ISO 17244:2015
(Main)Water quality — Determination of the toxicity of water samples on the embryo-larval development of Japanese oyster (Crassostrea gigas) and mussel (Mytilus edulis or Mytilus galloprovincialis)
Water quality — Determination of the toxicity of water samples on the embryo-larval development of Japanese oyster (Crassostrea gigas) and mussel (Mytilus edulis or Mytilus galloprovincialis)
ISO 17244:2015 specifies a method for determining the effects of chemical and aqueous samples on the embryo-larval development of marine bivalves. It allows the determination of the concentration levels that result in an abnormality in embryo-larval development. This test is suitable for salinity ranges between 20 and 40 for mussels and between 25 and 35 for oysters. This method applies to - chemical substances and preparations, - marine and brackish waters, - streams and aqueous effluents (urban, agricultural, industrial effluents, etc.) as long as the salinity is adjusted and/or dilution is limited so that the aforementioned salinity ranges are respected, and - aqueous extracts (pore water, elutriates, eluates, and leachates) from sediments and petroleum products.
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité d'échantillons aqueux sur le développement embryo-larvaire de l'huître creuse (Crassostrea gigas) et de la moule (Mytilus edulis ou Mytilus galloprovincialis)
ISO 17244:2015 spécifie une méthode de détermination des effets de substances chimiques et d'échantillons aqueux sur le développement embryo-larvaire de bivalves marins. Elle permet de déterminer les concentrations induisant une anomalie du développement embryo-larvaire. Cet essai convient pour des gammes de salinité allant de 20 à 40 pour les moules et de 25 à 35 pour les huîtres. Cette méthode est applicable: - aux substances et préparations chimiques, - aux eaux marines et estuariennes, - aux cours d'eau et aux effluents aqueux (urbains, agricoles, industriels, etc.) sous réserve d'ajuster la salinité et/ou de limiter la dilution afin de respecter les gammes de salinité définies ci-dessus, et - aux extraits aqueux (eau interstitielle, élutriats, éluats et lixiviats) de sédiments et de produits pétroliers.
General Information
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 17244
First edition
2015-09-15
Water quality — Determination of
the toxicity of water samples on
the embryo-larval development of
Japanese oyster (Crassostrea gigas)
and mussel (Mytilus edulis or Mytilus
galloprovincialis)
Qualité de l’eau — Détermination de la toxicité d’échantillons
aqueux sur le développement embryo-larvaire de l’huître creuse
(Crassostrea gigas) et de la moule (Mytilus edulis ou Mytilus
galloprovincialis)
Reference number
ISO 17244:2015(E)
©
ISO 2015
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ISO 17244:2015(E)
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ISO 17244:2015(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Test organisms and seawater . 2
5.1 Spawning stock or mature bivalves. 2
5.2 Reference seawater . 3
5.2.1 Natural seawater . 3
5.2.2 Synthetic seawater . 3
5.2.3 Hypersaline brine (HSB) . 4
6 Equipment . 4
7 Reference substance . 5
8 Test procedure . 5
8.1 Collection, preparation, and preservation of aqueous samples . 5
8.2 Preparation of test samples . 5
8.2.1 Chemicals . 5
8.2.2 Aqueous samples . 5
8.3 Selection of concentration/dilution range . 6
8.4 Collecting gametes . 6
8.4.1 General. 6
8.4.2 Thermal stimulation . 6
8.4.3 Stripping the gametes . . 8
8.5 Measurement of egg density . 8
8.6 Fertilization and inoculation of fertilized eggs . 8
8.7 Incubation . 9
8.8 Observation . 9
8.9 Analytical measurements .10
9 Expression of results .10
10 Validity criteria .12
11 Test report .12
Annex A (informative) Overview of the test applied to the Japanese oyster Crassostrea gigas .13
Annex B (informative) Performance data .14
Bibliography .22
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ISO 17244:2015(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical
Barriers to Trade (TBT), see the following URL: Foreword — Supplementary Information.
The committee responsible for this document is ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
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ISO 17244:2015(E)
Introduction
Traditionally, the level of pollution affecting a marine environment is shown in terms of the concentration
levels of the contaminants present in the environment of interest. However, these measurements do
not provide an estimation of the harmful effects on organisms and have to be complemented with the
biological responses obtained through biotests (see Reference [5]).
Among the marine organisms used to assess the potential impact of chemicals or discharges into the
environment, bivalve embryos and larvae are, together with sea urchins, among the organisms which
are most frequently used in biotests. This has been the case since the first research undertaken by Lillies
(1921) (see Reference [18]) on the sea urchin Arbacia and by Prytherch (1924) (see Reference [21]) on
the oyster Crassostrea virginica. The embryos and larvae are less tolerant to pollutants than the adults
of the same species. They therefore represent the critical stages for the toxicity tests (see References
[19] and [30]). Since 1972, Woelke (see Reference [35]) has recommended the use of the Pacific oyster,
Crassostrea gigas, to assess the quality of seawater. Furthermore, their worldwide distribution in
coastal waters, as well as their commercial importance (see Reference [10]), make bivalves the species
of choice for the undertaking of biotests.
