ISO 14501:2007
(Main)Milk and milk powder — Determination of aflatoxin M1 content — Clean-up by immunoaffinity chromatography and determination by high-performance liquid chromatography
Milk and milk powder — Determination of aflatoxin M1 content — Clean-up by immunoaffinity chromatography and determination by high-performance liquid chromatography
ISO 14501│IDF 171:2007 specifies a method for the determination of aflatoxin M1 content in milk and milk powder. The limit of detection is 0,08 µg/kg for whole milk powder, i.e. 0,008 µg/l for reconstituted liquid milk. The method is also applicable to low fat milk, skimmed milk, low fat milk powder, and skimmed milk powder.
Lait et lait en poudre — Détermination de la teneur en aflatoxine M1 — Purification par chromatographie d'immunoaffinité et détermination par chromatographie en phase liquide à haute performance
L'ISO 14501| FIL 171:2007 spécifie une méthode pour le dosage de l'aflatoxine M1 dans le lait et le lait en poudre. La limite de détection se situe à 0,08 mg/kg de poudre de lait entier, ce qui correspond à 0,008 mg/l de lait liquide reconstitué. La méthode est également applicable au lait à faible teneur en matière grasse, au lait écrémé et au lait en poudre à faible teneur en matière grasse ou écrémé.
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 14501
IDF
171
Второе издание
2007-10-15
Молоко и сухое молоко. Определение
содержания афлатоксина M . Очистка
1
иммуноаффинной хроматографией и
определение с помощью
высокоэффективной жидкостной
хроматографии
Milk and milk powder — Determination of aflatoxin M content —
1
Clean-up by immunoaffinity chromatography and determination by high-
performance liquid chromatography
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочные номера
ISO 14501:2007(R)
IDF 171:2007(R)
©
ISO и IDF 2007
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 14501:2007(R)
IDF 171:2007(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или вывести на экран, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на загрузку интегрированных шрифтов в компьютер, на котором ведется редактирование. В случае загрузки
настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение лицензионных условий
фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованным для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO и IDF 2007
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO или IDF по соответствующему адресу, указанному ниже.
ISO copyright office International Dairy Federation
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20 Diamant Building • Boulevard Auguste Reyers 80 • B-1030 Brussels
Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88
Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail copyright@iso.org E-mail info@fil-idf.org
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2007 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 14501:2007(R)
IDF 171:2007(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией
национальных организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных
стандартов обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член,
заинтересованный в деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть
представленным в этом комитете. Международные правительственные и неправительственные
организации, имеющие связи с ISO, также принимают участие в работах. Что касается стандартизации
в области электротехники, ISO работает в тесном сотрудничестве с Международной
электротехнической комиссией (IEC).
Проекты международных стандартов разрабатываются по правилам, указанным в Директивах ISO/IEC,
Часть 2.
Главная задача технических комитетов состоит в разработке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам на
голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения, по
меньшей мере, 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Обращается внимание на возможность патентования некоторых элементов данного международного
стандарта. ISO не несет ответственности за идентификацию какого-либо или всех таких патентных
прав.
Международный стандарт ISO 14501|IDF 171 был подготовлен Техническим комитетом ISO/ТС 34,
Пищевые продукты, Подкомитетом SC 5, Молоко и молочные продукты, и Международной
федерацией молочных продуктов (IDF). Он публикуется совместно ISO и IDF.
Это второе издание ISO 14501|IDF 171 отменяет и заменяет первое издание (ISO 14501:1988), которое
было технически пересмотрено.
© ISO 2007 – Все права сохраняются iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 14501:2007(R)
IDF 171:2007(R)
Предисловие
Международная федерация производства молочных продуктов (IDF) является всемирной
федерацией молочного сектора в национальных комитетах каждой страны-члена IDF. Каждый
национальный комитет имеет право быть представленным в постоянных комитетах IDF, выполняющих
техническую работу. IDF сотрудничает с ISO в разработке стандартных методов анализа и отбора проб
молока и молочных продуктов.
Проекты международных стандартов, принятые рабочими группами и постоянными комитетами
рассылаются национальным комитетам на голосование. Их опубликование в качестве международных
стандартов требует одобрения не менее 50% национальных комитетов, принимающих участие в
голосовании.
Следует иметь в виду, что некоторые элементы настоящего международного стандарта могут быть
объектом патентных прав. ISO не может нести ответственность за идентификацию какого-либо одного
или всех патентных прав.
Международный стандарт ISO 14501IDF 171 был подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 34
Пищевые продукты, Подкомитетом SC 5 Молоко и молочные продукты и Международной
федерацией молочных продуктов (IDF). Этот стандарт публикуется совместно ISO и IDF.
Вся работа была проделана совместной рабочей группой IDF-ISO по Органическим загрязняющим
веществам Постоянного комитета по Методам анализа добавок и загрязняющих веществ при
поддержке руководителя этого проекта, г-на L. Sørensen (DK).
