ISO 11868:1997

Heat-treated milk — Determination of lactulose content — Method using high-performance liquid chromatography

Lait traité thermiquement — Détermination de la teneur en lactulose — Méthode par chromatographie liquide à haute performance

La présente Norme internationale décrit une méthode par chromatographie liquide à haute performance pour la détermination de la teneur en lactulose du lait traité thermiquement (lait écrémé, demi-écrémé ou entier) afin de distinguer le lait stérilisé à ultra haute température (UHT) du lait stérilisé en bouteilles. La méthode décrite a été testée pour des teneurs en lactulose situées dans une plage allant de 200 mg/l à 1 500 mg/l et est applicable à tous les laits traités thermiquement. La méthode décrite dans la présente Norme internationale doit être utilisée en cas de litige.

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 10-Dec-1997
• Withdrawal Date: 10-Dec-1997
• ICS: 67.100.10 - Milk and processed milk products
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Completion Date: 09-Mar-2007

Relations

• Revised: ISO 11868:2007 - Heat-treated milk — Determination of lactulose content — Method using high-performance liquid chromatography
• Effective Date: 15-Apr-2008

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11868
First edition
1997-12-15
Heat-treated milk — Determination of
lactulose content — Method using high-
performance liquid chromatography
Lait traité thermiquement — Détermination de la teneur en lactulose —
Méthode par chromatographie liquide à haute performance
A Reference number
ISO 11868:1997(E)

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ISO 11868:1997(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (ISO member bodies). The work of
preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented
on that committee. International organizations, governmental and non-
governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 11868 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 34, Agricultural food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk
products, in collaboration with the International Dairy Federation (IDF) and
AOAC INTERNATIONAL, and will also be published by these
organizations.
Annexes A to C of this International Standard are for information only.
©  ISO 1997
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
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Printed in Switzerland
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INTERNATIONAL STANDARD  ISO ISO 11868:1997(E)
Heat-treated milk — Determination of lactulose content — Method
using high-performance liquid chromatography
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of the lactulose content of heated milk,
skimmed, partially skimmed or whole milk, by high-performance liquid chromatography in order to distinguish
sterilized milk by Ultra Heat Treatment (UHT) from in-bottle sterilized milk.
The method has been tested over a lactulose content range of 200 mg/l to 1 500 mg/l and is applicable to all heat-
treated milks.
The method described in this International Standard is to be used in cases of dispute.
2 Definition
For the purposes of this International Standard the following definition applies.
2.1
lactulose content of skimmed, partially skimmed or whole milk
mass of substances determined by the procedure specified in this International Standard
NOTE — The lactulose content is expressed as milligrams per litre of sample.
3 Principle
Removal of fat and protein, followed by filtration. Determination of lactulose in the filtrate by high-performance liquid
chromatography (HPLC). Evaluation of the result obtained for the sample by reference to standard samples
consisting of lactulose-free skimmed milk with known amounts of added lactulose.
4 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and double-distilled water or water of
equivalent purity.
4.1 Lactose monohydrate
4.2 Lactulose, at least 99 % pure.
1

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ISO
ISO 11868:1997(E)
4.3 Sample pretreatment solution
Dissolve 91,0 g of zinc acetate dihydrate, Zn(CH COO) �2H O, 54,6 g of phosphotungstic acid tetracosahydrate,
3 2 2
H [P(W O ) ]�24H O, and 58,1 ml of glacial acetic acid in water in a 1 000 ml volumetric flask and dilute to the mark
3 3 10 4 2
with water.
4.4 Eluent
Filter the water, HPLC grade, through a membrane filter with a 0,45 mm pore diameter and, prior to use, boil to
remove dissolved air.
NOTE — To remove dissolved air, other methods giving the same results (e.g. helium sparging) may be used instead of boiling
water. These alternatives are usually more expensive.
4.5 Standard samples
4.5.1 Lactulose standard solution
Weigh, to the nearest 0,1 mg, about 75 mg of lactulose (4.2) in a 100 ml volumetric flask (5.6). Dissolve in water
and make up to 100 ml with water.
4.5.2 Pasteurized skimmed milk, lactulose free, as determined using the method specified below.
Use identical pasteurized skimmed milk samples containing approximately 250 mg, 500 mg, 750 mg and 1 000 mg
of lactulose per litre, obtained by the addition of 5 ml, 10 ml, 15 ml and 20 ml respectively of the lactulose standard
solution (as described in 8.2) to the pasteurized skimmed milk.
5 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
5.1 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,1 mg.
5.2 Glass funnels, of diameter about 7 cm.
5.3 Filters
5.3.1 Filter papers, medium grade, of diameter about 12,5 cm.
5.3.2 Cellulose acetate membranes, with 0,45 mm pore diameter.
5.4 Measuring cylinder, of capacity 25 ml.
5.5 Graduated pipette, of capacity 10 ml, graduated in 0,1 ml.
5.6 One-mark volumetric flasks, of capacity 50 ml, 100 ml and 1 000 ml.
5.7 One-mark pipettes, capable of delivering 5 ml, 10 ml, 15 ml and 20 ml.
5.8 Glass filtration equipment, with 0,45 mm pore diameter filter.
5.9 Glass flasks, of capacity 20 ml, with stopcock.
5.10 Ultrasonic water bath
5.11 Water vacuum pump
2

