ISO 6579:2002
(Main)Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of Salmonella spp.
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of Salmonella spp.
ISO 6579:2002 specifies a horizontal method for the detection of Salmonella, including Salmonella Typhi and Salmonella Paratyphi. It is applicable to products intended for human consumption and the feeding of animals, and to environmental samples in the area of food production and food handling.
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche des Salmonella spp.
La présente Norme internationale spécifie une méthode horizontale de recherche des Salmonella, incluant Salmonella Typhi et Salmonella Paratyphi. La présente Norme internationale est applicable aux produits destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation animale.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 6579
Fourth edition
2002-07-15
Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Horizontal method for the
detection of Salmonella spp.
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche des
Salmonella spp.
Reference number
ISO 6579:2002(E)
©
ISO 2002
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ISO 6579:2002(E)
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Contents Page
Foreword.iv
Introduction.v
1 Scope .1
2 Normative references.1
3 Terms and definitions .1
4 Principle.2
4.1 General.2
4.2 Pre-enrichment in non-selective liquid medium .2
4.3 Enrichment in selective liquid media .2
4.4 Plating out and identification .2
4.5 Confirmation of identity .2
5 Culture media, reagents and sera.3
5.1 General.3
5.2 Culture media and reagents .3
5.3 Sera .4
6 Apparatus and glassware .4
7 Sampling.5
8 Preparation of test sample.5
9 Procedure (see diagram in annex A).5
9.1 Test portion and initial suspension .5
9.2 Non-selective pre-enrichment .6
9.3 Selective enrichment.6
9.4 Plating out and identification .6
9.5 Confirmation .6
10 Expression of results .10
11 Test report .10
12 Quality assurance.11
Annex A (normative) Diagram of procedure .12
Annex B (normative) Composition and preparation of culture media and reagents.14
Annex C (informative) Results of interlaboratory trial .24
Bibliography.27
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ISO 6579:2002(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards adopted
by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 6579 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology.
This fourth edition cancels and replaces the third edition (ISO 6579:1993), which has been technically revised.
Annexes A and B form a normative part of this Interntional Standard. Annex C is for information only.
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ISO 6579:2002(E)
Introduction
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not be appropriate in every
detail for certain products. In this case, different methods, which are specific to these products, may be used if
absolutely necessary for justified technical reasons. Nevertheless, every attempt should be made to apply this
horizontal method as far as possible.
When this International Standard is next reviewed, account will be taken of all information then available regarding
the extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from this method in the
case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate, and for certain groups of products International
Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this horizontal method. It is hoped
that when such standards are reviewed they will be changed to comply with this International Standard so that
eventually the only remaining departures from this horizontal method will be those necessary for well-established
technical reasons.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 6579:2002(E)
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal
method for the detection of Salmonella spp.
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests for detecting
Salmonella, and especially Salmonella Typhi and Salmonella Paratyphi, are only undertaken in properly
equipped laboratories, under the control of a skilled microbiologist, and that great care is taken in the
disposal of all incubated materials.
1 Scope
This International Standard specifies a horizontal method for the detection of Salmonella, including Salmonella
Typhi and Salmonella Paratyphi.
Subject to the limitations discussed in the Introduction, this International Standard is applicable to
products intended for human consumption and the feeding of animals;
environmental samples in the area of food production and food handling.
WARNING — The method may not recover all Salmonella Typhi and Paratyphi.
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For
undated references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC
maintain registers of currently valid International Standards.
ISO 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial
suspension and decimal dilutions
ISO 7218:1996, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General rules for microbiological examinations
ISO 8261, Milk and milk products — General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions and
decimal dilutions for microbiological examination
3 Terms and definitions
For the purposes of this International Standard, the following terms and definitions apply.
3.1
Salmonella
microorganisms which form typical or less typical colonies on solid selective media and which display the
biochemical and serological characteristics described when tests are carried out in accordance with this
International Standard
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3.2
detection of Salmonella
determination of the presence or absence of Salmonella (3.1), in a particular mass or volume of product, when
tests are carried out in accordance with this International Standard
4 Principle
4.1 General
The detection of Salmonella necessitates four successive stages (see also annex A).
NOTE The Salmonella may be present in small numbers and are often accompanied by considerably larger numbers of
other Enterobacteriaceæ or other families. Furthermore, pre-enrichment is necessary to permit the detection of low numbers of
Salmonella or injured Salmonella.
4.2 Pre-enrichment in non-selective liquid medium
Buffered peptone water is inoculated at ambient temperature with the test portion, then incubated at 37 °C ± 1 °C
for 18 h ± 2 h.
For certain foodstuffs the use of other pre-enrichment procedures is necessary. See 9.1.2.
For large quantities, the buffered peptone water should be heated to 37 °C ± 1 °C before inoculation with the test
portion.
4.3 Enrichment in selective liquid media
Rappaport-Vassiliadis medium with soya (RVS broth) and Muller-Kauffmann tetrathionate/novobiocin broth (MKTTn
broth) are inoculated with the culture obtained in 4.2.
The RVS broth is incubated at 41,5 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h, and the MKTTn broth at 37 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h.
