ISO 8968-1:2001

Milk — Determination of nitrogen content — Part 1: Kjeldahl method

ISO 8968-1|IDF 20-1:2001 specifies a method for the determination of the nitrogen content of liquid milk, whole or skimmed, by the Kjeldahl principle.

Lait — Détermination de la teneur en azote — Partie 1: Méthode Kjeldahl

L'ISO 8968-1|FIL 20-1:2001 spécifie une méthode pour la détermination de la teneur en azote du lait liquide, entier ou écrémé, selon le principe de Kjeldahl.

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 19-Dec-2001
• Withdrawal Date: 19-Dec-2001
• ICS: 67.100.10 - Milk and processed milk products
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Completion Date: 03-Feb-2014

Relations

• Revised: ISO 8968-1:2014 - Milk and milk products — Determination of nitrogen content — Part 1: Kjeldahl principle and crude protein calculation
• Effective Date: 26-Nov-2011
• Consolidates: ISO 7823-1:1991 - Poly(methyl methacrylate) sheets — Types, dimensions and characteristics — Part 1: Cast sheets
• Effective Date: 06-Jun-2022

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 8968-1
IDF
20-1
First edition
2001-12-15


Milk — Determination of nitrogen
content —
Part 1:
Kjeldahl method
Lait — Détermination de la teneur en azote
Partie 1: Méthode Kjeldahl




Reference numbers
ISO 8968-1:2001(E)
IDF 20-1:2001(E)
©
 ISO and IDF 2001

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ISO 8968-1:2001(E)
IDF 20-1:2001(E)
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or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO or IDF at the respective address below.
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Printed in Switzerland

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IDF 20-1:2001(E)
Contents Page
Foreword.iv
1 Scope .1
2 Normative reference.1
3 Term and definition .1
4 Principle.1
5 Reagents.2
6 Apparatus .3
7 Sampling.3
8 Preparation of test sample.4
9 Procedure .4
9.1 Test portion and pretreatment .4
9.2 Determination.4
9.3 Blank test.5
9.4 Recovery tests .6
10 Calculation and expression of results.6
10.1 Calculation of nitrogen content .6
10.2 Calculation of crude protein content.7
11 Precision.7
11.1 Interlaboratory test.7
11.2 Repeatability .8
11.3 Reproducibility.8
12 Test report .8
Annex A (informative) Modified procedure for analysis of other milk products when a separate
standard for that product does not exist .9
Bibliography.11


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ISO 8968-1:2001(E)
IDF 20-1:2001(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards adopted
by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this part of ISO 8968IDF 20 may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
International Standard ISO 8968-1IDF 20-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products,
Subcommittee SC 5, Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with
AOAC International. It is being published jointly by ISO and IDF and separately by AOAC International.
ISO 8968IDF 20 consists of the following parts, under the general title Milk — Determination of nitrogen content:
— Part 1: Kjeldahl method
— Part 2: Block-digestion method (Macro method)
— Part 3: Block-digestion method (Semi-micro rapid routine method)
— Part 4: Determination of the non-protein-nitrogen content
— Part 5: Determination of the protein-nitrogen content
Annex A of this part of ISO 8968IDF 20 is for information only.
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ISO 8968-1:2001(E)
IDF 20-1:2001(E)
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a worldwide federation of the dairy sector with a National Committee in
every member country. Every National Committee has the right to be represented on the IDF Standing Committees
carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO and AOAC International in the development of standard
methods of analysis and sampling for milk and milk products.
Draft International Standards adopted by the Action Teams and Standing Committees are circulated to the National
Committees for voting. Publication as an International Standard requires approval by at least 50 % of National
Committees casting a vote.
International Standard ISO 8968-1IDF 20-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products,
Subcommittee SC 5, Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with
AOAC International. It is being published jointly by ISO and IDF and separately by AOAC International.
All work was carried out by the Joint ISO/IDF/AOAC Action Team, Nitrogen compounds, under the aegis of its
project leader, Mr D.M. Barbano (US).

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ISO 8968-1:2001(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 20-1:2001(E)

