Horizontal methods for molecular biomarker analysis -- Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products

ISO/TS 21569-5:2016 specifies a procedure for the detection of a DNA sequence used in genetically modified (GM) plants by means of a real-time PCR (polymerase chain reaction). The method detects a 78 base pairs long segment of the Figwort mosaic virus 34S promoter DNA sequence. This segment in some GM plants is indicated as FMV promoter (P-FMV) and in other GM plants as FMV enhancer (E-FMV). The method was developed and validated for the analysis of DNA extracted from foodstuffs. It may be suitable also for analysis of other products such as feedstuffs and seeds. The procedure requires the extraction of an adequate quantity and quality of amplifiable DNA from the test sample. The DNA sequence amplified by the P-FMV element-specific method can be detected in samples which contain DNA of the naturally occurring Figwort mosaic virus. For this reason, it is necessary to confirm a positive screening result. Further analyses are required using construct-specific or event specific methods.

Méthodes horizontales d'analyse moléculaire de biomarqueurs -- Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés

L'ISO/TS 21569-5:2016 spécifie une méthode pour la détection d'une séquence d'ADN utilisée dans des plantes génétiquement modifiées, au moyen d'une PCR (réaction de polymérisation en chaîne) en temps réel. La méthode détecte un long segment comprenant 78 paires de bases de la séquence d'ADN du promoteur 34S du virus de la mosaďque de la scrofulaire. Ce segment est indiqué comme promoteur FMV (P-FMV) dans certaines plantes génétiquement modifiées, alors que dans d'autres plantes génétiquement modifiées, ce segment est indiqué comme amplificateur FMV (E-FMV). La méthode a été élaborée et validée pour l'analyse de l'ADN extrait de produits alimentaires. Elle peut ętre également utilisée pour analyser d'autres produits tels que des aliments pour animaux et des semences. La méthode exige qu'une quantité adéquate d'ADN amplifiable de qualité appropriée soit extraite de l'échantillon pour essai. La séquence d'ADN amplifiée par la méthode spécifique ŕ l'élément P-FMV peut ętre détectée dans des échantillons contenant l'ADN du virus de la mosaďque de la scrofulaire présent dans la nature. Pour cette raison, il est nécessaire de confirmer un résultat positif de criblage. D'autres analyses sont nécessaires au moyen de méthodes spécifiques aux construits ou spécifiques aux événements.

General Information

Status
Published
Publication Date
01-Nov-2016
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
06-Oct-2016
Completion Date
02-Nov-2016
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ISO/TS 21569-5:2016 - Méthodes horizontales d'analyse moléculaire de biomarqueurs -- Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés
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Standards Content (sample)

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 21569-5
First edition
2016-11-01
Horizontal methods for molecular
biomarker analysis — Methods
of analysis for the detection of
genetically modified organisms and
derived products —
Part 5:
Real-time PCR based screening
method for the detection of the FMV
promoter (P-FMV) DNA sequence
Méthodes horizontales d’analyse moléculaire de biomarqueurs —
Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés —
Partie 5: Méthode de dépistage PCR en temps réel pour la détection de
la séquence ADN du promoteur FMV (P-FMV)
Reference number
ISO/TS 21569-5:2016(E)
ISO 2016
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/TS 21569-5:2016(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2016, Published in Switzerland

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form

or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior

written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

the requester.
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ISO/TS 21569-5:2016(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Reagents and materials ................................................................................................................................................................................. 2

5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 2

5.2 PCR reagents ............................................................................................................................................................................................. 2

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 2

7 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 3

7.1 Preparation of test sample ............................................................................................................................................................ 3

7.2 Preparation of DNA extracts ........................................................................................................................................................ 3

7.3 PCR setup ..................................................................................................................................................................................................... 3

7.4 Temperature-time programme ................................................................................................................................................. 3

8 Accept/reject criteria ...................................................................................................................................................................................... 4

