ISO/TS 18867:2015
(Main)Microbiology of the food chain — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens — Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis
Microbiology of the food chain — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens — Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis
ISO/TS 18867:2015 specifies two horizontal methods for detection of the pathogenic bioserotypes of Y. enterocolitica and one for detection of Y. pseudotuberculosis by using real-time PCR-based methods. The described methods allow for the detection of the two pathogens in enrichments and allow the isolation of colonies. Y. pestis, the causative agent of bubonic and pneumonic plague harbours a variant of the ail gene as well and will be detected by the same primer/probe set as Y. pseudotuberculosis. However, Y. pestis is normally not associated with food. This Technical Specification is applicable to products for human consumption, animal feeding stuffs, and environmental samples.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection de micro-organismes pathogènes dans les aliments — Détection des Yersinia enterocolitica et Yersinia pseudotuberculosis pathogènes
ISO/TS 18867:2015 décrit deux méthodes horizontales pour la détection de biosérotypes pathogènes des Y. enterocolitica ainsi qu'une méthode pour la détection des Y. pseudotuberculosis en faisant appel à des méthodes basées sur la PCR en temps réel. Les méthodes décrites permettent la détection des deux micro-organismes pathogènes par enrichissement et permettent d'isoler des colonies. Y. pestis, l'agent responsable de la peste bubonique et pneumonique héberge aussi un variant du gène ail et sera détecté par le même ensemble d'amorce et de sonde que Y. pseudotuberculosis. Toutefois, Y. pestis n'est normalement pas associé aux aliments. La présente Spécification technique est applicable aux produits destinés à la consommation humaine, aux aliments pour animaux et aux échantillons environnementaux.
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Standards Content (Sample)
TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 18867
First edition
2015-09-15
Microbiology of the food chain —
Polymerase chain reaction (PCR)
for the detection of food-borne
pathogens — Detection of pathogenic
Yersinia enterocolitica and Yersinia
pseudotuberculosis
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Réaction de polymérisation
en chaîne (PCR) pour la détection de micro-organismes pathogènes
dans les aliments — Détection des Yersinia enterocolitica et Yersinia
pseudotuberculosis pathogènes
Reference number
ISO/TS 18867:2015(E)
©
ISO 2015
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ISO/TS 18867:2015(E)
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ISO/TS 18867:2015(E)
Contents Page
Foreword .v
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principles . 1
4.1 General . 1
4.2 Microbial enrichment . 2
4.3 Nucleic acid extraction . 2
4.4 Amplification and detection . 2
4.5 Isolation . 2
5 Reagents . 2
5.1 General . 2
5.2 Culture media . 2
5.2.1 General. 2
5.2.2 Diluent . 2
5.2.3 Enrichment media . 2
5.2.4 Selective solid medium . 4
5.2.5 Potassium hydroxide in saline solution, KOH . 5
5.3 Nucleic acid extraction . 5
5.4 Reagents for PCR . 5
5.5 Primers and probes. 5
6 Apparatus and equipment . 5
6.1 General . 5
6.2 Equipment for sample preparation prior to enrichment . 6
6.3 Equipment for microbial enrichment . . 6
6.4 Equipment for nucleic acid extraction . 6
6.5 Equipment for real-time PCR. 6
7 Sampling . 6
8 Procedure. 6
8.1 Sample preparation prior to enrichment . 6
8.1.1 General. 6
8.1.2 Preparation of the sample . 6
8.2 Microbial enrichment . 7
8.2.1 Pathogenic Y. enterocolitica . 7
8.2.2 Y. pseudotuberculosis . 7
8.2.3 Pathogenic Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis . 7
8.3 Isolation of colonies, optional . 7
8.3.1 Pathogenic Y. enterocolitica . 7
8.3.2 Y. pseudotuberculosis . 7
8.3.3 Process controls . 8
8.4 Nucleic acid extraction . 8
8.5 PCR amplification . 8
8.5.1 General. 8
8.5.2 PCR controls . . 8
8.6 Confirmation of the PCR product . 8
8.6.1 General. 8
8.6.2 Interpretation of the PCR result . 8
9 Test report . 9
Annex A (normative) PCR detection and isolation of pathogenic Y. enterocolitica (see
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ISO/TS 18867:2015(E)
Figure A.1) .10
Annex B (informative) Real-time PCR for detection of Y. enterocolitica .11
Annex C (informative) Detection and isolation of Y. pseudotuberculosis .21
Annex D (informative) Simultaneous detection of pathogenic Y. enterocolitica and
Y. pseudotuberculosis using multiplex real-time PCR .26
Bibliography .29
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ISO/TS 18867:2015(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
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through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
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The committee responsible for this document is the European Committee for Standardization (CEN)
Technical Committee CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in collaboration with Technical
Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the
Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
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ISO/TS 18867:2015(E)
Introduction
Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis are zoonotic bacterial pathogens causing food-
borne infection (yersiniosis) in humans worldwide. The main reservoir for pathogenic Y. enterocolitica
[3]
is domestic pigs and for Y. pseudotuberculosis a wide range of domestic and wild animals such as
[4]
rodents, deer, birds, and various farm animals serve as potential reservoirs. Some of the biotypes of Y.
enterocolitica are associated with human infection. In contrast, all Y. pseudotuberculosis are considered
[9]
potentially pathogenic to humans.