Это издание ISO 8870IDF 171 отменяет и заменяет IDF 171:1995, который был технически
пересмотрен.
iv © ISO 2007 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 14501:2007(R)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ
IDF 171:2007(R)
Молоко и сухое молоко. Определение содержания
афлатоксина M . Очистка иммуноаффинной
1
хроматографией и определение с помощью
высокоэффективной жидкостной хроматографии
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает метод для определения содержания афлатоксина
M в молоке и сухом молоке. Предел обнаружения составляет 0,08 мкг/кг для цельного сухого молока,
1
т.е., 0,008 мкг/л для восстановленного натурального молока.
Метод также применим для молока низкой жирности, снятого молока, сухого молока низкой жирности и
снятого сухого молока.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ
1 Для метода, описанного в данном документе, требуется использование растворов
афлатоксина M . Афлатоксины являются канцерогенами для человека. Следует иметь в
1
[4], [5]
виду заявление, сделанное Международным агентством по исследованию рака .
2 Лаборатория, в которой проводятся анализы, должна быть соответствующим образом
защищена от дневного света, и стандартные растворы афлатоксина следует хранить
защищенными от света, например, с помощью алюминиевой фольги.
3 Использование для водных растворов афлатоксина стеклянной посуды, не промытой в
кислоте (например, пробирки, пузырьки, колбы, мензурки, шприцы), может привести к
потери афлатоксина.
Кроме того перед использованием совершенно новой стеклянной посуды для водных
растворов афлатоксина ее следует опустить в разбавленную кислоту (например, серную
кислоту, 2 моль/л) на несколько часов, затем тщательно промыть дистиллированной водой
для удаления всех следов кислоты (контроль pH должен гарантировать его значение в
пределах от 6 до 8).
4 Следует проводить дезинфекционные процедуры для лабораторных отходов, таких как
твердые вещества, растворы в органических растворителях, водные растворы, пролитые
жидкости, и для стеклянной посуды, контактирующей с канцерогенными материалами.
Подходящие дезинфекционные процедуры разработаны и утверждены Международным
[4], [5]
агентством по исследованию рака .
2 Термины и определения
Применительно к настоящему документу используются следующие термины и определения.
2.1
содержание афлатоксина M
1
aflatoxin M content
1
концентрация или массовая доля веществ, определенная методом, установленным в этом
международном стандарте.
© ISO 2007 – Все права сохраняются 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 14501:2007(R)
IDF 171:2007(R)
ПРИМЕЧАНИЕ Концентрация афлатоксина M выражена в микрограммах на литр, а массовая доля в
1
микрограммах на килограмм.
3 Сущность метода
Афлатоксин M экстрагируют, пропуская анализируемую пробу через иммуноаффинную колонку,
1
которая содержит специфические антитела, связанные с твердым материалом субстрата.
Когда проба проходит через колонку, антитела селективно связываются с любым присутствующим
афлатоксином M (антигеном) и образуют комплекс антитело-антиген. Все другие компоненты
1
основного состав пробы вымываются из колонки водой. Затем афлатоксин M элюируют из колонки и
1
элюат собирают. Количество афлатоксина M , присутствующего в этом элюате, определяют методом
1
высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) вместе с флуориметрическим
детектированием.
4 Реактивы
Используют реактивы только признанной аналитической чистоты, если нет специальных указаний, и
только дистиллированную или деминерализованную воду.
4.1 Иммуноаффинная колонка.
Иммуноаффинная колонка должна содержать антитела относительно афлатоксина M . Максимальная
1
емкость колонки должна быть не менее 100 нг афлатоксина M (что соответствует 2 мкг/л, когда для
1
анализа используется проба объемом 50 мл). Выход должен быть не менее 80 % для афлатоксина M ,
1
когда применяется стандартный раствор, содержащий 4 нг токсина (что соответствует 80 нг/л при
использовании пробы объемом 50 мл). Можно использовать любую иммуноаффинную колонку,
удовлетворяющую вышеупомянутым техническим характеристикам. Работа колонок должна
проверяться регулярно и не менее одного раза для каждой партии колонок (см. процедуру в 4.1.1 и
4.1.2).
4.1.1 Контроль емкости.
Разбавляют водой 1,0 мл стандартного основного раствора афлатоксина M (4.4.2) до 50 мл. Хорошо
1
перемешивают и аккуратно наносят весь объем на иммуноаффинную колонку, следуя рекомендациям
по использованию колонок, предоставленным производителем. Моют колонку и элюируют токсин.
Определяют количество афлатоксина M , элюированного из колонки, методом HPLC после
1
приготовления подходящего разбавления окончательного элюата.
Вычисляют емкость для афлатоксина. Сравнивают результат с требованиями, данными в 4.1.
4.1.2 Контроль выхода.
