Molecular biomarker analysis -- Methods of analysis for the detection and identification of animal species in foods and food products (nucleic acid-based methods) -- General requirements and definitions

This document specifies minimum requirements of performance characteristics for the detection of nucleic acid sequences (DNA) by molecular methods, such as the polymerase chain reaction (PCR), including different post-PCR detection methods, real-time PCR, single and/or multiple probe-based detection techniques as well as the combination of such methods. The document is applicable to the detection, identification and quantification of DNA from animal species of higher and lower taxonomic groups in foodstuffs, and the validation of applicable methods. It is applicable to mammals, birds, reptiles, amphibians, fishes, molluscs, crustaceans and insects. Typical examples for each are listed in Annex A.

Analyse moléculaire de biomarqueurs -- Méthodes d'analyse pour la détection et l'identification des espèces animales dans les aliments et les produits alimentaires (méthodes basées sur l'utilisation des acides nucléiques) -- Exigences générales et définitions

Le présent document spécifie les exigences minimales concernant les caractéristiques de performances pour la détection de séquences d'acide nucléique (ADN) par des méthodes moléculaires telles que la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), incluant différentes méthodes de détection post-PCR, la PCR en temps réel, des techniques de détection basées sur une et/ou plusieurs sondes, ainsi que la combinaison de ces méthodes. Le présent document est applicable ŕ la détection, l'identification, la quantification de l'ADN d'espčces animales appartenant ŕ des groupes taxonomiques supérieurs ou inférieurs dans les produits alimentaires, ainsi que la validation des méthodes applicables. Il est applicable aux mammifčres, aux oiseaux, aux reptiles, aux amphibiens, aux poissons, aux mollusques, aux crustacés et aux insectes. Pour chacun d'entre eux, des exemples typiques sont fournis dans l'Annexe A.

General Information

Status
Published
Publication Date
08-May-2019
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
16-Apr-2019
Completion Date
09-May-2019
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ISO 20813:2019 - Molecular biomarker analysis -- Methods of analysis for the detection and identification of animal species in foods and food products (nucleic acid-based methods) -- General requirements and definitions
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ISO 20813:2019 - Analyse moléculaire de biomarqueurs -- Méthodes d'analyse pour la détection et l'identification des especes animales dans les aliments et les produits alimentaires (méthodes basées sur l'utilisation des acides nucléiques) -- Exigences générales et définitions
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20813
First edition
2019-05
Molecular biomarker analysis —
Methods of analysis for the detection
and identification of animal species
in foods and food products (nucleic
acid-based methods) — General
requirements and definitions
Analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes d'analyse pour la
détection et l'identification des espèces animales dans les aliments et
les produits alimentaires (méthodes basées sur l'utilisation des acides
nucléiques) — Exigences générales et définitions
Reference number
ISO 20813:2019(E)
ISO 2019
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ISO 20813:2019(E)
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© ISO 2019

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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 20813:2019(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Performance characteristics of the methods .......................................................................................................................... 2

4.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 2

4.2 Scope of the method ........................................................................................................................................................................... 2

4.3 Scientific basis ......................................................................................................................................................................................... 2

4.4 Units of measurement ......... .............................................................................................................................................................. 2

4.5 Applicability .............................................................................................................................................................................................. 2

4.6 Specificity .................................................................................................................................................................................................... 3

4.6.1 General...................................................................................................................................................................................... 3

4.6.2 Requirements for inclusivity testing .............................................................................................................. 3

4.6.3 Requirements for exclusivity testing .............................................................................................................. 3

4.7 Sensitivity .................................................................................................................................................................................................... 4

4.7.1 General...................................................................................................................................................................................... 4

4.7.2 Limit of detection (LOD) ........................................................................................................................................... 4

4.8 Specific requirements for quantitative methods ....................................................................................................... 5

4.8.1 General...................................................................................................................................................................................... 5

4.8.2 Limit of quantification (LOQ) ................................................................................................................................ 5

4.8.3 Dynamic range ................................................................................................................................................................... 5

4.8.4 Determination of precision and trueness for quantitative methods .................................. 6

4.9 Robustness ................................................................................................................................................................................................. 6

4.9.1 General...................................................................................................................................................................................... 6

4.9.2 Robustness determination by interlaboratory study ....................................................................... 6

4.9.3 Robustness determination by a multifactorial orthogonal test design ............................ 6

5 Single-laboratory validation .................................................................................................................................................................... 6

6 Interlaboratory study (collaborative study) ............................................................................................................................ 7

6.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 7

6.2 Qualitative methods............................................................................................................................................................................ 7

6.3 Quantitative methods ........................................................................................................................................................................ 7

7 General laboratory and procedural requirements ........................................................................................................... 7

