitut (surrogate)
microorganisme non pathogène ayant une capacité de survie (3.27) similaire ou supérieure à celle du
microorganisme pathogène, à la fois dans la matrice et dans les conditions de transformation étudiées
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ISO 20976-2:2022(F)
3.27
survie
état qui consiste à continuer à vivre ou à exister sans augmentation ou diminution significative de la
viabilité
3.28
niveau cible de réduction
niveau cible d’inactivation exprimé en log
10
3.29
t
0
moment auquel le traitement commence
3.30
t
fin
moment auquel le traitement est terminé
3.31
t
inoc
moment auquel le microorganisme est inoculé dans l’aliment
3.32
t
xD
durée de traitement nécessaire pour une réduction de x log du microorganisme cible
3.33
prise d’essai
échantillon représentatif mesuré (volume ou masse) prélevé sur l’unité pour essai (3.34) pour servir à
l’analyse
[SOURCE: ISO 6887-1:2017, 3.5, modifié — «l’unité pour essai pour servir à l’analyse» remplace
«l’échantillon pour laboratoire pour servir à la préparation de la suspension mère» et la Note 1 à l’article
a été supprimée.]
3.34
unité pour essai
quantité (volume ou masse) mesurée de l’aliment utilisé pour l’inoculation, le traitement (3.35) ultérieur
et l’analyse
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.24, modifié — «le traitement ultérieur et l’analyse» a été ajouté.]
3.35
traitement
tout procédé, toute formulation ou toute caractéristique de produit, ou une combinaison de ceux-ci,
destinés à inactiver le microorganisme cible
3.36
cellule végétative
état d’une forme microbienne qui est capable de croître dans des conditions environnementales
favorables
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.25]
3.37
activité de l’eau
a
w
rapport de la pression de vapeur d’eau dans la denrée alimentaire sur la pression de vapeur de l’eau
pure à la même température
[SOURCE: ISO 18787:2017, 3.1, modifié — «pression de vapeur d’eau dans la denrée alimentaire sur
la pression de vapeur de l’eau pure» remplace «pression partielle de vapeur d’eau en équilibre avec le
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produit analysé sur la pression saturante de vapeur d’eau en équilibre avec l’eau pure», et la formule et
les notes à l’article ont été supprimées.]
3.38
valeur z
modification du traitement (3.35) (par exemple, température, pH, a ) qui induit une variation de 10 fois
w
de la valeur D (3.6)
Note 1 à l'article: La température, le pH et a peuvent être indexés à la valeur z pour indiquer le traitement évalué.
w
4 Principe
Les études d’inactivation sont conçues pour déterminer les variations dans la concentration du
microorganisme cible pendant le test d’inactivation. Ces études peuvent être employées pour évaluer
si l’inactivation microbienne est importante ou non dans une denrée alimentaire et pour quantifier
la diminution du microorganisme cible dans des conditions de transformation et/ou une formulation
donnée(s) du produit alimentaire. Le champ et l’objectif de l’étude doivent être clairement spécifiés (par
exemple, évaluation/validation de l’efficacité du procédé alimentaire en tant que mesure de maîtrise,
évaluation de la stabilité et de la survie microbiennes), y compris le niveau cible de réduction et les
critères de décision. Le plan expérimental doit être en conformité avec cet objectif et doit tenir compte
des étapes du procédé et de la chaîne alimentaire pour lesquelles l’inactivation microbienne est évaluée.
La connaissance de l’exploitant du secteur alimentaire (par exemple, concernant les caractéristiques
et le procédé de production de ses produits) doit être combinée avec l’expertise en microbiologie
des aliments et sciences analytiques pour garantir la robustesse de l’étude (voir 14.3.2). Les études
d’inactivation utilisent de préférence le microorganisme cible. Dans les études de tests d’inactivation
réalisées dans les installations de production alimentaire, un substitut validé doit être utilisé à la place
[26]
du microorganisme pathogène cible .
Le laboratoire organisateur doit avoir des connaissances et des compétences en microbiologie des
aliments, sciences et technologies des aliments, ainsi qu’en statistique pour concevoir et réaliser les
études, interpréter les résultats et tirer les conclusions. Les analyses doivent être effectuées dans le
cadre d’un système d’assurance qualité (par exemple, ISO/IEC 17025).
Pour réaliser une étude de test d’inactivation, il convient de préparer l’inoculum de sorte que les
cellules ou spores microbiennes aient été adaptées aux conditions environnementales qui simulent
l’environnement de transformation des aliments, favorisant ainsi la réponse microbienne naturelle une
fois l’aliment inoculé.
La même souche microbienne peut présenter différentes formes en fonction du traitement (voir Figure 1)
[14]
. L
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.