ISO/TS 18867:2015
(Main)Microbiology of the food chain — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens — Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis
Microbiology of the food chain — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens — Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis
ISO/TS 18867:2015 specifies two horizontal methods for detection of the pathogenic bioserotypes of Y. enterocolitica and one for detection of Y. pseudotuberculosis by using real-time PCR-based methods. The described methods allow for the detection of the two pathogens in enrichments and allow the isolation of colonies. Y. pestis, the causative agent of bubonic and pneumonic plague harbours a variant of the ail gene as well and will be detected by the same primer/probe set as Y. pseudotuberculosis. However, Y. pestis is normally not associated with food. This Technical Specification is applicable to products for human consumption, animal feeding stuffs, and environmental samples.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection de micro-organismes pathogènes dans les aliments — Détection des Yersinia enterocolitica et Yersinia pseudotuberculosis pathogènes
ISO/TS 18867:2015 décrit deux méthodes horizontales pour la détection de biosérotypes pathogènes des Y. enterocolitica ainsi qu'une méthode pour la détection des Y. pseudotuberculosis en faisant appel à des méthodes basées sur la PCR en temps réel. Les méthodes décrites permettent la détection des deux micro-organismes pathogènes par enrichissement et permettent d'isoler des colonies. Y. pestis, l'agent responsable de la peste bubonique et pneumonique héberge aussi un variant du gène ail et sera détecté par le même ensemble d'amorce et de sonde que Y. pseudotuberculosis. Toutefois, Y. pestis n'est normalement pas associé aux aliments. La présente Spécification technique est applicable aux produits destinés à la consommation humaine, aux aliments pour animaux et aux échantillons environnementaux.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 18867
First edition
2015-09-15
Microbiology of the food chain —
Polymerase chain reaction (PCR)
for the detection of food-borne
pathogens — Detection of pathogenic
Yersinia enterocolitica and Yersinia
pseudotuberculosis
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Réaction de polymérisation
en chaîne (PCR) pour la détection de micro-organismes pathogènes
dans les aliments — Détection des Yersinia enterocolitica et Yersinia
pseudotuberculosis pathogènes
Reference number
©
ISO 2015
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ii © ISO 2015 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .v
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principles . 1
4.1 General . 1
4.2 Microbial enrichment . 2
4.3 Nucleic acid extraction . 2
4.4 Amplification and detection . 2
4.5 Isolation . 2
5 Reagents . 2
5.1 General . 2
5.2 Culture media . 2
5.2.1 General. 2
5.2.2 Diluent . 2
5.2.3 Enrichment media . 2
5.2.4 Selective solid medium . 4
5.2.5 Potassium hydroxide in saline solution, KOH . 5
5.3 Nucleic acid extraction . 5
5.4 Reagents for PCR . 5
5.5 Primers and probes. 5
6 Apparatus and equipment . 5
6.1 General . 5
6.2 Equipment for sample preparation prior to enrichment . 6
6.3 Equipment for microbial enrichment . . 6
6.4 Equipment for nucleic acid extraction . 6
6.5 Equipment for real-time PCR. 6
7 Sampling . 6
8 Procedure. 6
8.1 Sample preparation prior to enrichment . 6
8.1.1 General. 6
8.1.2 Preparation of the sample . 6
8.2 Microbial enrichment . 7
8.2.1 Pathogenic Y. enterocolitica . 7
8.2.2 Y. pseudotuberculosis . 7
8.2.3 Pathogenic Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis . 7
8.3 Isolation of colonies, optional . 7
8.3.1 Pathogenic Y. enterocolitica . 7
8.3.2 Y. pseudotuberculosis . 7
8.3.3 Process controls . 8
8.4 Nucleic acid extraction . 8
8.5 PCR amplification . 8
8.5.1 General. 8
8.5.2 PCR controls . . 8
8.6 Confirmation of the PCR product . 8
8.6.1 General. 8
8.6.2 Interpretation of the PCR result . 8
9 Test report . 9
Annex A (normative) PCR detection and isolation of pathogenic Y. enterocolitica (see
Figure A.1) .10
Annex B (informative) Real-time PCR for detection of Y. enterocolitica .11
Annex C (informative) Detection and isolation of Y. pseudotuberculosis .21
Annex D (informative) Simultaneous detection of pathogenic Y. enterocolitica and
Y. pseudotuberculosis using multiplex real-time PCR .26
Bibliography .29
iv © ISO 2015 – All rights reserved
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
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ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
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constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical
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The committee responsible for this document is the European Committee for Standardization (CEN)
Technical Committee CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in collaboration with Technical
Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the
Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
Introduction
Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis are zoonotic bacterial pathogens causing food-
borne infection (yersiniosis) in humans worldwide. The main reservoir for pathogenic Y. enterocolitica
[3]
is domestic pigs and for Y. pseudotuberculosis a wide range of domestic and wild animals such as
[4]
rodents, deer, birds, and various farm animals serve as potential reservoirs. Some of the biotypes of Y.
enterocolitica are associated with human infection. In contrast, all Y. pseudotuberculosis are considered
[9]
potentially pathogenic to humans.
The chromosomally located gene ail (attachment invasion locus) is present in all bio(sero)types of
[8]
Y. enterocolitica associated with disease and a variant of it is also present in Y. pseudotuberculosis.
The ail gene is the target gene used for detection in this Technical Specification, and the developed
[7][8][13][14]
primer/probe sets target different sites of the ail gene for the two pathogens.
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TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 18867:2015(E)
Microbiology of the food chain — Polymerase chain
reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens
— Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica and
Yersinia pseudotuberculosis
1 Scope
This Technical Specification specifies two horizontal methods for detection of the pathogenic
bioserotypes of Y. enterocolitica and one for detection of Y. pseudotuberculosis by using real-time PCR-
based methods. The described methods allow for the detection of the two pathogens in enrichments
and allow the isolation of colonies. Y. pestis, the causative agent of bubonic and pneumonic plague
harbours a variant of the ail gene as well and will be detected by the same primer/probe set as Y.
pseudotuberculosis. However, Y. pestis is normally not associated with food. This Technical Specification
is applicable to products for human consumption, animal feeding stuffs, and environmental samples.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination – Part 1: General rules for the preparation of the
initial suspension and decimal dilutions
ISO 10273, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of
presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica
ISO 20837, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — Requirements for sample preparation for qualitative detection
ISO 20838, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — Requirements for amplification and detection for qualitative methods
ISO 22119, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Real-time polymerase chain reaction (PCR) for
the detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
ISO 22174, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
3 Terms and definitions
For the purpose of this document, the following terms and definitions given in ISO 22174 and
ISO 22119 apply.
4 Principles
4.1 General
The method comprises the following consecutive steps:
a) Microbial enrichment (4.2);
b) Nucleic acid extraction (4.3);
c) Amplification and detection (4.4);
d) Isolation (4.5).
4.2 Microbial enrichment
The number of pathogenic Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis bacterial cells is increased by
growth in a non-selective or semi-selective liquid nutrient medium.
4.3 Nucleic acid extraction
Bacteria cells are separated from the nutrient broth, lysed, and the nucleic acid extracted for use in the
PCR reaction.
4.4 Amplification and detection
The extracted nucleic acid is amplified using a probe-based real-time PCR. Detection of the target sequence
is achieved by monitoring a clear increase in the fluorescence signal above the cycle threshold, Ct.
NOTE Probe-based real-time PCR combines amplification, detection, and confirmation of the target DNA.
4.5 Isolation
After a PCR-positive result is obtained, the target organism can be isolated by using culture methods as
described in this Technical Specification.
5 Reagents
5.1 General
For the stages in 4.1 b)-c), molecular grade reagents and consumables suitable for molecular biology
shall be used as given in ISO 20837 and ISO 20838.
Requirements are specified in ISO 20838.
The following media and reagents should be used.
5.2 Culture media
5.2.1 General
See ISO 7218 and ISO 11133 for the preparation, production, and performance testing of culture media.
5.2.2 Diluent
See ISO 6887-1 and the relevant part of ISO 6887 dealing with the product to be examined.
5.2.3 Enrichment media
5.2.3.1 Tryptone-soya broth supplemented with yeast, TSBY
5.2.3.1.1 Composition
Pancreatic digest of casein 17,0 g
2 © ISO 2015 – All rights reserved
Papaic digest of soyabean meal 3,0 g
Sodium chloride, (NaCl) 5,0 g
Dibasic potassium phosphate, (K HPO ) 2,0 g
2 4
Glucose 2,5 g
Yeast extract 6,0 g
Water 1 000 ml
5.2.3.1.2 Preparation
Dissolve the above ingredients in 1 000 ml distilled water. Adjust the pH, if necessary, so that after
sterilization it is pH 7,3 ± 0,2. Dispense the medium into tubes or flasks of suitable capacity to obtain
portions appropriate for the test samples. Sterilize for 15 min at 121 °C ± 1 °C.