4.4 Plating out and identification
From the cultures obtained in 4.3, two selective solid media are inoculated:
xylose lysine deoxycholate agar (XLD agar);
any other solid selective medium complementary to XLD agar and especially appropriate for the isolation of
lactose-positive Salmonella and Salmonella Typhi and Salmonella Paratyphi strains; the laboratory may
choose which medium to use.
The XLD agar is incubated at 37 °C ± 1 °C and examined after 24 h ± 3 h. The second selective agar is incubated
according to the manufacturer's recommendations.
NOTE For information, Brilliant green agar (BGA), bismuth sulfite agar, etc., could be used as the second plating-out
medium.
4.5 Confirmation of identity
Colonies of presumptive Salmonella are subcultured, then plated out as described in 4.4, and their identity is
confirmed by means of appropriate biochemical and serological tests.
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5 Culture media, reagents and sera
5.1 General
For current laboratory practice, see ISO 7218.
5.2 Culture media and reagents
NOTE Because of the large number of culture media and reagents, it is considered preferable, for clarity, to give their
compositions and preparations in annex B.
5.2.1 Non-selective pre-enrichment medium: Buffered peptone water
See B.1.
5.2.2 First selective enrichment medium: Rappaport-Vassiliadis medium with soya (RVS broth)
See B.2.
5.2.3 Second selective enrichment medium: Muller-Kauffmann tetrathionate novobiocin broth (MKTTn
broth)
See B.3.
5.2.4 Solid selective plating-out media
5.2.4.1 First medium: Xylose lysine deoxycholate agar (XLD agar)
See B.4.
5.2.4.2 Second medium
The choice of the second appropriate medium is left to the discretion of the testing laboratory. The manufacturer's
instructions should be precisely followed regarding its preparation for use.
5.2.5 Nutrient agar
See B.5.
5.2.6 Triple sugar/iron agar (TSI agar)
See B.6.
5.2.7 Urea agar (Christensen)
See B.7.
5.2.8 L-Lysine decarboxylation medium
See B.8.
5.2.9 Reagent for detection of β-galactosidase (or prepared paper discs used in accordance with the
manufacturer's instructions)
See B.9.
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5.2.10 Reagents for Voges-Proskauer (VP) reaction
See B.10.
5.2.11 Reagents for indole reaction
See B.11.
5.2.12 Semi-solid nutrient agar
See B.12.
5.2.13 Physiological saline solution
See B.13.
5.3 Sera
Several types of agglutinating sera containing antibodies for one or several O-antigens are available commercially;
i.e. anti-sera containing one or more “O” groups (called monovalent or polyvalent anti-O sera), anti-Vi sera, and
anti-sera containing antibodies for one or several H-factors (called monovalent or polyvalent anti-H sera).
Every attempt should be made to ensure that the anti-sera used are adequate to provide for the detection of all
Salmonella serotypes. Assistance towards this objective may be obtained by using only anti-sera prepared by a
supplier recognized as competent (for example, by an appropriate government agency).
6 Apparatus and glassware
Disposable apparatus is an acceptable alternative to reusable glassware if it has suitable specifications.
Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet sterilization (autoclave)
See ISO 7218.
6.2 Drying cabinet or oven, ventilated by convection, capable of operating between 37 °C and 55 °C.
6.3 Incubator, capable of operating at 37 °C ± 1 °C.
6.4 Water bath, capable of operating at 41,5 °C ± 1 °C, or incubator, capable of operating at 41,5 °C ± 1 °C.
6.5 Water baths, capable of operating at 44 °C to 47 °C.
6.6 Water bath, capable of operating at 37 °C ± 1 °C.
It is recommended to use a water bath (6.4, 6.5 and 6.6) containing an antibacterial agent because of the low
infective dose of Salmonella.
6.7 Sterile loops, of diameter approximately 3 mm or 10 µl, or sterile pipettes.
6.8 pH-meter, having an accuracy of calibration of ± 0,1 pH unit at 20 °C to 25 °C.
6.9 Test tubes or flasks, of appropriate capacity.
Bottles or flasks with non-toxic metallic or plastic screw-caps may be used.
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6.10 Graduated pipettes or automatic pipettes, of nominal capacities 10 ml and 1 ml, graduated respectively in
0,5 ml and 0,1 ml divisions.
6.11 Petri dishes, of small size (diameter 90 mm to 100 mm) and/or large size (diameter 140 mm).
7 Sampling
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. See the specific International Standard
dealing with the product concerned. If there is no specific International Standard, it is recommended that the parties
concerned come to an agreement on this subject.
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with the specific International Standard dealing with the product concerned.
If there is no specific International Standard, it is recommended that the parties concerned come to an agreement
on this subject.
9 Procedure (see diagram in annex A)
9.1 Test portion and initial suspension
9.1.1 General
See ISO 6887-1 and the specific International Standard dealing with the product concerned. See ISO 8261 for milk
and milk products.
For preparation of the initial suspension, in the general case use as diluent the pre-enrichment medium specified in
5.2.1 and 4.2 (buffered peptone water).
If the specified mass of test portion is other than 25 g, use the necessary quantity of pre-enrichment medium to
yield a 1/10 dilution.
To reduce the examination workload when more than one 25 g test portion from a specified lot of food has to be
examined, and when evidence is available that compositing (pooling the test portions) does not affect the result for
that particular food, the test portions may be composited. For example, if 10 test portions of 25 g are to be
examined, combine the 10 units to form a composite test portion of 250 g and add 2,25 l of pre-enrichment broth.