7.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 7

7.2 Facilities, materials and equipment ...................................................................................................................................... 8

7.3 Sample preparation and DNA extraction .......................................................................................................................... 8

7.4 Use of controls ......................................................................................................................................................................................... 9

7.5 Data analysis ............................................................................................................................................................................................. 9

7.5.1 Control ...................................................................................................................................................................................... 9

7.5.2 Conventional PCR .........................................................................................................................................................10

7.5.3 Real-time PCR amplification curves .............................................................................................................10

7.6 Expression of results .......................................................................................................................................................................10

7.6.1 Expression of positive results ............................................................................................................................10

7.6.2 Expression of negative results ..........................................................................................................................11

7.6.3 Expression of quantitative results .................................................................................................................11

8 Test report ................................................................................................................................................................................................................11

Annex A (informative) List of typical species used for inclusivity and exclusivity testing ........................12

Annex B (informative) Examples of unit conversion methods from DNA copy numbers to

the ratio of masses ...........................................................................................................................................................................................17

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................26

© ISO 2019 – All rights reserved iii
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ISO 20813:2019(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso

.org/iso/foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,

Horizontal methods for molecular biomarker analysis.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
iv © ISO 2019 – All rights reserved
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 20813:2019(E)
Molecular biomarker analysis — Methods of analysis
for the detection and identification of animal species in
foods and food products (nucleic acid-based methods) —
General requirements and definitions
1 Scope

This document specifies minimum requirements of performance characteristics for the detection of

nucleic acid sequences (DNA) by molecular methods, such as the polymerase chain reaction (PCR),

including different post-PCR detection methods, real-time PCR, single and/or multiple probe-based

detection techniques as well as the combination of such methods.

The document is applicable to the detection, identification and quantification of DNA from animal

species of higher and lower taxonomic groups in foodstuffs, and the validation of applicable methods.

It is applicable to mammals, birds, reptiles, amphibians, fishes, molluscs, crustaceans and insects.

Typical examples for each are listed in Annex A.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 16577, Molecular biomarker analysis — Terms and definitions

ISO 24276, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — General requirements and definitions
3 Terms and definitions

For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577, ISO 24276 and the

following apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
basic local alignment search tool
BLAST

sequence comparison algorithm optimized for speed that is used to search sequence databases for

optimal local alignments to a query

Note 1 to entry: This algorithm directly approximates alignments that optimize a measure of local similarity, the

maximum signal pair (MST) score or high-scoring segment pair (HSP) score.
Note 2 to entry: See Reference [2].
Note 3 to entry: BLASTn is applicable to nucleotide sequence comparison.
© ISO 2019 – All rights reserved 1
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ISO 20813:2019(E)
3.2
conventional polymerase chain reaction
conventional PCR

PCR method that requires a post-PCR step such as gel electrophoresis for detection or visualization of

amplification products to provide a qualitative result
4 Performance characteristics of the methods
4.1 General

The methods to be used for animal species analysis shall meet the performance characteristics in

accordance with this document. The results of all interlaboratory and/or single-laboratory validations

and the performance characteristics shall be described.

NOTE Some guidelines are available for implementation of methods, see Reference [10].

4.2 Scope of the method

Information regarding the intended use and the limitations of the methods shall be provided. In

particular, information shall indicate that the criteria set out in this document have been fulfilled.

4.3 Scientific basis

An overview of the principles and references to relevant scientific publications should be provided.

4.4 Units of measurement

Qualitative analyses indicate the presence or absence (lack of detection) of a certain target.

In quantitative analyses, the measured value is calculated as ratio of DNA copy numbers (c/c). The use

of this ratio should examine possible influences, including the number of DNA copies with regard to the

target in the genome. Other units (e.g. ratio of masses) can be employed. The principles of calculation of

the ratio shall be reported.

If a quantitative method is intended to judge the mass/mass ratio of different animal species ingredients

in a sample, it should be indicated that the values measured for the DNA copy number ratio cannot

reflect in all cases the mass/mass ratio of animal constituents in the sample.
4.5 Applicability

When assessing if a method is fit for purpose, the following aspects regarding the nature of the target

should be considered:
— the location of the target (nuclear or mitochondrial);
— the copy number per cell;
— the length of the target sequence.

For quantitative species-specific methods, a nuclear gene, excluding mitochondrial DNA shall be

targeted. The target sequence shall be present as a single copy per haploid genome or the copy number

shall be determined/known.

When assessing if a method is fit for purpose, the following aspects regarding the matrix should be

considered:
— the nature of the potential sample matrices;
— the degree of processing of the sample constituents;
2 © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 20813:2019(E)
— the different species and animal tissue types involved;
— the preparation of the sample matrix.

The applicability of the method shall be tested by extracting DNA from test samples reflecting the

matrices and analytical scope.