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5.12 HPLC equipment, as follows:
5.12.1 Magnetic stirrer and heater, for keeping the eluent at a temperature of 90 °C ± 2 C.
5.12.2 Pump, capable of delivering a volume flow rate of between 0,3 ml/min and 0,6 ml/min with a pulsation of
less than 1 % of the pressure drop over the column (1,5 MPa to 4 MPa).
1
5.12.3 HPX-87 P column (Bio-Rad, 30 cm x 0,78 cm), or an equivalent column packed with sulfonic ion
exchanger in the lead form, based on a polystyrene divinylbenzene 8 % crosslinked polymer. The pre-column
1)
consists of the Bio-Rad de-ashing system (a cartridge, 3 cm x 0,46 cm, packed with a cation-exchange resin in the
hydrogen form and a cartridge, 3 cm x 0,46 cm, packed with an anion-exchange resin in the carbonate form) or a
system of equivalent effectiveness.
NOTE — The pre-columns extend both the life and the length of the analytical column, minimizing separation problems and
substantially reducing quantization errors. When the HPLC system begins to lose resolution, replace the spent pre-column
before contamination extends to the main column.
5.12.4 Thermostatic column oven, capable of being maintained at a temperature of 75 °C ± 1 °C.
NOTE — The pre-columns should be placed outside the oven. The inlet tubing to the main column should have a length of 10
cm to 15 cm in the oven to equilibrate the eluent temperature to 75 °C, otherwise peak distortion may occur.
29
5.12.5 Refractive index detector, highly sensitive, with a noise level less than 5 x 10 Refractive Index Units
(RIU), measured in water. The internal thermostat should be set at a temperature above room temperature,
sufficient to obtain a stable baseline. A temperature of 35 °C to 40 °C is advisable in most cases.
NOTE — Highly sensitive monitoring of the refractive index is hampered by baseline drift due to thermal changes. To minimize
the baseline drift, it is advisable to locate the HPLC equipment in a conditioned room to avoid temperature changes.
5.12.6 Integrator, capable of peak height measurements.
The integration control parameters should be carefully chosen (e.g. peak width, slope drift, peak threshold, etc.).
The integrator should be forced to drop a perpendicular between the lactose and the lactulose peaks. (Skimming
leads to inaccuracy due to the presence of varying amounts of glucose in the milk.) The integrator shall be inhibited
against finding the baseline between the lactose and the lactulose peaks, unless the valley reaches the baseline at
all lactulose concentrations.
Many integrators automatically vary peak integration parameters during the run. If possible, this feature should be
disconnected in order to obtain more repeatable results.
6 Sampling
6.1 Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling
method is given in ISO 707 [1].
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
6.2 Store the sample in such a way that deterioration and change in composition are prevented.

1)  The HPX-87P column (Bio-Rad, 30 cm x 0,78 cm) and Bio-Rad de-ashing system are examples of suitable products
available commercially. This information is given for the convenience of users of this International Standard and does not
constitute an endorsement by ISO of these products.
3

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ISO 11868:1997(E)
7 Preparation of test sample
Bring the sample to 25 °C ± 5 °C and mix carefully. If the fat is not evenly dispersed, heat the sample slowly to
40°C, mix gently by inversion only and cool quickly to 20 °C ± 2 °C.
8 Procedure
8.1 Test portion
8.1.1 Pipette 15 ml of the test sample (clause 7) into a 50 ml volumetric flask (5.6). Add 20 ml of water using a
graduated cylinder (5.4) and swirl. Add 5,5 ml of the sample pretreatment solution (4.3) with a graduated pipette
(5.5) and swirl. Dilute to the mark with water and mix.
8.1.2 After leaving to stand for 1 h at 25 °C ± 5 °C, filter (5.3) using a glass funnel (5.2). Discard the first 5 ml of
filtrate. Collect the rest of the filtrate in the glass funnel.
8.2 Preparation of calibration samples
8.2.1 Pipette 1
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 11868
Première édition
1997-12-15
Lait traité thermiquement — Détermination
de la teneur en lactulose — Méthode par
chromatographie liquide à haute
performance
Heat-treated milk — Determination of lactulose content — Method using
high-performance liquid chromatography
A
Numéro de référence
ISO 11868:1997(F)