Milk — Determination of nitrogen content —
Part 1:
Kjeldahl method
WARNING — The use of this part of ISO 8968ΩΩΩΩIDF 20 may involve the use of hazardous materials,
operations, and equipment. This standard does not purport to address all the safety risks associated with
its use. It is the responsibility of the user of this standard to establish appropriate safety and healthy
practices and determine the applicability of local regulatory limitations prior to use.
1 Scope
This part of ISO 8968ΩIDF 20 specifies a method for the determination of the nitrogen content of liquid milk, whole
or skimmed, by the Kjeldahl principle.
2 Normative reference
The following normative document contains provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this part of ISO 8968ΩIDF 20. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this part of ISO 8968ΩIDF 20 are encouraged
to investigate the possibility of applying the most recent edition of the normative document indicated below. For
undated references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC
maintain registers of currently valid International Standards.
ISO 385-1, Laboratory glassware — Burettes — Part 1: General requirements
3 Term and definition
For the purposes of this part of ISO 8968ΩIDF 20, the following term and definition apply.
3.1
nitrogen content
mass fraction of nitrogen determined by the procedure specified in this part of ISO 8968ΩIDF 20
NOTE The nitrogen content is expressed as a percentage by mass.
4 Principle
A test portion is digested with a mixture of concentrated sulfuric acid and potassium sulfate, using copper(II) sulfate
as a catalyst to thereby convert organic nitrogen present to ammonium sulfate. The function of the potassium
sulfate is to elevate the boiling point of the sulfuric acid and to provide a stronger oxidizing mixture for digestion.
Excess sodium hydroxide is added to the cooled digest to liberate ammonia.The liberated ammonia is distilled into
excess boric acid solution then titrated with hydrochloric acid. The nitrogen content is calculated from the amount of
ammonia produced.
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ISO 8968-1:2001(E)
IDF 20-1:2001(E)
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled or demineralized water
or water of equivalent purity.
5.1 Potassium sulfate (K SO ), nitrogen free.
2 4
5.2 Copper(II) sulfate solution, c(CuSO ) = 5,0 g per 100 ml.
4
Dissolve 5,0 g of copper(II) sulfate pentahydrate (CuSO ⋅5H O) in water in a 100 ml one-mark volumetric flask.
4 2
Dilute to the mark with water and mix.
5.3 Sulfuric acid (H SO ), with a mass fraction of at least 95 % to 98 %, nitrogen free (р = 1,84 g/ml
2 4 20
approximately).
5.4 Sodium hydroxide solution (NaOH), nitrogen free, containing 50 g of sodium hydroxide per 100 g of
solution.
5.5 Indicator solution
Dissolve 0,1 g of methyl red in 95 % (volume fraction) ethanol. Dilute to 50 ml with the ethanol. Dissolve 0,5 g of
bromocresol green in 95 % (volume fraction) ethanol. Dilute to 250 ml with the ethanol. Mix amounts of one part of
the methyl red solution with five parts of the bromocresol green solution or combine and mix all of both solutions.
5.6 Boric acid solution, c(H BO ) = 40,0 g/l.
3 3
Dissolve 40,0 g of boric acid in 1 litre of hot water in a 1 000 ml one-mark volumetric flask. Allow the flask and its
contents to cool to 20 °C. Dilute to the mark with water, add 3 ml of the indicator solution (5.5) and mix. Store the
solution, which will be light orange in colour, in a borosilicate glass bottle. Protect the solution from light and
sources of ammonia fumes during storage.
If using the electronic pH endpoint titration, the addition of the indicator solution to the boric acid solution may be
omitted. On the other hand, the change in colour may also be used as a check of proper titration procedures.
5.7 Hydrochloric acid standard volumetric solution, c(HCI) = (0,1 ± 0,000 5) mol/l.
It is recommended that this material be purchased prestandardized by the manufacturer to meet or exceed the
above specification.
NOTE Often systematic errors (which can be avoided) introduced by an analyst diluting a concentrated stock acid and then
determining the molarity of the acid, can reduce the reproducibility of the method. The analyst should not use a solution for
titration that has a higher concentration than 0,1 mol/l, because this will reduce the total titration volume per sample and the
uncertainty in readability of the burette will become a larger percentage of the value. This will have a negative impact on the
repeatability and reproducibility of the method. The same issues and additional sources of error arise when another acid (e.g.
sulfuric acid) is substituted for hydrochloric acid. Thus, these substitutions are not recommended.
5.8 Ammonium sulfate [(NH ) SO ], minimum assay 99,9 % (mass fraction) on dried material.
4 2 4
Immediately before use, dry the ammonium sulfate at 102 °C ± 2 °C for not less than 2 h. Cool to room temperature
in a desiccator.
5.9 Tryptophan (C H N O ) or lysine hydrochloride (C H ClN O ), minimum assay 99 % (mass fraction).
11 12 2 2 6 15 2 2
Do not dry these reagents in an oven before use.
5.10 Sucrose, with a nitrogen content of not more than 0,002 % (mass fraction).
Do not dry the sucrose in an oven before use.
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ISO 8968-1:2001(E)
IDF 20-1:2001(E)
6 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1 Water bath, capable of being maintained at 38 °C ± 2 °C
6.2 Kjeldahl flasks, of capacity 500 ml or 800 ml.
6.3 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,1 mg.
6.4 Boiling aids, e.g. glowed pumice, zinc dust, hard pieces of porcelain or high-purity amphoteric alundum (i.e.
carbarundum) granules, plain, mesh size 10.
Do not reuse the aids.
NOTE Glass beads of approximately 5 mm diameter are sometimes used, but they might not promote as efficient boiling
as the alundum granules and more foaming problems can be encountered during digestion with glass beads.
6.5 Burette or automatic pipette, capable of delivering 1,0 ml portions of the copper sulfate solution (5.2).
6.6 Graduated measuring cylinders, of capacity 50 ml, 100 ml and 500 ml.
6.7 Digestion apparatus, to hold the Kjeldahl flasks (6.2) in an inclined position (at approximately 45°), with
electric heaters or gas burners that do not heat the flasks above the level of their contents, and with a fume
extraction system.
The heater source should be adjustable to control the maximum heater setting to be used during digestion. Preheat
the heat source at the heater setting for evaluation. In the case of a gas heater, the preheated period shall be
10 min, and for an electric heater it shall be 30 min. For each of the heaters, determine the heater setting that
brings 250 ml of water including 5 to 10 boiling aids with an initial temperature of 25 °C to its boiling point in 5 min
to 6 min. This is the maximum heater setting to be used during digestion.
6.8 Distillation apparatus, made of borosilicate glass or other suitable material to which can be fitted a Kjeldahl
flask (6.2) consisting of an efficient splash-head connected to an efficient condenser with straight inner tube and an
outlet tube attached to its lower end.
The connecting tubing and stopper(s) shall be close fitting and preferably made of neoprene.
6.9 Conical flasks, of capacity 500 ml, graduated at every 200 ml.
6.10 Burette, of capacity 50 ml, graduated at least at every 0,01 ml, complying with the requirements of
ISO 385-1, class A.
Alternatively, an automatic burette may be used if it fulfils the same requirements.
6.11 Automatic titrator provided with a pH-meter
The pH-meter should be correctly calibrated in the range of pH 4 to 7 following normal laboratory pH-calibration
procedures.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this part of ISO 8968ΩIDF 20. A recommended sampling method is
given in ISO 707.
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
© ISO and IDF 2001 – All rights reserved 3