DNA should be extracted from a minimum of three matrices of the most relevant types, including those

types reflecting the method scope, containing a known mass/mass content of the target(s) species

materials (evenly distributed over the percentage dynamic range of the method) and tissues relevant

for the application.

NOTE 1 Mitochondrial PCR targets cannot be used for reliable quantification of haploid genome copy number

ratios of different species, because the number of mitochondrial targets differs with tissue type.

NOTE 2 Different animal tissue types can have variable DNA contents per mass equivalent.

NOTE 3 The practical limit of detection (LOD) (see ISO 21569) can differ significantly for different matrices.

Furthermore, different processing grades of animal constituents in the same product will further contribute to

DNA degradation and a possible asymmetric DNA distribution between ingredients. For example, a product can

be composed of different types of animal tissue containing different amounts of DNA. This imbalance can be

further intensified if some ingredients underwent pre-processing, like cooking or acid treatment, lowering DNA

quality, whereas other ingredients were added for example raw or processed differently.

4.6 Specificity
4.6.1 General

The specificity should be assessed in a two-step procedure: theoretical and experimental evaluation of

the inclusivity and exclusivity.

In silico testing of the specificity of primers and probes with available bioinformatics tools shall be

performed.
[1] [2]

NOTE 1 Examples are testing primer-dimer formation with primer3 and BLAST searches in nucleic acid

sequence databases.

If sequence data are used for verification of animal speciation results, they should be based on

appropriate databases with due consideration of the timing of submission of individual entries and any

subsequent changes in taxonomic classification or naming.

NOTE 2 In cases of unexpected results, further investigation can be carried out with appropriate techniques,

such as sequencing, gel electrophoresis or hybridization techniques in order to confirm reference material

identity.
4.6.2 Requirements for inclusivity testing

Experimental results from testing the method with the target animal species should be provided.

This testing should include relevant breeds of the animal species according to the scope of the

method (see 4.2).
[6]

Material for experimental inclusivity testing should contain approximately 100 target DNA copies .

Each sample material shall be at a minimum tested in duplicate. Sequence variants of the target animal

species should be detected with comparable amplification efficiency, if they occur.

NOTE The target animal species for inclusivity testing are normally more than five breeds.

4.6.3 Requirements for exclusivity testing

Experimental results from testing the method with non-target animal species shall be provided. This

testing should include both taxonomically close and not closely related animal species. Animal species

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ISO 20813:2019(E)

or taxonomic groups relevant with regard to the scope of the method shall be tested, e.g. species

commonly used in food in general and particularly in matrices considered in the scope of the method.

The method should clearly distinguish between target and non-target animal species.

[6]

Sufficient DNA should be used for experimental exclusivity testing. A number of 2 500 target copies

ensures that cross reactivity can be identified.

Select a minimum of 10 species that could cause interference with the target animal species present in

the food test material. Examples of suitable organisms are listed in Annex A.

Other species should be included if relevant, e.g. if there are sequence homologies of oligonucleotides to

nucleic acid sequences.
Cross-reactivity of matrix should be characterized.

The suitability of the DNA used for amplification should be confirmed by an amplification control, e.g.

by a single copy (chromosomal) DNA consensus PCR system (e.g. myostatin or actin).

4.7 Sensitivity
4.7.1 General

Experimental results from testing the method at different concentrations in order to test the range of

use of the method shall be available. They shall be described in the validation report.

If applicable, detailed information about how a cut-off value can be established and used in the

laboratory should be provided.

Animal species that require qualitative testing should be detected at levels relevant for the interested

party, e.g. the consumer.
4.7.2 Limit of detection (LOD)
4.7.2.1 Absolute LOD

The absolute LOD (LOD ) shall be indicated in copy numbers of the target sequence per reaction with

abs
the confidence level (typically 95 %) specified.

NOTE 1 Twenty copies or less can be applied for single copy genes and an appropriate number of haploid

genome equivalents for high copy number genes.

NOTE 2 If for the LOD determination a DNA with known copy number of target sequence is not available,

plasmid DNA can be used.

The LOD of the method is determined experimentally by preparing a dilution series of target material

abs

with dilutions in the range of the expected/targeted limit of detection. Guidance for assessment of the

LOD is described in Reference [6].
abs
4.7.2.2 Relative LOD

The relative LOD (LOD ) shall be determined in relevant non-target animal species DNA as

rel

background. Depending on test requirements, the LOD is adjusted to this value. The LOD expresses

rel rel

the relative c/c % of the target animal species DNA in other animal species DNA which is detected with

95 % confidence.