8.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 4

8.2 Identification ............................................................................................................................................................................................ 4

9 Validation status and performance criteria ............................................................................................................................. 4

9.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 4

9.2 Robustness ................................................................................................................................................................................................. 5

9.3 Collaborative trial ................................................................................................................................................................................. 5

9.4 Sensitivity .................................................................................................................................................................................................... 6

9.5 Specificity .................................................................................................................................................................................................... 7

10 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 8

Annex A (informative) Detection of the Figwort mosaic virus (FMV) open reading frame VII .................9

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................10

© ISO 2016 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/TS 21569-5:2016(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity assessment,

as well as information about ISO’s adherence to the World Trade Organization (WTO) principles in the

Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL: www.iso.org/iso/foreword.html.

The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,

Horizontal methods for molecular biomarker analysis.

A list of all the parts in the ISO/TS 21569 series can be found on the ISO website.

iv © ISO 2016 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 21569-5:2016(E)
Horizontal methods for molecular biomarker analysis —
Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products —
Part 5:
Real-time PCR based screening method for the detection of
the FMV promoter (P-FMV) DNA sequence
1 Scope

This document specifies a procedure for the detection of a DNA sequence used in genetically modified

(GM) plants by means of a real-time PCR (polymerase chain reaction). The method detects a 78 base

pairs long segment of the Figwort mosaic virus 34S promoter DNA sequence. This segment in some GM

plants is indicated as FMV promoter (P-FMV) and in other GM plants as FMV enhancer (E-FMV).

The method was developed and validated for the analysis of DNA extracted from foodstuffs. It may be

suitable also for analysis of other products such as feedstuffs and seeds. The procedure requires the

extraction of an adequate quantity and quality of amplifiable DNA from the test sample.

The DNA sequence amplified by the P-FMV element-specific method can be detected in samples which

contain DNA of the naturally occurring Figwort mosaic virus. For this reason, it is necessary to confirm

a positive screening result. Further analyses are required using construct-specific or event specific

methods.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 21569, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — Qualitative nucleic acid based methods

ISO 21570, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — Quantitative nucleic acid based methods

ISO 21571:2005, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — Nucleic acid extraction

ISO 24276, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — General requirements and definitions
3 Terms and definitions

For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— IEC Electropedia: available at http://www.electropedia.org/
— ISO Online browsing platform: available at http://www.iso.org/obp
© ISO 2016 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO/TS 21569-5:2016(E)
4 Principle

DNA is extracted from the test portion applying a suitable method (see ISO 21571). The DNA analysis

consists of two parts:

a) verification of the amount, quality and amplifiability of the extracted DNA, e.g. by a taxon-specific

PCR assay (according to ISO 21569 and ISO 21570), see also Reference [1];
b) detection of the P-FMV DNA sequence in a real-time PCR, see Reference [2].
5 Reagents and materials
5.1 General

For the purpose of this document, only chemicals and water of recognized analytical grade, appropriate

for molecular biology shall be used. Unless stated otherwise, solutions should be prepared by dissolving

the corresponding reagents in water and be autoclaved. For all operations for which gloves are used it

should be ensured that these are powder-free. The use of aerosol protected pipette tips (protection

against cross contamination) is recommended.
5.2 PCR reagents
5.2.1 Thermostable DNA polymerase (for hot-start PCR).

5.2.2 PCR buffer solution (containing magnesium chloride and deoxyribonucleoside triphosphates

dNTPs.