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ISO 8968-1:2001(E)
IDF 20-1:2001(E)
8 Preparation of test sample
Warm the test sample in the water bath (6.1) set at 38 °C. Gently mix the test sample thoroughly by repeatedly
inverting the sample bottle without causing frothing or churning. Cool the sample to room temperature immediately
prior to weighing the test portion (9.1).
NOTE For advice on sample size to apply this method to dairy products other than milk, see annex A.
9 Procedure
9.1 Test portion and pretreatment
Add to a clean and dry Kjeldahl flask (6.2), 5 to 10 boiling aids (6.4), 15,0 g of the potassium sulfate (5.1), 1,0 ml of
the copper(II) sulfate solution (5.2), approximately 5 ml ± 0,1 ml of the prepared test sample (clause 8), weighed to
the nearest 0,1 mg, and 25 ml of the sulfuric acid (5.3). Use the sulfuric acid to wash down any copper(II) sulfate
solution, potassium sulfate or test portion left on the neck of the flask. If any charred digest still is left on the neck,
rinse it with a small amount of water. Gently, mix the contents of the Kjeldahl flask.
NOTE For advice on test portion size to apply this method to dairy products other than milk, see annex A of this part.
9.2 Determination
9.2.1 Digestion
Turn on the fume extraction system of the digestion apparatus (6.7) prior to beginning the digestion. Heat the
Kjeldahl flask and its contents (9.1) on the digestion apparatus using a heater setting low enough such that charred
digest does not foam up the neck of the Kjeldahl flask. Digest at this heat setting until white fumes appear in the
flask after approximately 20 min. Increase the heater setting to half-way to the maximum setting determined in 6.7
and continue the heating for 15 min. At the end of the 15 min period increase the heat to the maximum setting
determined in 6.7. After the digest clears (clear with light blue-green colour), continue boiling for 1 h to 1,5 h at
maximum setting. If the liquid does not boil, the final burner setting may be too low. The total digestion time will be
between 1,8 h and 2,25 h.
To determine the specific boiling time required for analysis conditions in a particular laboratory using a particular
set of apparatus, select for milk analysis a high-protein, high-fat milk sample and determine its protein content
using different boiling times (1 h to 1,5 h) after clearing. The mean protein result increases with increasing boiling
time, becomes consistent and then decreases when the boiling time is too long. Select the boiling time that
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 8968-1
FIL
20-1
Première édition
2001-12-15


Lait — Détermination de la teneur en
azote —
Partie 1:
Méthode Kjeldahl
Milk — Determination of nitrogen content —
Part 1: Kjeldahl method