The results of these biotests demonstrate the necessity to determine the potential toxicity thresholds
of chemicals which could enter the marine environment either accidentally or chronically, as well as the
“biological quality” of an environment or the potential toxicity of river water or a discharge that reach
the sea. Quiniou et al. (1993, 1997) (see References [27] and [26]) and His et. al (1999) (see Reference
[11]) defined potential toxicity on the basis of teratological effects.
This International Standard specifies a method based on the embryo-larval development of bivalves
(oyster or mussel). It can be routinely used to assess development abnormalities caused by the possible
presence of chemicals and mixtures in seawater. It also allows to assess the toxicity of aqueous samples
like seawater, surface water, effluents (urban, agricultural, industrial effluents, etc.), aqueous extracts
from sediments, and petroleum products that could be leached in the water column at the time of their
resuspension or discharge and presence in the sea.
This test can be performed throughout the year with mature bivalves sampled from the natural
environment during their reproduction periods or mature bivalves which come from a hatchery where
they have been conditioned.
This toxicity test, recommended by the International Council for the Exploration of the Sea (ICES), (see
Reference [14]), has been the subject of the first European inter-calibration test performed in 1991 (see
Reference [31]). The protocol described in this International Standard corresponds to a modification
and simplification of the ASTM standard method (1994) (see Reference [3]).
The toxicity assessment of metals performed on C. gigas and Mytilus edulis demonstrated that both
organisms had a similar level of sensitivity (see References [19] and [15]). Two other studies performed
on urban effluents showed similar findings for both species (see References [16] and [28]). These
observations have been confirmed by the work carried out on mercury by Beiras and His (1994) (see
Reference [4]), who compared the findings of four embryo-larval tests: M. edulis, M. galloprovincialis,
C. gigas, and C. virginica. Another study showed that the embryos of C. gigas are more sensitive to metals
and hydrocarbons than the other marine organisms which are commonly used, for example, polychaete,
amphipods, fish, and crustaceans (see Reference [8]).
The sensitivity of the bivalve embryo-larval development confirms the suitability of this test to assess
the toxicity of chemicals and aqueous samples. The pH, salinity, and temperature ranges acceptable
to bivalves make them easy to use in ecotoxicity studies, particularly when assessing the quality of
coastal and estuarine environments (see Reference [11]).
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 17244:2015(E)
Water quality — Determination of the toxicity of water
samples on the embryo-larval development of Japanese
oyster (Crassostrea gigas) and mussel (Mytilus edulis or
Mytilus galloprovincialis)
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if
any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and
health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this
International Standard be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for determining the effects of chemical and aqueous
samples on the embryo-larval development of marine bivalves. It allows the determination of the
concentration levels that result in an abnormality in embryo-larval development. This test is suitable for
salinity ranges between 20 and 40 for mussels and between 25 and 35 for oysters. This method applies to
— chemical substances and preparations,
— marine and brackish waters,
— streams and aqueous effluents (urban, agricultural, industrial effluents, etc.) as long as the salinity
is adjusted and/or dilution is limited so that the aforementioned salinity ranges are respected, and
— aqueous extracts (pore water, elutriates, eluates, and leachates) from sediments and petroleum
products.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
ISO 14442, Water quality — Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials,
volatile compounds, metals and waste water
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
EC
x
calculated concentration (of a substance) or dilution (of an aqueous sample, in %) for which an effect of
x % is expected compared to the control
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ISO 17244:2015(E)
3.2
lowest observed effect concentration
LOEC
lowest concentration of the tested sample at which a statistically significant effect is observed
3.3
no observed effect concentration
NOEC
tested concentration just below the LOEC
[SOURCE: ISO/TS 20281:2006, 3.18]
3.4
reference seawater
natural or synthetic seawater used to induce gamete production and prepare the solutions to be tested
3.5
D-shell stage larvae
larvae stage so named due to their characteristic D-shape under microscopic examination
Note 1 to entry: The normal D larvae obtained after incubation have fully developed and symmetrical shells with
a straight hinge. The larvae size is regular and around 70 µm. After fixation, the mantle nearly fills the interior of
the larvae, but is totally included within the two closed shells.
4 Principle
This biotest assesses the effects of chemicals and aqueous environmental samples on the embryo-larval
development of marine bivalves under static conditions.
The exposure is performed from fertilized eggs to D larvae. This static test aims to determine the
concentration level (EC ) which results in abnormalities for x % of exposed larvae in 24 h for the
x
Japanese oyster, also named Pacific oyster (Crassostrea gigas), and in 48 h for the mussel (Mytilus edulis
or Mytilus galloprovincialis). Several parameters can be assessed on the abnormal larvae: alteration of
the shell (hinge is not straight, unequal, or incomplete valves), hypertrophy of the mantle, delayed or
stopped embryonic development, and finally, death. The results are expressed as EC (EC or EC ).
x 20 50
The lowest observed effect concentration (LOEC) and no observed effect concentration (NOEC) can also
be determined.
NOTE This method can be applied to other species of bivalves (e.g. C. virginica). Nevertheless, the test
conditions have to be defined to reach the validity criteria of the standard.