The chromosomally located gene ail (attachment invasion locus) is present in all bio(sero)types of
[8]
Y. enterocolitica associated with disease and a variant of it is also present in Y. pseudotuberculosis.
The ail gene is the target gene used for detection in this Technical Specification, and the developed
[7][8][13][14]
primer/probe sets target different sites of the ail gene for the two pathogens.
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TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 18867:2015(E)
Microbiology of the food chain — Polymerase chain
reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens
— Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica and
Yersinia pseudotuberculosis
1 Scope
This Technical Specification specifies two horizontal methods for detection of the pathogenic
bioserotypes of Y. enterocolitica and one for detection of Y. pseudotuberculosis by using real-time PCR-
based methods. The described methods allow for the detection of the two pathogens in enrichments
and allow the isolation of colonies. Y. pestis, the causative agent of bubonic and pneumonic plague
harbours a variant of the ail gene as well and will be detected by the same primer/probe set as Y.
pseudotuberculosis. However, Y. pestis is normally not associated with food. This Technical Specification
is applicable to products for human consumption, animal feeding stuffs, and environmental samples.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination – Part 1: General rules for the preparation of the
initial suspension and decimal dilutions
ISO 10273, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of
presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica
ISO 20837, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — Requirements for sample preparation for qualitative detection
ISO 20838, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — Requirements for amplification and detection for qualitative methods
ISO 22119, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Real-time polymerase chain reaction (PCR) for
the detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
ISO 22174, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
3 Terms and definitions
For the purpose of this document, the following terms and definitions given in ISO 22174 and
ISO 22119 apply.
4 Principles
4.1 General
The method comprises the following consecutive steps:
a) Microbial enrichment (4.2);
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ISO/TS 18867:2015(E)
b) Nucleic acid extraction (4.3);
c) Amplification and detection (4.4);
d) Isolation (4.5).
4.2 Microbial enrichment
The number of pathogenic Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis bacterial cells is increased by
growth in a non-selective or semi-selective liquid nutrient medium.
4.3 Nucleic acid extraction
Bacteria cells are separated from the nutrient broth, lysed, and the nucleic acid extracted for use in the
PCR reaction.
4.4 Amplification and detection
The extracted nucleic acid is amplified using a probe-based real-time PCR. Detection of the target sequence
is achieved by monitoring a clear increase in the fluorescence signal above the cycle threshold, Ct.
NOTE Probe-based real-time PCR combines amplification, detection, and confirmation of the target DNA.
4.5 Isolation
After a PCR-positive result is obtained, the target organism can be isolated by using culture methods as
described in this Technical Specification.
5 Reagents
5.1 General
For the stages in 4.1 b)-c), molecular grade reagents and consumables suitable for molecular biology
shall be used as given in ISO 20837 and ISO 20838.
Requirements are specified in ISO 20838.
The following media and reagents should be used.
5.2 Culture media
5.2.1 General
See ISO 7218 and ISO 11133 for the preparation, production, and performance testing of culture media.
5.2.2 Diluent
See ISO 6887-1 and the relevant part of ISO 6887 dealing with the product to be examined.
5.2.3 Enrichment media
5.2.3.1 Tryptone-soya broth supplemented with yeast, TSBY
5.2.3.1.1 Composition
Pancreatic digest of casein 17,0 g
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Papaic digest of soyabean meal 3,0 g
Sodium chloride, (NaCl) 5,0 g
Dibasic potassium phosphate, (K HPO ) 2,0 g
2 4
Glucose 2,5 g
Yeast extract 6,0 g
Water 1 000 ml
5.2.3.1.2 Preparation
Dissolve the above ingredients in 1 000 ml distilled water. Adjust the pH, if necessary, so that after
sterilization it is pH 7,3 ± 0,2. Dispense the medium into tubes or flasks of suitable capacity to obtain
portions appropriate for the test samples. Sterilize for 15 min at 121 °C ± 1 °C.
Store the medium in the dark at room temperature and not longer than 4 weeks.
Alternatively, use dehydrated Tryptone soya broth (TSB) 30 g/l supplemented with 0,6 % yeast extract,
pH 7,3 ± 0,2.