Store the medium in the dark at room temperature and not longer than 4 weeks.
Alternatively, use dehydrated Tryptone soya broth (TSB) 30 g/l supplemented with 0,6 % yeast extract,
pH 7,3 ± 0,2.
[15]
5.2.3.2 Peptone-sorbitol-bile-salt broth, PSB
5.2.3.2.1 Composition
Peptone 5,0 g
Sorbitol 10,0 g
Sodium chloride, (NaCl) 5,0 g
Disodium hydrogen phosphate (Na HPO ) 8,23 g
2 4
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH PO .H O) 1,2 g
2 4 2
Bile salts 1,5 g
Water 1 000 ml
5.2.3.2.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water, if necessary by heating.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization it is pH 7,6 ± 0,2.
Dispense the medium into tubes or flasks of suitable capacity to obtain portions appropriate for the
test samples. Sterilize for 15 min at 121 °C ± 1 °C.
[5]
5.2.3.3 Cold enrichment broth, PMB
5.2.3.3.1 Composition
Disodium hydrogen phosphate (Na HPO ) 7,6 g
2 4
Potassium dihydrogen phosphate (KH PO ) 1,0 g
2 4
Sodium chloride (NaCl) 8,5 g
Mannitol 10,0 g
Bile salts N°. 3 1,5 g
Water 1 000 ml
5.2.3.3.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water, if necessary by heating.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization it is pH 7,6 ± 0,2.
Dispense the medium into tubes or flasks of suitable capacity to obtain portions appropriate for the
test samples. Sterilize for 15 min at 121 °C ± 1 °C.
5.2.4 Selective solid medium
[10]
5.2.4.1 Cefsulodin Irgasan Novobiocin agar, CIN
5.2.4.1.1 Basic medium, composition
Enzymatic digest of gelatin 17,0 g
Enzymatic digest of casein and animal tissues 3,0 g
Yeast extract 2,0 g
Mannitol 20,0 g
Sodium pyruvate 2,0 g
Sodium chloride, (NaCl) 1,0 g
Magnesium sulfate, (MgSO .7 H O) 0,01 g
4 2
Sodium desoxycholate 0,5 g
Neutral red 0,03 g
Crystal violet 0,001 g
Agar 12,5 g
Water 1 000 ml
5.2.4.1.2 Preparation
Dissolve the components or dehydrated basic medium in the water by boiling. Adjust the pH, if necessary,
so that after sterilization it is pH 7,4 ± 0,2 at 25 °C. Dispense the medium into flasks of suitable capacity.
Sterilize for 15 min at 121 °C ± 1 °C.
5.2.4.2 Supplements
5.2.4.2.1 Cefsulodin solution (15 mg/ml)
Dissolve 1,5 g Cefsulodin in 100 ml water. Sterilize by filtration.
™
5.2.4.2.2 Irgasan [5-chloro-2-(2,4-dichlorophenoxy)phenol], ethanolic solution (4 mg/ml).
Dissolve Irgasan in ethanol, store the solution at about −20 °C for not more than 4 weeks.
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5.2.4.2.3 Novobiocin solution (2,5 mg/ml)
Dissolve novobiocin in water. Sterilize by filtration.
5.2.4.3 Composition of the complete medium
Basic medium (5.2.4.1.1) 997 ml
Cefsulodin solution (5.2.4.2.1) 1 ml
Irgasan solution (5.2.4.2.2) 1 ml
Novobiocin solution (5.2.4.2.3) 1 ml
5.2.4.4 Preparation
Add each antibiotic solution aseptically to the basic medium, cooled to about 45 °C, and mix. Pour
approximately 15 ml of the complete medium into sterile petri dishes.
5.2.5 Potassium hydroxide in saline solution, KOH
5.2.5.1 Composition
Potassium hydroxide (KOH) 0,25 g/0,50 g
Saline solution 100 ml
NOTE It is recommended to use freshly prepared 0,5 % KOH for pathogenic Y. enterocolitica and 0,25 % for
Y. pseudotuberculosis.
5.2.5.2 Preparation
Dissolve the potassium hydroxide in the saline solution. Dispense the solution into flasks of a suitable
capacity. Sterilize for 15 min at 121 °C ± 1 °C. Prepare the solution the day before use.
5.3 Nucleic acid extraction
Nucleic acid extraction procedure and reagents appropriate for Gram-negative bacteria shall be used.
NOTE Commercial kits can also be used.
5.4 Reagents for PCR
See ISO 22119 and ISO 20838.
5.5 Primers and probes
The primers and probes for detection of pathogenic Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis are listed
in Annex B and Annex C.
6 Apparatus and equipment
6.1 General
Microbiology equipment (see ISO 7218, ISO 20837, and ISO 22119), in particular, the following
6.2 Equipment for sample preparation prior to enrichment
Peristaltic blender and sterile bags with filter.
NOTE Filter of small pore size suitable for PCR is recommended.
6.3 Equipment for microbial enrichment
Incubators, capable of operating at 25 °C ± 1 °C and 30 °C ± 1 °C.
6.4 Equipment for nucleic acid extraction
6.4.1 Micro-centrifuge tubes, with capacities of 1,5 ml and 2,0 ml.
6.4.2 Centrifuge, for reaction tubes with a capacity of 1,5 ml and 2,0 ml and capable of achieving an
acceleration up to approximately 14 000 × g.
6.4.3 Thermoblock, with heating capacity of up to 100 °C.
6.4.4 Graduated pipettes and pipette filter tips, for volumes between 1 µl to 1 000 µl.
6.4.5 Mixer.
6.5 Equipment for real-time PCR
6.5.1 Real-time PCR thermal cycler.
6.5.2 96-well plates and/or 8-well strips.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this Technical Specification. If there is no specific
International Standard dealing with sampling of the product concerned, it is recommended that the
parties concerned come to an agreement on this subject.
8 Procedure
See diagram in Annex A.
8.1 Sample preparation prior to enrichment
8.1.1 General
It is recommended to analyse at least 25 g or 25 ml of sample. However, if sample amount is limited
other sample sizes can be used.
8.1.2 Preparation of the sample
Prepare and homogenize the sample according to ISO 6887-1 and the relevant part of ISO 6887 dealing
with the specific product type intended for analysis (see ISO 6887-1 to ISO 6887-5).
A test portion of the sample is added to the enrichment medium to obtain a ratio of the test portion to
medium of 1/10.
6 © ISO 2015 – All rights reserved
8.2 Microbial enrichment
Depending on the target, most suitable enrichment medium should be used.
8.2.1 Pathogenic Y. enterocolitica
PSB enrichment medium should be used prior to detection by PCR.
PSB enrichment is performed at 25 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h.
If isolation of colonies is required, enrichment time should be increased up to 48 h. It is recommended
to refer to ISO 10273.
If thermal lysis is used to extract DNA (method Annex B), prolonged enrichment for 48 h in PSB
may be needed.
8.2.2 Y. pseudotuberculosis
TSBY enrichment medium should be used prior to detection by PCR.
TSBY enrichment is performed at 25 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h.
NOTE The procedure does not allow isolation of the bacterium. Isolation involves re-enrichment of the
sample by selective culture as described in 8.3.2 and C.2.
If there is a limited amount of sample or swab sample that cannot be divided for PCR screening (TSBY)
and isolation of colonies, PMB should be used instead of TSBY, see C.2, 5.2.3.3, and 8.3.2.
8.2.3 Pathogenic Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis
For the simultaneous detection of Y. pseudotuberculosis and pathogenic Y. enterocolitica by PCR, TSBY
medium may be used.
The risk of false-negative results for Y. enterocolitica may increase when TSBY is used.
8.3 Isolation of colonies, optional
8.3.1 Pathogenic Y. enterocolitica
After enrichment for 24 h ± 3 h, transfer 0,5 ml of the PSB enrichment into 4,5 ml 0,5 % potassium
hydroxide solution, KOH (5.2.5) and mix gently for 25 s ± 5 s. Inoculate 1 µl, 10 µl, and 100 µl of the
mixture after streaking on the surface of three CIN-agar plates. Continue incubation of the enrichment
for further 24 h. Incubate CIN agar plates at 30 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h. Plates are examined (preferably
by stereo microscope) and typical colonies with bull’s eye appearance are picked for confirmation.
Second plating on CIN agar is made after 48 h ± 4 h enrichment, performed in the same way as for the
plating after 24 h.