5 Test organisms and seawater
5.1 Spawning stock or mature bivalves
The mature bivalves used for gamete production can be obtained from the natural environment
during reproductive periods as long as the good quality of their sampling area has been proven. The
reproduction period along the European and African coasts depends on the site. In some places, it can
occur all year.
For oysters, it is also possible to use mature animals from hatcheries where they have previously
undergone a conditioning cycle so that they are ready for spawning as soon as they arrive in the
laboratory. This enables to perform tests throughout the year.
As soon as the bivalves are received in the laboratory, it is recommended to keep them dry until the
beginning time of the experiment (for example, 15 °C) or in seawater at a temperature close to their
conditioning or rearing temperature (for example, 20 °C for hatchery oysters). If the mature bivalves
have to be kept for more than 48 h after sampling and/or dispatching, they shall be stored in water (see
5.2) with the same temperature as the original location and shall be provided with rich and appropriate
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ISO 17244:2015(E)
feeding (see Reference [9]). In this case, the spawning stock is placed in tanks (15 animals for 30 l of
seawater). The water in the tanks, which is continuously aerated, is kept at a temperature of 20 °C ± 1
°C. On a daily basis, one third of the volume has to be discarded and replaced by the same volume of a
6
single-species Prasinophycean culture (Tetraselmis suecica) at an average concentration of 1 × 10 cells
6
per ml or diatom Skeletonema costatum at an average concentration of 2,7 × 10 cells per ml.
The pH of seawater should be between 7,0 and 8,5 for mussels and oysters.
NOTE Other species can be used, for example, Phaeodactylum tricornutum. Neverthelss, the appropriate
concentration of algae has to be defined.
5.2 Reference seawater
This test requires good quality reference seawater. This water is used to prepare the controls and
dilutions of the samples and/or chemicals to be tested. This seawater may be either natural or synthetic.
5.2.1 Natural seawater
Natural seawater shall allow a good bivalve embryo-larval development and enable at least 80 %
of the normal D larvae to be free of any abnormality. The test is sensitive to high concentrations of
ammonia (NH ). Consequently, the ammonium concentration of seawater used shall not exceed
3
100 µmol/l (= 1,8 mg/l).
As soon as the water is collected, it is recommended that it is checked to ensure that the water is not
contaminated by any known substance (discharges, human activity, etc.). The water should be pre-
filtered with 1 µm membrane. The seawater shall then be stored in the dark in controlled conditions
between 5 °C and 15 °C and be used within two weeks from collection. Under no circumstance shall this
seawater be frozen or autoclaved.
Just before use, adjust the seawater salinity if necessary by adding ultra-pure water (for dilution) or
hypersaline brine (see 5.2.3) to reach the salinity range adapted to the selected species: i.e. from 20 to
40 for mussels and 25 to 35 for oysters. Then, filter it through a 0,45 µm membrane. Salinity shall then
be checked with a suitable probe (see 6.6).
Direct addition of sea salts to the sample may be a source of toxicity and should be avoided
(see Reference [17]).
5.2.2 Synthetic seawater
Alternatively, synthetic seawater prepared in compliance with Table 1 may be used. The composition of
this seawater is similar to that suggested by Zaroogian et al. (1969) (see Reference [36]) without EDTA in
order not to reduce the bio-availability of bivalent metal ions, thus, resulting in a decrease in the apparent
toxicity of these ions (see Reference [25]). Synthetic seawater is prepared by adding reagent grade
chemicals to ultrapure water (distilled or demineralized water) in the order specified in Table 1. Prepare
a minimum of 5 l of synthetic seawater. Mix after each addition of salt to ensure a good dissolution.
Once ready, the synthetic seawater is filtered in the same way as the natural seawater (see 5.2.1).
Table 1 — Composition of synthetic seawater for one litre of ultra-pure water
Chemical Concentration in ultrapure water
(g/l)
NaF 0,003
SrCl ·6H O 0,02
2 2
H BO 0,03
3 3
KBr 0,1
a
Silicate is not needed when the water is prepared in a glass vial.
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Table 1 (continued)
Chemical Concentration in ultrapure water
(g/l)
KCl 0,7
CaCl ·2H O 1,47
2 2
Na SO 4,0
2 4
MgCl ·6H O 10,78
2 2
NaCl 23,5
a
Na SiO ·H O 0,2
2 3 2
NaHCO 0,2
3
a
Silicate is not needed when the water is prepared in a glass vial.
Synthetic seawater which only contains mineral salts may be kept for up to one year in a watertight
container that is kept out of the light in a clean, dry, temperate and odourless place. It may also be kept
in a cold room in watertight containers.
5.2.3 Hypersaline brine (HSB)
Hypersaline brine can be made by concentrating of natural seawater by freezing or evaporation. The
maximum salinity of brine prepared this way is around 100 % (USEPA method, Reference [33]).
Hypersaline brine can also be prepared following the Zaroogian’s formula concentrated up to 5x maximum.
Commercial sea salts may also be used for preparing HSB, but a test with the reference substance shall
be conducted to assess the absence of complexing agents.