The LOD should be determined experimentally by preparing one or more defined reference samples

rel

with defined percentage content of the target DNA in the range of the limit of detection. Each reference

sample is analysed in at least 10 replicates. The percentage of the reference sample where at least 95 %

of the replicates give positive results is considered the LOD .
rel
4 © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 20813:2019(E)
4.7.2.3 Asymmetric LOD (for multiplex methods only)

In the case of multiplex methods where the detection of different targets is restricted by competitive

effects, as in the case of multiplex real-time PCR methods, the LOD for the single targets in an

asymmetric target situation expressed as target ratio needs to be validated. Different contents of

the specific animal target sequence are mixed to obtain defined copy ratios (i.e. ratios of 1:1 000 and

1 000:1; 1:100 and 100:1). The ratio where each target animal is detected with 95 % confidence is

determined experimentally with an appropriate number of replicates for the defined reference sample.

4.8 Specific requirements for quantitative methods
4.8.1 General

The upper and lower limit of the linear range of the method shall be determined. The assessment of

these limits and the linear range shall be carried out on samples containing animal non-target DNA

relevant to the food item.
4.8.2 Limit of quantification (LOQ)

The absolute LOQ (LOQ ) shall be indicated as copy numbers of the target sequence. It shall be equal

abs
to the smallest amount included in the dynamic range.

The relative LOQ (LOQ ) shall be determined in DNA of other relevant animal species. Depending on

rel

the test requirements, the LOQ should be adjusted to this value. The LOQ expresses the ratio of the

rel rel

target animal species DNA copy number to other animal species DNA copies or to the DNA copies of a

reference gene representative for the whole taxonomic rank. The LOQ should be equal to the smallest

rel
concentration included in the dynamic range.

If, for the LOQ determination, a DNA with known copy number of target sequence is not available,

plasmid DNA should be used. This plasmid can also serve as a calibrator.

A minimum of 15 replicates with a target concentration of the expected LOQ shall be tested. The criteria

for precision and trueness shall be fulfilled for the results.

NOTE The LOQ values reported from collaborative study data generally refer to the lowest level of analyte

that was observed to have a relative reproducibility standard deviation of 25 % or less.

4.8.3 Dynamic range

The dynamic range should cover the percentage values as well as the copy numbers according to the

expected use and scope of the method.

In order to define the relevant minimum copy number, the desired dynamic range in terms of target

copy percentages shall be determined. It should be considered that the genome size of the species in the

expected sample material restricts the maximum copy number that can be used for the analysis (e.g.

100 ng to 200 ng, depending on the method).

NOTE 1 For example, for cattle, a genome size of 4 pg can be assumed, which results in a maximum copy

[18][22]
number of 25 000 in 100 ng of sample DNA material. See Table B.2 .

The copy numbers of the dynamic range for both, target and reference sequence, shall be then

determined as follows:

— for the reference sequence, the maximum number of copies can be calculated considering genome

sizes and amount of sample DNA used for analysis as described above;

— for the target, the lowest copy number should be the absolute LOQ; as a prerequisite, the lowest

possible value considering the ratio compared to the maximum number of copies of total/reference

DNA should be taken into consideration;
© ISO 2019 – All rights reserved 5
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ISO 20813:2019(E)

— the minimum copy number of the reference sequence and the maximum copy number for the target

sequence should be given by the ratio of the minimum and maximum, respectively, percentage value.

NOTE 2 The dynamic range is established on the basis of a standard curve with a minimum of four

concentration levels evenly distributed at least in duplicate.

NOTE 3 For a desired upper limit of the percentage dynamic range of 100 %, the minimum copy number of the

reference can be equal to the lower limit of the copy number range of the target sequence, and for a desired LOQ

of 0,1 % at an absolute LOQ of 30 copies, the upper limit of the reference target is 30,000 copies.

4.8.4 Determination of precision and trueness for quantitative methods

The precision should be determined and expressed as relative repeatability standard deviation (S ).

A sufficient number of replicates (at least 15) for at least three DNA materials with different target

percentages covering the whole dynamic range should be analysed.
NOTE Mitochondrial DNA cannot be used for the targets of quantitative methods.

The S for all replicates shall be ≤ 25 % over the whole dynamic range of the method.

The trueness shall be within 25 % of the accepted reference value for all replicates over the whole

dynamic range of the method.
4.9 Robustness
4.9.1 General

Results from the empirical testing of the method against small but deliberate variations in method

parameters (e.g. variation in concentration of kit components, variation in apparatus) should be

provided, if available.
4.9.2 Robustness determination by interlaboratory study

An interlaboratory study introduces a deliberate change in the laboratory performing the method and

meets the criteria for an evaluation of robustness. Empirically, a robust method shall be selected by

considering that the results from different laboratories do not vary significantly.