Alternatively, the 0,1 ml (in 10 ml of RVS broth) and 1 ml (in 10 ml of MKTTn broth) portions of the pre-enrichment
broth from the 10 separate test portions (see 9.3.1) may be composited for enrichment in 100 ml of selective
enrichment media.
9.1.2 Specific preparations of the initial suspension for certain foodstuffs
NOTE The following specific preparations concern only the case of Salmonella. Specific preparations applicable for the
determination of any microorganisms are described in ISO 6887-2, ISO 6887-3, ISO 6887-4 and ISO 8261.
9.1.2.1 Cocoa and cocoa-containing products (e.g. more than 20 %)
Add to the buffered peptone water (5.2.1) preferably 50 g/l of casein (avoid the use of acid casein), or 100 g/l of
sterile skim milk powder and add, after about 2 h incubation, 0,018 g/l of Brilliant green if the foodstuff is likely to be
highly contaminated with Gram-positive flora.
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9.1.2.2 Acidic and acidifying foodstuffs
Ensure that the pH does not fall to below 4,5 during pre-enrichment.
NOTE The pH of acidic and acidifying foodstuffs is more stable if double-strength buffered peptone water is used.
9.2 Non-selective pre-enrichment
Incubate the initial suspension (9.1) at 37 °C ± 1 °C for 18 h ± 2 h.
9.3 Selective enrichment
9.3.1 Transfer 0,1 ml of the culture obtained in 9.2 to a tube containing 10 ml of the RVS broth (5.2.2); transfer
1 ml of the culture obtained in 9.2 to a tube containing 10 ml of MKTTn broth (5.2.3).
9.3.2 Incubate the inoculated RVS broth (9.3.1) at 41,5 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h and the inoculated MKTTn broth
at 37 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h. Care should be taken that the maximum allowed incubation temperature (42,5 °C) is
not exceeded.
9.4 Plating out and identification
9.4.1 After incubation for 24 h ± 3 h, using the culture obtained in the RVS broth (9.3.2), inoculate by means of a
loop (6.7) the surface of one large-size Petri dish (6.11) containing the first selective plating-out medium (XLD agar,
see 5.2.4.1), so that well-isolated colonies will be obtained.
In the absence of large dishes, use two small dishes one after the other, using the same loop.
Proceed in the same way with the second selective plating-out medium (5.2.4.2) using a sterile loop and Petri
dishes as above.
9.4.2 After incubation for 24 h ± 3 h, using the culture obtained in the MKTTn broth (9.3.2), repeat the procedure
described in 9.4.1 with the two selective plating-out media.
9.4.3 Invert the dishes (9.4.1 and 9.4.2) so that the bottom is uppermost, and place them in the incubator (6.3)
set at 37 °C for the first plating-out medium (5.2.4.1). The manufacturer's instructions shall be followed for the
second plating-out medium (5.2.4.2).
9.4.4 After incubation for 24 h ± 3 h, examine the plates (9.4.3) for the presence of typical colonies of Salmonella
and atypical colonies that may be Salmonella (see Note). Mark their position on the bottom of the dish.
Typical colonies of Salmonella grown on XLD agar have a black centre and a lightly transparent zone of reddish
colour due to the colour change of the indicator.
NOTE Salmonella H S negative variants (e.g. S. Paratyphi A) grown on XLD agar are pink with a darker pink centre.
2
Lactose-positive Salmonella grown on XLD agar are yellow with or without blackening.
Incubate the second selective solid medium at the appropriate temperature and examine after the appropriate time
to check for the presence of colonies which, from their characteristics, are considered to be presumptive
Salmonella.
9.5 Confirmation
9.5.1 General
If shown to be reliable, commercially available identification kits for the biochemical examination of Salmonella may
be used. The use of identification kits concerns the biochemical confirmation of colonies. These kits should be used
following the manufacturer's instructions.
NOTE The recognition of colonies of Salmonella is to a large extent a matter of experience, and their appearance may vary
somewhat, not only from serovar to serovar, but also from batch to batch of the selective culture medium used.
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9.5.2 Selection of colonies for confirmation
For confirmation, take from each dish (two small-sized dishes or one large-sized dish) of each selective medium
(see 9.4) at least one colony considered to be typical or suspect and a further four colonies if the first is negative.
It is recommended that at least five colonies be identified in the case of epidemiological studies. If on one dish
there are fewer than five typical or suspect colonies, take for confirmation all the typical or suspect colonies.
Streak the selected colonies onto the surface of pre-dried nutrient agar plates (5.2.5), in a manner which will allow
well-isolated colonies to develop. Incubate the inoculated plates (9.4.3) at 37 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h.
Use pure cultures for biochemical and serological confirmation.
9.5.3 Biochemical confirmation
9.5.3.1 General
By means of an inoculating wire, inoculate the media specified in 9.5.3.2 to 9.5.3.7 with each of the cultures
obtained from the colonies selected in 9.5.2.
9.5.3.2 TSI agar (5.2.6)
Streak the agar slant surface and stab the butt. Incubate at 37 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h.