A control test with the HSB diluted to an acceptable salinity for the embryo development has to be
realized to check the lack of effect of this preparation.
6 Equipment
Usual laboratory equipment and in particular, the following.
6.1 Thermoregulated room or enclosure for the incubations.
6.2 Microscope, at least 200x, but preferably 400x.
If possible, use an inverse light microscope so that observations can be made directly in the small
experiment vials (e.g. microplate wells).
6.3 Culture flasks, capacity from a fraction of millilitres to several litres.
Experiments are usually performed using a volume of test solution of 50 ml. Therefore, culture
flasks with the capacity of 100 ml to 200 ml are preferred. Culture flasks may be made of glass
(systematically washed and sterilized) or single-use crystal polystyrene such as multi-well plates or
medical sampling containers.
6.4 Cartridge or membrane based filtering device, equipped with filters and pre-filters suitable for
the preparation of the test media.
6.5 Oven or autoclave, for sterilizing the equipment and glassware for the biotests.
6.6 Equipment for measuring temperature, salinity, pH, and dissolved oxygen in water.
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ISO 17244:2015(E)
6.7 Sieves, with mesh size of 32 µm and 100 µm for the filtering of male and female gametes,
respectively.
The gametes which pass through the appropriate sieves are collected for the fertilization step.
6.8 Pipettes, single-use polyethylene transfer pipettes (1 ml to 3 ml).
6.9 Binocular magnifying glass.
6.10 Electronic particle counter (optional).
All glassware used as for isolation of the spawning stock and the collection of the gametes, as well as
the pipettes, shall either be disposable or sterilized before use in the tests (e.g. placed in an oven for 2 h
at 200 °C for glassware).
7 Reference substance
Copper sulfate pentahydrate (CuSO ·5H O) is the recommended reference substance. This chemical is
4 2
added systematically in each test series to check the sensitivity of the larvae. The test concentrations
are included in the range 0 µg/l to 100 µg/l of CuSO ·5H O, or, 0 µg/l to 25 µg/l expressed as copper.
4 2
The value of EC should be between 4 µg/l and 16 µg/l expressed as total copper (see Annex B).
50
Alternately, zinc sulfate heptahydrate (ZnSO ·7H O) can be used as reference substance. In such case,
4 2
the test concentrations should be included in the range 44 µg/l to 2 462,9 µg/l of ZnSO ·7H O, or, 10 µg
4 2
to 560 µg expressed as zinc.
NOTE Experience gained with zinc sulfate is less than for copper sulfate. Therefore, no acceptable range can
be recommended yet in this International Standard.
8 Test procedure
8.1 Collection, preparation, and preservation of aqueous samples
Collect and transport the samples in accordance with the general procedures described in ISO 5667-16.
Samples are collected in chemically inert flasks.
Undertake the toxicity test as soon as possible, ideally within 12 h after collection of the samples. If this
time cannot be followed, store the samples at 4 °C and perform the test preferably within 15 d after
sample collection.
8.2 Preparation of test samples
8.2.1 Chemicals
Stock solutions of test chemicals are prepared by dissolving the substances in the reference seawater
(either natural or synthetic).
When the substance to be tested is poorly soluble in seawater, the stock solution may be prepared in
demineralized water or according to the modifications specified in ISO 14442 and ISO 5667-16 (use of a
solubilizing agent, ultrasonic dispersion, etc.).
8.2.2 Aqueous samples
Aqueous samples (seawater, river water, urban, agricultural or industrial effluents, or even aqueous
extracts) are tested in their raw state and/or after filtering or centrifugation to determine the fraction
© ISO 2015 – All rights reserved 5
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responsible for the effects observed. Furthermore, depending on the physico-chemical parameters
of these aqueous samples, it may be necessary to adjust their salinity to be consistent with the
recommended range for the selected species.
8.3 Selection of concentration/dilution range
For chemicals, the test solutions are prepared by diluting the stock solution in natural or synthetic
seawater.
In the case of samples of low salinity water, effluents, leachates, and eluates, all dilutions shall
remain within the salinity range acceptable for the species being used. For freshwater, the maximum
concentration tested shall not exceed 18 % volume fraction of the initial sample. Salinity should be
adjusted with hypersaline brine (see 5.2.1) if this appears to be essential.
These solutions may be prepared in advance or immediately before the test if rapid changes in the
sample composition are expected.
A minimum of five dilutions shall be performed to cover a concentration range that enables the
observation of a full range of effects between 0 % and 100 % of abnormal embryo-larval development.