С помощью пипетки (5.4) разбавляют водой 0,8 мл стандартного рабочего раствора афлатоксина M
1
концентрацией 0,005 мкг/мл (4.4.3) до 10 мл. Хорошо перемешивают и аккуратно наносят весь объем
на иммуноаффинную колонку, следуя рекомендациям по использованию колонок, предоставленным
производителем. Моют колонку и элюируют токсин. Определяют количество афлатоксина M ,
1
элюированного из колонки, методом HPLC после приготовления подходящего разбавления
окончательного элюата.
Вычисляют выход для афлатоксина. Сравнивают результат с требованиями, данными в 4.1.
4.2 Ацетонитрил, чистый, класс HPLC.
4.2.1 Раствор ацетонитрила, 25 %.
Добавляют 250 мл ацетонитрила (4.2) к 750 мл воды и перемешивают. Можно использовать другие
2 © ISO 2007 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 14501:2007(R)
IDF 171:2007(R)
объемы в такой же пропорции. Раствор (элюент) перед использованием дегазируют.
4.2.2 Раствор ацетонитрила, 10 %.
Добавляют 100 мл ацетонитрила (4.2) к 900 мл воды и перемешивают. Можно использовать другие
объемы в такой же пропорции. Раствор (элюент) перед использованием дегазируют.
4.3 Азот газообразный.
4.4 Стандартные растворы афлатоксина M .
1
4.4.1 Стандартный калибровочный раствор афлатоксина M
1
Приготовляют стандартный калибровочный раствор афлатоксина M путем растворения афлатоксина
1
M (C H O ) в ацетонитриле (4.2) для получения номинальной концентрации 10 мкг/мл. Определяют
1 17 12 7
фактическую концентрацию афлатоксина M путем измерения оптической плотности при длине волны
1
максимума поглощения раствора следующим образом.
Используют спектрофотометр (5.14) для записи оптической плотности стандартного калибровочного
раствора афлатоксина M относительно ацетонитрила (4.2), применяемого в качестве холостого
1
реактива, в диапазоне длин волн от 330 нм до 370 нм. Измеряют оптическую плотность, A, при длине
волны максимума поглощения, λ , близкой к 350 нм.
max
Вычисляют концентрацию, c , выраженную в микрограммах на миллилитр, используя Уравнение (1):
1
100
cA=×M× (1)
1
d×ε
где:
A числовое значение оптической плотности при λ ;
max
M молярная масса, в граммах на моль, афлатоксина M (M = 328 г/моль);
1
d оптическая длина пути, в сантиметрах (d = 1 см);
ε числовое значение коэффициента поглощения, в квадратных метрах на моль, токсина в
2 −1
ацетонитриле (ε = 1 985 м ·моль ).
4.4.2 Стандартный основной раствор афлатоксина M .
1
После проверки концентрации разбавляют стандартный калибровочный раствор афлатоксина M
1
(4.4.1) ацетонитрилом (4.2) до получения стандартного основного раствора афлатоксина M
1
концентрацией 0,1 мкг/мл. Стандартный основной раствор следует держать в хорошо закупоренном
пузырьке, обернутом алюминиевой фольгой для защиты от света.
Хранят стандартный основной раствор афлатоксина M в холодильнике при температуре от 1 °C до
1
5 °C в темноте. В таких условиях основной раствор устойчив как минимум в течение двух месяцев.
Если срок хранения стандартного основного раствора превышает два месяца, то перед его
использованием нужно определить концентрацию афлатоксина M . Если есть какие-либо изменения,
1
этот раствор отбраковывают и приготовляют свежий стандартный основной раствор.
4.4.3 Стандартные рабочие растворы афлатоксина M
1
Перед приготовлением стандартных рабочих растворов афлатоксина M дают стандартному
1
основному раствору (4.4.2) достигнуть температуры окружающей среды. Приготовляют стандартные
рабочие растворы в день использования.
© ISO 2007 – Все права сохраняются 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 14501:2007(R)
IDF 171:2007(R)
Разбавляют стандартный основной раствор афлатоксина M (4.4.2) 10 %-ным раствором ацетонитрила
1
(4.2.2) до получения концентрации афлатоксина M 0,005 мкг/мл.
1
Извлекают аликвоты разбавленного стандартного основного раствора для приготовления ряда
стандартных рабочих растворов, содержащих, например, 0,05 нг/мл, 0,10 нг/мл, 0,20 нг/мл и 0,40 нг/млl
афлатоксина M , путем разбавления 10 %-ным раствором ацетонитрила (4.2.2). Можно выбрать другие
1
окончательные разбавления в зависимости от объема инжекционной петли.
5 Оборудование
Используется обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее.
5.1 Одноразовые шприцы, емкостью 10 мл и 50 мл.
1)
5.2 Вакуумная система [т.е. колба Бюхнера, система Vac-Elut или шланговый насос].
5.3 Центрифуга, обеспечивающая радиальное ускорение не менее 2 000г.
5.4 Пипетки, емкостью 1,0 мл, 2,0 мл и 50,0 мл или подходящая автопипетка.
