ISO 6579:2002/Amd 1:2007
(Amendment)Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of Salmonella spp. — Amendment 1: Annex D: Detection of Salmonella spp. in animal faeces and in environmental samples from the primary production stage
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of Salmonella spp. — Amendment 1: Annex D: Detection of Salmonella spp. in animal faeces and in environmental samples from the primary production stage
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche des Salmonella spp. — Amendement 1: Annexe D: Recherche des Salmonella spp. dans les matières fécales des animaux et dans des échantillons environnementaux au stade de la production primaire
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 6579
Fourth edition
2002-07-15
AMENDMENT 1
2007-07-15
Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Horizontal method for the
detection of Salmonella spp.
AMENDMENT 1: Annex D: Detection of
Salmonella spp. in animal faeces and in
environmental samples from the primary
production stage
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche
des Salmonella spp.
AMENDEMENT 1: Annexe D: Recherche des Salmonella spp. dans les
matières fécales des animaux et dans des échantillons
environnementaux au stade de la production primaire
Reference number
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The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
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Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Amendment 1 to ISO 6579:2002 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products,
Subcommittee SC 9, Microbiology.
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Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal
method for the detection of Salmonella spp.
AMENDMENT 1: Annex D: Detection of Salmonella spp. in animal
faeces and in environmental samples from the primary production
stage
Page 1, Clause 2
Replace the introductory text as follows and add the two references.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production
of culture media — Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the
laboratory
ISO/TS 11133-2:2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and
production of culture media — Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
Page 27, after Annex C
Add the following as Annex D.
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Annex D
(normative)
Detection of Salmonella spp. in animal faeces and in environmental
samples from the primary production stage
D.1 Introduction
The method given in the main text of this International Standard is primarily intended for the isolation of
Salmonella spp. from food and feeding stuffs and is not always suitable for the detection of Salmonella spp.
from other matrices.
This annex is applicable to the detection of Salmonella spp. in
⎯ animal faeces (such as from poultry, pigs, cattle), and
⎯ environmental samples in the area of the primary production stage (such as dust).
The method in this annex is based upon Clause 9, with a different selective enrichment medium. Therefore,
where possible, reference will be made to Clause 9.
The selective enrichment medium as described in this annex (modified semi-solid Rappaport-Vassiliadis:
MSRV) is intended for the detection of motile Salmonellae and is not appropriate for the detection of
non-motile Salmonellae.
NOTE The non-motile Salmonella biovars of Salmonella Gallinarum (Salmonella Gallinarum biovar gallinarum and
Salmonella Gallinarum biovar pullorum do not seem to survive long in environmental samples and will therefore rarely be
detected in faecal or environmental (such as dust) samples (regardless of the method). The number of other non-motile
Salmonella serovars in faecal samples seems to be generally low. For example, in Reference [7] in which
circa 1 000 faecal samples of poultry layer flocks and circa 900 faecal samples of broiler flocks were analysed, less than
1 % of the total number of samples were positive in a selective broth and at the same time negative on MSRV (and likely
to be non-motile). Similar results were found in a Dutch study with circa 3 200 faecal samples of pigs (non-published data).
On the other hand, in the case of the study in Reference [7], up to almost 40 % of positive samples would not have been
detected (i.e. false negatives) if only a selective broth (in this case Rappaport Vassiliadis) had been used instead of a
semi-solid medium.
D.2 Principle
D.2.1 General
The detection of Salmonella in animal faeces and in samples of the primary production stage necessitates
four stages, as described in Clause 4.
D.2.2 Pre-enrichment in non-selective liquid medium
Buffered peptone water (BPW) is inoculated at ambient temperature with the test portion, then incubated
at 37 °C ± 1 °C for 18 h ± 2 h.
D.2.3 Enrichment on selective semi-solid medium
Modified semi-solid Rappaport-Vassiliadis (MSRV) agar plates are inoculated with the culture obtained
in D.2.2.
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The MSRV is incubated at 41,5 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h. If a plate is negative after 24 h, it is incubated for a
further 24 h ± 3 h.
D.2.4 Selective plating and identification
From the culture obtained in D.2.3, two selective solid media are inoculated:
⎯ xylose lysine deoxycholate (XLD) agar;
⎯ any other solid selective medium complementary to XLD agar (see 4.4).
The XLD agar is incubated at 37 °C ± 1 °C and examined after 24 h ± 3 h.
The second selective medium is incubated in accordance with the manufacturer’s instructions.
D.2.5 Confirmation of identity
Colonies of presumptive Salmonella are subcultured, then plated-out as described in D.2.4, and their identity
is confirmed by means of appropriate biochemical and serological tests.
D.3 Culture media, reagents and sera
D.3.1 General
For current laboratory practice, see ISO 7218.
All media and reagents needed for this annex are described in Annex B, except for modified semi-solid
Rappaport-Vassiliadis (MSRV) medium, which is described in D.3.2. Alternatively, dehydrated complete media
or diluents may be used. Follow, in that respect, the manufacturer’s instructions.