Presumptive pathogenic Y. enterocolitica colonies should be confirmed according to ISO 10273.
NOTE Only for samples with high expected Y. enterocolitica contamination levels, enrichment in PSB can
be used to isolate colonies as described in this Technical Specification. For samples with low suspected Y.
enterocolitica contamination levels, it is recommended to follow ISO 10273 for isolation of colonies.
8.3.2 Y. pseudotuberculosis
Test sample is inoculated (dilution 1/10) into the cold enrichment medium PMB (5.2.3.3), homogenized
and incubated at 4 °C ± 1 °C for 7 days and 14 days. If PCR detection of Y. pseudotuberculosis has to be
performed after enrichment in PMB (see 8.2.2), nucleid acid extraction and further PCR amplification
should be carried out after 72 h ± 8 h of incubation (see 8.4 and 8.5).
Transfer 0,5 ml of the incubated enrichment (PMB) into 4,5 ml 0,25 % potassium hydroxide solution,
KOH, (5.2.5) and mix gently for 25 s ± 5 s. Transfer the mixture by using a 10 µl loop onto the surface of
a CIN-agar plate(performed in duplicate). Incubate CIN-agar plates at 30 °C ± 1 °C for a total of 48 h ± 4 h
but examine the plates for typical growth after 24 h. Plates are examined by stereo microscope and
typical colonies are picked for confirmation. Typical colonies are small (usually <0,5 mm in diameter
after 24 h incubation) and irregular-edged. Colonies usually have deep-red diffuse centre with no clear
borderline. The transparent or translucent zone surrounding the centre has ground-glass appearance
and may be thin and hardly visible after 24 h. For confirmation, biochemical or PCR tests can be used.
8.3.3 Process controls
Positive and negative process controls shall be used according to ISO 22174.
8.4 Nucleic acid extraction
Nucleic acid is extracted from a portion, usually 1 ml, of the enriched culture. Any nucleic acid extraction
procedure appropriate for Gram-negative bacteria tested suitable for this purpose can be used, for
[2]
example the CTAB extraction method. Also commercial kits can be used.
NOTE It is known that for certain matrices a nucleic acid extraction method producing high yield and high
purity DNA is needed (see Annexes B, C, and D for the tested matrices).
8.5 PCR amplification
8.5.1 General
Different protocols for probe-based real-time PCR amplification can be used.
Examples of real-time PCR assays for detection of pathogenic Y. enterocolitica are given in Annex B.
Example of a real-time PCR assay for Y. pseudotuberculosis is given in Annex C.
Example of a real-time PCR assay for simultaneous detection of pathogenic Y. enterocolitica and
Y. pseudotuberculosis is given in Annex D.
8.5.2 PCR controls
PCR controls shall be in accordance with ISO 22174.
8.6 Confirmation of the PCR product
8.6.1 General
According to ISO 20838 a probe-based PCR-positive result does not require additional confirmation of
the PCR product.
8.6.2 Interpretation of the PCR result
The result obtained, including the controls specified in ISO 22174, should be unambiguous otherwise
the PCR shall be repeated.
The PCR result will be either
a) positive if a specific PCR product has been detected and all the controls give expected results, or
b) negative within the limits of detection, if a specific PCR product has not been detected, and all
controls give expected results.
8 © ISO 2015 – All rights reserved
9 Test report
The test report shall conform to the requirements of ISO 22174.
Additionally, it shall specify which method within this Technical Specification has been used, in particular
when the simultaneous detection of pathogenic Y. enterolitica and Y. pseudotuberculosis is performed.
Annex A
(normative)
PCR detection and isolation of pathogenic Y. enterocolitica (see
Figure A.1)
Figure A.1 — Flow diagram for PCR detection and isolation of pathogenic Y. enterocolitica
10 © ISO 2015 – All rights reserved
Annex B
(informative)
Real-time PCR for detection of Y. enterocolitica
B.1 Real-time PCR for detection of Y. enterocolitica — Method 1
B.1.1 General
This is a method for the detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by amplification of a sequence
specific for the ail locus of Y. enterocolitica. This gene is part of the pathogenicity mechanism of Y.
enterocolitica.
The detection system was developed as duplex real-time PCR in combination with a heterologous internal
amplification control based on the plasmid pUC 19. By real-time PCR, a fragment spanning from the lac
operon from M13mp18 to sequences of pBR322 is amplified. This sequence does not occur naturally.
B.1.2 Performance characteristics
B.1.2.1 General
The method is applicable for the detection of Y. enterocolitica strains representing the bioserotypes
associated with pathogenicity in humans.
[7]
The method has been published.
B.1.2.2 Selectivity
Selectivity was performed using the primers ye-ail-F2 and ye-ail-R2, in combination with the hydrolysis
probe ye-ail-tmp in combination with the internal amplification control using the primer-probe system
pUC 18-F, pUC 18-R, and Tm-pUC 18.
B.1.2.2.1 Inclusivity test
Inclusivity of the PCR assay was tested on 50 strains, 100 % inclusivity was obtained (see Table B.1).
The strains tested were isolated from samples of human, animal, and food origin.
Table B.1 — Inclusivity using 50 target strains
Species and bio/serotype Number of strains resulting in
(Number of strains) amplification of the target fragment
Y. enterocolitica 4/O:3 (33) 33
Y. enterocolitica 2/O:9 (3) 3
Y. enterocolitica 2/O:9 (11) 11
Y. enterocolitica 1B/O:8 (1) 1
Y. enterocolitica 2/O:5,27 (2) 2
Total (50) 50
B.1.2.2.2 Exclusivity test
Exclusivity of the PCR assay was tested on 51 non-target strains, 100 % exclusivity was obtained (see
Table B.2) The strains tested were isolated from samples of human, animal, and food origin.
Table B.2 — Exclusivity using 51 non-target strains
Number of strains resulting in
Species and bio/serotype
amplification of the target frag-
(Number of strains)
ment
Y. enterocolitica 1A/O:5 (2) 0
Y. enterocolitica 1A/O:6, 30 (1) 0
Y. enterocolitica 1A/O:10 (1) 0
Y. frederiksenii (2) 0
Y. kristensenii (2) 0
Y. intermedia (2) 0
Y. aldovae (1) 0
Y. mollaretii (1) 0
Y. pseudotuberculosis (3) 0
Diverse food-related bacterial species (34) 0
Saccharomyces cerevisiae (1) 0
Aspergillus niger (1) 0
Total (51) 0
B.1.2.2.3 Molecular selectivity
According to a BLAST search (16.5.2011) the primers and probe have been validated in silico.
B.1.2.3 Sensitivity
B.1.2.3.1 Reaction sensitivity
The limit of detection is 5 genome equivalents [25 femtograms (fg)] per single reaction. All analyses
were performed in the presence of approximately 25 copies of the internal amplification control (IAC).
B.1.2.3.2 Method sensitivity
[17]
The detection level LOD of the PCR method was 10,7 cfu per 25 g of food. The limit of detection
of the method was assessed measuring four different food matrices, i.e. Mortadella sausage, cabbage,
pasteurized milk, and uncooked fish, inoculated with 5 cfu and 50 cfu in 25 g with six replicates for
each contamination level. After 48 h of enrichment in PSB, the limit of detection in Mortadella sausage,
uncooked fish, and pasteurized milk was 5 cfu in 25 g and in cabbage it was 50 cfu in 25 g.
B.1.2.3.3 Performance parameters relative accuracy, relative sensitivity, relative specificity
Relative accuracy AC 89,5 %
Relative sensitivity SE 100 %
Relative specificity SP 76,7 %
12 © ISO 2015 – All rights reserved
The performance parameters were assessed by comparison with the culture method according to
ISO 10273:2003, Clause 5.
NOTE These data were obtained by the analysis of artificially contaminated samples.
B.1.2.4 Robustness
The robustness of the PCR was tested by applying the following modifications in the reaction setup.
— Increasing and decreasing the primer and probe concentrations by ±20 % in the presence of 25
copies of the internal amplification control.
— Use of two different formulations of the Taq-polymerase mastermixes from two suppliers.
The modifications did not influence the reaction performance.
B.1.2.5 Instruments
1)
Evaluation was carried out using the Roche LightCycler® 480 and the ABI 7900HT real-time PCR
1)
instruments .
Different real-time PCR instruments did not have a significant influence in the method’s performance.
B.1.3 Procedure
B.1.3.1 Principle
A specific DNA fragment of the ail locus of Yersinia enterocolitica is amplified and detected by real-
time PCR. The real-time PCR system is based on a specific hydrolysis probe which is labelled with
Carboxyfluorescein (FAM) as reporter molecule and Dabcyl as non-fluorescent quencher molecule.