Numéros de référence
ISO 8968-1:2001(F)
FIL 20-1:2001(F)
©
 ISO et FIL 2001

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 8968-1:2001(F)
FIL 20-1:2001(F)
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soit de la FIL à l’adresse respective ci-après.
ISO copyright office Fédération Internationale de Laiterie
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Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88
Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail [e-mail] E-mail [e-mail]
Web www.iso.ch Web www.fil-idf.org
Imprimé en Suisse

ii © ISO et FIL 2001 – Tous droits réservés

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ISO 8968-1:2001(F)
FIL 20-1:2001(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d'application .1
2 Référence normative .1
3 Terme et définition.1
4 Principe.1
5 Réactifs.2
6 Appareillage .3
7 Échantillonnage .4
8 Préparation de l'échantillon pour essai .4
9 Mode opératoire.4
9.1 Prise d'essai et prétraitement.4
9.2 Détermination.4
9.3 Essai à blanc .6
9.4 Essais de récupération .6
10 Calcul et expression des résultats .7
10.1 Calcul de la teneur en azote .7
10.2 Calcul de la teneur en matière azotée totale.8
11 Fidélité .8
11.1 Essai interlaboratoires.8
11.2 Répétabilité .8
11.3 Reproductibilité .8
12 Rapport d'essai.9
Annexe A (informative) Mode opératoire modifié pour l'analyse d'autres produits laitiers lorsqu'une
norme particulière n'existe pas pour ces produits .10
Bibliographie.12


© ISO et FIL 2001 – Tous droits réservés iii

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ISO 8968-1:2001(F)
FIL 20-1:2001(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments de la présente partie de l'ISO 8968FIL 20 peuvent
faire l’objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour
responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
La Norme internationale ISO 8968-1FIL 20-1 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits
alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL), en
collaboration avec l’AOAC International. Elle est publiée conjointement par l’ISO et la FIL, et séparément par
l’AOAC International.
L'ISO 8968FIL 20 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Lait — Détermination de la
teneur en azote:
— Partie 1: Méthode Kjeldahl
— Partie 2: Méthode de minéralisation en bloc (Méthode macro)
— Partie 3: Méthode de minéralisation en bloc (Méthode pratique semi-micro)
— Partie 4: Détermination de la teneur en azote non protéique
— Partie 5: Détermination de la teneur en azote protéique
L'annexe A de la présente partie de l'ISO 8968FIL 20 est donnée uniquement à titre d’information.

iv © ISO et FIL 2001 – Tous droits réservés

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ISO 8968-1:2001(F)
FIL 20-1:2001(F)
Avant-propos
La FIL (Fédération internationale de laiterie) est une fédération mondiale du secteur laitier avec un Comité
National dans chacun de ses pays membres. Chaque Comité National a le droit de faire partie des Comités
permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux techniques. La FIL collabore avec l’ISO et avec l’AOAC
International pour l’élaboration de méthodes normalisées d’analyse et d’échantillonnage pour le lait et les produits
laitiers.
Les projets de Normes internationales adoptés par les Équipes d’Action et les Comités permanents sont soumis
aux Comités Nationaux pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 50 %
au moins des Comités Nationaux votants.
La Norme internationale ISO 8968-1FIL 20-1 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits
alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL), en
collaboration avec l’AOAC International. Elle est publiée conjointement par l’ISO et la FIL, et séparément par
l’AOAC International.
L’ensemble des travaux a été confié à l’Équipe d’Action mixte ISO/FIL/AOAC, Composés azotés, du Comité
permanent chargé des Composants principaux du lait, sous la conduite de son chef de projet, M. D.M. Barbano
(États-Unis d’Amérique).

© ISO et FIL 2001 – Tous droits réservés v

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ISO 8968-1:2001(F)
NORME INTERNATIONALE
FIL 20-1:2001(F)