4.9.3 Robustness determination by a multifactorial orthogonal test design

The test should be carried out in a multifactorial approach where several alterations, including, but

not limited to, mastermix concentration, reaction volume
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 20813
Première édition
2019-05
Analyse moléculaire de
biomarqueurs — Méthodes d'analyse
pour la détection et l'identification
des espèces animales dans les
aliments et les produits alimentaires
(méthodes basées sur l'utilisation
des acides nucléiques) — Exigences
générales et définitions
Molecular biomarker analysis — Methods of analysis for the detection
and identification of animal species in foods and food products
(nucleic acid-based methods) — General requirements and definitions
Numéro de référence
ISO 20813:2019(F)
ISO 2019
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ISO 20813:2019(F)
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Fax: +41 22 749 09 47
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Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 20813:2019(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Caractéristiques de performances des méthodes ............................................................................................................. 2

4.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 2

4.2 Domaine d’application de la méthode ................................................................................................................................ 2

4.3 Base scientifique .................................................................................................................................................................................... 2

4.4 Unités de mesure ................................................................................................................................................................................... 2

4.5 Applicabilité .............................................................................................................................................................................................. 3

4.6 Spécificité ..................................................................................................................................................................................................... 3

4.6.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 3

4.6.2 Exigences pour les essais d’inclusivité ......................................................................................................... 4

4.6.3 Exigences pour les essais d’exclusivité ......................................................................................................... 4

4.7 Sensibilité .................................................................................................................................................................................................... 4

4.7.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 4

4.7.2 Limite de détection (LOD) ....................................................................................................................................... 5

4.8 Exigences spécifiques pour les méthodes quantitatives ..................................................................................... 5

4.8.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 5

4.8.2 Limite de quantification (LQ) ............................................................................................................................... 5

4.8.3 Gamme dynamique ........................................................................................................................................................ 6

4.8.4 Détermination de la fidélité et de la justesse des méthodes quantitatives ................... 6

4.9 Robustesse .................................................................................................................................................................................................. 7

4.9.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 7

4.9.2 Détermination de la robustesse par une étude interlaboratoires ......................................... 7

4.9.3 Détermination de la robustesse par un essai orthogonal multifactoriel ......................... 7

5 Validation par un seul laboratoire ..................................................................................................................................................... 7

6 Étude interlaboratoires ................................................................................................................................................................................. 7

6.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 7

6.2 Méthodes qualitatives ....................................................................................................................................................................... 8

6.3 Méthodes quantitatives ................................................................................................................................................................... 8

7 Exigences générales du laboratoire et du mode opératoire ................................................................................... 8

7.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 8

7.2 Installations, matériaux et équipement............................................................................................................................. 8

7.3 Préparation de l’échantillon et extraction de l’ADN ................................................................................................ 9

7.4 Utilisation de témoins ....................................................................................................................................................................10

7.5 Analyse des données .......................................................................................................................................................................10

7.5.1 Témoin ...................................................................................................................................................................................10

7.5.2 PCR classique ...................................................................................................................................................................11

7.5.3 Courbes d’amplification de PCR en temps réel ...................................................................................11

7.6 Expression des résultats ..............................................................................................................................................................11

7.6.1 Expression des résultats positifs ....................................................................................................................11

7.6.2 Expression des résultats négatifs ...................................................................................................................12

7.6.3 Expression des résultats quantitatifs ..........................................................................................................12

8 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................12

Annexe A (informative) Liste des espèces typiques utilisées pour les essais d’inclusivité et

d’exclusivité ............................................................................................................................................................................................................14

Annexe B (informative) Exemples de méthodes de conversion des unités des nombres de

copies d’ADN en rapport de masses ...............................................................................................................................................19

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................28

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ISO 20813:2019(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.

L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/directives).

L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion

de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 16, Méthodes horizontales pour l'analyse moléculaire de biomarqueurs.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
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NORME INTERNATIONALE ISO 20813:2019(F)
Analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes
d'analyse pour la détection et l'identification des espèces
animales dans les aliments et les produits alimentaires
(méthodes basées sur l'utilisation des acides nucléiques)
— Exigences générales et définitions
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie les exigences minimales concernant les caractéristiques de performances

pour la détection de séquences d’acide nucléique (ADN) par des méthodes moléculaires telles que la

réaction de polymérisation en chaîne (PCR), incluant différentes méthodes de détection post-PCR,

la PCR en temps réel, des techniques de détection basées sur une et/ou plusieurs sondes, ainsi que la

combinaison de ces méthodes.

Le présent document est applicable à la détection, l’identification, la quantification de l’ADN d’espèces

animales appartenant à des groupes taxonomiques supérieurs ou inférieurs dans les produits

alimentaires, ainsi que la validation des méthodes applicables.