[15]
5.2.3.2 Peptone-sorbitol-bile-salt broth, PSB
5.2.3.2.1 Composition
Peptone 5,0 g
Sorbitol 10,0 g
Sodium chloride, (NaCl) 5,0 g
Disodium hydrogen phosphate (Na HPO ) 8,23 g
2 4
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH PO .H O) 1,2 g
2 4 2
Bile salts 1,5 g
Water 1 000 ml
5.2.3.2.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water, if necessary by heating.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization it is pH 7,6 ± 0,2.
Dispense the medium into tubes or flasks of suitable capacity to obtain portions appropriate for the
test samples. Sterilize for 15 min at 121 °C ± 1 °C.
[5]
5.2.3.3 Cold enrichment broth, PMB
5.2.3.3.1 Composition
Disodium hydrogen phosphate (Na HPO ) 7,6 g
2 4
Potassium dihydrogen phosphate (KH PO ) 1,0 g
2 4
Sodium chloride (NaCl) 8,5 g
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ISO/TS 18867:2015(E)
Mannitol 10,0 g
Bile salts N°. 3 1,5 g
Water 1 000 ml
5.2.3.3.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water, if necessary by heating.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization it is pH 7,6 ± 0,2.
Dispense the medium into tubes or flasks of suitable capacity to obtain portions appropriate for the
test samples. Sterilize for 15 min at 121 °C ± 1 °C.
5.2.4 Selective solid medium
[10]
5.2.4.1 Cefsulodin Irgasan Novobiocin agar, CIN
5.2.4.1.1 Basic medium, composition
Enzymatic digest of gelatin 17,0 g
Enzymatic digest of casein and animal tissues 3,0 g
Yeast extract 2,0 g
Mannitol 20,0 g
Sodium pyruvate 2,0 g
Sodium chloride, (NaCl) 1,0 g
Magnesium sulfate, (MgSO .7 H O) 0,01 g
4 2
Sodium desoxycholate 0,5 g
Neutral red 0,03 g
Crystal violet 0,001 g
Agar 12,5 g
Water 1 000 ml
5.2.4.1.2 Preparation
Dissolve the components or dehydrated basic medium in the water by boiling. Adjust the pH, if necessary,
so that after sterilization it is pH 7,4 ± 0,2 at 25 °C. Dispense the medium into flasks of suitable capacity.
Sterilize for 15 min at 121 °C ± 1 °C.
5.2.4.2 Supplements
5.2.4.2.1 Cefsulodin solution (15 mg/ml)
Dissolve 1,5 g Cefsulodin in 100 ml water. Sterilize by filtration.
™
5.2.4.2.2 Irgasan [5-chloro-2-(2,4-dichlorophenoxy)phenol], ethanolic solution (4 mg/ml).
Dissolve Irgasan in ethanol, store the solution at about −20 °C for not more than 4 weeks.
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ISO/TS 18867:2015(E)
5.2.4.2.3 Novobiocin solution (2,5 mg/ml)
Dissolve novobiocin in water. Sterilize by filtration.
5.2.4.3 Composition of the complete medium
Basic medium (5.2.4.1.1) 997 ml
Cefsulodin solution (5.2.4.2.1) 1 ml
Irgasan solution (5.2.4.2.2) 1 ml
Novobiocin solution (5.2.4.2.3) 1 ml
5.2.4.4 Preparation
Add each antibiotic solution aseptically to the basic medium, cooled to about 45 °C, and mix. Pour
approximately 15 ml of the complete medium into sterile petri dishes.
5.2.5 Potassium hydroxide in saline solution, KOH
5.2.5.1 Composition
Potassium hydroxide (KOH) 0,25 g/0,50 g
Saline solution 100 ml
NOTE It is recommended to use freshly prepared 0,5 % KOH for pathogenic Y. enterocolitica and 0,25 % for
Y. pseudotuberculosis.
5.2.5.2 Preparation
Dissolve the potassium hydroxide in the saline solution. Dispense the solution into flasks of a suitable
capacity. Sterilize for 15 min at 121 °C ± 1 °C. Prepare the solution the day before use.
5.3 Nucleic acid extraction
Nucleic acid extraction procedure and reagents appropriate for Gram-negative bacteria shall be used.
NOTE Commercial kits can also be used.
5.4 Reagents for PCR
See ISO 22119 and ISO 20838.
5.5 Primers and probes
The primers and probes for detection of pathogenic Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis are listed
in Annex B and Annex C.
6 Apparatus and equipment
6.1 General
Microbiology equipment (see ISO 7218, ISO 20837, and ISO 22119), in particular, the following
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ISO/TS 18867:2015(E)
6.2 Equipment for sample preparation prior to enrichment
Peristaltic blender and sterile bags with filter.
NOTE Filter of small pore size suitable for PCR is recommended.
6.3 Equipment for microbial enrichment
Incubators, capable of operating at 25 °C ± 1 °C and 30 °C ± 1 °C.