Lait — Détermination de la teneur en azote —
Partie 1:
Méthode Kjeldahl
AVERTISSEMENT — L’utilisation de la présente partie de l’ISO 8968FIL 20 peut impliquer l’utilisation de
produits et la mise en œuvre de modes opératoires et d’appareillages à caractère dangereux. La présente
Norme internationale ne prétend pas aborder tous les risques liés à son utilisation. Il incombe à
l’utilisateur de la présente Norme internationale d’établir, avant de l’utiliser, des pratiques appropriées
d’hygiène et de sécurité et de déterminer l’applicabilité de restrictions réglementaires locales.
1 Domaine d'application
La présente partie de l’ISO 8968FIL 20 spécifie une méthode pour la détermination de la teneur en azote du lait
liquide, entier ou écrémé, selon le principe de Kjeldahl.
2 Référence normative
Le document normatif suivant contient des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente partie de l’ISO 8968FIL 20. Pour les références datées, les amendements
ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes aux accords
fondés sur la présente partie de l’ISO 8968FIL 20 sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer l'édition la
plus récente du document normatif indiqué ci-après. Pour les références non datées, la dernière édition du
document normatif en référence s’applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des Normes
internationales en vigueur.
ISO 385-1, Verrerie de laboratoire — Burettes — Partie 1: Spécifications générales
3 Terme et définition
Pour les besoins de la présente partie de l’ISO 8968FIL 20, le terme et la définition suivants s'appliquent.
3.1
teneur en azote
rapport de masse d’azote, déterminé par le mode opératoire décrit dans la présente partie de l’ISO 8968FIL 20
NOTE La teneur en azote est exprimée sous forme de pourcentage en masse.
4 Principe
Minéralisation d'une prise d'essai avec un mélange d'acide sulfurique concentré et de sulfate de potassium, en
utilisant du sulfate de cuivre(II) comme catalyseur pour convertir ainsi l'azote organique présent en sulfate
d'ammonium. (La fonction du sulfate de potassium est d’élever le point d’ébullition de l’acide sulfurique et de
permettre d’obtenir un mélange oxydant plus fort pour la minéralisation.) Addition d'hydroxyde de sodium
excédentaire au minéralisat refroidi pour libérer de l'ammoniac. Distillation de l'ammoniac libéré dans un excédent
de solution d'acide borique, puis titrage en utilisant de l'acide chlorhydrique. Calcul de la teneur en azote à partir de
la quantité d'ammoniac produite.
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5 Réactifs
Sauf indication différente, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l'eau distillée ou
déminéralisée, ou de l'eau de pureté au moins équivalente.
5.1 Sulfate de potassium (K SO ), exempt d’azote.
2 4
5.2 Solution de sulfate de cuivre(II), c(CuSO ) = 5,0 g par 100 ml.
4
Dans une fiole jaugée de 100 ml, dissoudre 5,0 g de sulfate de cuivre(II) pentahydraté (CuSO ,5H O) dans de
4 2
l'eau. Diluer jusqu'au repère avec de l’eau, puis mélanger.
5.3 Acide sulfurique (H SO ), avec un rapport de masse compris entre 95 % et 98 %, sans azote
2 4
(ρ = environ 1,84 g/ml).
20
5.4 Solution d'hydroxyde de sodium (NaOH), exempte d’azote, contenant 50 g d'hydroxyde de sodium par
100 g de solution.
5.5 Solution indicatrice.
Dissoudre 0,1 g de rouge de méthyle dans de l'éthanol à 95 % (rapport de volume) et diluer à 50 ml avec de
l'éthanol. Dissoudre 0,5 g de vert de bromocrésol dans de l'éthanol à 95 % (rapport de volume) et diluer à 250 ml
avec de l'éthanol. Mélanger une dose de la solution de rouge de méthyle à cinq doses de la solution de vert de
bromocrésol ou combiner et mélanger l'ensemble des deux solutions.
5.6 Solution d'acide borique, c(H BO ) = 40,0 g/l.
3 3
Dans une fiole jaugée de 1 000 ml, dissoudre 40,0 g d'acide borique dans 1 litre d'eau chaude. Laisser refroidir la
fiole et son contenu à 20 °C. Compléter au volume avec de l’eau, ajouter 3 ml de la solution indicatrice (5.5) et
mélanger. Conserver la solution, qui doit être orange clair, dans une bouteille en verre de borosilicate. Durant le
stockage, protéger la solution de la lumière et des sources de vapeurs d'ammoniac.
En cas de titrage électronique du pH avec point final, l’ajout de la solution indicatrice à la solution d’acide borique
peut être omis. D’autre part, le changement de couleur peut aussi servir à contrôler le mode opératoire de titrage.
5.7 Solution volumétrique standard d'acide chlorhydrique, c(HCl) = (0,1 ± 0,000 5) mol/l.
Il est recommandé d’acheter ce matériau déjà prénormalisé, répondant à ces spécifications.