B.1.3.2 Reagents
B.1.3.2.1 General
For quality of reagents used, see ISO 22174.
B.1.3.2.2 Reagents for PCR
See ISO 22119 and ISO 20838.
B.1.3.2.3 Oligonucleotides
B.1.3.2.3.1 Oligonucleotides, pathogenic Y. enterocolitica
Table B.3 — Sequences of the oligonucleotides
Primer and Size of the PCR
DNA sequence of the oligonucleotide (5’ – 3’)
probe product
ye-ail-F2 5’-GGT TAT GCA CAA AGC CAT GTA AA -3’
93 bp
ye-ail-R2 5’-AAA CGA ACC TAT TAC TCC CCA GTT-3’
a
FAM: 6 Carboxyfluorescein, DB: Dabcyl.
1) The Roche LightCycler® 480 and the ABI 7900HT real-time PCR instruments, are examples of suitable products
available commercially from Roche Diagnostics and Life Technologies respectively. This information is given for the
convenience of the user of this Technical Specification and does not constitute an endorsement of these products.
Equivalent products can be used if they can be shown to lead to equivalent results.
Table B.3 (continued)
Primer and Size of the PCR
DNA sequence of the oligonucleotide (5’ – 3’)
probe product
ye-ail-tmp-
a
5’-FAM-AAC CTG AAG TAC CGT TAT GAA CTC GAT GA-DB-3’
probe
a
FAM: 6 Carboxyfluorescein, DB: Dabcyl.
B.1.3.2.3.2 Oligonucleotides, internal amplification control, IAC
Table B.4 — Sequences of the oligonucleotides
Name DNA sequence of the oligonucleotide (5’ – 3’) Size of the PCR
product
pUC 18-F 5’-TGT CGT GCC AGC TGC ATT A-3’
83 bp
pUC 18-R 5’-GAG CGA GGA AGC GGA AGA G-3’
a
Tm-pUC18- 5’-TexasRed - AAT CGG CCA ACG CGC GG -BHQ2–3’
probe
a
TexasRed:Sulforhodamin-101-Sulfonylchlorid, BHQ2:N-Nitrophenylazo-dimethoxy-
phenylazo-phenyl-N-dimethoxytrityloxy-ethyl-2-aminoethyl-1-oxyglycolate (Black-Hole Quencher 2™).
NOTE Equivalent reporter molecule and/or quencher molecule can be used.
B.1.4 Molecular procedure
B.1.4.1 DNA extraction
1 ml of each aliquot of the above listed samples is transferred into a 1,5 ml reaction tube and centrifuged
for 10 min at 13 000 × g. The bacterial pellet is washed twice in 1 ml 0,9 % NaCl and finally resuspended
in 200 µl molecular grade water. After 10 min incubation at 95 °C, 2,5 µl is used as template for the
real-time PCR.
B.1.4.2 PCR setup
The total PCR volume is 25 µl per PCR reaction. The reagents are listed in Table B.5.
Table B.5 — Addition of reagents
Reagent (Stock conc.) Final concentration Volume per reaction (μl)
a
LightCycler® 480 Probes Master 1 x 12,5
(containing Fast Start Taq DNA
polymerase, reaction buffer, dNTP-
mix with dUTP instead of dTTP and
6,4 mmol/l MgCl2)
ye-ail-F2 (10 µmol/l) 300 nmol/l 0,75
ye-ail-R2 (10 µmol/l) 300 nmol/l 0,75
ye-ail-tmp (10 µmol/l) 125 nmol/l 0,312
pUC 18-F (10 µmol/l) 250 nmol/l 0,625
pUC 18-R (10 µmol/l) 250 nmol/l 0,625
Tm-pUC18 (10 µmol/l) 100 nmol/l 0,25
a
Roche LC 480 Probes Master is an example of a suitable product available commercially from Roche Diagnostics. This
information is given for the convenience of the user of this Technical Specification and does not constitute an endorsement
of this product. Equivalent products can be used if they can be shown to give to the same results.
14 © ISO 2015 – All rights reserved
Table B.5 (continued)
Reagent (Stock conc.) Final concentration Volume per reaction (μl)
IAC plasmid pUC19 ~25 copies (0,1 pg) 1
Test sample 2,5
Sterile distilled water Adjust the volume to 25 μl 5,687
a
Roche LC 480 Probes Master is an example of a suitable product available commercially from Roche Diagnostics. This
information is given for the convenience of the user of this Technical Specification and does not constitute an endorsement
of this product. Equivalent products can be used if they can be shown to give to the same results.
B.1.4.3 PCR controls
PCR controls shall be in accordance with ISO 22174.
B.1.4.3.1 Negative PCR control
DNA-free water is used as a negative control.
B.1.4.3.2 Positive PCR control
A solution containing a defined amount and/or copy number of target DNA is used as a positive control.
B.1.4.3.3 Amplification control
An example of an IAC is given in Table B.4. This IAC is based on E. coli plasmid pUC19 DNA as target
molecule. Also commercially available amplification controls can be used.
NOTE The plasmid vectors pUC18 and pUC19 (Accession number L08752; 2686 Bp) are identical except that
they contain polycloning sites arranged in opposite directions.
B.1.4.4 Temperature - time programme
The temperature-time programme stated in Table B.6 has proven suitable.
Table B.6 — Temperature/time programme
Activation/initial denaturation 95 °C 10 min
Denaturation 95 °C 10 s
Amplification 60 °C 30 s
Number of cycles 45
B.1.4.5 Limitations of the assay
[8]
A high correlation has been found between the presence of the ail gene and virulence of yersiniae,
however, in rare occasions Yersinia enterocolitica biotype 1A strains, which are generally considered
[6][11]
as non-pathogenic, may carry a variant of the ail gene. However, there are indications that a small
[12]
proportion of the 1A strains may be pathogenic to humans.
B.2 Real-time PCR for detection of pathogenic Y. enterocolitica — Method 2
B.2.1 General
This is a method for the detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by amplification of a sequence
specific for the ail locus of Yersinia enterocolitica. This gene is part of the pathogenicity mechanism of
Yersinia enterocolitica.
The detection system was developed as duplex real-time PCR in combination with a heterologous
internal amplification control based on the plasmid pUC 19.
B.2.2 Performance characteristics
B.2.2.1 General
The method is applicable for the detection of Y. enterocolitica strains representing the bioserotypes
associated with patogenicity in humans.
[13][14]
The method has been published.
B.2.2.2 Selectivity
Selectivity was performed using the primers R-real 9A and F-real 10A, in combination with a MGB™-
2)
probe or a TAMRA-quenched probe (ail probe) in combination with the internal amplification control
using the primer-probe system IAC-fw, IAC-re, and probe pUC 19.
B.2.2.2.1 Inclusivity test
Inclusivity of the PCR assay was tested on 102 strains, 100 % inclusivity was obtained, see Table B.7.
The strains tested were isolated from samples of human (n = 70), animal (n = 15), food (n = 8), and
unknown (n = 9) origin.
Table B.7 — Inclusivity using 102 target strains
Species and bio/serotype Number of strains resulting in amplification
(Number of strains) of the target fragment
Y. enterocolitica 4/O:3 (81) 81
Y. enterocolitica NT/O:9 (3) 3
Y. enterocolitica NT/O:8 (8) 8
Y. enterocolitica NT/O:5,27 (4) 4
Y. enterocolitica 1B/O:18 (1) 1
Y. enterocolitica NT/O:20 (2) 2
Y. enterocolitica 1B/O:21 (1) 1
Y. enterocolitica 3/O:1,2,3 (1) 1
Y. enterocolitica 5/O:2,3 (1) 1
Total 102 102
NT = not typed.
B.2.2.2.2 Exclusivity test
Exclusivity of the PCR assay was tested on 71 non-target
...
SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 18867
Première édition
2015-09-15
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) pour
la détection de micro-organismes
pathogènes dans les aliments —
Détection des Yersinia enterocolitica
et Yersinia pseudotuberculosis
pathogènes
Microbiology of the food chain — Polymerase chain reaction (PCR)
for the detection of food-borne pathogens — Detection of
pathogenic Yersinia enterocolitica and Yersinia
pseudotuberculosis
Numéro de référence
©
ISO 2015
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Fax +41 22 749 09 47
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www.iso.org
ii © ISO 2015 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principes . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Enrichissement microbien . 2
4.3 Extraction de l’ADN . 2
4.4 Amplification et détection . 2
4.5 Isolement . 2
5 Réactifs . 2
5.1 Généralités . 2
5.2 Milieux de culture . 2
5.2.1 Généralités . 2
5.2.2 Diluant . 2
5.2.3 Milieux d’enrichissement . 3
5.2.4 Milieux solides sélectifs . 4
5.2.5 Solution d’hydroxyde de potassium en solution saline, KOH . 5
5.3 Extraction de l’ADN . 5
5.4 Réactifs pour la PCR. 5
5.5 Amorces et sondes . 6
6 Appareillage et équipement . 6
6.1 Généralités . 6
6.2 Équipement de préparation des échantillons avant l’enrichissement . 6
6.3 Équipement pour l’enrichissement microbien . 6
6.4 Équipement pour l’extraction de l’ADN . 6
6.5 Équipement pour la PCR en temps réel . 6
7 Échantillonnage . 6
8 Mode opératoire. 6
8.1 Préparation de l’échantillon avant l’enrichissement . 7
8.1.1 Généralités . 7
8.1.2 Préparation de l’échantillon . 7
8.2 Enrichissement microbien . 7
8.2.1 Y. enterocolitica pathogènes . 7
8.2.2 Y. pseudotuberculosis . 7
8.2.3 Y. enterocolitica et Y. pseudotuberculosis pathogènes . 7
8.3 Isolement de colonies, facultatif . 7
8.3.1 Y. enterocolitica pathogènes . 7
8.3.2 Y. pseudotuberculosis . 8
8.3.3 Témoins de processus . 8
8.4 Extraction de l’acide désoxyribonucléique (ADN) . 8
8.5 Amplification PCR. 8
8.5.1 Généralités . 8
8.5.2 Témoins de PCR . 9
8.6 Confirmation du produit PCR . 9
8.6.1 Généralités . 9
8.6.2 Interprétation du résultat de PCR . 9
9 Rapport d’essai . 9
Annexe A (normative) Détection par PCR et isolement des Y. enterocolitica pathogènes
(voir la Figure A.1) .10
Annexe B (informative) PCR en temps réel pour la détection des Y. enterocolitica .11
Annexe C (informative) Détection et isolement des Y. pseudotuberculosis .21
Annexe D (informative) Détection simultanée des Y. enterocolitica et des
Y. pseudotuberculosis pathogènes par PCR multiplex en temps réel .26
Bibliographie .29
iv © ISO 2015 – Tous droits réservés
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer
un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est le CEN/TC 275, Analyse des produits
alimentaires — Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec
le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à
l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Introduction
Yersinia enterocolitica et Yersinia pseudotuberculosis sont des bactéries pathogènes, agents de zoonoses,
responsables au niveau mondial d’une infection d’origine alimentaire (yersiniose) chez l’homme.
[3]
Les porcs domestiques sont le principal réservoir de Y. enterocolitica pathogènes, tandis que pour
Y. pseudotuberculosis, un large éventail d’animaux domestiques et sauvages tels que les rongeurs, les
[4]
cervidés, les oiseaux et divers animaux de ferme servent de réservoirs potentiels. Certains biotypes
de Y. enterocolitica sont associés à l’infection humaine. Par contre, toutes les Y. pseudotuberculosis sont
[9]
considérées comme potentiellement pathogènes pour l’homme.
Le gène ail (attachment invasion locus) situé sur l’ADN chromosomique est présent dans tous les
bio-(séro) types de Y. enterocolitica associés à la maladie et un de ses variants est également présente
[8]
dans Y. pseudotuberculosis. Le gène ail est le gène cible utilisé pour la détection décrite dans la
présente Spécification technique, et les couples d’amorces et de sondes mis au point ciblent différents
[7][8][13][14]
sites du gène ail pour les deux pathogènes.
vi © ISO 2015 – Tous droits réservés
SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 18867:2015(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Réaction
de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection
de micro-organismes pathogènes dans les aliments
— Détection des Yersinia enterocolitica et Yersinia
pseudotuberculosis pathogènes
1 Domaine d’application
La présente Spécification technique décrit deux méthodes horizontales pour la détection de biosérotypes
pathogènes des Y. enterocolitica ainsi qu’une méthode pour la détection des Y. pseudotuberculosis en
faisant appel à des méthodes basées sur la PCR en temps réel. Les méthodes décrites permettent la
détection des deux micro-organismes pathogènes par enrichissement et permettent d’isoler des
colonies. Y. pestis, l’agent responsable de la peste bubonique et pneumonique héberge aussi un variant
du gène ail et sera détecté par le même ensemble d’amorce et de sonde que Y. pseudotuberculosis.
Toutefois, Y. pestis n’est normalement pas associé aux aliments. La présente Spécification technique
est applicable aux produits destinés à la consommation humaine, aux aliments pour animaux et aux
échantillons environnementaux.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables
à l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence (y compris les éventuels
amendements) s’applique.
ISO 6887-1, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de
la suspension mère et des dilutions décimales
ISO 10273, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche de Yersinia enterocolitica
présumées pathogènes
ISO 20837, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection des
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences relatives à la préparation des échantillons
pour la détection qualitative
ISO 20838, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection des
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences relatives à l’amplification et à la détection
pour les méthodes qualitatives
ISO 22119, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en temps réel pour la
détection des micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
ISO 22174, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 22174 et dans
l’ISO 22119 s’appliquent.
4 Principes
4.1 Généralités
La méthode comporte plusieurs étapes consécutives:
a) l’enrichissement microbien (4.2);
b) l’extraction de l’ADN (acide désoxyribonucléique) (4.3);
c) l’amplification et la détection (4.4);
d) l’isolement (4.5).
4.2 Enrichissement microbien
Le nombre de cellules bactériennes pathogènes de Y. enterocolitica et de Y. pseudotuberculosis est
augmenté en favorisant leur croissance dans un milieu nutritif liquide non sélectif ou semi-sélectif.
4.3 Extraction de l’ADN
Les cellules bactériennes sont séparées du bouillon nutritif, lysées et l’ADN est extrait pour être utilisé
dans la réaction de PCR.
4.4 Amplification et détection
L’ADN extrait est amplifiée par PCR en temps réel avec sonde. La séquence cible est détectée en
observant une nette augmentation du signal de fluorescence au-dessus du cycle seuil, Ct.
NOTE La PCR en temps réel avec sonde combine l’amplification, la détection et la confirmation de l’ADN cible.
4.5 Isolement
Après obtention d’un résultat positif par PCR, l’organisme cible peut être isolé en utilisant les méthodes
de culture décrites dans la présente Spécification technique.
5 Réactifs
5.1 Généralités
Pour les étapes indiquées en 4.1 b)-c), des réactifs de qualité biologie moléculaire et des consommables
adaptés à la biologie moléculaire doivent être utilisés tel qu’indiqué dans l’ISO 20837 et l’ISO 20838.
Les exigences sont spécifiées dans l’ISO 20838.
Il convient d’utiliser les milieux et réactifs suivants.
5.2 Milieux de culture
5.2.1 Généralités
Voir l’ISO 7218 et l’ISO 11133 pour la préparation, la production et les essais de performance des
milieux de culture.
5.2.2 Diluant
Voir l’ISO 6887-1 et la partie pertinente de l’ISO 6887 traitant du produit à examiner.
2 © ISO 2015 – Tous droits réservés
5.2.3 Milieux d’enrichissement
5.2.3.1 Bouillon de tryptone-soja supplémenté en levure, TSBY
5.2.3.1.1 Composition
Digestion pancréatique de caséine 17,0 g
Digestion papaïnique de farine de soja 3,0 g
Chlorure de sodium, (NaCl) 5,0 g
Phosphate dipotassique, (K HPO ) 2,0 g
2 4
Glucose 2,5 g
Extrait de levure 6,0 g
Eau 1 000 ml
5.2.3.1.2 Préparation
Dissoudre les ingrédients ci-dessus dans 1 000 ml d’eau distillée. Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte
qu’après stérilisation, il soit de 7,3 ± 0,2. Répartir le milieu dans des tubes ou des flacons de capacité
adaptée pour obtenir des volumes appropriés pour les échantillons pour essai. Stériliser pendant
15 min à 121 °C ± 1 °C.
Conserver le milieu dans l’obscurité et à température ambiante pendant une durée maximale de
4 semaines.
En alternative, utiliser un bouillon de tryptone-soja déshydraté (TSB) à 30 g/l supplémenté avec 0,6 %
d’extrait de levure, pH 7,3 ± 0,2.