6.4 Equipment for nucleic acid extraction
6.4.1 Micro-centrifuge tubes, with capacities of 1,5 ml and 2,0 ml.
6.4.2 Centrifuge, for reaction tubes with a capacity of 1,5 ml and 2,0 ml and capable of achieving an
acceleration up to approximately 14 000 × g.
6.4.3 Thermoblock, with heating capacity of up to 100 °C.
6.4.4 Graduated pipettes and pipette filter tips, for volumes between 1 µl to 1 000 µl.
6.4.5 Mixer.
6.5 Equipment for real-time PCR
6.5.1 Real-time PCR thermal cycler.
6.5.2 96-well plates and/or 8-well strips.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this Technical Specification. If there is no specific
International Standard dealing with sampling of the product concerned, it is recommended that the
parties concerned come to an agreement on this subject.
8 Procedure
See diagram in Annex A.
8.1 Sample preparation prior to enrichment
8.1.1 General
It is recommended to analyse at least 25 g or 25 ml of sample. However, if sample amount is limited
other sample sizes can be used.
8.1.2 Preparation of the sample
Prepare and homogenize the sample according to ISO 6887-1 and the relevant part of ISO 6887 dealing
with the specific product type intended for analysis (see ISO 6887-1 to ISO 6887-5).
A test portion of the sample is added to the enrichment medium to obtain a ratio of the test portion to
medium of 1/10.
6 © ISO 2015 – All rights reserved
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ISO/TS 18867:2015(E)
8.2 Microbial enrichment
Depending on the target, most suitable enrichment medium should be used.
8.2.1 Pathogenic Y. enterocolitica
PSB enrichment medium should be used prior to detection by PCR.
PSB enrichment is performed at 25 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h.
If isolation of colonies is required, enrichment time should be increased up to 48 h. It is recommended
to refer to ISO 10273.
If thermal lysis is used to extract DNA (method Annex B), prolonged enrichment for 48 h in PSB
may be needed.
8.2.2 Y. pseudotuberculosis
TSBY enrichment medium should be used prior to detection by PCR.
TSBY enrichment is performed at 25 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h.
NOTE The procedure does not allow isolation of the bacterium. Isolation involves re-enrichment of the
sample by selective culture as described in 8.3.2 and C.2.
If there is a limited amount of sample or swab sample that cannot be divided for PCR screening (TSBY)
and isolation of colonies, PMB should be used instead of TSBY, see C.2, 5.2.3.3, and 8.3.2.
8.2.3 Pathogenic Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis
For the simultaneous detection of Y. pseudotuberculosis and pathogenic Y. enterocolitica by PCR, TSBY
medium may be used.
The risk of false-negative results for Y. enterocolitica may increase when TSBY is used.
8.3 Isolation of colonies, optional
8.3.1 Pathogenic Y. enterocolitica
After enrichment for 24 h ± 3 h, transfer 0,5 ml of the PSB enrichment into 4,5 ml 0,5 % potassium
hydroxide solution, KOH (5.2.5) and mix gently for 25 s ± 5 s. Inoculate 1 µl, 10 µl, and 100 µl of the
mixture after streaking on the surface of three CIN-agar plates. Continue incubation of the enrichment
for further 24 h. Incubate CIN agar plates at 30 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h. Plates are examined (preferably
by stereo microscope) and typical colonies with bull’s eye appearance are picked for confirmation.
Second plating on CIN agar is made after 48 h ± 4 h enrichment, performed in the same way as for the
plating after 24 h.
Presumptive pathogenic Y. enterocolitica colonies should be confirmed according to ISO 10273.
NOTE Only for samples with high expected Y. enterocolitica contamination levels, enrichment in PSB can
be used to isolate colonies as described in this Technical Specification. For samples with low suspected Y.
enterocolitica contamination levels, it is recommended to follow ISO 10273 for isolation of colonies.
8.3.2 Y. pseudotuberculosis
Test sample is inoculated (dilution 1/10) into the cold enrichment medium PMB (5.2.3.3), homogenized
and incubated at 4 °C ± 1 °C for 7 days and 14 days. If PCR detection of Y. pseudotuberculosis has to be
performed after enrichment in PMB (see 8.2.2), nucleid acid extraction and further PCR amplification
should be carried out after 72 h ± 8 h of incubation (see 8.4 and 8.5).
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ISO/TS 18867:2015(E)
Transfer 0,5 ml of the incubated enrichment (PMB) into 4,5 ml 0,25 % potassium hydroxide solution,
KOH, (5.2.5) and mix gently for 25 s ± 5 s. Transfer the mixture by using a 10 µl loop onto the surface of
a CIN-agar plate(performed in duplicate). Incubate CIN-agar plates at 30 °C ± 1 °C for a total of 48 h ± 4 h
but examine the plates for typical growth after 24 h. Plates are examined by stereo microscope and
typical colonies are picked for confirmation. Typica
...
SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 18867
Première édition
2015-09-15
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) pour
la détection de micro-organismes
pathogènes dans les aliments —
Détection des Yersinia enterocolitica
et Yersinia pseudotuberculosis
pathogènes
Microbiology of the food chain — Polymerase chain reaction (PCR)
for the detection of food-borne pathogens — Detection of
pathogenic Yersinia enterocolitica and Yersinia
pseudotuberculosis
Numéro de référence
ISO/TS 18867:2015(F)
©
ISO 2015
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ISO/TS 18867:2015(F)
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ISO/TS 18867:2015(F)
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principes . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Enrichissement microbien . 2
4.3 Extraction de l’ADN . 2
4.4 Amplification et détection . 2
4.5 Isolement . 2
5 Réactifs . 2
5.1 Généralités . 2
5.2 Milieux de culture . 2
5.2.1 Généralités . 2
5.2.2 Diluant . 2
5.2.3 Milieux d’enrichissement . 3
5.2.4 Milieux solides sélectifs . 4
5.2.5 Solution d’hydroxyde de potassium en solution saline, KOH . 5
5.3 Extraction de l’ADN . 5
5.4 Réactifs pour la PCR. 5
5.5 Amorces et sondes . 6
6 Appareillage et équipement . 6
6.1 Généralités . 6
6.2 Équipement de préparation des échantillons avant l’enrichissement . 6
6.3 Équipement pour l’enrichissement microbien . 6
6.4 Équipement pour l’extraction de l’ADN . 6
6.5 Équipement pour la PCR en temps réel . 6
7 Échantillonnage . 6
8 Mode opératoire. 6
8.1 Préparation de l’échantillon avant l’enrichissement . 7
8.1.1 Généralités . 7
8.1.2 Préparation de l’échantillon . 7
8.2 Enrichissement microbien . 7
8.2.1 Y. enterocolitica pathogènes . 7
8.2.2 Y. pseudotuberculosis . 7
8.2.3 Y. enterocolitica et Y. pseudotuberculosis pathogènes . 7
8.3 Isolement de colonies, facultatif . 7
8.3.1 Y. enterocolitica pathogènes . 7
8.3.2 Y. pseudotuberculosis . 8
8.3.3 Témoins de processus . 8
8.4 Extraction de l’acide désoxyribonucléique (ADN) . 8
8.5 Amplification PCR. 8
8.5.1 Généralités . 8
8.5.2 Témoins de PCR . 9
8.6 Confirmation du produit PCR . 9
8.6.1 Généralités . 9
8.6.2 Interprétation du résultat de PCR . 9
9 Rapport d’essai . 9
Annexe A (normative) Détection par PCR et isolement des Y. enterocolitica pathogènes
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ISO/TS 18867:2015(F)
(voir la Figure A.1) .10
Annexe B (informative) PCR en temps réel pour la détection des Y. enterocolitica .11
Annexe C (informative) Détection et isolement des Y. pseudotuberculosis .21
Annexe D (informative) Détection simultanée des Y. enterocolitica et des
Y. pseudotuberculosis pathogènes par PCR multiplex en temps réel .26
Bibliographie .29
iv © ISO 2015 – Tous droits réservés
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ISO/TS 18867:2015(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer
un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est le CEN/TC 275, Analyse des produits
alimentaires — Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec
le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à
l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
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ISO/TS 18867:2015(F)
Introduction
Yersinia enterocolitica et Yersinia pseudotuberculosis sont des bactéries pathogènes, agents de zoonoses,
responsables au niveau mondial d’une infection d’origine alimentaire (yersiniose) chez l’homme.
[3]
Les porcs domestiques sont le principal réservoir de Y. enterocolitica pathogènes, tandis que pour
Y. pseudotuberculosis, un large éventail d’animaux domestiques et sauvages tels que les rongeurs, les
[4]
cervidés, les oiseaux et divers animaux de ferme servent de réservoirs potentiels. Certains biotypes
de Y. enterocolitica sont associés à l’infection humaine. Par contre, toutes les Y. pseudotuberculosis sont
[9]
considérées comme potentiellement pathogènes pour l’homme.
Le gène ail (attachment invasion locus) situé sur l’ADN chromosomique est présent dans tous les
bio-(séro) types de Y. enterocolitica associés à la maladie et un de ses variants est également présente
[8]
dans Y. pseudotuberculosis. Le gène ail est le gène cible utilisé pour la détection décrite dans la
présente Spécification technique, et les couples d’amorces et de sondes mis au point ciblent différents
[7][8][13][14]
sites du gène ail pour les deux pathogènes.