NOTE Souvent, les erreurs systématiques (qui peuvent être évitées) introduites par un analyste qui dilue un acide
concentré, puis détermine la molarité de l’acide, peuvent diminuer la reproductibilité de la méthode. Il convient que l’analyste
n’utilise pas de solution de titrage de concentration supérieure à 0,1 mol/l car cela réduirait le volume total de titrage par
échantillon, et l’incertitude de lecture de la burette représenterait un pourcentage plus élevé de la valeur. Cela aura un impact
négatif sur la répétabilité et la reproductibilité de la méthode. Les mêmes problèmes se posent, avec le risque d’erreurs
supplémentaires, lorsqu’un autre acide (par exemple l’acide sulfurique) est substitué à l’acide chlorhydrique. Ces substitutions
ne sont donc pas recommandées.
5.8 Sulfate d'ammonium [(NH ) SO ], ayant une pureté minimale de 99,9 % (rapport de masse) sur matière
4 2 4
sèche.
Immédiatement avant l'emploi, sécher le sulfate d'ammonium à 102 °C ± 2 °C pendant au moins 2 h. Laisser
refroidir à température ambiante dans un dessiccateur.
5.9 Tryptophane (C H N O ) ou hydrochlorure de lysine (C H ClN O ), ayant une pureté minimale de
11 12 2 2 6 15 2 2
99,9 % (rapport de masse).
Ne pas sécher ces réactifs dans une étuve avant l'emploi.
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5.10 Saccharose, dont la teneur en azote est inférieure à 0,002 % (fraction massique).
Ne pas sécher la saccharose dans une étuve avant l'emploi.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Bain d’eau, pouvant être maintenu à une température de 38 °C ± 2 °C.
6.2 Ballons de Kjeldahl, d'une capacité de 500 ml ou 800 ml.
6.3 Balance analytique, permettant de peser à 0,1 mg près.
6.4 Corps facilitant l'ébullition, par exemple pierre ponce incandescente, poussière de zinc, pièces de
porcelaine dures ou granules d'alundon amphotères (carbarundon) lisses, d'une pureté élevée et d'une taille de
mailles de 10.
Ne pas réutiliser ces corps.
NOTE Des billes de verre d’environ 5 mm de diamètre sont parfois utilisées, mais celles-ci peuvent être moins efficaces
pour l’ébullition que les granules d’alundon, et des problèmes de formation de mousse pendant la minéralisation risquent
davantage de se poser avec les billes de verre.
6.5 Burette ou pipette automatique, permettant d'obtenir des doses de 1,0 ml de solution de sulfate de
cuivre (5.2).
6.6 Éprouvettes graduées, d'une capacité de 50 ml, 100 ml et 500 ml.
6.7 Appareil de minéralisation, pour maintenir les ballons de Kjeldahl (6.2) en position inclinée (à environ 45°),
pourvu de résistances électriques ou de becs à gaz ne chauffant pas les ballons au-delà du niveau de leur
contenu, ainsi que d'un système d'évacuation des fumées.
Il convient que la source chauffante soit réglable pour permettre de contrôler le réglage maximal de l'élément
chauffant à appliquer durant la minéralisation. Préchauffer la source chauffante au réglage de l'élément chauffant à
évaluer. La durée de préchauffage doit être de 10 min dans le cas d'un bec à gaz et de 30 min dans le cas d'un
élément chauffant électrique. Déterminer, pour chacun des éléments chauffants, le réglage qui permet de porter à
ébullition 250 ml d'eau et 5 à 10 corps facilitant l'ébullition (en partant d’une température initiale de 25 °C) en 5 min
à 6 min. Ce réglage correspond au réglage maximal de l'élément chauffant à appliquer durant la minéralisation.
6.8 Appareil de distillation, en verre de borosilicate ou autre matière appropriée, pouvant être équipé d’un
ballon de Kjeldahl (6.2), se composant d'une tête antiprojections efficace, relié à un condenseur efficace avec tube
intérieur droit et un tube d'écoulement fixé à son extrémité inférieure.
Le tubage de connexion et le(s) bouchon(s) doivent être étanches et de préférence en néoprène.
6.9 Fioles coniques, d'une capacité de 500 ml, graduées tous les 200 ml.
6.10 Burette, d'une capacité de 50 ml, graduée au moins tous les 0,01 ml, conformes aux exigences de
l'ISO 385, classe A.
Il est également possible d’utiliser une burette automatique satisfaisant aux mêmes exigences.
6.11 Dispositif de titrage automatique pourvu d’un pH-mètre.
Il convient que le pH-mètre soit correctement étalonné dans la gamme de pH 4 à pH 7 selon les méthodes
normales d’étalonnage du pH en laboratoire.
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7 Échantillonnage
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente partie de l’ISO 8968FIL 20. Une
méthode d'échantillonnage recommandée est indiquée dans l'ISO 707.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif et n'ayant pas été endommagé ou
modifié durant le transport ou le stockage.
8 Préparation de l'échantillon pour essai