Interpret the changes in the medium as follows.
a) Butt
yellow glucose positive (glucose used)
red or unchanged glucose negative (glucose not used)
black formation of hydrogen sulfide
bubbles or cracks gas formation from glucose
b) Slant surface
yellow lactose and/or sucrose positive (lactose and/or sucrose used)
red or unchanged lactose and sucrose negative (neither lactose nor sucrose used)
Typical Salmonella cultures show alkaline (red) slants and acid (yellow) butts with gas formation (bubbles) and (in
about 90 % of the cases) formation of hydrogen sulfide (blackening of the agar) (9.5.3.8).
When a lactose-positive Salmonella is isolated (see 4.4), the TSI slant is yellow. Thus, preliminary confirmation of
Salmonella cultures shall not be based on the results of the TSI agar test only (see 9.5.3).
9.5.3.3 Urea agar (5.2.7)
Streak the agar slant surface. Incubate at 37 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h and examine at intervals.
If the reaction is positive, splitting of urea liberates ammonia, which changes the colour of phenol red to rose-pink
and later to deep cerise. The reaction is often apparent after 2 h to 4 h.
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9.5.3.4 L-Lysine decarboxylation medium (5.2.8)
Inoculate just below the surface of the liquid medium. Incubate at 37 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h.
Turbidity and a purple colour after incubation indicates a positive reaction. A yellow colour indicates a negative
reaction.
9.5.3.5 Detection of β-galactosidase (5.2.9)
Suspend a loopful of the suspected colony in a tube containing 0,25 ml of the saline solution (5.2.13).
Add 1 drop of toluene and shake the tube. Put the tube in a water bath (6.6) set at 37 °C and leave for several
minutes (approximately 5 min). Add 0,25 ml of the reagent for detection of β-galactosidase and mix.
Replace the tube in the water bath set at 37 °C and leave for 24 h ± 3 h, examining the tube at intervals.
A yellow colour indicates a positive reaction. The reaction is often apparent after 20 min.
If prepared paper discs (5.2.9) are used, follow the manufacturer's instructions.
9.5.3.6 Medium for Voges-Proskauer (VP) reaction (5.2.10)
Suspend a loopful of the suspected colony in a sterile tube containing 3 ml of the VP medium.
Incubate at 37 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h.
After incubation, add two drops of the creatine solution, three drops of the ethanolic solution of 1-naphthol and then
two drops of the potassium hydroxide solution; shake after the addition of each reagent.
The formation of a pink to bright red colour within 15 min indicates a positive reaction.
9.5.3.7 Medium for indole reaction (5.2.11)
Inoculate a tube containing 5 ml of the tryptone/tryptophan medium with the suspected colony.
Incubate at 37 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h. After incubation, add 1 ml of the Kovacs reagent.
The formation of a red ring indicates a positive reaction. A yellow-brown ring indicates a negative reaction.
9.5.3.8 Interpretation of the biochemical tests
Salmonella generally show the reactions given in Table 1.
9.5.4 Serological confirmation and serotyping
9.5.4.1 General
The detection of the presence of Salmonella O-, Vi- and H-antigens is tested by slide agglutination with the
appropriate sera, from pure colonies (9.5.2) and after auto-agglutinable strains have been eliminated. Use the
antisera according to the producer's instructions if different from the description below.
9.5.4.2 Elimination of auto-agglutinable strains
Place one drop of the saline solution (5.2.13) onto a carefully cleaned glass slide. Disperse in the drop, by means
of a loop (6.7), part of the colony to be tested, in order to obtain a homogeneous and turbid suspension.
NOTE It is also possible to disperse part of the colony to be tested in a drop of water, and then to mix this solution with one
drop of saline solution (5.2.13).
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Rock the slide gently for 30 s to 60 s. Observe the result against a dark background, preferably with the aid of a
magnifying glass.
If the bacteria have clumped into more o
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 6579
Quatrième édition
2002-07-15
Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour la recherche des
Salmonella spp.
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the
detection of Salmonella spp.
Numéro de référence
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Imprimé en Suisse
ii © ISO 2002 – Tous droits réservés
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction.v
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions.2
4 Principe.2
4.1 Généralités .2
4.2 Préenrichissement en milieu non sélectif liquide .2
4.3 Enrichissement en milieux sélectifs liquides .2
4.4 Isolement et identification .2
4.5 Confirmation .3
5 Milieux de culture, réactifs et sérum .3
5.1 Généralités .3
5.2 Milieux de culture et réactifs .3
5.3 Sérums.4
6 Appareillage et verrerie.4
7 Échantillonnage .5
8 Préparation de l'échantillon pour essai .5
9 Mode opératoire (voir le schéma en annexe A).5
9.1 Prise d'essai et suspension mère.5
9.2 Préenrichissement non sélectif .6
9.3 Enrichissement sélectif.6
9.4 Isolement et identification .6
9.5 Confirmation .7
10 Expression des résultats .11
11 Rapport d'essai.11
12 Assurance de la qualité.11
Annexe A (normative) Schéma du mode opératoire .12
Annexe B (normative) Composition et préparation des milieux de culture et des réactifs .14
Annexe C (informative) Résultats de l'essai interlaboratoires .24
Bibliographie.27
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ISO 6579:2002(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 3.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments de la présente Norme internationale peuvent faire
l'objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 6579 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie.