Il est applicable aux mammifères, aux oiseaux, aux reptiles, aux amphibiens, aux poissons, aux

mollusques, aux crustacés et aux insectes. Pour chacun d’entre eux, des exemples typiques sont fournis

dans l’Annexe A.
2 Références normatives

Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur

contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.

Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les

éventuels amendements).
ISO 16577, Analyse moléculaire de biomarqueurs — Termes et définitions

ISO 24276, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l’ISO 16577, l’ISO 24276, ainsi que les

suivants, s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
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ISO 20813:2019(F)
3.1
basic local alignment search tool
BLAST

algorithme de comparaison de séquences à vitesse optimisée, qui est utilisé pour les recherches dans

les bases de données de séquences, pour des alignements locaux optimaux en réponse à une requête

Note 1 à l'article: Cet algorithme effectue automatiquement une approximation des alignements optimisant une

mesure de similarité locale, le score MST (maximal signal pair) ou le score HSP (high-scoring segment pair).

Note 2 à l'article: Voir Référence [2].

Note 3 à l'article: BLASTn est applicable à la comparaison de séquence nucléotidique.

3.2
réaction de polymérisation en chaîne classique
PCR classique

méthode de PCR nécessitant une étape post-PCR telle que l’électrophorèse sur gel pour la détection ou

la visualisation des produits d’amplification, afin d’obtenir un résultat qualitatif

4 Caractéristiques de performances des méthodes
4.1 Généralités

Les méthodes employées pour l’analyse des espèces animales doivent répondre aux caractéristiques

de performances conformément au présent document. Les résultats de toutes les validations

interlaboratoires et/ou de laboratoire unique et les caractéristiques de performances doivent être

décrits.

NOTE Un certain nombre de lignes directrices sont disponibles pour la mise en œuvre des méthodes,

voir Référence [10].
4.2 Domaine d’application de la méthode

Des informations concernant l’utilisation prévue et les limites des méthodes doivent être fournies.

En particulier, les informations doivent indiquer que les critères définis dans le présent document ont

été satisfaits.
4.3 Base scientifique

Il convient de fournir une vue d’ensemble des principes et références à des publications scientifiques

pertinentes.
4.4 Unités de mesure

Les analyses qualitatives indiquent la présence ou l’absence (non-détection) d’une certaine cible.

Dans les analyses quantitatives, la valeur mesurée est calculée comme le rapport des nombres de copies

d’ADN (c/c). Il convient que l’utilisation de ce rapport examine les influences possibles, y compris le

nombre de copies d’ADN de la cible dans le génome. D’autres unités (par exemple, rapport de masses)

peuvent être employées. Les principes de calcul du rapport doivent être indiqués.

Si une méthode quantitative est destinée à juger le rapport masse/masse d’ingrédients provenant

d’espèces animales différentes dans un échantillon, il convient d’indiquer que les valeurs mesurées

pour le rapport de nombre de copies d’ADN ne peuvent pas refléter dans tous les cas le rapport masse/

masse des constituants animaux dans l’échantillon.
2 © ISO 2019 – Tous droits réservés
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ISO 20813:2019(F)
4.5 Applicabilité

Lors de l’évaluation de l’adéquation d’une méthode pour un usage donné, il convient de considérer les

aspects suivants concernant la nature de la cible:
— la localisation de la cible (nucléaire ou mitochondriale);
— le nombre de copies par cellule;
— la longueur de la séquence cible.

Pour les méthodes quantitatives spécifiques d’une espèce, un gène nucléaire, en excluant l’ADN

mitochondrial, doit être ciblé. La séquence cible doit être présente sous la forme d’une copie unique par

génome haploïde, ou le nombre de copies doit être déterminé/connu.

Lors de l’évaluation de l’adéquation d’une méthode pour un usage donné, il convient de considérer les

aspects suivants concernant la matrice:
— la nature des matrices d’échantillon potentielles;
— le degré de traitement des constituants de l’échantillon;
— les différentes espèces et les différents types de tissus animaux impliqués;
— la préparation de la matrice d’échantillon.

L’applicabilité de la méthode doit être soumise à essai en extrayant l’ADN d’échantillons pour essai

reflétant les matrices et le domaine d’application de l’analyse.

Il convient d’extraire l’ADN d’un minimum de trois matrices parmi les types les plus pertinents,

incluant les types reflétant le domaine d’application de la méthode, contenant une teneur masse/masse

connue des matériaux de la ou des espèces cibles (uniformément répartis sur la gamme dynamique de

pourcentage de la méthode) et des tissus pertinents pour l’application.

NOTE 1 Les cibles de PCR mitochondriales ne peuvent pas être utilisées pour une quantification fiable des

rapports de nombre de copies de génome haploïde d’espèces différentes, car la quantité de cibles mitochondriales

diffère selon le type de tissu.

NOTE 2 Différents types de tissus animaux peuvent avoir une teneur en ADN variable par équivalent massique.