Chauffer l'échantillon pour essai dans le bain d’eau (6.1) réglé à 38 °C. Bien mélanger, mais délicatement, au
moyen de retournements répétés du récipient, sans causer ni mousse ni barattage. Laisser refroidir l’échantillon à
température ambiante immédiatement avant de peser la prise d'essai (9.1).
NOTE Si l’on souhaite appliquer cette méthode à des produits laitiers autres que le lait, voir l’annexe A pour des
recommandations sur la taille de l’échantillon pour essai.
9 Mode opératoire
9.1 Prise d'essai et prétraitement
Introduire dans le ballon de Kjeldahl (6.2) propre et sec de 5 à 10 corps facilitant l'ébullition (6.4), 15,0 g de sulfate
de potassium (5.1), 1,0 ml de solution de sulfate de cuivre(ll) (5.2), environ 5 ml ± 0,1 ml de l'échantillon pour essai
préparé (article 8), pesé à 0,1 mg près, et 25 ml d'acide sulfurique (5.3). À cet effet, utiliser l'acide sulfurique pour
entraîner tout résidu de la solution de sulfate de cuivre(ll), du sulfate de potassium ou de la prise d'essai restant sur
le col du ballon. S’il reste un peu de minéralisat brûlé sur le col, rincer avec une petite quantité d’eau. Mélanger
doucement le contenu du ballon de Kjeldahl.
NOTE Si l’on souhaite appliquer cette méthode à des produits laitiers autres que le lait, voir l’annexe A pour des
recommandations sur la taille de la prise d’essai.
9.2 Détermination
9.2.1 Minéralisation
Brancher le système d'évacuation des fumées de l'appareil de minéralisation (6.7) avant de commencer la
minéralisation. Chauffer le ballon de Kjeldahl et son contenu (9.1) sur l'appareil de minéralisation en réglant
l'élément chauffant sur une température suffisamment basse pour que le minéralisat brûlé ne déborde pas en
moussant par le col du ballon de Kjeldahl. Effectuer la minéralisation à ce réglage de l'élément chauffant jusqu'à ce
que de la fumée blanche apparaisse dans le ballon au bout d’environ 20 min. Augmenter le réglage de l'élément
chauffant jusqu'à une position correspondant à la moitié du réglage maximal déterminé en 6.7 et continuer le
chauffage pendant 15 min. Au terme des 15 min, augmenter le chauffage jusqu'au réglage maximal déterminé en
6.7. Une fois que le minéralisat s'est éclairci (il devient transparent avec une coloration bleu clair à vert), continuer
à faire bouillir le contenu pendant 1 h à 1,5 h au réglage maximal. Si le liquide ne bout pas, il est possible que le
réglage final du bec à gaz soit trop faible. La durée totale de la minéralisation sera comprise entre 1,8 h et 2,25 h.
Pour déterminer le temps d'ébullition spécifique nécessaire pour les conditions d'analyse du lait dans un laboratoire
particulier utilisant un ensemble bien défini d'appareils, sélectionner un échantillon de lait à haute teneur en
protéines et en matières grasses et déterminer sa teneur en protéines en appliquant différents temps d'ébullition
(de 1 h à 1,5 h) après l'éclaircissement. Le résultat moyen de la teneur en protéines augmente avec le temps
d'ébullition, se stabilise, puis diminue quand le temps d'ébullition est trop long. Choisir le temps d'ébullition qui
permet d'obtenir la teneur maximale en protéines.
Au terme de la minéralisation, le minéralisat doit être transparent et exempt de matière non digérée. Laisser
refroidir le minéralisat à température ambiante dans des flacons ouverts pendant environ 25 min. Si les ballons
refroidissent sur les becs encore chauds, le temps pour atteindre la température ambiante sera plus long. À la fin
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de cette période de refroidissement de 25 min, il convient que le minéralisat refroidi soit complètement liquide ou
liquide avec quelques petits cristaux au fond du ballon. Ne pas laisser le minéralisat non dilué dans les ballons
pendant toute une nuit. En effet, le minéralisat non dilué peut se cristalliser lors de cette période et il sera ensuite
très difficile de le remettre en solution.
NOTE La cristallisation excessive au bout de 25 min est le résultat d'une perte d'acide trop importante au cours de la
minéralisation et risque de donner des valeurs d'essai faibles. Cette perte d'acide est causée par une aspiration excessive des
fumées ou par une minéralisation trop longue due à un réglage maximal incorrect du bec.
Ajouter 300 ml d'eau dans les ballons de Kjeldahl de 500 ml, ou 400 ml d'eau dans les ballons de Kjeldahl de
800 ml, en utilisant également l'eau pour éliminer tout résidu sur le col des ballons. Mélanger complètement le
contenu en s'assurant que tous les cristaux qui se sont formés sont dissous. Ajouter de 5 à 10 corps facilitant
l'ébullition (6.4). Laisser le mélange refroidir à température ambiante avant de procéder à la distillation. Les