5.5 Стеклянные химические стаканы, емкостью 250 мл.
5.6 Мерная колба с одной меткой, емкостью 100 мл.
5.7 Термостаты водяные, способные поддерживать температуру 30 °C ± 2 °C, в интервале от 35 °C
до 37 °C и 50 °
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14501
IDF
171
Second edition
2007-10-15
Milk and milk powder — Determination of
aflatoxin M content — Clean-up by
1
immunoaffinity chromatography and
determination by high-performance liquid
chromatography
Lait et lait en poudre — Détermination de la teneur en aflatoxine M —
1
Purification par chromatographie d'immunoaffinité et détermination par
chromatographie en phase liquide à haute performance
Reference numbers
ISO 14501:2007(E)
IDF 171:2007(E)
©
ISO and IDF 2007
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 14501:2007(E)
IDF 171:2007(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. Neither the ISO Central
Secretariat nor the IDF accepts any liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies
and IDF national committees. In the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the ISO Central Secretariat at the
address given below.
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO and IDF 2007
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO or IDF at the respective
address below.
ISO copyright office International Dairy Federation
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20 Diamant Building • Boulevard Auguste Reyers 80 • B-1030 Brussels
Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88
Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail copyright@iso.org E-mail info@fil-idf.org
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Published in Switzerland
ii © ISO and IDF 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 14501:2007(E)
IDF 171:2007(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has
been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 14501⎪IDF 171 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO and
IDF.
This second edition of ISO 14501⎪IDF 171 cancels and replaces the first edition (ISO 14501:1998), which has
been technically revised.
© ISO and IDF 2007 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 14501:2007(E)
IDF 171:2007(E)
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a worldwide federation of the dairy sector with a National
Committee in every member country. Every National Committee has the right to be represented on the IDF
Standing Committees carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO in the development of
standard methods of analysis and sampling for milk and milk products.
Draft International Standards adopted by the Action Teams and Standing Committees are circulated to the
National Committees for voting. Publication as an International Standard requires approval by at least 50 % of
the IDF National Committees casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 14501⎪IDF 171 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO and
IDF.
All work was carried out by the Joint IDF-ISO Action Team on Organic contaminants of the Standing
Committee on Analytical methods for additives and contaminants under the aegis of its project leader,
Mr. L. Sørensen (DK).
This edition of ISO 14501⎪IDF 171 cancels and replaces IDF 171:1995, which has been technically revised.
iv © ISO and IDF 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 14501:2007(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 171:2007(E)
Milk and milk powder — Determination of aflatoxin M
1
content — Clean-up by immunoaffinity chromatography and
determination by high-performance liquid chromatography
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of aflatoxin M content in milk and milk
1
powder. The limit of detection is 0,08 µg/kg for whole milk powder, i.e. 0,008 µg/l for reconstituted liquid milk.
The method is also applicable to low fat milk, skimmed milk, low fat milk powder, and skimmed milk powder.
CAUTION
1 The method described in this protocol requires the use of solutions of aflatoxin M . Aflatoxins are
1
carcinogenic to humans. Attention is drawn to the statement made by the International Agency for
[4], [5]
Research on Cancer .
2 Protect the laboratory in which the analyses are performed adequately from daylight and keep
aflatoxin standard solutions protected from light, e.g. by using aluminium foil.
3 The use of non-acid-washed glassware (e.g. tubes, vials, flasks, beakers, syringes) for aqueous
aflatoxin solutions may cause loss of aflatoxin.
Moreover, brand new laboratory glassware, before coming into contact with aqueous solutions of
aflatoxin, should be soaked in dilute acid (e.g. sulfuric acid, 2 mol/l) for several hours, then rinsed
well with distilled water to remove all traces of acid (check to ensure pH is in the range 6 to 8).
4 Use decontamination procedures for laboratory wastes such as solid compounds, solutions in
organic solvents, aqueous solutions and spills, and for glassware coming into contact with
carcinogenic materials. Suitable decontamination procedures have been developed and validated
[4], [5]
by the International Agency for Research on Cancer .
2 Terms and definitions
For the purposes of this document the following terms and definitions apply.
2.1
aflatoxin M content
1
concentration or mass fraction of substances determined by the procedure specified in this International
Standard.
NOTE The aflatoxin M concentration is expressed in micrograms per litre and the mass fraction in micrograms per
1
kilogram.
3 Principle
Aflatoxin M is extracted by passing the test portion through an immunoaffinity column that contains specific
1
antibodies bound onto a solid support material.
© ISO and IDF 2007 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 14501:2007(E)
IDF 171:2007(E)
As the sample passes through the column, the antibodies are selectively bound with any aflatoxin M
1
(antigen) present and form an antibody-antigen complex. All other components of the sample matrix are
washed off the column with water. Then aflatoxin M is eluted from the column and the eluate is collected. The
1
amount of aflatoxin M present in this eluate is determined by means of high-performance liquid
1
chromatography (HPLC) coupled with fluorimetric detection.