Ready-to-use reagent mixtures or mixtures of individual components can be used. Reagents and

polymerases which lead to equal or better results may also be used.
5.2.3 Oligonucleotides (see Table 1) .
Table 1 — Oligonucleotides
Final concentration
Name DNA sequence of the oligonucleotide
in PCR
[2],[3]
P-FMV as the target sequence (GeneBank accession number X06166 ):
pFMV-F 5’-CAA AAT AAC GTG GAA AAG AGC T−3’ 340 nmol/l
pFMV-R 5’-TCT TTT GTG GTC GTC ACT GC−3’ 340 nmol/l
Probe pFMV 5’-(FAM)-CTG ACA GCC CAC TCA CTA ATG C-(BHQ1)-3’ 120 nmol/l

FAM: 6-Carboxyfluorescein, BHQ-1: Black Hole Quencher® 1 (non-fluorescent chromophore). This information is given

for convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent

products from other manufacturers may be used if they can be shown to give equivalent or better results.

6 Apparatus

Requirements concerning apparatus and materials shall be according to ISO 21569. In addition to the

usual laboratory equipment, the following equipment is required.

6.1 Real-time PCR device, suitable for the excitation of fluorescent molecules and the detection of

fluorescence signals generated during PCR.

1) In the interlaboratory trial performed for P-FMV, participants were provided with dried aliquots (per 50

reactions) of primer/probe -mixes (to be stored in dark until the start of the interlaboratory trial). Per aliquot 375 μl

PCR grade water was added and allowed to settle.
2 © ISO 2016 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/TS 21569-5:2016(E)
7 Procedure
7.1 Preparation of test sample

It should be ensured that the test sample used for DNA extraction is representative of the laboratory

sample, e.g. by grinding or homogenizing of the laboratory sample. Measures and operational steps to

be taken into consideration should be according to ISO 21571 and ISO 24276.
7.2 Preparation of DNA extracts

Concerning the preparation of DNA from the test portion the general instructions and measures

described in ISO 21571 shall be followed. It is recommended to choose one of the DNA extraction

methods described in ISO 21571:2005, Annex A.
7.3 PCR setup

The method described applies for a total volume of 25 μl per PCR. The reaction setup is given in Table 2.

Reagents are completely thawed at room temperature. Each reagent should be carefully mixed and

briefly centrifuged immediately before pipetting. A PCR reagent mixture is prepared which contains

all components except for the sample DNA. The required amount of the PCR reagent mixture depends

on the number of reactions to be performed, including at least one additional reaction as a pipetting

reserve. Add 5 µl of sample DNA to each reaction.
Table 2 — Reaction setup for the amplification
Total reaction volume 25 µl
Sample DNA (up to 200 ng) or controls 5 µl

PCR buffer solution (including MgCl , dNTPs and hot-start DNA polymerase) 12,5 µl

Primer pFMV-F and pFMV-R see Table 1
Probe pFMV see Table 1
Water to 25 µl

In the collaborative trial the QuantiTect Multiplex PCR NoROX Kit (Qiagen GmbH, Hilden/Germany) was used. This

information is given for convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product

named. Equivalent products from other manufacturers may be used if they yield similar or better results. If necessary,

adapt the amounts of the reagents and the temperature-time programme.

Mix the PCR reagent mixture, centrifuge briefly and pipette 20 µl into each reaction vial. For the

amplification reagent control, add 5 µl of water into the respective reaction setup. Pipette either 5 µl

of sample DNA or 5 µl of the respective control solution (extraction blank control, positive DNA target

control). If necessary, prepare a PCR inhibition control as described in ISO 24276.

Transfer the reaction setups into the thermal cycler and start the temperature-time programme.

7.4 Temperature-time programme

The temperature-time programme as outlined in Table 3 has been used in the validation study. The use

of different reaction conditions and real-time PCR cyclers may require specific optimization. The time

for initial denaturation depends on the master mix used.
© ISO 2016 – All rights reserved 3
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ISO/TS 21569-5:2016(E)
Table 3 — Temperature-time programme
Step Parameter Temperature Time Fluorescence Cycles
measurement
1 UNG activation (optional) 50 °C 2 min no 1
2 Initial denaturation 95 °C 15 min no 1
Denaturation 95 °C 15 s no
3 Amplification 45
Annealing and elongation 60 °C 60 s yes
8 Accept/reject criteria
8.1 General
...