Cette quatrième édition annule et remplace la troisième édition (ISO 6579:1993), qui a fait l'objet d'une révision
technique.
Les annexes A et B constituent des éléments normatifs de la présente Norme internationale. L'annexe C est
donnée uniquement à titre d'information.
iv © ISO 2002 – Tous droits réservés
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ISO 6579:2002(F)
Introduction
En raison de la diversité des produits alimentaires, il est possible que cette méthode horizontale ne soit pas
applicable dans tous ses détails à certains d'entre eux. Dans ce cas, des méthodes différentes, spécifiques à ces
produits, pourront être utilisées si cela s'avère absolument nécessaire pour des raisons techniques justifiées.
Néanmoins, tous les efforts doivent être faits pour appliquer cette méthode horizontale chaque fois que possible.
Lors du réexamen périodique de la présente Norme internationale, il sera tenu compte de toutes les évolutions
intervenues depuis sa publication et, notamment, dans quelle mesure cette méthode horizontale aura été suivie
ainsi que les raisons des dérogations dans le cas de produits particuliers.
L'harmonisation de toutes les méthodes d'essai ne peut être réalisée de façon immédiate; de ce fait, il peut déjà
exister des Normes internationales et/ou nationales pour certains groupes de produits qui ne concordent pas avec
cette méthode horizontale. Lorsque de telles normes viendront en révision, il serait souhaitable de les aligner avec
les prescriptions de la présente Norme internationale et de ne conserver que les seules divergences justifiées
indispensables pour des raisons techniques.
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NORME INTERNATIONALE ISO 6579:2002(F)
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la
recherche des Salmonella spp.
AVERTISSEMENT — Afin de sauvegarder la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel que les
essais de recherche des Salmonella, et particulièrement des Salmonella Typhi et des Salmonella Paratyphi,
ne soient réalisés que dans des laboratoires équipés à cet effet, sous la surveillance d’un microbiologiste
expérimenté, et qu’un grand soin soit pris pour se débarrasser de tous les éléments incubés.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode horizontale de recherche des Salmonella, incluant
Salmonella Typhi et Salmonella Paratyphi.
Compte tenu des remarques signalées dans l'introduction, la présente Norme internationale est applicable aux
produits destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation animale;
échantillons environnementaux dans le domaine de la production et de la manutention de produits
alimentaires.
AVERTISSEMENT — Cette méthode peut ne pas permettre de retrouver toutes les Salmonella Typhi et
Paratyphi.
2 Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente Norme internationale. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s'appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
aux accords fondés sur la présente Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les
éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s'applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur.
ISO 6887-1, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions
décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de la suspension
mère et des dilutions décimales
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Règles générales pour les examens microbiologiques
ISO 8261, Lait et produits laitiers — Lignes directrices générales pour la préparation des échantillons pour essai,
de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
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ISO 6579:2002(F)
3 Termes et définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
Salmonella
micro-organismes formant des colonies typiques ou moins typiques sur des milieux sélectifs solides et possédant
les caractéristiques biochimiques et sérologiques décrites lorsque l'essai est exécuté selon la présente Norme
internationale
3.2
recherche des Salmonella
détermination de la présence ou de l'absence de Salmonella (3.1), dans une quantité déterminée de produit,
lorsque l'essai est exécuté selon la présente Norme internationale
4 Principe
4.1 Généralités
La recherche de Salmonella nécessite quatre phases successives (voir également annexe A).
NOTE Les Salmonella peuvent, en effet, être présentes en petit nombre et sont souvent accompagnées d'un nombre
beaucoup plus grand d'autres micro-organismes appartenant à la famille des Enterobacteriaceæ ou à d'autres familles. En
conséquence, un enrichissement sélectif est nécessaire; de plus, un préenrichissement est aussi souvent nécessaire afin de
pouvoir rechercher les Salmonella en nombre restreint ou les Salmonella ayant subi une altération.
4.2 Préenrichissement en milieu non sélectif liquide
Ensemencement de la prise d'essai dans de l'eau peptonée tamponnée à température ambiante, puis incubation à
37 °C ± 1 °C pendant 18 h ± 2 h.
Pour certains aliments, l'utilisation d'autres modalités de préenrichissement est nécessaire. Voir 9.1.2.
En cas de grandes quantités, il convient de chauffer l’eau peptonée tamponnée à 37 °C ± 1 °C avant
l’ensemencement avec la prise d’essai.
4.3 Enrichissement en milieux sélectifs liquides
Ensemencement du bouillon Rappaport-Vassiliadis avec soja (bouillon RVS) et d'un bouillon Muller-Kauffmann au
tétrathionate-novobiocine (MKTTn) avec la culture obtenue en 4.2.
Incubation du bouillon RVS à 41,5 °C ± 1 °C pendant 24 h ± 3 h et du bouillon MKTTn à 37 °C ± 1°C pendant
24 h ± 3 h.
4.4 Isolement et identification
À partir des cultures obtenues en 4.3, ensemencement de deux milieux sélectifs solides:
gélose xylose lysine désoxycholate (gélose XLD);
un autre milieu sélectif solide approprié, laissé au choix du laboratoire, complémentaire du milieu gélose XLD,
permettant la recherche de Salmonella lactose positive, incluant Salmonella Typhi et Salmonella Paratyphi.