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ISO 11868:1997(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d'organismes nationaux de normalisation (comités membres de
l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en
ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 11868 a été élaborée par le comité technique
ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et
produits laitiers, en collaboration avec la Fédération internationale de
laiterie (FIL) et l'AOAC INTERNATIONAL, et sera également publiée par
ces organismes.
Les annexes A, B et C de la présente Norme internationale sont données
uniquement à titre d'information.
©  ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord
écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
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Imprimé en Suisse
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NORME INTERNATIONALE  ISO ISO 11868:1997(F)
Lait traité thermiquement — Détermination de la teneur en
lactulose — Méthode par chromatographie liquide à haute
performance
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale décrit une méthode par chromatographie liquide à haute performance pour la
détermination de la teneur en lactulose du lait traité thermiquement (lait écrémé, demi-écrémé ou entier) afin de
distinguer le lait stérilisé à ultra haute température (UHT) du lait stérilisé en bouteilles.
La méthode décrite a été testée pour des teneurs en lactulose situées dans une plage allant de 200 mg/l à
1 500 mg/l et est applicable à tous les laits traités thermiquement.
La méthode décrite dans la présente Norme internationale doit être utilisée en cas de litige.
2 Définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, la définition suivante s'applique.
2.1
teneur en lactulose du lait écrémé, demi-écrémé ou entier
masse des substances déterminées par la méthode décrite dans la présente Norme internationale
NOTE — La teneur en lactulose est exprimée en milligrammes par litre d'échantillon.
3 Principe
Elimination des matières grasses et des protéines suivie d'une filtration. Détermination de la teneur en lactulose
dans le filtrat, par chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Evaluation du résultat obtenu pour
l'échantillon par comparaison avec des échantillons étalons de lait écrémé sans lactulose auxquels ont été ajoutées
des quantités connues de lactulose.
4 Réactifs
Sauf indication différente, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue, et de l'eau bidistillée ou
de l'eau de pureté équivalente.
4.1 Lactose, monohydraté
4.2 Lactulose, ayant une pureté minimale de 99 %.
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ISO 11868:1997(F) ISO
4.3 Solution de prétraitement de l'échantillon
Dissoudre dans de l'eau 91,0 g d'acétate de zinc dihydraté, Zn(CH COO) ,2H O, 54,6 g d'acide phosphotungstique
3 2 2
hydraté, H [P(W O ) ],24H O, et 58,1 ml d'acide acétique cristallisable, dans une fiole jaugée de 1 000 ml et
3 3 10 4 2
compléter au trait repère avec de l'eau.
4.4 Eluant
Filtrer l'eau, de qualité CLHP, à travers un filtre sur membrane d'un diamètre de pore de 0,45 μm, et avant l'emploi,
la porter à ébullition pour éliminer l'air dissous.
NOTE — Au lieu de porter l'eau à ébullition, il est possible d'utiliser d'autres méthodes d'élimination de l'air dissous qui
conduisent au même résultat (par exemple, barbotage à l'hélium). Cependant, la plupart de ces variantes sont plus onéreuses.
4.5 Echantillons étalons
4.5.1 Solution étalon de lactulose
Peser, à 0,1 mg près, environ 75 mg de lactulose (4.2) dans une fiole jaugée de 100 ml (5.6). Dissoudre dans de
l'eau et compléter à 100 ml avec de l'eau.
4.5.2 Lait écrémé pasteurisé, sans lactulose, reconnu comme tel en utilisant la méthode décrite ci-dessous.
Utiliser des échantillons identiques de lait écrémé pasteurisé contenant environ 250 mg, 500 mg, 750 g et 1 000 mg
de lactulose par litre obtenus en leur ajoutant, respectivement, 5 ml, 10 ml, 15 ml et 20 ml de solution étalon de
lactulose (comme décrit en 8.2).
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
5.1 Balance analytique, précise à 0,1 mg près.
5.2 Entonnoirs en verre, d'environ 7 cm de diamètre.
5.3 Filtres
5.3.1 Papiers filtres, à filtration moyenne, d'environ 12,5 cm de diamètre.
5.3.2 Membranes en acétate de cellulose, d'un diamètre de pore de 0,45 μm.
5.4 Eprouvette graduée, de 25 ml de capacité.
5.5 Pipette graduée, de 10 ml de capacité, avec graduations de 0,1 ml.
5.6 Fioles jaugées, de 50 ml, 100 ml et 1 000 ml de capacité.
5.7 Pipettes à un trait, de 5 ml, 10 ml, 15 ml et 20 ml de capacité.
5.8 Appareil de filtration en verre, avec filtre d'un diamètre de pore de 0,45 μm.
5.9 Flacons en verre, de 20 ml de capacité, munis d'un robinet d'arrêt.
5.10 Bain d'eau à ultrasons.
5.11 Pompe à vide hydraulique.
5.12 , comme suit.
Matériel de CLHP
2