Depending on the possible effects sought, the substances may be tested alone or in mixtures. For the
aqueous samples, the dilution range to be tested may be optimized in line with the test
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 17244
Première édition
2015-09-15
Qualité de l’eau — Détermination de
la toxicité d’échantillons aqueux sur
le développement embryo-larvaire de
l’huître creuse (Crassostrea gigas) et
de la moule (Mytilus edulis ou Mytilus
galloprovincialis)
Water quality — Determination of the toxicity of water samples on
the embryo-larval development of Japanese oyster (Crassostrea
gigas) and mussel (Mytilus edulis or Mytilus galloprovincialis)
Numéro de référence
ISO 17244:2015(F)
©
ISO 2015
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ISO 17244:2015(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Organismes d’essai et eau de mer . 2
5.1 Géniteurs ou bivalves matures . 2
5.2 Eau de mer de référence . 3
5.2.1 Eau de mer naturelle . 3
5.2.2 Eau de mer artificielle . 3
5.2.3 Saumure hyper saline (HSB) . 4
6 Matériel . 4
7 Substance de référence . 5
8 Mode opératoire d’essai. 5
8.1 Prélèvement, préparation et conservation des échantillons aqueux . 5
8.2 Préparation des échantillons pour essai . 6
8.2.1 Substances chimiques . 6
8.2.2 Échantillons aqueux . 6
8.3 Choix de la gamme de concentration/dilution . 6
8.4 Obtention de gamètes . 6
8.4.1 Généralités . 6
8.4.2 Stimulation thermique . . . 7
8.4.3 Stripping des gamètes . 8
8.5 Mesurage de la densité des œufs . 9
8.6 Fécondation et ensemencement des œufs fécondés . 9
8.7 Incubation .10
8.8 Observation .10
8.9 Mesurages analytiques .10
9 Expression des résultats.10
10 Critères de validité .12
11 Rapport d’essai .12
Annexe A (informative) Vue d’ensemble de l’essai appliqué à l’huître creuse Crassostrea gigas .14
Annexe B (informative) Données de performance .15
Bibliographie .22
© ISO 2015 – Tous droits réservés iii
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ISO 17244:2015(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre noter des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
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pour information, par souci de commodité à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer
un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation
de la conformité, et pour toute autre information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de
l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos –
Informations supplémentaires
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité
SC 5, Méthodes biologiques.
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ISO 17244:2015(F)
Introduction
Le niveau de contamination du milieu marin est traditionnellement présenté en termes de concentrations
des contaminants présents dans le milieu. Cependant, ces mesures ne donnent pas une estimation des
effets néfastes sur les organismes et doivent être complétées par les réponses biologiques obtenues au
moyen de bio-essais (voir la Référence [5]).
Parmi les organismes marins utilisés pour évaluer l’impact potentiel des substances ou rejets arrivant
dans l’environnement, les embryons et larves de bivalves sont, avec les oursins, parmi les organismes
les plus fréquemment employés dans les bio-essais, depuis les premiers travaux de Lillies (1921) (voir
la Référence [18]) sur l’oursin Arbacia et de Prytherch (1924) (voir la Référence [21]) sur l’huître
Crassostrea virginica. Les embryons et les larves sont moins tolérants aux polluants que les adultes
des mêmes espèces. Ils représentent donc les stades critiques pour les essais de toxicité (voir les
Références [19] et [30]). Dès 1972, Woelke (voir la Référence [35]) préconise l’utilisation de l’huître
creuse, Crassostrea gigas, pour l’évaluation de la qualité de l’eau de mer. De plus, leur répartition dans
les franges d’eaux côtières ainsi que leur importance commerciale (voir la Référence [10]), font des
bivalves des espèces de choix pour la réalisation de bio-essais.
Les résultats de ces bio-essais permettent de déterminer les seuils de toxicité potentielle des substances
chimiques susceptibles d’arriver dans le milieu marin, de manière accidentelle ou chronique, ainsi
que la «qualité biologique» d’un milieu ou la toxicité potentielle d’une eau de rivière ou d’un rejet
arrivant en mer. Quiniou et al. (1993, 1997) (voir les Références [27] et [26]) et His et. al (1999) (voir la
Référence [11]) définissent la toxicité potentielle à partir des effets tératologiques.
La présente Norme internationale spécifie une méthode basée sur le développement embryo-larvaire
de bivalves (huître creuse ou moule); elle est utilisable en routine pour l’évaluation des anomalies de
développement dues à la présence éventuelle de substances chimiques et de mélanges présents dans
l’eau de mer. Elle permet également d’évaluer la toxicité d’échantillons aqueux tels que les eaux marines,
les eaux de surface, les effluents (urbains, agricoles, industriels, etc.), les extraits aqueux de sédiments et
les produits pétroliers susceptibles d’être relargués dans la colonne d’eau lors de remise en suspension
ou de leur déversement et séjour en mer.
Cet essai est réalisable durant toute l’année, en utilisant des bivalves matures prélevés dans le milieu
naturel pendant leurs périodes de reproduction ou des bivalves matures provenant d’écloserie où ils
ont été conditionnés.
Cet essai de toxicité, préconisé par le Conseil International pour l’Exploration de la Mer (CIEM),
(voir la Référence [14]), a fait l’objet du premier essai d’intercalibration européen dès 1991 (voir
la Référence [31]). Le protocole décrit dans la présente Norme internationale correspond à une
modification et simplification de la méthode normalisée proposée par l’ASTM (1994) (voir la
Référence [3]).