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 21569-5
Première édition
2016-11-01
Méthodes horizontales d’analyse
moléculaire de biomarqueurs —
Méthodes d’analyse pour la détection
des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés —
Partie 5:
Méthode de criblage par PCR en temps
réel pour la détection de la séquence
ADN du promoteur FMV (P-FMV)
Horizontal methods for molecular biomarker analysis — Methods
of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products —
Part 5: Real-time PCR based screening method for the detection of the
FMV promoter (P-FMV) DNA sequence
Numéro de référence
ISO/TS 21569-5:2016(F)
ISO 2016
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/TS 21569-5:2016(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2016, Publié en Suisse

Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée

sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur

l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ii © ISO 2016 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/TS 21569-5:2016(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Réactifs et matériaux ....................................................................................................................................................................................... 2

5.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 2

5.2 Réactifs PCR ............................................................................................................................................................................................... 2

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 3

7 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 3

7.1 Préparation de l’échantillon pour essai ............................................................................................................................. 3

7.2 Préparation des extraits d’ADN ................................................................................................................................................. 3

7.3 Réaction PCR ............................................................................................................................................................................................. 3

7.4 Programme d’amplification ......................................................................................................................................................... 4

8 Critères d’acceptation/rejet ..................................................................................................................................................................... 4

8.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 4

8.2 Identification ............................................................................................................................................................................................ 5

9 État de validation et critères de performance ....................................................................................................................... 5

9.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 5

9.2 Robustesse .................................................................................................................................................................................................. 5

9.3 Essai interlaboratoires ..................................................................................................................................................................... 5

9.4 Sensibilité .................................................................................................................................................................................................... 7

9.5 Spécificité ..................................................................................................................................................................................................... 8

10 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 9

Annexe A (informative) Détection du cadre ouvert de lecture VII du virus de la mosaïque de

la scrofulaire (FMV) ........................................................................................................................................................................................10

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................11

© ISO 2016 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/TS 21569-5:2016(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.

iso.org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation

de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation

mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien

suivant: www.iso.org/iso/fr/avant-propos.html

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.

Une liste de toutes les parties de l’ISO/TS 21569 est disponible sur le site de l’ISO.

iv © ISO 2016 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 21569-5:2016(F)
Méthodes horizontales d’analyse moléculaire de
biomarqueurs — Méthodes d’analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés et des produits
dérivés —
Partie 5:
Méthode de criblage par PCR en temps réel pour la
détection de la séquence ADN du promoteur FMV (P-FMV)
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie une méthode pour la détection d’une séquence d’ADN utilisée dans

des plantes génétiquement modifiées, au moyen d’une PCR (réaction de polymérisation en chaîne)

en temps réel. La méthode détecte un long segment comprenant 78 paires de bases de la séquence

d’ADN du promoteur 34S du virus de la mosaïque de la scrofulaire. Ce segment est indiqué comme

promoteur FMV (P-FMV) dans certaines plantes génétiquement modifiées, alors que dans d’autres

plantes génétiquement modifiées, ce segment est indiqué comme amplificateur FMV (E-FMV).

La méthode a été élaborée et validée pour l’analyse de l’ADN extrait de produits alimentaires. Elle peut

être également utilisée pour analyser d’autres produits tels que des aliments pour animaux et des

semences. La méthode exige qu’une quantité adéquate d’ADN amplifiable de qualité appropriée soit

extraite de l’échantillon pour essai.

La séquence d’ADN amplifiée par la méthode spécifique à l’élément P-FMV peut être détectée dans des

échantillons contenant l’ADN du virus de la mosaïque de la scrofulaire présent dans la nature. Pour cette

raison, il est nécessaire de confirmer un résultat positif de criblage. D’autres analyses sont nécessaires

au moyen de méthodes spécifiques aux construits ou spécifiques aux événements.
2 Références normatives

Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des

exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 21569, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques

ISO 21570, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Méthodes quantitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques

ISO 21571:2005, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes

génétiquement modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques

ISO 24276, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 16577 s’appliquent.