4 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and only distilled or
demineralized water or water of equivalent purity.
4.1 Immunoaffinity column.
The immunoaffinity column shall contain antibodies against aflatoxin M . The column shall have a maximum
1
capacity of not less than 100 ng of aflatoxin M (which corresponds to 2 µg/l when a volume of 50 ml of a test
1
portion is applied). It shall give a recovery of not less than 80 % for aflatoxin M when a standard solution
1
containing 4 ng of toxin is applied (which corresponds to 80 ng/l when a volume of 50 ml of sample is applied).
Any immunoaffinity column meeting the performance specifications mentioned above can be used. The
performance of the columns shall be checked regularly and at least once for every batch of columns (see the
procedure in 4.1.1 and 4.1.2).
4.1.1 Capacity check.
Dilute 1,0 ml of aflatoxin M standard stock solution (4.4.2) to 50 ml with water. Mix well and apply the whole
1
volume to the immunoaffinity column carefully following the recommendations given by the manufacturer for
the use of columns. Wash the column and elute the toxin. Determine the amount of aflatoxin M eluted from
1
the column by HPLC after preparing a suitable dilution of the final eluate.
Calculate the capacity for the aflatoxin. Compare the result with the requirements given in 4.1.
4.1.2 Recovery check.
Use a pipette (5.4) to dilute 0,8 ml of aflatoxin M standard working solution of 0,005 µg/ml (4.4.3) to 10 ml
1
with water. Mix well and apply the whole volume to the immunoaffinity column carefully following the
recommendations given by the manufacturer for the use of columns. Wash the column and elute the toxin.
Determine the amount of aflatoxin M eluted from the column by HPLC after preparing a suitable dilution of
1
the final eluate.
Calculate the recovery for the aflatoxin. Compare the result with the requirements given in 4.1.
4.2 Acetonitrile, pure, HPLC grade.
4.2.1 Acetonitrile solution, 25 %.
Add 250 ml of acetonitrile (4.2) to 750 ml of water and mix. Other volumes in the same proportion may be
used. Degas the solution (eluent) before using it.
4.2.2 Acetonitrile solution, 10 %.
Add 100 ml of acetonitrile (4.2) to 900 ml of water and mix. Other volumes in the same proportion may be
used. Degas the solution before using it.
4.3 Nitrogen gas.
4.4 Aflatoxin M standard solutions.
1
4.4.1 Aflatoxin M standard calibration solution.
1
2 © ISO and IDF 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 14501:2007(E)
IDF 171:2007(E)
Prepare an aflatoxin M standard calibration solution by dissolving aflatoxin M (C H O ) in acetonitrile (4.2)
1 1 17 12 7
to give a nominal concentration of 10 µg/ml. Determine the actual aflatoxin M concentration by measurement
1
of the absorbance at the maximum absorption wavelength of the solution as follows.
Use the spectrophotometer (5.14) to record the absorbance of the aflatoxin M standard calibration solution
1
against acetonitrile (4.2) as blank at wavelengths between 330 nm and 370 nm. Measure the absorbance, A,
at its maximum absorption wavelength, λ , which is close to 350 nm.
max
Calculate the concentration, c , expressed in micrograms per millilitre, by using Equation (1):
1
100
cA=×M× (1)
1
d×ε
where:
A is the numerical value of the absorbance at λ ;
max
M is the molar mass, in grams per mole, of aflatoxin M (M = 328 g/mol);
1
d is the optical pathlength, in centimetres (d = 1 cm);
ε is the numerical value of the absorption coefficient, in square metres per mole, of the toxin in
2 −1
acetonitrile (ε = 1 985 m ·mol ).
4.4.2 Aflatoxin M standard stock solution.
1
After checking its concentration, dilute the aflatoxin M standard calibration solution (4.4.1) with acetonitrile
1
(4.2) to an aflatoxin M standard stock solution of 0,1 µg/ml. The standard stock solution shall be well
1
stoppered and wrapped in aluminium foil to protect it from light.
Store the aflatoxin M standard stock solution in a refrigerator at a temperature between 1 °C and 5 °C in the
1
dark. Under these conditions the stock solution is stable for at least two months. If the standard stock solution
is more than two months old, determine the aflatoxin M concentration before use. If there is any change,
1
discard the solution and prepare a fresh standard stock solution.
4.4.3 Aflatoxin M standard working solutions.
1
Before preparing the aflatoxin M standard working solutions, allow the standard stock solution (4.4.2) to
1
attain ambient temperature. Prepare the standard working solutions on the day of use.
Dilute the aflatoxin M standard stock solution (4.4.2) with the 10 % acetonitrile solution (4.2.2) to an aflatoxin
1
M concentration of 0,005 µg/ml.
1
Remove aliquots of the diluted standard stock solution to prepare a series of standard working solutions
containing, for example, 0,05 ng/ml, 0,10 ng/ml, 0,20 ng/ml, and 0,40 ng/ml of aflatoxin M by diluting with the
1
10 % acetonitrile solution (4.2.2). Other final dilutions may be chosen, depending on the injection loop volume.