L’évaluation de la toxicité de métaux sur C. gigas et Mytilus edulis a permis de conclure à une sensibilité
similaire des deux organismes (voir les Références [19] et [15]). Deux autres études effectuées sur
des effluents urbains ont mis en évidence des réponses similaires pour les deux espèces (voir les
Références [16] et [28]). Ces observations sont confirmées par les travaux réalisés sur le mercure par
Beiras et His (1994) (voir la Référence [4]), qui ont comparé les résultats de quatre essais embryo-
larvaires: M. edulis, M. galloprovincialis, C. gigas et C. virginica. Les embryons de C. gigas se révèlent plus
sensibles aux métaux et aux hydrocarbures que les autres organismes marins couramment utilisés, par
exemple les polychètes, les amphipodes, les poissons et les crustacés (voir la Référence [8]).
La sensibilité de la phase embryo-larvaire des bivalves souligne l’adéquation de cet essai pour
l’évaluation de la toxicité de substances chimiques et d’échantillons aqueux. Les gammes de pH,
de salinité et de température tolérées par les bivalves permettent leur emploi aisé dans les études
d’écotoxicité, en particulier pour l’évaluation de la qualité des milieux côtiers et estuariens (voir la
Référence [11]).
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NORME INTERNATIONALE ISO 17244:2015(F)
Qualité de l’eau — Détermination de la toxicité
d’échantillons aqueux sur le développement embryo-
larvaire de l’huître creuse (Crassostrea gigas) et de la
moule (Mytilus edulis ou Mytilus galloprovincialis)
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale connaisse
bien les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n’a pas pour but de
traiter de tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe
à l’utilisateur de la présente norme d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et
de sécurité et de s’assurer de la conformité à la réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est indispensable que les essais menés selon la présente Norme internationale
soient effectués par un personnel adéquatement qualifié.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination des effets de substances
chimiques et d’échantillons aqueux sur le développement embryo-larvaire de bivalves marins. Elle
permet de déterminer les concentrations induisant une anomalie du développement embryo-larvaire.
Cet essai convient pour des gammes de salinité allant de 20 à 40 pour les moules et de 25 à 35 pour les
huîtres. Cette méthode est applicable:
— aux substances et préparations chimiques,
— aux eaux marines et estuariennes,
— aux cours d’eau et aux effluents aqueux (urbains, agricoles, industriels, etc.) sous réserve d’ajuster
la salinité et/ou de limiter la dilution afin de respecter les gammes de salinité définies ci-dessus, et
— aux extraits aqueux (eau interstitielle, élutriats, éluats et lixiviats) de sédiments et de produits
pétroliers.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 5667-16, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques
des échantillons
ISO 14442, Qualité de l’eau — Lignes directrices pour essais d’inhibition de la croissance algale avec
matières peu solubles, composés volatils, métaux et eaux résiduaires
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
CE
x
concentration (d’une substance) ou dilution (d’un échantillon aqueux, en %) calculée, pour laquelle un
effet de x % est prévu par rapport au contrôle
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ISO 17244:2015(F)
3.2
concentration minimale avec effet observé
CMEO
concentration minimale de l’échantillon soumis à essai pour laquelle un effet statistiquement
significatif est observé
3.3
concentration sans effet observé
CSEO
concentration soumise à essai juste en-dessous de la CMEO
[SOURCE: ISO/TS 20281:2006, 3.18]
3.4
eau de mer de référence
eau de mer naturelle ou eau de mer artificielle utilisée pour l’obtention des gamètes et la préparation
des solutions d’essai
3.5
stade larve D
stade larvaire appelé ainsi en raison de la forme D caractéristique des larves observées au microscope
Note 1 à l’article: Les larves D normales obtenues après incubation possèdent une coquille avec charnière
rectiligne aux valves symétriques. La taille des larves est régulière (environ 70 µm). Après fixation, le manteau
remplit pratiquement l’intérieur des larves mais est totalement inclus dans les deux valves fermées.
4 Principe
Ce bio-essai évalue les effets de substances chimiques et d’échantillons aqueux environnementaux sur
le développement embryo-larvaire de bivalves marins en conditions statiques.
L’exposition porte sur la période allant de l’œuf fécondé au stade larve D. Cet essai statique vise à
déterminer la concentration (CE ) qui induit des anomalies chez x % de larves exposées, en 24 h
x
pour l’huître creuse, également appelée huître du Pacifique (Crassostrea gigas) et en 48 h pour la
moule (Mytilus edulis ou Mytilus galloprovincialis). Plusieurs paramètres peuvent être évalués sur des
larves anormales: altération de la coquille (charnière non rectiligne, valves inégales ou incomplètes),
hypertrophie du manteau, retard ou blocage du développement embryonnaire et, pour finir, mort. Les
résultats sont exprimés sous forme CE (CE ou CE ). La Concentration Minimale avec Effet Observé
x 20 50
(CMEO) et la Concentration Sans Effet Observé (CSEO) peuvent aussi être déterminées.
NOTE Cette méthode peut être appliquée à d’autres espèces de bivalves (par exemple, C. virginica). Toutefois,
les conditions d’essai doivent être définies pour remplir les critères de validité de la norme.