NOTE 3 La limite de détection (LOD) pratique (voir l’ISO 21569) peut différer significativement pour des

matrices différentes. En outre, différents grades de traitement des constituants animaux dans le même produit

contribueront à la dégradation de l’ADN et à une distribution asymétrique possible de l’ADN entre les ingrédients.

Par exemple, un produit peut être composé de différents types de tissus animaux, contenant différentes quantités

d’ADN. Ce déséquilibre peut en outre être intensifié si certains ingrédients ont subi un prétraitement, comme

une cuisson ou un traitement acide, abaissant la qualité de l’ADN, alors que d’autres ingrédients ont été ajoutés,

par exemple bruts ou traités différemment.
4.6 Spécificité
4.6.1 Généralités

Il convient d’évaluer la spécificité selon un mode opératoire en deux étapes: évaluation théorique et

expérimentale de l’inclusivité et de l’exclusivité.

Des essais in silico de la spécificité des amorces et des sondes doivent être réalisés avec les outils

bioinformatiques disponibles.

NOTE 1 Des exemples sont les essais portant sur la formation de dimères d’amorces avec les recherches au

[1] [2]

moyen de primer3 et de BLAST dans les bases de données de séquences d’acides nucléiques.

Si les données de séquences sont utilisées pour vérifier les résultats de spéciation animale, il convient

d’employer des bases de données appropriées, en tenant compte de manière appropriée du moment de

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ISO 20813:2019(F)

soumission des entrées individuelles et de toute modification ultérieure de la classification taxonomique

ou de la dénomination.

NOTE 2 En cas de résultats inattendus, des investigations supplémentaires peuvent être menées avec des

techniques appropriées telles que le séquençage, l’électrophorèse sur gel ou l’hybridation, pour confirmer

l’identité du matériau de référence.
4.6.2 Exigences pour les essais d’inclusivité

Il convient de fournir les résultats expérimentaux des essais de la méthode avec les espèces animales

cibles. Il convient que ces essais incluent des races pertinentes des espèces animales, selon le domaine

d’application de la méthode (voir 4.2).

Il convient que le matériau employé pour les essais d’inclusivité contienne environ 100 copies

[6]

d’ADN cible . Chaque matériau échantillon doit être soumis à essai en double au minimal. Il convient

de détecter les variants de séquence des espèces animales cibles avec une efficacité d’amplification

comparable, le cas échéant.

NOTE Les espèces animales cibles pour les essais d’inclusivité appartiennent normalement à plus de

cinq races.
4.6.3 Exigences pour les essais d’exclusivité

Les résultats expérimentaux fournis par les essais de la méthode avec des espèces animales non cibles

doivent être fournis. Il convient que ces essais incluent à la fois des espèces animales étroitement et non

étroitement liées sur le plan taxonomique. Des espèces animales ou groupes taxonomiques pertinents

au vu du champ d’application de la méthode doivent être soumis à essai, par exemple des espèces

couramment employées dans les aliments en général et en particulier dans les matrices considérées

dans le champ d’application de la méthode. Il convient que la méthode fasse clairement la distinction

entre les espèces animales cibles et non cibles.

Il convient d’utiliser une quantité suffisante d’ADN pour les essais d’exclusivité expérimentale. Un

[6]

nombre de 2 500 copies cibles garantit que la réactivité croisée peut être identifiée.

Sélectionner un minimum de 10 espèces qui pourraient causer des interférences avec les espèces

animales cibles présentes dans le matériau pour essai. Des exemples d’organismes adaptés sont donnés

à l’Annexe A.

Il convient d’inclure d’autres espèces si elles sont pertinentes, par exemple en cas d’homologies de

séquences d’oligonucléotides avec les séquences d’acides nucléiques.
Il convient de caractériser la réactivité croisée de la matrice.

Il convient de confirmer l’adéquation de l’ADN employé pour l’amplification en utilisant un témoin

d’amplification, par exemple un système de PCR consensus avec ADN (chromosomique) monocopie (par

exemple, myostatine ou actine).
4.7 Sensibilité
4.7.1 Généralités

Les résultats expérimentaux obtenus avec la méthode à différentes concentrations pour évaluer la

plage d’utilisation de la méthode doivent être disponibles. Ils doivent être décrits dans le rapport de

validation.

S’il y a lieu, il convient de fournir des informations détaillées sur la manière dont une valeur seuil peut

être établie et utilisée dans le laboratoire.

Il convient de détecter aux niveaux pertinents pour la partie intéressée, par exemple le consommateur,

les espèces animales nécessitant un essai qualitatif.
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ISO 20813:2019(F)
4.7.2 Limite de détection (LOD)
4.7.2.1 LOD absolue

La LOD absolue (LOD ) doit être indiquée en nombre de copies de la séquence cible par réaction et le

abs
niveau de confiance (généralement 95 %) doit être précisé.