5 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
5.1 Disposable syringes, of capacities 10 ml and 50 ml.
© ISO and IDF 2007 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 14501:2007(E)
IDF 171:2007(E)
1)
5.2 Vacuum system [i.e. Büchner flask, Vac-Elut system or peristaltic pump].
5.3 Centrifuge, capable of producing a radial acceleration of at least 2 000g.
5.4 Pipettes, of capacities 1,0 ml, 2,0 ml and 50,0 ml or suitable autopipette.
5.5 Glass beakers, of capacity 250 ml.
5.6 One-mark volumetric flask, of capacity 100 ml.
5.7 Water baths, capable of operating at 30 °C ± 2 °C, at between 35 °C and 37 °C and 50 °C ± 5 °C.
1)
5.8 Filter paper, Whatman No. 4 or equivalent.
5.9 Graduated conical glass tubes, with ground glass neck and stopper of capacities 5 ml, 10 ml and
20 ml.
5.10 HPLC apparatus, equipped with a pulse-free pump, capable of prod
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 14501
FIL
171
Deuxième édition
2007-10-15
Lait et lait en poudre — Détermination de
la teneur en aflatoxine M — Purification
1
par chromatographie d'immunoaffinité et
détermination par chromatographie en
phase liquide à haute performance
Milk and milk powder — Determination of aflatoxin M content —
1
Clean-up by immunoaffinity chromatography and determination by
high-performance liquid chromatography
Numéros de référence
ISO 14501:2007(F)
FIL 171:2007(F)
©
ISO et FIL 2007
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 14501:2007(F)
FIL 171:2007(F)
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées
acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO et la FIL
déclinent toute responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info
du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir
l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO et les comités nationaux de la FIL. Dans le cas peu probable où
surviendrait un problème d'utilisation, veuillez en informer le Secrétariat central de l'ISO à l'adresse donnée ci-dessous.
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO et FIL 2007
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
soit de l'ISO soit de la FIL, à l'une ou l'autre des adresses ci-après.
ISO copyright office Fédération Internationale de Laiterie
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20 Diamant Building • Boulevard Auguste Reyers 80 • B-1030 Bruxelles
Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88
Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail copyright@iso.org E-mail info@fil-idf.org
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Publié en Suisse
ii © ISO et FIL 2007 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 14501:2007(F)
FIL 171:2007(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 14501⎪FIL 171 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL). Elle est publiée conjointement
par l'ISO et la FIL.
Cette deuxième édition de l'ISO 14501⎪FIL 171 annule et remplace la première édition (ISO 14501:1998), qui
a fait l'objet d'une révision technique.
© ISO et FIL 2007 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 14501:2007(F)
FIL 171:2007(F)
Avant-propos
La FIL (Fédération internationale de laiterie) est une fédération mondiale du secteur laitier avec un Comité
National dans chacun de ses pays membres. Chaque Comité National a le droit de faire partie des Comités
permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux techniques. La FIL collabore avec l'ISO pour
l'élaboration de méthodes normalisées d'analyse et d'échantillonnage pour le lait et les produits laitiers.
Les projets de Normes internationales adoptés par les Équipes d'Action et les Comités permanents sont
soumis aux Comités Nationaux pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert
l'approbation de 50 % au moins des Comités Nationaux de la FIL votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 14501⎪FIL 171 a été élaborée par la Fédération internationale de laiterie (FIL) et le comité technique
ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Elle est publiée conjointement
par la FIL et l'ISO.
L'ensemble des travaux a été confié à l'Équipe d'Action mixte ISO/FIL, Contaminants biologiques, du Comité
permanent chargé des Méthodes analytiques pour additifs et contaminants, sous la conduite de son chef de
projet, Monsieur L. Sørensen (DK).
Cette édition de l'ISO 14501⎪FIL 171 annule et remplace la FIL 171:1995, qui a fait l'objet d'une révision
technique.
iv © ISO et FIL 2007 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 14501:2007(F)
NORME INTERNATIONALE
FIL 171:2007(F)
Lait et lait en poudre — Détermination de la teneur en aflatoxine
M — Purification par chromatographie d'immunoaffinité et
1
détermination par chromatographie en phase liquide à haute
performance
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode pour le dosage de l'aflatoxine M dans le lait et le lait
1
en poudre. La limite de détection se situe à 0,08 µg/kg de poudre de lait entier, ce qui correspond à 0,008 µg/l
de lait liquide reconstitué.
La méthode est également applicable au lait à faible teneur en matière grasse, au lait écrémé et au lait en
poudre à faible teneur en matière grasse ou écrémé.