[15]
5.2.3.2 Bouillon à la peptone, au sorbitol et aux sels biliaires, PSB
5.2.3.2.1 Composition
Peptone 5,0 g
Sorbitol 10,0 g
Chlorure de sodium, (NaCl) 5,0 g
Hydrogénophosphate de sodium (Na HPO ) 8,23 g
2 4
Dihydrogénophosphate de sodium monohydraté (NaH PO .H O) 1,2 g
2 4 2
Sels biliaires 1,5 g
Eau 1 000 ml
5.2.3.2.2 Préparation
Dissoudre, dans de l’eau, les composants ou le milieu complet déshydraté, en chauffant si nécessaire.
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après stérilisation, il soit de 7,6 ± 0,2.
Répartir le milieu dans des tubes ou des flacons de capacité adaptée pour obtenir des volumes
appropriés pour les échantillons pour essai. Stériliser pendant 15 min à 121 °C ± 1 °C.
[5]
5.2.3.3 Bouillon d’enrichissement au froid, PMB
5.2.3.3.1 Composition
Hydrogénophosphate de sodium (Na HPO ) 7,6 g
2 4
Dihydrogénophosphate de potassium (KH PO ) 1,0 g
2 4
Chlorure de sodium (NaCl) 8,5 g
Mannitol 10,0 g
Sels biliaires N°. 3 1,5 g
Eau 1 000 ml
5.2.3.3.2 Préparation
Dissoudre, dans de l’eau, les composants ou le milieu complet déshydraté, en chauffant si nécessaire.
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après stérilisation, il soit de 7,6 ± 0,2.
Répartir le milieu dans des tubes ou des flacons de capacité adaptée pour obtenir des volumes
appropriés pour les échantillons pour essai. Stériliser pendant 15 min à 121 °C ± 1 °C.
5.2.4 Milieux solides sélectifs
[10]
5.2.4.1 Gélose à la cefsulodine, à l’Irgasan et à la novobiocine, CIN
5.2.4.1.1 Milieu de base, composition
Digestion enzymatique de gélatine 17,0 g
Digestion enzymatique de caséine et de tissus animaux 3,0 g
Extrait de levure 2,0 g
Mannitol 20,0 g
Pyruvate de sodium 2,0 g
Chlorure de sodium, (NaCl) 1,0 g
Sulfate de magnésium, (MgSO .7 H O) 0,01 g
4 2
Désoxycholate de sodium 0,5 g
Rouge neutre 0,03 g
Violet cristallisé 0,001 g
Gélose 12,5 g
Eau 1 000 ml
5.2.4.1.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau les composants ou le milieu de base déshydraté, en portant à ébullition. Ajuster le
pH, si nécessaire, de sorte qu’après stérilisation, il soit de 7,4 ± 0,2 à 25 °C. Répartir le milieu dans des
fioles de capacité appropriée. Stériliser pendant 15 min à 121 °C ± 1 °C.
4 © ISO 2015 – Tous droits réservés
5.2.4.2 Suppléments
5.2.4.2.1 Solution de cefsulodine (15 mg/ml)
Dissoudre 1,5 g de cefsulodine dans 100 ml d’eau. Stériliser par filtration.
™
5.2.4.2.2 Irgasan [5-chloro-2-(2,4-dichlorophénoxy)phénol], solution éthanolique(4 mg/ml).
Dissoudre l’Irgasan dans l’éthanol, conserver la solution à environ −20 °C pendant une durée maximale
de 4 semaines.
5.2.4.2.3 Solution de novobiocine (2,5 mg/ml)
Dissoudre la novobiocine dans l’eau. Stériliser par filtration.
5.2.4.3 Composition du milieu complet
Milieu de base (5.2.4.1.1) 997 ml
Solution de cefsulodine (5.2.4.2.1) 1 ml
Solution d’Irgasan (5.2.4.2.2) 1 ml
Solution de novobiocine (5.2.4.2.3) 1 ml
5.2.4.4 Préparation
Ajouter stérilement chaque solution antibiotique au milieu de base, refroidi à environ 45 °C, puis
mélanger. Couler environ 15 ml de milieu complet dans des boîtes de Petri stériles.
5.2.5 Solution d’hydroxyde de potassium en solution saline, KOH
5.2.5.1 Composition
Hydroxyde de potassium (KOH) 0,25 g/0,50 g
Solution saline 100 ml
NOTE Il est recommandé d’utiliser du KOH à 0,5 % préparé extemporanément pour Y. enterocolitica
pathogènes et à 0,25 % pour Y. pseudotuberculosis.
5.2.5.2 Préparation
Dissoudre l’hydroxyde de potassium dans la solution saline. Répartir la solution dans des fioles de capacité
adéquate. Stériliser pendant 15 min à 121 °C ± 1 °C. Préparer la solution la veille de son utilisation.
5.3 Extraction de l’ADN
Un mode opératoire d’extraction de l’ADN ainsi que des réactifs appropriés pour les bactéries à Gram
négatif doivent être utilisés.
NOTE Il est également possible d’utiliser des kits disponibles dans le commerce.
5.4 Réactifs pour la PCR
Voir l’ISO 22119 et l’ISO 20838.
5.5 Amorces et sondes
Les amorces et les sondes pour la détection des Y. enterocolitica et des Y. pseudotuberculosis pathogènes
sont listées dans l’Annexe B et l’Annexe C.
6 Appareillage et équipement
6.1 Généralités
Équipement de microbiologie (voir l’ISO 7218, l’ISO 20837 et l’ISO 22119), en particulier, ce qui suit.
6.2 Équipement de préparation des échantillons avant l’enrichissement
Homogénéisateur péristaltique et sacs stériles avec filtre.
NOTE Il est recommandé d’utiliser un filtre de faible porosité adapté pour la PCR.
6.3 Équipement pour l’enrichissement microbien
Étuves, réglables respectivement à (25 ± 1) °C et à (30 ± 1) °C.
6.4 Équipement pour l’extraction de l’ADN
6.4.1 Micro-tubes à centrifuger, de capacités de 1,5 ml et 2,0 ml.
6.4.2 Centrifugeuse, pour des tubes de réaction d’une capacité de 1,5 ml et 2,0 ml et pouvant atteindre
une accélération jusqu’à environ 14 000 × g.
6.4.3 Bloc chauffant thermostaté, de capacité thermique jusque 100°C.
6.4.4 Pipettes graduées et cônes à filtres pour pipettes, pour des volumes compris entre 1 µl et
1 000 µl.
6.4.5 Agitateur.
6.5 Équipement pour la PCR en temps réel
6.5.1 Thermocycleur de PCR en temps réel.
6.5.2 Plaques de 96 puits et/ou barrettes de 8 puits.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Spécification technique.
S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique traitant de l’échantillonnage du produit concerné, il
est recommandé que les parties concernées se mettent d’accord à ce sujet.
8 Mode opératoire
Voir le diagramme à l’Annexe A.
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8.1 Préparation de l’échantillon avant l’enrichissement
8.1.1 Généralités
Il est recommandé d’analyser au moins 25 g ou 25 ml d’échantillon. Toutefois, si la quantité d’échantillon
est limitée, il est possible d’utiliser d’autres quantités d’échantillon.
8.1.2 Préparation de l’échantillon
Préparer et homogénéiser l’échantillon conformément à l’ISO 6887-1 et à la partie appropriée de
l’ISO 6887 traitant du type de produit spécifique destiné à être analysé (voir de l’ISO 6887-1 à
l’ISO 6887-5).
Une prise d’essai de l’échantillon est ajoutée au milieu d’enrichissement pour obtenir un rapport prise
d’essai sur milieu de 1/10.
8.2 Enrichissement microbien
En fonction de la cible, il convient d’utiliser le milieu d’enrichissement le plus adapté.
8.2.1 Y. enterocolitica pathogènes
Il convient d’utiliser le milieu d’enrichissement PSB avant la détection par PCR.
L’enrichissement en PSB est réalisé à (25 ± 1) °C pendant (24 ± 3) h.
S’il est nécessaire d’isoler les colonies, il convient d’augmenter le temps d’enrichissement jusqu’à 48 h. Il
est recommandé de se référer à l’ISO 10273.
Si une lyse thermique est employée pour extraire l’ADN (méthode de l’Annexe B), un enrichissement
prolongé pendant 48 h dans le PSB peut être nécessaire.
8.2.2 Y. pseudotuberculosis
Il convient d’utiliser le milieu d’enrichissement TSBY avant la détection par PCR.
L’enrichissement en TSBY est réalisé à (25 ± 1) °C pendant (24 ± 3) h.
NOTE Le mode opératoire ne permet pas d’isoler la bactérie. L’isolement implique d’enrichir à nouveau
l’échantillon par culture sélective, tel que décrit en 8.3.2 et C.2.