NOTE 1 Vingt copies ou moins peuvent être appliquées pour les gènes monocopie et un nombre approprié

d’équivalents génome haploïde pour les gènes à nombre élevé de copies.

NOTE 2 Si, pour la détermination de la LOD, un ADN avec un nombre connu de copies de la séquence cible n’est

pas disponible, un ADN plasmidique peut être employé.

La LOD de la méthode est déterminée expérimentalement en préparant une série de dilutions du

abs

matériau cible avec des dilutions comprises dans la plage de limite de détection attendue/cible. Des

recommandations pour l’évaluation de la LOD sont fournies dans la Référence [6].
abs
4.7.2.2 LOD relative

La LOD relative (LOD ) doit être déterminée dans l’ADN d’espèces animales non cibles pertinentes

rel

comme référence. Selon les exigences de l’essai, la LOD est ajustée à cette valeur. La LOD exprime

rel rel

le % c/c relatif de l’ADN de l’espèce animale cible dans l’ADN d’autres espèces animales, avec une

confiance de 95 %.

Il convient de déterminer la LOD expérimentalement en préparant un ou plusieurs échantillons de

rel

référence définis contenant un pourcentage défini de l’ADN cible dans la plage de limite de détection.

Chaque échantillon de référence est analysé en au moins 10 réplicats. Le pourcentage de l’échantillon de

référence pour lequel au moins 95 % des réplicats donnent des résultats positifs est considéré comme

la LOD .
rel
4.7.2.3 LOD asymétrique (pour les méthodes multiplex uniquement)

Dans le cas des méthodes multiplex où la détection des différentes cibles est limitée par des effets

compétitifs, comme dans le cas des méthodes de PCR en temps réel multiplex, la LOD des cibles uniques

dans une situation d’asymétrie de cibles exprimée en rapport de cible doit être validée. Différentes

teneurs en séquence cible animale spécifique sont mélangées pour obtenir des rapports de copies

définis (c’est-à-dire rapports de 1/1 000 et 1 000/1; 1/100 et 100/1). Le rapport dans lequel chaque

animal cible est détecté avec une confiance de 95 % est déterminé expérimentalement avec un nombre

approprié de réplicats pour l’échantillon de référence défini.
4.8 Exigences spécifiques pour les méthodes quantitatives
4.8.1 Généralités

La limite supérieure et inférieure de la gamme linéaire de la méthode doit être déterminée. L’évaluation

de ces limites et de la gamme linéaire doit être réalisée sur des échantillons contenant de l’ADN non

cible animal pertinent pour l’aliment.
4.8.2 Limite de quantification (LQ)

La LOQ absolue (LOQ ) doit être indiquée sous la forme de nombres de copies de la séquence cible. Elle

abs
doit être égale à la plus faible quantité incluse dans la gamme dynamique.

La LOQ relative (LOQ ) doit être déterminée dans l’ADN d’autres espèces animales pertinentes. Selon

rel

les exigences de l’essai, il convient d’ajuster la LOQ à cette valeur. La LOQ exprime le rapport entre

rel rel

le nombre de copies d’ADN de l’espèce animale cible et de copies d’ADN d’autres espèces animales

ou copies d’ADN d’un gène de référence représentatif du rang taxonomique complet. Il convient que

la LOQ soit égale à la plus faible concentration incluse dans la gamme dynamique.

rel
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ISO 20813:2019(F)

Si, pour la détermination de la LOQ, un ADN avec un nombre connu de copies de la séquence cible n’est

pas disponible, il convient d’utiliser un ADN plasmidique. Ce plasmide peut également servir d’étalon.

Un minimum de 15 réplicats avec une concentration cible de la LOQ attendue doit être soumis à essai.

Les critères de fidélité et de justesse doivent être remplis pour les résultats.

NOTE Les valeurs de LOQ fournies par l’étude interlaboratoires font généralement référence au plus faible

niveau d’analyte observé ayant un écart-type de reproductibilité relatif de 25 % ou moins.

4.8.3 Gamme dynamique

Il convient que la gamme dynamique couvre les valeurs de pourcentage ainsi que les nombres de copies

conformément à l’utilisation attendue et au domaine d’application de la méthode.

Afin de définir le nombre de copies minimal pertinent, la gamme dynamique désirée en termes de

pourcentages de copies cibles doit être déterminée. Il convient de considérer que la taille du génome des

espèces dans le matériau échantillon attendu limite le nombre maximal de copies pouvant être utilisé

pour l’analyse (par exemple de 100 ng à 200 ng, selon la méthode).
NOTE 1 Par
...

Questions, Comments and Discussion

Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.