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Incubation du milieu gélose XLD à 37 °C ± 1 °C puis examen après 24 h ± 3 h. Incubation du second milieu sélectif
selon les recommandations du fabricant.
NOTE Pour information, la gélose au vert brillant (BGA: brilliant green agar), la gélose au sulfite de bismuth, etc.,
pourraient être utilisées comme second milieu d'isolement.
4.5 Confirmation
Repiquage des colonies présumées de Salmonella isolées en 4.4, et confirmation au moyen des essais
biochimiques et sérologiques appropriés.
5 Milieux de culture, réactifs et sérum
5.1 Généralités
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir l'ISO 7218.
5.2 Milieux de culture et réactifs
NOTE En raison du nombre important de milieux de culture et de réactifs, il a été jugé préférable, pour la clarté du texte,
de donner leur composition et leur préparation dans l'annexe B.
5.2.1 Milieu de préenrichissement non sélectif: eau peptonée tamponnée
Voir B.1.
5.2.2 Premier milieu d'enrichissement sélectif: bouillon Rappaport-Vassiliadis avec soja (bouillon RVS)
Voir B.2.
5.2.3 Deuxième milieu d'enrichissement sélectif: bouillon Muller-Kauffmann au tétrathionate-novobiocine
(bouillon MKTTn)
Voir B.3.
5.2.4 Milieux d'isolement sélectifs solides
5.2.4.1 Premier milieu: gélose au xylose lysine désoxycholate (gélose XLD)
Voir B.4.
5.2.4.2 Deuxième milieu
Le choix du deuxième milieu est laissé à l'initiative du laboratoire d'essais. Il convient de suivre scrupuleusement
les instructions du fabricant quant à sa préparation.
5.2.5 Gélose nutritive
Voir B.5.
5.2.6 Gélose au citrate de fer et aux trois sucres (gélose TSI)
Voir B.6.
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ISO 6579:2002(F)
5.2.7 Gélose à l'urée (Christensen)
Voir B.7.
5.2.8 Milieu pour décarboxylation de la L-lysine
Voir B.8.
5.2.9 Réactif pour la recherche de la β-galactosidase (ou disques de papier tout préparés utilisés selon les
instructions du fabricant)
Voir B.9.
5.2.10 Réactifs pour la réaction de Voges-Proskauer (réaction VP)
Voir B.10.
5.2.11 Réactifs pour la recherche de l'indole
Voir B.11.
5.2.12 Gélose nutritive semi-solide
Voir B.12.
5.2.13 Solution saline physiologique
Voir B.13.
5.3 Sérums
On peut trouver dans le commerce plusieurs types de sérums agglutinants contenant des anticorps contre un ou
plusieurs facteurs antigéniques O, c'est-à-dire des antisérums contenant un ou plusieurs groupes «O» (dénommés
antisérums «O» monovalents ou polyvalents), des antisérums Vi et des antisérums contenant des anticorps contre
un ou plusieurs facteurs «H» (dénommés antisérums «H» monovalents ou polyvalents).
Il convient de faire tous les efforts afin de s'assurer que les antisérums utilisés conviennent pour la recherche de
tous les sérotypes de Salmonella. Dans ce but, on pourra se servir d'antisérums préparés par un fournisseur dont
la compétence est reconnue (par exemple, par un organisme gouvernemental approprié).
6 Appareillage et verrerie
Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, si les spécifications sont
similaires.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave)
Voir l'ISO 7218.
6.2 Enceinte de séchage, ou étuve, ventilée par convection, réglable entre 37 °C et 55 °C.
6.3 Étuve, réglable à 37 °C ± 1 °C.
6.4 Bain d'eau, réglable à 41,5 °C ± 1 °C, ou étuve, réglable à 41,5 °C ± 1 °C.
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ISO 6579:2002(F)
6.5 Bains d'eau, réglables de 44 °C à 47 °C.
6.6 Bain d'eau, réglable à 37 °C ± 1 °C.
Il est recommandé d'utiliser des bains d'eau (6.4, 6.5 et 6.6) contenant un agent antibactérien, la dose infectante
de Salmonella étant faible.
6.7 Anses bouclées, d'environ 3 mm de diamètre ou 10 µl, ou pipettes stériles.
6.8 pH-mètre, ayant une précision de réglage de ± 0,1 unité de pH de 20 °C à 25 °C.
6.9 Tubes à essai, ou flacons, de capacité appropriée.
Des bouteilles ou flacons à capsules métalliques ou en matière plastique à vis non toxiques peuvent être utilisés.
6.10 Pipettes graduées ou pipettes automatiques, de 10 ml et 1 ml de capacités nominales, graduées
respectivement en divisions de 0,5 ml et 0,1 ml.
6.11 Boîtes de Petri, de petites dimensions (diamètre de 90 mm à 100 mm) et/ou de grandes dimensions
(diamètre de 140 mm).
7 Échantillonnage
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié lors
du transport et de l'entreposage.
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Voir la Norme
internationale spécifique du produit concerné. S'il n'y a pas de Norme internationale spécifique disponible, il est
recommandé que les parties concernées se mettent d'accord à ce sujet.