AVERTISSEMENT
1 La méthode décrite dans la présente Norme internationale nécessite l'utilisation de solutions
d'aflatoxine M . Les aflatoxines présentent un danger cancérigène pour l'homme. On attire
1
l'attention sur la déclaration de l'Agence internationale pour la recherche sur le cancer
[4], [5]
(OMS) .
2 Protéger correctement de la lumière du jour le laboratoire dans lequel sont effectuées les
analyses et conserver les solutions étalons d'aflatoxine à l'abri de la lumière (par exemple à l'aide
d'une feuille d'aluminium).
3 L'utilisation d'une verrerie pour les solutions aqueuses d'aflatoxine (par exemple tubes, flacons,
ballons et fioles, béchers, seringues) lavée avec des produits non acides peut provoquer une
perte d'aflatoxine.
De plus, il convient de laisser tremper pendant plusieurs heures dans de l'acide dilué (par
exemple de l'acide sulfurique à 2 mol/l) la verrerie neuve de laboratoire entrant en contact avec
les solutions aqueuses d'aflatoxine, puis de la rincer à l'eau distillée afin de retirer toute trace
d'acide (vérifier que le pH se situe entre 6 et 8).
4 Utiliser une méthode de décontamination des déchets de laboratoire tels que composés solides,
solutions dans les solvants organiques, verrerie, solutions aqueuses et pilules. La méthode de
décontamination a été mise au point et validée dans le cadre d'un programme de l'Agence
[4], [5]
internationale pour la recherche contre le cancer (OMS) .
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
teneur en aflatoxine M
1
concentration ou fraction massique de substances, déterminée selon le mode opératoire spécifié dans la
présente Norme internationale
NOTE La concentration en aflatoxine M est exprimée en microgrammes par litre et la fraction massique en
1
microgrammes par kilogramme.
© ISO et FIL 2007 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 14501:2007(F)
FIL 171:2007(F)
3 Principe
L'aflatoxine M est extraite par passage de la prise d'essai à travers une colonne d'immunoaffinité qui contient
1
des anticorps spécifiques fixés sur un support solide.
Au fur et à mesure que l'échantillon traverse la colonne, les anticorps se lient de manière sélective à toute
aflatoxine M (antigène) présente et constituent un complexe anticorps-antigène. Tous les autres composants
1
de la matrice échantillon sont éliminés de la colonne avec de l'eau. L'aflatoxine M est ensuite éluée de la
1
colonne et l'éluat recueilli. La quantité d'aflatoxine M présente dans l'éluat est déterminée par
1
chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) associée à une détection fluorimétrique.
4 Réactifs
Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l'eau distillée
ou déminéralisée ou de l'eau de pureté équivalente.
4.1 Colonne d'immunoaffinité.
La colonne d'immunoaffinité doit contenir des anticorps antiaflatoxine M . La capacité ne doit pas être
1
inférieure à 100 ng d'aflatoxine M (ce qui correspond à 2 µg/l pour 50 ml d'une prise d'essai utilisés). Son
1
taux de récupération ne doit pas être inférieur à 80 % d'aflatoxine M en cas d'utilisation d'une solution étalon
1
contenant 4 ng de toxine (ce qui correspond à 80 ng/l pour 50 ml d'échantillon utilisés). Toute colonne
d'immunoaffinité répondant aux spécifications de performance susmentionnées peut être utilisée. Les
performances des colonnes doivent être contrôlées régulièrement et au moins une fois pour chaque lot de
colonnes (voir le mode opératoire en 4.1.1 et en 4.1.2).
4.1.1 Contrôle de la capacité.
Diluer 1,0 ml de solution étalon de garde d'aflatoxine M (4.4.2) à 50 ml avec de l'eau. Bien mélanger et
1
verser la totalité du volume dans la colonne d'immunoaffinité en suivant soigneusement les recommandations
données par le fabricant pour l'utilisation des colonnes. Laver la colonne et éluer la toxine. Déterminer la
quantité d'aflatoxine M éluée de la colonne par CLHP après avoir préparé la dilution appropriée de l'éluat
1
final.
Calculer la capacité d'aflatoxine. Comparer le résultat à la spécification donnée en 4.1.
4.1.2 Contrôle du taux de récupération.
À l'aide d'une pipette (5.4), diluer 0,8 ml de la solution étalon de travail d'aflatoxine M à 0,005 µg/ml (4.4.3) à
1
10 ml avec de l'eau. Bien mélanger et verser la totalité du volume dans la colonne d'immunoaffinité en suivant
soigneusement les recommandations données par le fabricant pour l'utilisation des colonnes. Laver la
colonne et éluer la toxine. Déterminer la quantité d'aflatoxine M éluée de la colonne par CLHP après avoir
1
préparé la dilution appropriée de l'éluat final.
Calculer le taux de récupération d'aflatoxine. Comparer le résultat à la spécification donnée en 4.1.
4.2 Acétonitrile, pur, qualité pour CLHP.
4.2.1 Solution d'acétonitrile, 25 %.
Ajouter 250 ml d'acétonitrile (4.2) à 750 ml d'eau et mélanger. On peut utiliser d'autres volumes dans les
mêmes proportions. Dégazer la solution (éluant) avant usage.