5 Organismes d’essai et eau de mer
5.1 Géniteurs ou bivalves matures
Les bivalves matures utilisés pour l’obtention des gamètes peuvent être prélevés dans le milieu naturel,
au cours des périodes de reproduction, à condition que soit vérifiée la bonne qualité du milieu de leur
zone d’échantillonnage. Les périodes de reproduction sur les côtes européennes et africaines dépendent
du milieu. Dans certaines régions, elles peuvent avoir lieu toute l’année.
Il est aussi possible, pour les huîtres, de se procurer des animaux matures auprès des écloseries où
ils ont préalablement subit un cycle de conditionnement afin d’être prêts à pondre dès leur arrivée au
laboratoire; ceci permet la réalisation d’essais pendant toute l’année.
Dès réception des bivalves par le laboratoire, il est recommandé de les conserver au sec jusqu’au
démarrage de l’expérience (par exemple 15 °C) ou dans de l’eau de mer à une température proche
de leur température de conditionnement ou d’élevage (par exemple 20 °C pour les huîtres provenant
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d’écloseries). S’il s’avère nécessaire de garder les bivalves matures plus de 48 h après l’échantillonnage
et/ou l’expédition, il faut les conserver dans de l’eau (voir en 5.2) à la même température que leur
lieu d’origine et leur apporter une alimentation riche et appropriée (voir la Référence [9]). Dans ce
cas, les géniteurs sont placés dans des bacs (15 animaux pour 30 litres d’eau de mer). L’eau des bacs,
aérée en permanence, est maintenue à la température de 20 °C ± 1 °C. Un tiers du volume doit être
quotidiennement éliminé et remplacé par le même volume d’une culture monospécifique de la
6
prasinophycée (Tetraselmis suecica) à une concentration moyenne de 1 x 10 cellules par ml ou de la
6
diatomée Skeletonema costatum à une concentration moyenne de 2,7 x 10 cellules par ml.
Il convient que la valeur de pH de l’eau de mer soit comprise entre 7,0 et 8,5 pour les moules et les huîtres.
NOTE D’autres espèces peuvent être utilisées, par exemple, Phaeodactylum tricornutum. Toutefois, la
concentration appropriée d’algues doit être définie.
5.2 Eau de mer de référence
La réalisation de cet essai nécessite de disposer d’une eau de mer de référence de qualité. Elle sert à la
réalisation des témoins et à la préparation des dilutions des échantillons et/ou substances à soumettre
à essai. Cette eau de mer peut être une eau de mer naturelle ou une eau de mer artificielle.
5.2.1 Eau de mer naturelle
L’eau de mer naturelle doit permettre un bon développement embryo-larvaire des bivalves et l’obtention
d’un taux de larves sans anomalie au stade D d’au moins 80 %. L’essai étant sensible aux concentrations
élevées en ammoniac (NH ), la concentration en ammonium de l’eau de mer utilisée ne doit donc pas
3
dépasser 100 µmol/l (= 1,8 mg/l).
Dès son prélèvement, il est recommandé de s’assurer que l’eau n’est pas contaminée par des substances
connues (rejets, activités anthropiques, etc.). Il convient de la préfiltrer sur une membrane de 1 µm
de porosité. Cette eau doit ensuite être utilisée dans les deux semaines suivant son prélèvement, en la
conservant dans une enceinte thermostatée entre 5 °C et 15 °C et à l’abri de la lumière. Cette eau de mer
ne doit en aucun cas être congelée ou passée à l’autoclave.
Juste avant son emploi, ajuster l’eau de mer si nécessaire, par addition d’eau ultra pure (pour la dilution)
ou de saumure hyper saline (voir en 5.2.3), à une salinité adaptée en fonction de l’espèce: de 20 à 40
pour les moules et de 25 à 35 pour les huîtres. La filtrer ensuite sur une membrane de 0,45 µm de
porosité. La salinité doit ensuite être vérifiée à l’aide d’une sonde appropriée (voir en 6.6).
L’ajout direct de sels de mer à l’échantillon peut être une source de toxicité et il convient d’éviter cette
opération (Référence [17]).
5.2.2 Eau de mer artificielle
De l’eau de mer artificielle, préparée conformément au Tableau 1, peut également être utilisée. La
composition de cette eau de mer est similaire à celle indiquée par Zaroogian et al. (1969) (voir la
Référence [36]) sans EDTA afin de ne pas réduire la biodisponibilité des ions métalliques bivalents,
entraînant une diminution de la toxicité apparente de ces ions (voir la Référence [25]). La préparation de
l’eau de mer artificielle se fait par ajout de substances chimiques de qualité réactifs pour analyse dans une
eau ultra pure (eau distillée ou déminéralisée) dans l’ordre du Tableau 1. Préparer un volume minimal de
5 l d’eau de mer artificielle. Mélanger après chaque ajout de sel pour garantir une bonne dissolution.
Une fois préparée, l’eau de mer artificielle est filtrée comme l’eau de mer naturelle (voir en 5.2.1).