NOTE The composition of MSRV, as described in Reference [8], contained 20 mg/l of novobiocin. However, from a
scientific point of view, 10 mg/l novobiocin is preferred. In studies performed at the CRL-Salmonella, more Salmonella-
positive results were found in pig faeces samples when tested with MSRV containing 10 mg/l than with MSRV containing
20 mg/l novobiocin (see Reference [9]). Furthermore, when testing different animal faeces (pigs, chicken, cattle) and
naturally contaminated dust, the migration zones on MSRV containing 10 mg/l novobiocin were (much) larger than on
MSRV containing 20 mg/l novobiocin (Reference [9]). The influence of novobiocin on bacterial motility was earlier
described in Reference [10].
For the preparation of the selective plating agar media (see B.4, XLD-agar), standard size Petri dishes may be
used (90 mm or 100 mm) instead of large size Petri dishes (140 mm).
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D.3.2 Modified semi-solid Rappaport-Vassiliadis medium (MSRV)
D.3.2.1 Base medium
D.3.2.1.1 Composition
Enzymatic digest of animal and plant tissue 4,6 g
Acid hydrolysate of casein 4,6 g
Sodium chloride (NaCl) 7,3 g
Potassium dihydrogenphosphate (KH PO) 1,5 g
2 4
Magnesium chloride anhydrous (MgCl) 10,9 g
2
Malachite green oxalate 0,04 g
Agar 2,7 g
Water 1 000 ml
D.3.2.1.2 Preparation
Suspend the ingredients into the water.
Heat to boiling with agitation. Do not autoclave.
Do not hold the medium at high temperatures longer than necessary.
Cool the medium to 47-50 °C.
D.3.2.2 Novobiocin solutio
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 6579
Quatrième édition
2002-07-15
AMENDEMENT 1
2007-07-15
Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour la recherche des
Salmonella spp.
AMENDEMENT 1: Annexe D: Recherche
des Salmonella spp. dans les matières
fécales des animaux et dans des
échantillons environnementaux au stade de
la production primaire
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for
the detection of Salmonella spp.
AMENDMENT 1: Annex D: Detection of Salmonella spp. in animal
faeces and in environmental samples from the primary production stage
Numéro de référence
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'Amendement 1 à l'ISO 6579:2002 a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 9, Microbiologie.
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Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la
recherche des Salmonella spp.
AMENDEMENT 1: Annexe D: Recherche des Salmonella spp. dans
les matières fécales des animaux et dans des échantillons
environnementaux au stade de la production primaire
Page 1, Article 2
Remplacer le texte d'introduction par ce qui suit et ajouter les deux références suivantes.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO/TS 11133-1, Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de
culture — Partie 1: Guide général pour l'assurance de la qualité pour la préparation des milieux de culture en
laboratoire
ISO/TS 11133-2:2003, Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de
culture — Partie 2: Guide général pour les essais de performance des milieux de culture
Page 27, après l'Annexe C
Ajouter ce qui suit en temps qu'Annexe D.
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Annexe D
(normative)
Recherche des Salmonella spp. dans les matières fécales animales
et dans les échantillons environnementaux au stade de la
production primaire
D.1 Introduction
La méthode donnée dans le texte principal de la présente Norme internationale est conçue principalement
pour la recherche des Salmonella spp. dans les produits pour l'alimentation humaine et animale et n'est pas
toujours adaptée à la recherche des Salmonella spp. dans d'autres matrices.
La présente annexe s'applique à la recherche des Salmonella spp. dans
⎯ les matières fécales d'animaux (volailles, porcs, bovins, par exemple), et
⎯ les échantillons environnementaux au stade de la production primaire (poussière, par exemple).
La méthode spécifiée dans la présente annexe est fondée sur l'Article 9, mais avec un milieu d'enrichissement
sélectif différent. Par conséquent, chaque fois que cela est possible, référence est faite au texte de l'Article 9.
Le milieu d'enrichissement sélectif décrit dans la présente annexe [bouillon Rappaport-Vassiliadis semi-solide
(MSRV) modifié] est conçu pour la recherche des Salmonelles mobiles et n'est pas adapté à la recherche des
Salmonelles immobiles.
NOTE Il semble que les biovars de Salmonella immobile, Salmonella Gallinarum (Salmonella Gallinarum biovar
gallinarum et Salmonella Gallinarum biovar pullorum), ne survivent pas longtemps dans les échantillons
environnementaux, ils sont par conséquent rarement détectés dans les échantillons de fèces ou environnementaux
(poussière, par exemple) et cela quelle que soit la méthode. Il semble que le nombre des autres sérovars de Salmonella
immobiles soit généralement faible dans les échantillons de fèces. Par exemple, dans la Référence [7], environ
1 000 échantillons de fèces de poules pondeuses et environ 900 de poulets de chair ont été analysés, moins de 1 % du
nombre total d'échantillons étaient positifs en bouillon de culture sélectif et négatifs en MSRV (donc susceptibles d'être
immobiles). Une étude hollandaise menée sur environ 3 200 échantillons de fèces de porcs a fourni des résultats
similaires (données non publiées). D'autre part, dans l'étude de la Référence [7], au moins 40 % des échantillons positifs
n'auraient pas été détectés («faux négatifs») si un bouillon de culture sélectif avait uniquement été utilisé (dans ce cas, le
bouillon Rappaport-Vassiliadis) à la place d'un milieu semi-solide.