© ISO 2016 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO/TS 21569-5:2016(F)

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http://www.electropedia.org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http://www.iso.org/obp
4 Principe

L’ADN est extrait de la prise d’essai en appliquant une méthode appropriée (voir l’ISO 21571). L’analyse

de l’ADN comprend deux parties:

a) vérification de la quantité, de la qualité et de l’amplificabilité de l’ADN extrait, par exemple au moyen

d’une PCR spécifique pour un taxon (conformément à l’ISO 21569 et à l’ISO 21570), voir également

la Référence [1];

b) détection de la séquence d’ADN P-FMV par une PCR en temps réel, voir la Référence [2].

5 Réactifs et matériaux
5.1 Généralités

Pour les besoins du présent document, seules des substances chimiques et de l’eau de qualité analytique

reconnue, appropriées pour la biologie moléculaire, doivent être utilisées. Sauf indication contraire,

il convient de préparer les solutions par dissolution des réactifs correspondants dans l’eau et par

traitement à l’autoclave. Pour toutes les opérations nécessitant le port de gants, il convient de s’assurer

que ceux-ci ne sont pas poudrés. Pour éviter toute contamination croisée, il est recommandé d’utiliser

des embouts de pipette protégés contre les aérosols.
5.2 Réactifs PCR
5.2.1 ADN polymérase thermostable (pour PCR «à démarrage à chaud»).

5.2.2 Solution tampon pour PCR (contenant du chlorure de magnésium et des désoxyribonucléosides

triphosphates, dNTP).

Il est possible d’utiliser des mélanges de réactifs ou des mélanges de composants individuels prêts à

l’emploi. Des réactifs et des polymérases conduisant à des résultats équivalents ou meilleurs peuvent

être également utilisés.
5.2.3 Oligonucléotides (voir Tableau 1) .

1) Lors de l’essai interlaboratoires réalisé pour la séquence P-FMV, les participants ont reçu des aliquotes séchées

(par 50 réactions) de mélanges d’amorces/sondes (devant être conservés dans l’obscurité jusqu’au démarrage de

l’essai interlaboratoires). Pour chaque aliquote, on a ajouté 375 μl d’eau de qualité PCR et laissé décanter.

2 © ISO 2016 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/TS 21569-5:2016(F)
Tableau 1 — Oligonucléotides
Concentration finale
Nom Séquence d’ADN de l’oligonucléotide
dans la PCR
[2][3]

P-FMV en tant que séquence cible (dans la base de données GenBank, numéro de référence X06166 ):

pFMV-F 5’-CAA AAT AAC GTG GAA AAG AGC T−3’ 340 nmol/l
pFMV-R 5’-TCT TTT GTG GTC GTC ACT GC−3’ 340 nmol/l
Sonde pFMV 5’-(FAM)-CTG ACA GCC CAC TCA CTA ATG C-(BHQ1)-3’ 120 nmol/l

FAM: carboxy-6-fluorescéine, BHQ-1: Black Hole Quencher®-1 (chromophore non fluorescent). Cette information est

donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande

l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents commercialisés par d’autres fabricants peuvent être

utilisés s’il peut être démontré qu’ils donnent des résultats similaires ou meilleurs.

6 Appareillage

Les exigences concernant l’appareillage et les matériaux doivent être conformes à l’ISO 21569. Outre le

matériel courant de laboratoire, l’équipement suivant est requis.

6.1 Appareil de PCR en temps réel, approprié pour l’excitation des molécules fluorescentes et pour

la détection des signaux de fluorescence générés pendant la PCR.
7 Mode opératoire
7.1 Préparation de l’échantillon pour essai

Il convient de s’assurer que l’échantillon pour essai utilisé pour l’extraction de l’ADN est représentatif de

l’échantillon pour laboratoire, par exemple en broyant ou homogénéisant l’échantillon pour laboratoire.