Si une quantité limitée d’échantillon ou un écouvillon ne peut pas être divisée pour l’analyse par PCR
(TSBY) et l’isolement de colonies, il convient de remplacer le TSBY par du PMB, voir C.2, 5.2.3.3 et 8.3.2.
8.2.3 Y. enterocolitica et Y. pseudotuberculosis pathogènes
Il est possible d’utiliser le milieu TSBY pour la détection simultanée des Y. pseudotuberculosis et des
Y. enterocolitica pathogènes par PCR.
Le risque de résultats faux négatifs pour Y. enterocolitica peut augmenter lorsque le TSBY est utilisé.
8.3 Isolement de colonies, facultatif
8.3.1 Y. enterocolitica pathogènes
Après l’enrichissement de (24 ± 3) h, transférer 0,5 ml du milieu d’enrichissement PSB dans 4,5 ml de
solution d’hydroxyde de potassium à 0,5 %, KOH (5.2.5) et mélanger doucement pendant (25 ± 5) s.
Ensemencer 1 µl, 10 µl et 100 µl du mélange après étalement sur la surface de trois boites de gélose CIN.
Poursuivre l’incubation du milieu d’enrichissement pendant 24 h supplémentaires. Incuber les boîtes
de gélose CIN à (30 ± 1) °C pendant (24 ±) 3 h. Les boîtes sont examinées (de préférence au microscope
stéréoscopique) et les colonies typiques ayant l’aspect en œil de bœuf sont prélevées pour confirmation.
Un second isolement sur gélose est réalisé après (48 ± 4) h d’enrichissement, de la même manière que
pour l’isolement après 24 h.
Il convient de confirmer les colonies de Y. enterocolitica présumées pathogènes conformément à
l’ISO 10273.
NOTE Uniquement pour les échantillons présentant des contaminations élevées attendues en Y. enterocolitica,
l’enrichissement en PSB peut être utilisé pour isoler les colonies tel que décrit dans la présente Spécification
technique. Pour les échantillons avec de faibles contaminations suspectés en Y. enterocolitica, il est recommandé
de suivre l’ISO 10273 pour l’isolement des colonies.
8.3.2 Y. pseudotuberculosis
ème
L’échantillon pour essai est ensemencé (dilution au 1/10 ) dans le milieu d’enrichissement PMB au
froid (5.2.3.3), homogénéisé et incubé à (4 ± 1) °C pendant 7 jours et 14 jours. S’il faut réaliser la détection
des Y. pseudotuberculosis par PCR après l’enrichissement en PMB (voir 8.2.2), il convient d’effectuer
l’extraction de l’ADN puis l’amplification par PCR après (72 ± 8) h d’incubation (voir 8.4 et 8.5).
Transférer 0,5 ml du milieu d’enrichissement incubé (PMB) dans 4,5 ml de solution d’hydroxyde de
potassium à 0,25 %, KOH, (5.2.5) et mélanger doucement pendant (25 ± 5) s. Transférer le mélange à l’aide
d’une anse de 10 µl sur la surface d’une boîte de gélose CIN (en double). Incuber les boîtes de gélose CIN
à (30 ± 1) °C pendant une durée totale de (48 ± 4) h mais examiner les boîtes pour observer la croissance
typique au bout de 24 h. Les boîtes sont examinées au microscope stéréoscopique et les colonies typiques
sont prélevées pour confirmation. Les colonies typiques sont petites (généralement <0,5 mm de diamètre
après 24 h d’incubation) et leurs bords sont irréguliers. Le centre des colonies est généralement diffus,
rouge foncé, sans délimitation claire. La zone transparente ou translucide entourant le centre présente
un aspect en verre dépoli et peut être mince et difficilement visible après 24 h. Pour confirmation, il est
possible d’utiliser des produits biochimiques ou des essais par PCR.
8.3.3 Témoins de processus
Des témoins positif et négatif de processus doivent être utilisés conformément à l’ISO 22174.
8.4 Extraction de l’acide désoxyribonucléique (ADN)
L’ADN est extrait à partir d’une partie, généralement 1 ml, de la culture enrichie. Il est possible d’utiliser
un mode opératoire d’extraction de l’ADN approprié pour les bactéries à Gram négatif soumises à
[2]
essai adaptées à cet effet, par exemple la méthode d’extraction à base de CTAB. Il est aussi possible
d’utiliser des kits disponibles dans le commerce.
NOTE On sait que pour certaines matrices, il est nécessaire d’employer une méthode d’extraction de
l’ADN produisant un rendement élevé et un ADN de haute pureté (voir les Annexes B, C et D pour les matrices
soumises à essai).
8.5 Amplification PCR
8.5.1 Généralités
Différents protocoles pour l’amplification PCR en temps réel avec sonde peuvent être utilisés.
Des exemples d’analyses PCR en temps réel pour la détection des Y. enterocolitica pathogènes sont
présentés à l’Annexe B.
Un exemple d’analyse PCR en temps réel pour Y. pseudotuberculosis est présenté à l’Annexe C.
Un exemple d’analyse PCR en temps réel pour la détection simultanée des Y. enterocolitica et des
Y. pseudotuberculosis pathogènes est présenté à l’Annexe D.
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8.5.2 Témoins de PCR
Les témoins de PCR doivent être conformes à l’ISO 22174.
8.6 Confirmation du produit PCR
8.6.1 Généralités
Conformément à l’ISO 20838, un résultat positif de PCR avec sonde ne nécessite pas de confirmation
supplémentaire du produit PCR.
8.6.2 Interprétation du résultat de PCR
Il convient que le résultat obtenu, incluant ceux des témoins spécifiés dans l’ISO 22174, soient cohérents,
sinon la PCR doit être répétée.
Le résultat de PCR sera
a) positif si un produit PCR spécifique a été détecté et que tous les témoins donnent les résultats
attendus, ou
b) négatif dans les limites de détection, si un produit PCR spécifique n’a pas été détecté et que tous les
témoins donnent les résultats attendus.
9 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit se conformer aux exigences de l’ISO 22174.
Par ailleurs, il doit spécifier quelle méthode décrite dans la présente Spécification technique
a été utilisée, en particulier dans le cas de la détection simultanée des Y. enterocolitica et des
Y. pseudotuberculosis pathogènes.
Annexe A
(normative)
Détection par PCR et isolement des Y. enterocolitica pathogènes
(voir la Figure A.1)
Figure A.1 — Logigramme pour la détection par PCR et l’isolement de Y. enterocolitica
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Annexe B
(informative)
PCR en temps réel pour la détection des Y. enterocolitica
B.1 PCR en temps réel pour la détection des Y. enterocolitica — Méthode 1
B.1.1 Généralités
Il s’agit d’une méthode pour la détection des Yersinia enterocolitica pathogènes par amplification d’une
séquence spécifique pour le locus ail de Y. enterocolitica. Ce gène intervient dans le mécanisme de
pathogénicité des Y. enterocolitica.
Le système de détection a été élaboré sous forme de PCR duplex en temps réel combinée à un témoin
interne d’amplification hétérologue basé sur le plasmide pUC 19. Un fragment allant de l’opéron lac de
M13mp18 jusqu’aux séquences de pBR322 est amplifié par PCR en temps réel. On ne trouve pas cette
séquence naturellement.
B.1.2 Caractéristiques de performance
B.1.2.1 Généralités
La méthode est applicable pour la détection de souches des Y. enterocolitica représentant les
biosérotypes associés à la pathogénicité chez l’homme.
[7]
La méthode a été publiée.
B.1.2.2 Sélectivité
La sélectivité a été évaluée à l’aide des amorces ye-ail-F2 et ye-ail-R2, en combinaison avec la sonde
d’hydrolyse ye-ail-tmp en combinaison avec le témoin interne d’amplification utilisant le système
d’amorce et de sonde pUC 18-F, pUC 18-R et Tm-pUC 18.
B.1.2.2.1 Essai d’inclusivité
L’inclusivité de l’analyse PCR a été évaluée sur 50 souches et une inclusivité de 100 % a été obtenue
(voir le Tableau B.1).
Les souches soumises à essai ont été isolées à partir d’échantillons d’origine humaine, animale et
alimentaire.
Tableau B.1 — Inclusivité sur 50 souches cibles
Espèce et bio/sérotype Nombre de souches résultant en
(Nombre de souches) l’amplification du fragment cible
Y. enterocolitica 4/O:3 (33) 33
Y. enterocolitica 2/O:9 (3) 3
Y. enterocolitica 2/O:9 (11) 11
Y. enterocolitica 1B/O:8 (1) 1
Y. enterocolitica 2/O:5,27 (2) 2
Total (50) 50
B.1.2.2.2 Essai d’exclusivité
L’exclusivité de l’analyse PCR a été évaluée sur 51 souches non cibles et une exclusivité de 100 % a
été obtenue (voir le Tableau B.2). Les souches soumises à essai ont été isolées à partir d’échantillons
d’origine humaine, animale et alimentaire.