minéralisats dilués peuvent être conservés dans des fioles bouchées et utilisés ultérieurement pour la distillation.
9.2.2 Distillation
Faire circuler l'eau du condenseur pour l'appareil de distillation (6.8). Ajouter 75 ml de solution d'hydroxyde de
sodium (5.4) au minéralisat dilué (9.2.1) en versant délicatement la solution dans le col incliné du ballon de
Kjeldahl, de façon à former une couche au fond du bulbe du ballon. Il convient que l'interface entre les deux
solutions soit nette. Pour réduire le risque de perte d’ammoniac, relier le ballon de Kjeldahl à l'appareil de
distillation (6.8) immédiatement après l'adjonction de la solution d'hydroxyde de sodium dans le ballon. La pointe
du tube d'écoulement du condenseur est plongée dans 50 ml de la solution d'acide borique (5.6) contenue dans
une fiole conique (6.9). Agiter vigoureusement par un mouvement de rotation le ballon de Kjeldahl jusqu’à ce qu’il
n’y ait plus de couches de solution séparées visibles dans le ballon. Placer le ballon sur le bec et mettre en marche
le bec à un réglage suffisamment élevé pour porter le mélange à ébullition. Continuer la distillation jusqu'à ce
qu'une ébullition irrégulière (ébullition pulsatoire) commence, puis déconnecter immédiatement le ballon de
Kjeldahl et arrêter le chauffage. Arrêter l'eau du condenseur. Rincer à l’eau l’intérieur et l’extérieur de l’extrémité du
tube d'écoulement, recueillir l’eau de rinçage dans la fiole conique et mélanger.
Le débit de distillation doit permettre de recueillir environ 150 ml de distillat avant que ne commence l'ébullition
irrégulière (ébullition pulsatoire). Le volume total contenu dans la fiole conique sera d'environ 200 ml. Si le volume
de distillat recueilli est inférieur à 150 ml, il est probable qu'une quantité d'eau inférieure à 300 ml a été ajoutée
pour diluer le minéralisat. L'efficacité du condenseur doit être telle que la température du contenu de la fiole
conique ne dépasse pas 35 °C pendant la distillation en cas d’utilisation d’un point final de titrage colorimétrique.
9.2.3 Titrage
Titrer le contenu de la fiole conique (9.2.2) avec l'acide chlorhydrique (5.7) à l’aide d’une burette (6.5). Le point final
de titrage est atteint à la première trace de rose dans le contenu. Estimer la lecture de la burette à 0,05 ml près.
Une plaque agitatrice magnétique éclairée peut faciliter la visualisation du point final de titrage.
Il est également possible de titrer le contenu de la fiole conique (9.2.2) avec l’acide chlorhydrique (5.7) au moyen
d’un dispositif de titrage automatique étalonné équipé d’un pH-mètre (6.11). Le point final de titrage est atteint au
pH 4,6, qui correspond au point le plus haut de la courbe de titrage (point d’inflection). Lire la quantité de solution
titrée utilisée sur le dispositif de titrage automatique.
NOTE 1 La première trace de rose est observée entre pH 4,6 et pH 4,3 pour le système indicateur et la solution d’acide
borique à 4 % spécifiée dans la présente méthode. En pratique, la variation du pH en fonction de l’ajout d’acide chlorhydrique à
0,1 mol/l est très rapide dans cette gamme de pH. Il faut environ 0,05 ml d’acide chlorhydrique à 0,1 mol/l pour changer le pH
de 0,3 unité dans la gamme de pH comprise entre 4,6 et 4,3 dans ce système.
NOTE 2 Les statistiques intralaboratoires et interlaboratoires concernant cette méthode ont été déterminées à l’aide d’un
titrage à point final colorimétrique. La comparaison entre les résultats d’essai, y compris ceux des essais à blanc, obtenus avec
un point final de pH 4,6 et les résultats d’un titrage à point final colorimétrique a montré que, statistiquement, aucune différence
significative n’était démontrable entre ces résultats.
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9.3 Essai à blanc
Titrer les prises d'essai à blanc en utilisant toujours le même acide chlorhydrique (5.7) et la même burette (6.5) ou
le même dispositif de titrage automatique équipé d’un pH-mètre (6.11) que pour les prises d’essai. Réaliser un
essai à blanc en suivant le mode opératoire décrit en 9.1 à 9.2.3, en remplaçant la prise d'essai par 5 ml d'eau
avec environ 0,85 g de saccharose (5.10).
Consigner les valeurs à blanc. Si ces valeurs varient, identifier la cause de ce changement.
NOTE 1 Dans une prise d'essai à blanc ou un étalon de récupération, la saccharose est utilisée comme matière organique
pour consommer, lors de la minéralisation, une quantité d'acide sulfurique pratiquement équivalente à celle nécessaire pour une
prise d’essai. Si la quantité d'acide sulfurique libre restant à la fin de la minéralisation est insuffisante, la récupération de l'azote
déterm
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