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SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 18867:2015(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Réaction
de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection
de micro-organismes pathogènes dans les aliments
— Détection des Yersinia enterocolitica et Yersinia
pseudotuberculosis pathogènes
1 Domaine d’application
La présente Spécification technique décrit deux méthodes horizontales pour la détection de biosérotypes
pathogènes des Y. enterocolitica ainsi qu’une méthode pour la détection des Y. pseudotuberculosis en
faisant appel à des méthodes basées sur la PCR en temps réel. Les méthodes décrites permettent la
détection des deux micro-organismes pathogènes par enrichissement et permettent d’isoler des
colonies. Y. pestis, l’agent responsable de la peste bubonique et pneumonique héberge aussi un variant
du gène ail et sera détecté par le même ensemble d’amorce et de sonde que Y. pseudotuberculosis.
Toutefois, Y. pestis n’est normalement pas associé aux aliments. La présente Spécification technique
est applicable aux produits destinés à la consommation humaine, aux aliments pour animaux et aux
échantillons environnementaux.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables
à l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence (y compris les éventuels
amendements) s’applique.
ISO 6887-1, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de
la suspension mère et des dilutions décimales
ISO 10273, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche de Yersinia enterocolitica
présumées pathogènes
ISO 20837, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection des
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences relatives à la préparation des échantillons
pour la détection qualitative
ISO 20838, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection des
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences relatives à l’amplification et à la détection
pour les méthodes qualitatives
ISO 22119, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en temps réel pour la
détection des micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
ISO 22174, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 22174 et dans
l’ISO 22119 s’appliquent.
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ISO/TS 18867:2015(F)
4 Principes
4.1 Généralités
La méthode comporte plusieurs étapes consécutives:
a) l’enrichissement microbien (4.2);
b) l’extraction de l’ADN (acide désoxyribonucléique) (4.3);
c) l’amplification et la détection (4.4);
d) l’isolement (4.5).
4.2 Enrichissement microbien
Le nombre de cellules bactériennes pathogènes de Y. enterocolitica et de Y. pseudotuberculosis est
augmenté en favorisant leur croissance dans un milieu nutritif liquide non sélectif ou semi-sélectif.
4.3 Extraction de l’ADN
Les cellules bactériennes sont séparées du bouillon nutritif, lysées et l’ADN est extrait pour être utilisé
dans la réaction de PCR.
4.4 Amplification et détection
L’ADN extrait est amplifiée par PCR en temps réel avec sonde. La séquence cible est détectée en
observant une nette augmentation du signal de fluorescence au-dessus du cycle seuil, Ct.
NOTE La PCR en temps réel avec sonde combine l’amplification, la détection et la confirmation de l’ADN cible.
4.5 Isolement
Après obtention d’un résultat positif par PCR, l’organisme cible peut être isolé en utilisant les méthodes
de culture décrites dans la présente Spécification technique.
5 Réactifs
5.1 Généralités
Pour les étapes indiquées en 4.1 b)-c), des réactifs de qualité biologie moléculaire et des consommables
adaptés à la biologie moléculaire doivent être utilisés tel qu’indiqué dans l’ISO 20837 et l’ISO 20838.
Les exigences sont spécifiées dans l’ISO 20838.
Il convient d’utiliser les milieux et réactifs suivants.
5.2 Milieux de culture
5.2.1 Généralités
Voir l’ISO 7218 et l’ISO 11133 pour la préparation, la production et les essais de performance des
milieux de culture.
5.2.2 Diluant
Voir l’ISO 6887-1 et la partie pertinente de l’ISO 6887 traitant du produit à examiner.
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ISO/TS 18867:2015(F)
5.2.3 Milieux d’enrichissement
5.2.3.1 Bouillon de tryptone-soja supplémenté en levure, TSBY
5.2.3.1.1 Composition
Digestion pancréatique de caséine 17,0 g
Digestion papaïnique de farine de soja 3,0 g
Chlorure de sodium, (NaCl) 5,0 g
Phosphate dipotassique, (K HPO ) 2,0 g
2 4
Glucose 2,5 g
Extrait de levure 6,0 g
Eau 1 000 ml
5.2.3.1.2 Préparation
Dissoudre les ingrédients ci-dessus dans 1 000 ml d’eau distillée. Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte
qu’après stérilisation, il soit de 7,3 ± 0,2. Répartir le milieu dans des tubes ou des flacons de capacité
adaptée pour obtenir des volumes appropriés pour les échantillons pour essai. Stériliser pendant
15 min à 121 °C ± 1 °C.
Conserver le milieu dans l’obscurité et à température ambiante pendant une durée maximale de
4 semaines.
En alternative, utiliser un bouillon de tryptone-soja déshydraté (TSB) à 30 g/l supplémenté avec 0,6 %
d’extrait de levure, pH 7,3 ± 0,2.
[15]
5.2.3.2 Bouillon à la peptone, au sorbitol et aux sels biliaires, PSB
5.2.3.2.1 Composition
Peptone 5,0 g
Sorbitol 10,0 g
Chlorure de sodium, (NaCl) 5,0 g
Hydrogénophosphate de sodium (Na HPO ) 8,23 g
2 4
Dihydrogénophosphate de sodium monohydraté (NaH PO .H O) 1,2 g
2 4 2
Sels biliaires 1,5 g
Eau 1 000 ml
5.2.3.2.2 Préparation
Dissoudre, dans de l’eau, les composants ou le milieu complet déshydraté, en chauffant si nécessaire.