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ISO ISO 11868:1997(F)
5.12.1 Agitateur magnétique et réchauffeur, pour conserver l'éluant à la température de 90 °C ± 2 °C.
5.12.2 Pompe, capable de délivrer un débit de 0,3 ml/min à 0,6 ml/min avec une pulsation inférieure à 1 % de la
perte de charge sur la colonne (1,5 MPa à 4 MPa).
1)
5.12.3 Colonne HPX-87 P (Bio-Rad, 30 cm x 0,78 cm) ou colonne équivalente garnie d'un échangeur d'ions
sulfoniques sous forme plomb, greffée sur un polymère réticulé à 8 % de divinylbenzène de polystyrène. La
1)
précolonne est constituée du système de déminéralisation Bio-Rad (cartouche de 3 cm x 0,46 cm, garnie d'une
résine échangeuse de cations sous forme hydrogène et cartouche de 3 cm x 0,46 cm, garnie d'une résine
échangeuse d'anions sous forme carbonate) ou système offrant une efficacité similaire.
NOTE — Les précolonnes augmentent à la fois la durée de vie et la longueur de la colonne analytique, en diminuant les
problèmes de séparation et en réduisant de manière importante les erreurs de dosage quantitatif. Quand le système CLHP
commence à perdre de sa résolution, remplacer la précolonne usagée avant qu'elle ne contamine la colonne principale.
5.12.4 Four thermostatique de la colonne, pouvant être réglée à 75 °C ± 1 °C.
NOTE — Il convient de placer les précolonnes à l'extérieur du four. Il convient que le tube d'entrée de la colonne principale
entre sur une longueur de 10 cm à 15 cm dans le four pour équilibrer la température de l'éluant à 75 °C, sinon, il pourrait y
avoir risque de distorsion des pics.
-
9
5.12.5 Détecteur d'indice de réfraction, très sensible, avec un bruit de fond inférieur à 5 x 10 RIU, mesuré
dans l'eau. La température interne du thermostat doit être réglée à une température supérieure à la température
ambiante et être suffisante pour obtenir une ligne de base stable. On recommande dans la plupart des cas une
température de 35 °C à 40 °C.
NOTE — Une dérive de la ligne de base due à des changements de température entravant la mesure à haute sensibilité de
l'indice de réfraction, il convient de maintenir une température constante en plaçant le matériel CLHP dans une pièce
climatisée.
5.12.6 Intégrateur, capable de mesurer la hauteur des pics.
Les paramètres de contrôle doivent être choisis soigneusement (par exemple la largeur de pic, la dérive de la ligne
de base, le seuil de détection, etc.). L'intégrateur devrait être amené à tracer une perpendiculaire entre les pics du
lactose et du lactulose. (La logique d'intégration tangentielle entraîne des inexactitudes en raison de la présence de
quantités variables de glucose dans le lait). Il ne faut pas que l'intégrateur détecte une ligne de base entre les pics
du lactose et du lactulose, sauf si la vallée atteint la ligne de base pour toutes les concentrations de lactulose.
De nombreux intégrateurs font varier automatiquement les paramètres d'intégration des pics pendant l'analyse. Il
faut, si possible, déconnecter cette fonction afin d'obtenir des résultats plus répétables.
6 Échantillonnage
6.1 L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
méthode d'échantillonnage recommandée est donnée dans l'ISO 707 [1].
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifé lors du
transport et de l'entreprosage.
6.2 Conserver l'échantillon dans des conditions empêchant toute détérioration ou toute modification de la
composition.

1)
La colonne HPX-87P (Bio-Rad, 30 cm x 0,78 cm) et le système de déminéralisation Bio-Rad sont des exemples
convenables disponibles sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente
Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi
désigné.
3

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ISO 11868:1997(F) ISO
7 Préparation de l'échantillon pour essai
Porter l'échantillon à 25 °C ± 5 °C et mélanger soigneusement. Si la matière grasse n'est pas dispersée de façon
homogène, chauffer lentement l'échantillon à 40 °C, mélanger doucement par retournements répétés et modérés
puis refroidir rapidement à 20 °C ± 2 °C.
8 Mode opératoire
8.1 Prise d'essai
Prélever à la pipette, 15 ml de l'échantillon pour essai (article 7) dans une fiole jaugée de 50 ml (5.6).
8.1.1
Ajouter 20 ml d'eau à l'aide d'une éprouvette graduée (5.4) et agiter. Pipetter 5,5 ml de solution pour le
prétraitement de l'échantillon (4.3) avec une pipette graduée (5.5) et remuer. Compléter au trait repère avec de
l'eau e
...