Les mesures et étapes opératoires à prendre en considération doivent être telles que décrites dans

l’ISO 21571 et l’ISO 24276.
7.2 Préparation des extraits d’ADN

Concernant la préparation d’ADN à partir de la prise d’essai, il convient de suivre les instructions

générales et les mesures spécifiées dans l’ISO 21571. Il est recommandé de choisir l’une des méthodes

d’extraction d’ADN décrites dans l’ISO 21571:2005, Annexe A.
7.3 Réaction PCR

La méthode décrite s’applique pour un volume total de 25 µl par réaction PCR. Le mélange réactionnel

est indiqué dans le Tableau 2.

Les réactifs sont totalement décongelés à température ambiante. Il convient de s’assurer que chaque

réactif est soigneusement mélangé et brièvement centrifugé juste avant d’être pipeté. Un mélange de

réactifs pour PCR, contenant tous les composants, sauf l’ADN échantillon, est préparé. La quantité

nécessaire de mélange de réactifs pour PCR dépend du nombre de réactions à réaliser, en incluant

au moins une réaction supplémentaire comme réserve de pipetage. Ajouter 5 µl d’ADN échantillon à

chaque réaction.
© ISO 2016 – Tous droits réservés 3
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ISO/TS 21569-5:2016(F)
Tableau 2 — Mélange réactionnel pour l’amplification
Volume réactionnel total 25 µl
ADN échantillon (jusqu’à 200 ng) ou témoins 5 µl

Solution tampon pour PCR (contenant du MgCl , des dNTPs et de l’ADN polymérase 12,5 µl

à « démarrage à chaud »)
Amorce pFMV-F et pFMV-R voir Tableau 1
Sonde pFMV voir Tableau 1
Eau complément à 25 µl

Le kit QuantiTect Multiplex PCR NoROX Kit (Qiagen GmbH, Hilden/Allemagne) a été utilisé lors de l’essai

interlaboratoires. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement

que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents commercialisés

par d’autres fabricants peuvent être utilisés s’ils donnent des résultats similaires ou meilleurs. Si nécessaire, adapter les

quantités de réactifs ainsi que le programme d’amplification.

Agiter le mélange de réactifs pour PCR, le centrifuger brièvement et introduire à l’aide d’une pipette

20 µl dans chaque tube de réaction. Pour le témoin de réactif pour amplification, ajouter 5 µl d’eau au

mélange réactionnel correspondant. À l’aide d’une pipette, ajouter 5 µl d’ADN échantillon ou 5 µl de la

solution témoin correspondante (témoin de blanc d’extraction, témoin positif d’ADN cible). Si nécessaire,

préparer un témoin d’inhibition de PCR tel que décrit dans l’ISO 24276.

Transférer les mélanges réactionnels dans le thermocycleur et lancer le programme d’amplification.

7.4 Programme d’amplification

Le programme d’amplification indiqué dans le Tableau 3 a été utilisé pour l’étude de validation.

L’utilisation de diverses conditions de réaction et de divers cycleurs pour PCR en temps réel peut

nécessiter une optimisation spécifique. Le temps nécessaire pour la dénaturation initiale dépend du

mélange maître utilisé.
Tableau 3 — Programme d’amplification
Mesurage de la
Étape Paramètre Température Durée Cycles
fluorescence
1 Activation de l’UNG (facultatif) 50 °C 2 min non 1
2 Dénaturation initiale 95 °C 15 min non 1
Dénaturation 95 °C 15 s non
3 Amplification 45
Hybridation et 60 °C 60 s oui
élongation
8 Critères d’acceptation/rejet
8.1 Généralités

Un programme d’analyse des données spécifique à l’appareil de PCR en temps réel correspondant est

utilisé pour l’identification des
...

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