8 Préparation de l'échantillon pour essai
Préparer l'échantillon pour essai conformément à la Norme internationale spécifique du produit concerné. S'il
n'existe pas de Norme internationale spécifique, il est recommandé que les parties concernées se mettent d'accord
à ce sujet.
9 Mode opératoire (voir le schéma en annexe A)
9.1 Prise d'essai et suspension mère
9.1.1 Généralités
Voir l'ISO 6887-1 et la Norme internationale concernant le produit à examiner. Pour le lait et les produits laitiers,
voir l’ISO 8261.
Pour la préparation de la suspension mère, utiliser dans le cas général comme diluant le milieu de
préenrichissement spécifié en 5.2.1 et 4.2 (eau peptonée tamponnée).
Si la masse de la prise d'essai spécifiée n'est pas de 25 g, utiliser la quantité nécessaire de milieu de
préenrichissement pour obtenir une dilution au 1/10.
Afin de réduire la somme de travail d'examen, lorsqu'on doit examiner plus d'une prise d'essai de 25 g provenant
d'un lot déterminé de produit alimentaire, et lorsqu'on dispose de preuves indiquant qu'un mélange (réunissant les
prises d'essai) ne modifie pas les résultats en ce qui concerne ce produit alimentaire en particulier, les prises
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ISO 6579:2002(F)
d'essai peuvent être mélangées. Par exemple, si l'on doit examiner 10 prises d'essai de 25 g, il est possible de
combiner ces 10 unités afin d'obtenir une prise d’essai composite de 250 g et ajouter 2,25 l de bouillon de
préenrichissement; ou bien encore réunir les portions de 0,1 ml (dans 10 ml de bouillon RVS) et de 1 ml (dans
10 ml de bouillon MKTTn) des bouillons de préenrichissement provenant des 10 prises d'essai séparées (voir
9.3.1) pour en enrichir 100 ml des milieux d'enrichissement sélectif.
9.1.2 Préparations spécifiques de la suspension mère pour certains aliments
NOTE Les préparations spécifiques suivantes ne concernent que les Salmonella. Les préparations spécifiques applicables
à tous micro-organismes sont décrites dans l’ISO 6887-2, l’ISO 6887-3, l’ISO 6887-4 et l’ISO 8261.
9.1.2.1 Cacao et produits contenant du cacao (par exemple, plus de 20 %)
Ajouter à l'eau peptonée tamponnée (5.2.1) de préférence 50 g/l de caséine (éviter l’emploi de caséine acide), ou
bien 100 g/l de lait écrémé en poudre, et ajouter, après environ 2 h d'incubation, 0,018 g/l de vert brillant, s’il est
probable que le produit soit fortement contaminé par des flores Gram positif.
9.1.2.2 Aliments acides et acidifiants
S'assurer que la valeur du pH ne descende pas au-dessous de 4,5 pendant le préenrichissement.
NOTE Le pH d'aliments acides et acidifiants est plus stable quand de l'eau peptonée tamponnée à double titre est utilisée.
9.2 Préenrichissement non sélectif
Incuber la suspension mère (9.1) à 37 °C ± 1 °C pendant 18 h ± 2 h.
9.3 Enrichissement sélectif
9.3.1 Transférer 0,1 ml de la culture obtenue en 9.2 dans un tube contenant 10 ml de bouillon RVS (5.2.2);
transférer 1 ml de la culture obtenue en 9.2 dans un tube contenant 10 ml de bouillon MKTTn (5.2.3).
9.3.2 Incuber le bouillon RVS ensemencé (9.3.1) à 41,5 °C ± 1 °C pendant 24 h ± 3 h et le bouillon MKTTn à
37 °C ± 1 °C pendant 24 h ± 3 h. Il convient de s’assurer que la température maximale d’incubation (42,5 °C) ne
soit dépassée à aucun moment.
9.4 Isolement et identification
9.4.1 À partir de la culture obtenue dans le bouillon RVS (9.3.2), après 24 h ± 3 h d'incubation, ensemencer avec
une anse (6.7) la surface d'une grande boîte de Petri (6.11) contenant le premier milieu d'isolement sélectif (gélose
XLD, voir 5.2.4.1), de façon à permettre le développement de colonies bien isolées.
À défaut de grandes boîtes, utiliser deux petites boîtes, l'une après l'autre, en se servant de la même anse.
Opérer de même avec le deuxième milieu d'isolement sélectif (5.2.4.2) en se servant d'une nouvelle anse et de
boîtes de Petri de dimensions appropriées.
9.4.2 À partir de la culture obtenue dans le bouillon MKTTn (9.3.2), après 24 h ± 3 h d'incubation, répéter les
opérations décrites en 9.4.1 avec les deux milieux d'isolement sélectifs.
9.4.3 Dans le cas du premier milieu d'isolement (5.2.4.1), retourner les boîtes (9.4.1 et 9.4.2), les placer dans
une étuve (6.3) réglée à 37 °C. Pour le second milieu d'isolement (5.2.4.2), suivre les recommandations du
fabricant.
9.4.4 Après 24 h ± 3 h d'incubation, examiner les boîtes (9.4.3) afin de rechercher la présence de colonies
typiques de Salmonella, ainsi que les colonies atypiques susceptibles d'être des Salmonella (voir note). Marquer
leur position sur le dessous de la boîte.