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Tableau 1 — Composition de l’eau de mer artificielle pour un litre d’eau ultra pure
Substance chimique Concentration dans l’eau ultra pure (g/l)
NaF 0,003
SrCl ·6H O 0,02
2 2
H BO 0,03
3 3
KBr 0,1
KCl 0,7
CaCl ·2H O 1,47
2 2
Na SO 4,0
2 4
MgCl ·6H O 10,78
2 2
NaCl 23,5
a
Na SiO ·H O 0,2
2 3 2
NaHCO 0,2
3
a
Le silicate n’est pas nécessaire lorsque l’eau est préparée dans un flacon en verre.
L’eau de mer artificielle ne contenant que des sels minéraux peut être conservée jusqu’à un an dans un
récipient étanche stocké à l’abri de la lumière, dans un endroit propre, sec, tempéré et sans odeurs. Elle
peut également être conservée en chambre froide dans des récipients étanches.
5.2.3 Saumure hyper saline (HSB)
De la saumure hyper saline peut être préparée en concentrant de l’eau de mer naturelle par congélation
ou évaporation. La salinité maximale de la saumure préparée de cette manière est d’environ 100 %
(méthode de l’USEPA, Référence [33]).
De la saumure hyper saline peut également être préparée selon la formule de Zaroogian concentrée
jusqu’à 5× maximum.
Des sels de mer commerciaux peuvent aussi être utilisés pour préparer la HSB mais un essai avec la
substance de référence doit être réalisé pour s’assurer de l’absence d’agents complexants.
Un essai témoin avec la HSB diluée à une salinité acceptable pour le développement embryonnaire doit
être effectué pour vérifier l’absence d’effet de cette préparation.
6 Matériel
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Armoire ou enceinte thermostatée pour les incubations.
6.2 Microscope, 200x minimum mais 400x de préférence.
Si possible, utiliser un microscope optique inversé de manière à réaliser les observations directement
dans les petits flacons expérimentaux (par exemple, plaques multi-puits).
6.3 Flacons de culture, d’une capacité allant de moins d’un millilitre à plusieurs litres.
Les expériences sont généralement effectuées avec un volume de solution d’essai de 50 ml. Par
conséquent, il est préférable d’utiliser des flacons de culture d’une capacité de 100 ml à 200 ml. Les
flacons de culture peuvent être en verre (systématiquement lavé et stérilisé) ou en polystyrène cristal à
usage unique, comme des plaques multi-puits ou des récipients utilisés pour les prélèvements médicaux.
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ISO 17244:2015(F)
6.4 Dispositif de filtration sur cartouche ou membrane, équipé de filtres et pré-filtres adéquats
pour la préparation des milieux d’essai.
6.5 Four ou autoclave, pour la stérilisation du matériel et de la verrerie destinés aux bio-essais.
6.6 Sondes de mesure de la température, de la salinité, du pH et de l’oxygène dissous dans l’eau.
6.7 Tamis, de 32 µm et 100 µm de vide de maille, destinés, respectivement, à la filtration des gamètes
mâles et femelles.
Les gamètes qui passent au travers de tamis appropriés sont recueillis en vue de l’étape de fécondation.
6.8 Pipettes de transfert en polyéthylène à usage unique (1 ml à 3 ml).
6.9 Loupe binoculaire.
6.10 Compteur électronique de particules (en option).
Toute la verrerie utilisée pour isoler les géniteurs et prélever les gamètes, ainsi que les pipettes, doit être
soit à usage unique soit stérilisée avant emploi pour les essais (par exemple, passage au four pendant
2 h à 200 °C pour la verrerie).
7 Substance de référence
Le sulfate de cuivre pentahydraté (CuSO 5H O) est la substance de référence recommandée. Cette
4 2
substance chimique est systématiquement ajoutée dans chaque série d’essais afin de vérifier la
sensibilité des larves. Les concentrations d’essai sont comprises entre 0 µg/l et 100 µg/l de CuSO ·5H O
4 2
ou entre 0 µg/l et 25 µg/l exprimées en cuivre.
Il convient que la valeur de la CE soit comprise entre 4 µg/l et 16 µg/l pour le cuivre total (voir l’Annexe B).
50
Du sulfate de zinc heptahydraté (ZnSO ·7H O) peut également être utilisé comme substance de
4 2
référence. Dans ce cas, il convient que les concentrations d’essai soient comprises entre 44 µg/l et
2 462,9 µg/l de ZnSO ·7H O ou entre 10 µg et 560 µg exprimées en zinc.
4 2
NOTE L’expérience acquise avec le sulfate de zinc est moindre que pour le sulfate de cuivre. Par conséquent,
aucune gamme acceptable ne peut être encore recommandée dans la présente Norme internationale.
8 Mode opératoire d’essai
8.1 Prélèvement, préparation et conservation des échantillons aqueux
Procéder au prélèvement et au transport des échantillons conformément aux modes opératoires
généraux décrits dans l’ISO 5667-16.
Recueillir les échantillons dans des flacons en matériaux chimiquement inertes.
Procéder à l’essai de toxicité dès que possible, idéalement dans les 12 h suivant le prélèvement des
échantillons. Si cet intervalle de temps ne peut pas être respecté, conserver les échantillons à 4 °C et
effectuer l’essai de préférence dans les 15 jours suivant le prélèvement des échantillons.
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