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après stérilisation, il soit de 7,6 ± 0,2.
Répartir le milieu dans des tubes ou des flacons de capacité adaptée pour obtenir des volumes
appropriés pour les échantillons pour essai. Stériliser pendant 15 min à 121 °C ± 1 °C.
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ISO/TS 18867:2015(F)
[5]
5.2.3.3 Bouillon d’enrichissement au froid, PMB
5.2.3.3.1 Composition
Hydrogénophosphate de sodium (Na HPO ) 7,6 g
2 4
Dihydrogénophosphate de potassium (KH PO ) 1,0 g
2 4
Chlorure de sodium (NaCl) 8,5 g
Mannitol 10,0 g
Sels biliaires N°. 3 1,5 g
Eau 1 000 ml
5.2.3.3.2 Préparation
Dissoudre, dans de l’eau, les composants ou le milieu complet déshydraté, en chauffant si nécessaire.
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après stérilisation, il soit de 7,6 ± 0,2.
Répartir le milieu dans des tubes ou des flacons de capacité adaptée pour obtenir des volumes
appropriés pour les échantillons pour essai. Stériliser pendant 15 min à 121 °C ± 1 °C.
5.2.4 Milieux solides sélectifs
[10]
5.2.4.1 Gélose à la cefsulodine, à l’Irgasan et à la novobiocine, CIN
5.2.4.1.1 Milieu de base, composition
Digestion enzymatique de gélatine 17,0 g
Digestion enzymatique de caséine et de tissus animaux 3,0 g
Extrait de levure 2,0 g
Mannitol 20,0 g
Pyruvate de sodium 2,0 g
Chlorure de sodium, (NaCl) 1,0 g
Sulfate de magnésium, (MgSO .7 H O) 0,01 g
4 2
Désoxycholate de sodium 0,5 g
Rouge neutre 0,03 g
Violet cristallisé 0,001 g
Gélose 12,5 g
Eau 1 000 ml
5.2.4.1.2 Préparation
Dissoudre dans l’eau les composants ou le milieu de base déshydraté, en portant à ébullition. Ajuster le
pH, si nécessaire, de sorte qu’après stérilisation, il soit de 7,4 ± 0,2 à 25 °C. Répartir le milieu dans des
fioles de capacité appropriée. Stériliser pendant 15 min à 121 °C ± 1 °C.
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ISO/TS 18867:2015(F)
5.2.4.2 Suppléments
5.2.4.2.1 Solution de cefsulodine (15 mg/ml)
Dissoudre 1,5 g de cefsulodine dans 100 ml d’eau. Stériliser par filtration.
™
5.2.4.2.2 Irgasan [5-chloro-2-(2,4-dichlorophénoxy)phénol], solution éthanolique(4 mg/ml).
Dissoudre l’Irgasan dans l’éthanol, conserver la solution à environ −20 °C pendant une durée maximale
de 4 semaines.
5.2.4.2.3 Solution de novobiocine (2,5 mg/ml)
Dissoudre la novobiocine dans l’eau. Stériliser par filtration.
5.2.4.3 Composition du milieu complet
Milieu de base (5.2.4.1.1) 997 ml
Solution de cefsulodine (5.2.4.2.1) 1 ml
Solution d’Irgasan (5.2.4.2.2) 1 ml
Solution de novobiocine (5.2.4.2.3) 1 ml
5.2.4.4 Préparation
Ajouter stérilement chaque solution antibiotique au milieu de base, refroidi à environ 45 °C, puis
mélanger. Couler environ 15 ml de milieu complet dans des boîtes de Petri stériles.
5.2.5 Solution d’hydroxyde de potassium en solution saline, KOH
5.2.5.1 Composition
Hydroxyde de potassium (KOH) 0,25 g/0,50 g
Solution saline 100 ml
NOTE Il est recommandé d’utiliser du KOH à 0,5 % préparé extemporanément pour Y. enterocolitica
pathogènes et à 0,25 % pour Y. pseudotuberculosis.
5.2.5.2 Préparation
Dissoudre l’hydroxyde de potassium dans la solution saline. Répartir la solution dans des fioles de capacité
adéquate. Stériliser pendant 15 min à 121 °C ± 1 °C. Préparer la solution la veille de son utilisation.
5.3 Extraction de l’ADN
Un mode opératoire d’extraction de l’ADN ainsi que des réactifs appropriés pour les bactéries à Gram
négatif doivent être utilisés.
NOTE Il est également possible d’utiliser des kits disponibles dans le commerce.