4.2.2 Solution d'acétonitrile, 10 %.
Ajouter 100 ml d'acétonitrile (4.2) à 900 ml d'eau et mélanger. On peut utiliser d'autres volumes dans les
mêmes proportions. Dégazer la solution avant usage.
2 © ISO et FIL 2007 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 14501:2007(F)
FIL 171:2007(F)
4.3 Azote gazeux.
4.4 Solutions étalons d'aflatoxine M .
1
4.4.1 Solution étalon mère d'aflatoxine M .
1
Préparer la solution étalon mère d'aflatoxine M en diluant de l'aflatoxine M (C H O ) dans de
1 1 17 12 7
l'acétonitrile (4.2) de manière à obtenir une solution ayant une concentration nominale de 10 µg/ml.
Déterminer sa concentration réelle en mesurant l'absorbance à la longueur d'onde correspondant à
l'absorption maximale de la manière suivante.
À l'aide du spectrophotomètre (5.14), enregistrer l'absorbance de la solution étalon par rapport à
l'acétonitrile (4.2) comme blanc entre 340 nm et 370 nm. Mesurer l'absorbance, A, à la longueur d'onde
correspondant à son absorption maximale, λ , qui est proche de 350 nm.
max
Calculer la concentration, c , exprimée en µg/ml, à l'aide de l'Équation (1):
1
100
cA=×M× (1)
1
d × ε
où
A est la valeur numérique de l'absorbance à λ ;
max
M est la masse molaire de l'aflatoxine M (M = 328);
1
d est le parcours optique (d = 1 cm);
2 −1
ε est la valeur numérique du coefficient d'absorption de la toxine dans l'acétonitrile, en m ·mol
2 −1
(ε = 1 985 m ·mol ).
4.4.2 Solution étalon de garde d'aflatoxine M .
1
Après avoir vérifié sa concentration, diluer la solution étalon mère d'aflatoxine M (4.4.1) avec de
1
l'acétonitrile (4.2) de façon à obtenir une solution étalon de garde d'aflatoxine M de 0,1 µg/ml. La fiole
1
contenant la solution étalon de garde doit être bien bouchée et enveloppée dans une feuille d'aluminium à
l'abri de la lumière.
Conserver la solution étalon de garde d'aflatoxine M dans l'obscurité au réfrigérateur à une température
1
comprise entre 1 °C et 5 °C. Dans ces conditions, la solution étalon est stable pendant 2 mois au moins.
Après deux mois, avant tout emploi de la solution, déterminer la concentration en aflatoxine M . Si celle-ci a
1
varié, rejeter la solution et en préparer une nouvelle.
4.4.3 Solutions étalons de travail d'aflatoxine M .
1
Avant de préparer les solutions étalons de travail d'aflatoxine M , laisser la solution étalon de garde (4.4.2)
1
parvenir à température ambiante avant de prélever les parties aliquotes de solution en vue de la dilution.
Préparer les solutions étalons de travail le jour de leur utilisation.
Diluer la solution étalon de garde (4.4.2) avec la solution d'acétonitrile 10 % (4.2.2), de façon à arriver à une
teneur en aflatoxine M de 0,005 µg/ml.
1
Utiliser cette solution étalon de garde diluée pour la préparation d'une série de dilutions appropriées de
solutions étalons de travail d'aflatoxine M , afin d'obtenir, en fonction du volume de la boucle d'injection, des
1
solutions étalons de travail de 0,05 ng, de 0,1 ng, de 0,2 ng et de 0,4 ng d'aflatoxine M par ml. Diluer à l'aide
1
de la solution d'acétonitrile 10 % (4.2.2).
© ISO et FIL 2007 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 14501:2007(F)
FIL 171:2007(F)
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, notamment, les éléments suivants.
5.1 Seringues à usage unique, de 10 ml et de 50 ml de capacité respective.
1)
5.2 Installation de vide (par exemple ballon de Büchner, système Vac-Elut ou pompe péristaltique).
5.3 Centrifugeuse, pouvant provoquer une accélération radiale de 2 000g au minimum.
5.4 Pipettes, de 1,0 ml, de 2,0 ml et de 50,0 ml de capacité respective, ou pipette automatique
appropriée.
5.5 Béchers en verre, de 250 ml de capacité.
5.6 Fiole jaugée à un trait, de 100 ml de capacité.
5.7 Bains d'eau, capables de fonctionner à 30 °C ± 2 °C, entre 35 °C et 37 °C et à 50 °C ± 5 °C.
1)
5.8 Papier-filtre, Whatman n° 4 ou équivalent.
5.9 Tubes en verre coniques gradués, à col et à bouchon en verre rodé, de 5 ml, de 10 ml et de 20 ml de
capacité respective.
5.10 Appareillage pour CLHP, équipé d'une pompe à flux régul
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.