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ISO 6579:2002(F)
Les colonies typiques de Salmonella cultivées sur gélose XLD ont un centre noir et sont entourées d’un halo clair
transparent rouge dû à un changement de l’indicateur du milieu.
NOTE Les variantes Salmonella H S négatif (par exemple S. Paratyphi A) cultivées sur gélose XLD sont roses avec un
2
centre rose foncé. Les Salmonella lactose positif cultivées sur gélose XLD sont jaunes sans noircissement.
Incuber le second milieu sélectif à la température et au temps appropriés puis examiner la présence de colonies
qui, d’après leurs caractéristiques, peuvent être considérées comme des Salmonella présumées.
9.5 Confirmation
9.5.1 Généralités
Les galeries d'identification, actuellement disponibles dans le commerce et permettant d'identifier les Salmonella,
peuvent être utilisées. Ces kits d’identification concernent l’identification biochimique des colonies. Il convient
d’utiliser ces kits en suivant les instructions du fabricant.
NOTE La reconnaissance de colonies de Salmonella est en grande partie une question d'expérience et leur aspect peut
quelquefois varier, non seulement d'une espèce à une autre, mais également d'un lot de milieu de culture à un autre.
9.5.2 Choix des colonies pour la confirmation
Pour la confirmation, prélever, à partir de chaque boîte (deux boîtes de petites dimensions ou une boîte de
grandes dimensions) de chacun des milieux sélectifs (voir 9.4), au moins une colonie considérée comme
caractéristique ou suspecte, puis quatre autres colonies si la première s’est révélée négative.
Dans le cas d’études épidémiologiques, il est recommandé que cinq colonies au moins soient identifiées. S'il se
trouve une boîte avec moins de cinq colonies caractéristiques ou suspectes, retenir toutes les colonies
caractéristiques ou suspectes.
Ensemencer les colonies sélectionnées sur la surface de boîtes de gélose nutritive (5.2.5), préalablement séchées,
de façon à permettre le développement de colonies bien isolées. Incuber les boîtes ainsi ensemencées (9.4.3) à
37 °C ± 1 °C durant 24 h ± 3 h.
Utiliser des cultures pures pour les confirmations biochimiques et sérologiques.
9.5.3 Confirmation biochimique
9.5.3.1 Généralités
À l'aide d'un fil à ensemencer, ensemencer les milieux indiqués de 9.5.3.2 à 9.5.3.7 avec chacune des cultures
obtenues à partir des colonies retenues en 9.5.2.
9.5.3.2 Gélose TSI (5.2.6)
Ensemencer la pente du milieu en stries et le culot par piqûre. Incuber à 37 °C ± 1 °C durant 24 h ± 3 h.
Interpréter les phénomènes se produisant, de la façon suivante.
a) Culot
jaune glucose positif (utilisation du glucose)
rouge ou inchangé glucose négatif (pas d’utilisation du glucose)
noir formation de sulfure d'hydrogène
bulles ou fissures formation de gaz à partir du glucose
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ISO 6579:2002(F)
b) Pente de la gélose
jaune lactose et/ou saccharose positifs (utilisation du lactose et/ou du saccharose)
rouge ou inchangé lactose et saccharose négatifs (pas d'utilisation ni du lactose ni du saccharose)
Les cultures caractéristiques de Salmonella correspondent à une pente alcaline (rouge) et un culot acide (jaune)
avec formation de gaz (bulles), et (dans environ 90 % des cas) formation de sulfure d'hydrogène (noircissement de
la gélose) (9.5.3.8).
Lorsqu'on isole une Salmonella lactose positif (voir 4.4), la pente de la gélose TSI est jaune. En conséquence, une
confirmation préliminaire de cultures de Salmonella ne doit pas être fondée uniquement sur les résultats obtenus à
partir de la gélose TSI (voir 9.5.3).
9.5.3.3 Gélose à l'urée (5.2.7)
Ensemencer en stries la pente de la gélose. Incuber à 37 °C ± 1 °C durant 24 h ± 3 h et examiner de temps en
temps.
En cas de réaction positive, la décomposition de l'urée produit un dégagement d'ammoniac, faisant virer le rouge
de phénol au rose, puis au rouge foncé. La réaction est souvent visible au bout de 2 h à 4 h.
9.5.3.4 Milieu de décarboxylation de la L-lysine (5.2.8)
Ensemencer le milieu liquide juste au-dessous de la surface. Incuber à 37 °C ± 1 °C durant 24 h ± 3 h.
Une turbidité et une couleur violette après incubation indique une réaction positive. Une couleur jaune indique une
réaction négative.
9.5.3.5 Recherche de la β-galactosidase (5.2.9)
Mettre en suspension une anse de la colonie suspecte dans un tube contenant 0,25 ml de la solution saline
(5.2.13).
Ajouter 1 goutte de toluène et agiter le tube. Placer le tube dans le bain d'eau (6.6) réglé à 37 °C et l'y laisser
séjourner quelques minutes (environ 5 min). Ajouter 0,25 ml du réactif pour la recherche de la β-galactosidase et
mélanger.
Replacer le tube dans le bain d'eau réglé à
...
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