5.4 Réactifs pour la PCR
Voir l’ISO 22119 et l’ISO 20838.
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ISO/TS 18867:2015(F)
5.5 Amorces et sondes
Les amorces et les sondes pour la détection des Y. enterocolitica et des Y. pseudotuberculosis pathogènes
sont listées dans l’Annexe B et l’Annexe C.
6 Appareillage et équipement
6.1 Généralités
Équipement de microbiologie (voir l’ISO 7218, l’ISO 20837 et l’ISO 22119), en particulier, ce qui suit.
6.2 Équipement de préparation des échantillons avant l’enrichissement
Homogénéisateur péristaltique et sacs stériles avec filtre.
NOTE Il est recommandé d’utiliser un filtre de faible porosité adapté pour la PCR.
6.3 Équipement pour l’enrichissement microbien
Étuves, réglables respectivement à (25 ± 1) °C et à (30 ± 1) °C.
6.4 Équipement pour l’extraction de l’ADN
6.4.1 Micro-tubes à centrifuger, de capacités de 1,5 ml et 2,0 ml.
6.4.2 Centrifugeuse, pour des tubes de réaction d’une capacité de 1,5 ml et 2,0 ml et pouvant atteindre
une accélération jusqu’à environ 14 000 × g.
6.4.3 Bloc chauffant thermostaté, de capacité thermique jusque 100°C.
6.4.4 Pipettes graduées et cônes à filtres pour pipettes, pour des volumes compris entre 1 µl et
1 000 µl.
6.4.5 Agitateur.
6.5 Équipement pour la PCR en temps réel
6.5.1 Thermocycleur de PCR en temps réel.
6.5.2 Plaques de 96 puits et/ou barrettes de 8 puits.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Spécification technique.
S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique traitant de l’échantillonnage du produit concerné, il
est recommandé que les parties concernées se mettent d’accord à ce sujet.
8 Mode opératoire
Voir le diagramme à l’Annexe A.
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ISO/TS 18867:2015(F)
8.1 Préparation de l’échantillon avant l’enrichissement
8.1.1 Généralités
Il est recommandé d’analyser au moins 25 g ou 25 ml d’échantillon. Toutefois, si la quantité d’échantillon
est limitée, il est possible d’utiliser d’autres quantités d’échantillon.
8.1.2 Préparation de l’échantillon
Préparer et homogénéiser l’échantillon conformément à l’ISO 6887-1 et à la partie appropriée de
l’ISO 6887 traitant du type de produit spécifique destiné à être analysé (voir de l’ISO 6887-1 à
l’ISO 6887-5).
Une prise d’essai de l’échantillon est ajoutée au milieu d’enrichissement pour obtenir un rapport prise
d’essai sur milieu de 1/10.
8.2 Enrichissement microbien
En fonction de la cible, il convient d’utiliser le milieu d’enrichissement le plus adapté.
8.2.1 Y. enterocolitica pathogènes
Il convient d’utiliser le milieu d’enrichissement PSB avant la détection par PCR.
L’enrichissement en PSB est réalisé à (25 ± 1) °C pendant (24 ± 3) h.
S’il est nécessaire d’isoler les colonies, il convient d’augmenter le temps d’enrichissement jusqu’à 48 h. Il
est recommandé de se référer à l’ISO 10273.
Si une lyse thermique est employée pour extraire l’ADN (méthode de l’Annexe B), un enrichissement
prolongé pendant 48 h dans le PSB peut être nécessaire.
8.2.2 Y. pseudotuberculosis
Il convient d’utiliser le milieu d’enrichissement TSBY avant la détection par PCR.
L’enrichissement en TSBY est réalisé à (25 ± 1) °C pendant (24 ± 3) h.
NOTE Le mode opératoire ne permet pas d’isoler la bactérie. L’isolement implique d’enrichir à nouveau
l’échantillon par culture sélective, tel que décrit en 8.3.2 et C.2.
Si une quantité limitée d’échantillon ou un écouvillon ne peut pas être divisée pour l’analyse par PCR
(TSBY) et l’isolement de colonies, il convient de remplacer le TSBY par du PMB, voir C.2, 5.2.3.3 et 8.3.2.
8.2.3 Y. enterocolitica et Y. pseudotuberculosis pathogènes
Il est possible d’utiliser le milieu TSBY pour la détection simultanée des Y. pseudotuberculosis et des
Y. enterocolitica pathogènes par PCR.
Le risque de résultats faux négatifs pour Y. enterocolitica peut augmenter lorsque le TSBY est utilisé.
8.3 Isolement de colonies, facultatif
8.3.1 Y. enterocolitica pathogènes
Après l’enrichissement de (24 ± 3) h, transférer 0,5 ml du milieu d’enrichissement PSB dans 4,5 ml de
solution d’hydroxyde de potassium à 0,5 %, KOH (5.2.5) e
...
Questions, Comments and Discussion
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