D.2 Principe
D.2.1 Généralités
La recherche des Salmonella dans les matières fécales animales et dans les échantillons du stade de la
production primaire nécessite quatre phases, comme décrit dans l'Article 4.
D.2.2 Préenrichissement en milieu non sélectif liquide
Ensemencer l'eau peptonée tamponnée (EPT) à température ambiante avec la prise d'essai, puis incuber
à 37 °C ± 1 °C pendant 18 h ± 2 h.
D.2.3 Enrichissement en milieu sélectif semi-solide
Ensemencer les boîtes de gélose semi-solide de Rappaport-Vassiliadis modifié (MSRV) avec la culture
obtenue en D.2.2.
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ISO 6579:2002/Amd.1:2007(F)
Incuber la boîte de MSRV à 41,5 °C ± 1 °C pendant 24 h ± 3 h. Si une boîte s'avère négative après 24 h,
l'incuber pendant 24 h ± 3 h supplémentaires.
D.2.4 Isolement et identification
À partir de la culture obtenue en D.2.3, ensemencer deux milieux sélectifs solides:
⎯ gélose au xylose à la lysine et au désoxycholate (gélose XLD);
⎯ un autre milieu solide sélectif complémentaire de la gélose XLD (voir en 4.4).
Incuber la gélose XLD à 37 °C ± 1 °C et l'examiner après 24 h ± 3 h.
Incuber le second milieu selon les instructions du fabricant.
D.2.5 Confirmation
Repiquage des colonies présumées être des Salmonella isolées en D.2.4 et confirmation au moyen des
essais biochimiques et sérologiques appropriés.
D.3 Milieux de culture, réactifs et sérums
D.3.1 Généralités
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir l'ISO 7218.
Tous les milieux et réactifs nécessaires à la présente annexe sont décrits dans l'Annexe B, à l'exception du
milieu semi-solide de Rappaport-Vassiliadis modifié (milieu MSRV) qui est décrit en D.3.2. Des milieux
complets déshydratés ou des diluants peuvent également être utilisés. Dans ce cas, suivre les instructions du
fabricant.
NOTE Le milieu MSRV tel qu'il est décrit dans la Référence [8] se compose de 20 mg/l de novobiocine. Cependant,
d'un point de vue scientifique, une teneur en novobiocine de 10 mg/l est préférable. Les études menées au laboratoire
communautaire de référence-Salmonella ont montré qu'un nombre plus important d'échantillons de fèces de porcs étaient
positifs en utilisant un milieu MSRV ne contenant que 10 mg/l de novobiocine, qu'en utilisant un milieu MSRV contenant
20 mg/l (voir Référence [9]). De plus, dans les essais sur les matières fécales de différents animaux (porcs, volailles,
bovins) et sur la poussière naturellement contaminée, les zones de migration en milieu MSRV contenant 10 mg/l de
novobiocine étaient plus importantes que celles en milieu MSRV en contenant 20 mg/l (Référence [9]). L'influence de la
novobiocine sur la mobilité bactérienne a été précédemment décrite dans la Référence [10].
Pour la préparation des milieux gélosés sélectifs (voir en B.4, la gélose XLD), des boîtes de Petri de
dimensions standards (90 mm ou 100 mm) peuvent être utilisées, à la place des boîtes de Petri de grandes
dimensions (140 mm).
© ISO 2007 – Tous droits réservés 3
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ISO 6579:2002/Amd.1:2007(F)
D.3.2 Milieu semi-solide de Rappaport-Vassiliadis modifié (MSRV)
D.3.2.1 Milieu de base
D.3.2.1.1 Composition
Digestat enzymatique de tissus animaux et végétaux 4,6 g
Hydrolysat acide de caséine 4,6 g
Chlorure de sodium (NaCl) 7,3 g
Phosphate monopotassique (KH PO) 1,5 g
2 4
Chlorure de magnésium anhydre (MgCl) 10,9 g
2
Oxalate de vert de malachite 0,04 g
Agar-agar 2,7 g
Eau 1 000 ml
D.3.2.1.2 Préparation
Mettre en suspension les ingrédients dans l'eau.
Porter à ébullition en mélangeant. Ne pas autoclaver.
Ne pas maintenir le milieu à des températures élevées plus longtemps que nécessaire.
Laisser refroidir le milieu à une température de 47 °C à 50 °C.
D.3.2.2 Solution de novobiocine
D.3.2.2.1 Composition
Sel monodosique de novobiocine 0,05 g
Eau 10 ml
D.3.2.2.2 Prépar
...
Questions, Comments and Discussion
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