Tableau B.2 — Exclusivité sur 51 souches non cibles
Espèce et bio/sérotype Nombre de souches résultant en
(Nombre de souches) l’amplification du fragment cible
Y. enterocolitica 1A/O:5 (2) 0
Y. enterocolitica 1A/O:6, 30 (1) 0
Y. enterocolitica 1A/O:10 (1) 0
Y. frederiksenii (2) 0
Y. kristensenii (2) 0
Y. intermedia (2) 0
Y. aldovae (1) 0
Y. mollaretii (1) 0
Y. pseudotuberculosis (3) 0
Diverses espèces bactériennes alimen- (34) 0
taires
Saccharomyces cerevisiae (1) 0
Aspergillus niger (1) 0
Total (51) 0
B.1.2.2.3 Sélectivité moléculaire
Conformément à une étude BLAST (16.5.2011), les amorces et la sonde ont été validées in silico.
B.1.2.3 Sensibilité
B.1.2.3.1 Sensibilité de la réaction
La limite de détection est de 5 équivalents génomiques [25 femtogrammes (fg)] par réaction
individuelle. Toutes les analyses ont été réalisées en présence d’environ 25 copies du témoin interne
d’amplification (IAC).
B.1.2.3.2 Sensibilité de la méthode
[17]
Le niveau de détection LOD de la méthode de PCR était de 10,7 UFC pour 25 g d’aliment. La
limite de détection de la méthode a été évaluée en mesurant quatre matrices alimentaires différentes
(mortadelle, chou, lait pasteurisé et poisson cru) ensemencées avec 5 UFC et 50 UFC dans 25 g, avec
six réplicats pour chaque niveau de contamination. Après 48 h d’enrichissement en PSB, la limite de
détection était respectivement de 5 UFC dans 25 g de mortadelle, de poisson cru et de lait pasteurisé et
de 50 UFC dans 25 g de chou.
B.1.2.3.3 Paramètres de performance: exactitude relative, sensibilité relative, spécificité relative
Exactitude relative AC 89,5 %
Sensibilité relative SE 100 %
Spécificité relative SP 76,7 %
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Les caractéristiques de performance ont été évaluées par comparaison avec la méthode de culture
conformément à l’ISO 10273:2003, Article 5.
NOTE Ces données ont été obtenues à partir de l’analyse d’échantillons artificiellement contaminés.
B.1.2.4 Robustesse
La robustesse de la PCR a été soumise à essai en appliquant les modifications suivantes au déroulement
de la réaction:
— augmentation et diminution des concentrations de l’amorce et de la sonde de ± 20 % en présence de
25 copies du témoin interne d’amplification;
— utilisation de deux formulations différentes des mélanges maîtres de Taq-polymérase provenant de
deux fournisseurs.
Les modifications n’ont pas eu d’incidence sur les performances de la réaction.
B.1.2.5 Instruments
1)
L’évaluation a été réalisée en utilisant les instruments de PCR en temps réel LightCycler® 480 et
ABI 7900HT1).
Les différents instruments de PCR en temps réel n’ont pas eu d’incidence significative sur la performance
de la méthode.
B.1.3 Mode opératoire
B.1.3.1 Principe
Un fragment d’ADN spécifique du locus ail des Yersinia enterocolitica est amplifié et détecté par PCR en
temps réel. Le système de PCR en temps réel est basé sur une sonde d’hydrolyse spécifique marquée à
la carboxyfluorescéine (FAM) en tant que molécule reporter et au dabcyl en tant que molécule quencher
non fluorescente.
B.1.3.2 Réactifs
B.1.3.2.1 Généralités
Pour la qualité des réactifs utilisés, voir l’ISO 22174.
B.1.3.2.2 Réactifs pour la PCR
Voir l’ISO 22119 et l’ISO 20838.
B.1.3.2.3 Oligonucléotides
B.1.3.2.3.1 Oligonucléotides, Y. enterocolitica pathogènes
1) Les instruments de PCR en temps réel Roche LightCycler® 480 et ABI 7900HT sont des exemples de produits
adaptés disponibles sur le marché auprès de Roche Diagnostics et de Life Technologies respectivement. Cette
information est fournie à titre indicatif pour l’utilisateur de la présente Spécification technique et ne constitue en
aucun cas une approbation de ces produits. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est prouvé qu’ils
conduisent à des résultats équivalents.
Tableau B.3 — Séquences des oligonucléotides
Taille du pro-
Amorce et sonde Séquence d’ADN de l’oligonucléotide (5’ – 3’)
duit PCR
ye-ail-F2 5’-GGT TAT GCA CAA AGC CAT GTA AA -3’
93 bp
ye-ail-R2 5’-AAA CGA ACC TAT TAC TCC CCA GTT-3’
a
ye-ail-tmp-sonde 5’-FAM-AAC CTG AAG TAC CGT TAT GAA CTC GAT GA-DB-3’
a
FAM: 6-carboxyfluorescéine, DB: dabcyl.
B.1.3.2.3.2 Oligonucléotides, témoin interne d’amplification, IAC
Tableau B.4 — Séquences des oligonucléotides
Nom Séquence d’ADN de l’oligonucléotide (5’ – 3’) Taille du pro-
duit PCR
pUC 18-F 5’-TGT CGT GCC AGC TGC ATT A-3’
83 bp
pUC 18-R 5’-GAG CGA GGA AGC GGA AGA G-3’
a
Tm-pUC18-sonde 5’-rougeTexas - AAT CGG CCA ACG CGC GG -BHQ2–3’
a
Rouge Texas: sulforhodamine-101-chlorure de sulfuryle, BHQ2: N-Nitrophénylazo-diméthoxy-phénylazo-phényl-N-
diméthoxytrityloxy-éthyl-2-aminoéthyl-1-oxyglycolate (Black-Hole Quencher 2™).
NOTE Il est possible d’utiliser une molécule rapporteur (reporter) et/ou une molécule extincteur
(quencher) équivalente.
B.1.4 Mode opératoire moléculaire
B.1.4.1 Extraction de l’ADN
Transférer 1 ml de chaque fraction aliquote des échantillons susmentionnés dans un tube de réaction
de 1,5 ml et centrifuger pendant 10 min à 13 000 × g. Laver le culot bactérien deux fois dans 1 ml de
NaCl à 0,9 % et enfin remettre en suspension dans 200 µl d’eau de qualité biologie moléculaire. Après
10 min d’incubation à 95 °C, utiliser 2,5 µl pour la PCR en temps réel.
B.1.4.2 Déroulement de la PCR
Le volume de PCR total est de 25 µl par réaction de PCR. Les réactifs sont indiqués dans le Tableau B.5.
Tableau B.5 — Ajout de réactifs
Réactif (conc. mère) Concentration finale Volume par réaction (μl)
a
LightCycler® 480 Probes Master 1 x 12,5
(contenant la Taq ADN polymérase
Fast Start, un tampon de réac-
tion, un mélange dNTP avec dUTP
à la place de dTTP et du MgCl à
6,4 mmol/l)
ye-ail-F2 (10 µmol/l) 300 nmol/l 0,75
ye-ail-R2 (10 µmol/l) 300 nmol/l 0,75
ye-ail-tmp (10 µmol/l) 125 nmol/l 0,312
pUC 18-F (10 µmol/l) 250 nmol/l 0,625
a
Le dispositif Roche LC 480 Probes Master est un exemple de produit adapté disponible sur le marché auprès de Roche
Diagnostics. Cette information est fournie à titre indicatif pour l’utilisateur de la présente Spécification technique et ne
constitue en aucun cas une approbation de ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est prouvé qu’ils
conduisent aux mêmes résultats.
14 © ISO 2015 – Tous droits réservés
Tableau B.5 (suite)
Réactif (conc. mère) Concentration finale Volume par réaction (μl)
pUC 18-R (10 µmol/l) 250 nmol/l 0,625
Tm-pUC18 (10 µmol/l) 100 nmol/l 0,25
IAC plasmide pUC19 ~25 copies (0,1 pg) 1
Échantillon pour essai 2,5
Eau distillée stérile Ajuster le volume à 25 μl 5,687
a
Le dispositif Roche LC 480 Probes Master est un exemple de produit adapté disponible sur le marché auprès de Roche
Diagnostics. Cette information est fournie à titre indicatif pour l’utilisateur de la présente Spécification technique et ne
constitue en aucun cas une approbation de ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est pr
...
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