ISO/TS 21872-2:2007
(Main)Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. — Part 2: Detection of species other than Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. — Part 2: Detection of species other than Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae
ISO/TS 21872-2:2007 specifies a horizontal method for detection of the enteropathogenic Vibrio species, causing illness in or via the intestinal tract, other than Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae. The species detectable by the methods specified include Vibrio fluvialis, Vibrio mimicus and Vibrio vulnificus. It is not suitable for the isolation of Vibrio hollisae. Strains of V. parahaemolyticus and V. cholerae may also be detected during the application of this method. ISO/TS 21872-2:2007 is applicable to products intended for human consumption and the feeding of animals, and environmental samples in the area of food production and food handling. This method is not appropriate for the detection of Vibrio metschnikovii as this is oxidase negative.
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche des Vibrio spp. potentiellement entéropathogènes — Partie 2: Recherche des espèces autres que Vibrio parahaemolyticus et Vibrio cholerae
L'ISO/TS 21872-2:2007 décrit une méthode horizontale de recherche d'espèces entéropathogènes de Vibrio provoquant des maladies dans ou via le tractus intestinal et autres que Vibrio parahaemolyticus et Vibrio cholerae. Les espèces détectées par les méthodes spécifiées incluent Vibrio fluvialis, Vibrio mimicus et Vibrio vulnificus. Elle ne convient pas pour l'isolement du Vibrio hollisae. Les souches de V. parahaemolyticus et de V. cholerae peuvent être aussi recherchées au cours de l'application de cette méthode. L'ISO/TS 21872-2:2007 est applicable aux produits destinés à la consommation humaine et à l'alimentation animale, et aux échantillons d'environnement prélevés dans la zone de production et de traitement des produits alimentaires. Cette méthode n'est pas appropriée pour la recherche de Vibrio metschnikovii, qui est oxydase négative.
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TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 21872-2
First edition
2007-04-15
Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Horizontal method for the
detection of potentially enteropathogenic
Vibrio spp. —
Part 2:
Detection of species other than Vibrio
parahaemolyticus and Vibrio cholerae
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche
des Vibrio spp. potentiellement entéropathogènes —
Partie 2: Recherche des espèces autres que Vibrio parahaemolyticus et
Vibrio cholerae
Reference number
ISO/TS 21872-2:2007(E)
©
ISO 2007
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ISO/TS 21872-2:2007(E)
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ISO/TS 21872-2:2007(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Terms and definitions .2
4 Principle.2
4.1 General.2
4.2 First enrichment in a liquid selective medium.2
4.3 Second enrichment in a liquid selective medium .2
4.4 Isolation and identification .2
4.5 Confirmation.3
5 Culture media, reagents.3
5.1 Enrichment medium: Alkaline saline peptone water (ASPW) .3
5.2 Solid selective isolation media.3
5.3 Saline nutrient agar (SNA) .3
5.4 Reagent for detection of oxidase.3
5.5 Saline triple sugar iron (TSI) agar .3
5.6 Saline medium for detection of ornithine decarboxylase (ODC) .3
5.7 Saline medium for detection of lysine decarboxylase (LDC).3
5.8 Saline medium for detection of arginine dihydrolase (ADH) .4
5.9 Reagent for detection of β-galactosidase .4
5.10 Saline medium for detection of indole.4
5.11 Saline peptone waters.4
5.12 Sodium chloride solution.4
6 Apparatus and glassware .4
7 Sampling.4
8 Preparation of test sample.4
9 Procedure (see Annex A) .5
9.1 Test portion and initial suspension .5
9.2 First selective enrichment .5
9.3 Second selective enrichment .5
9.4 Isolation and identification .5
9.5 Confirmation.6
10 Expression of results .10
11 Test report .10
Annex A (normative) Diagram of procedure.11
Annex B (normative) Composition and preparation of the culture media and reagents.12
Bibliography .24
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ISO/TS 21872-2:2007(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a
technical committee may decide to publish other types of normative document:
— an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) represents an agreement between technical experts in
an ISO working group and is accepted for publication if it is approved by more than 50 % of the members
of the parent committee casting a vote;
— an ISO Technical Specification (ISO/TS) represents an agreement between the members of a technical
committee and is accepted for publication if it is approved by 2/3 of the members of the committee casting
a vote.
An ISO/PAS or ISO/TS is reviewed after three years in order to decide whether it will be confirmed for a
further three years, revised to become an International Standard, or withdrawn. If the ISO/PAS or ISO/TS is
confirmed, it is reviewed again after a further three years, at which time it must either be transformed into an
International Standard or be withdrawn.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 21872-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology.
ISO/TS 21872 consists of the following parts, under the general title Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp.:
⎯ Part 1: Detection of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae
⎯ Part 2: Detection of species other than Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae
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ISO/TS 21872-2:2007(E)
Introduction
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not be appropriate in every
detail for certain products. In this case, different methods, which are specific to these products may be used if
absolutely necessary for justified technical reasons. Nevertheless, every attempt will be made to apply this
horizontal method as far as possible.
When this Technical Specification is next reviewed, account will be taken of all information then available
regarding the extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from
this method in the case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate, and for certain groups of products International
Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this horizontal method. It is
hoped that when such standards are reviewed they will be changed to comply with this Technical Specification
so that eventually the only remaining departures from this horizontal method will be those necessary for
well-established technical reasons.
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TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 21872-2:2007(E)
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal
method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio
spp. —
Part 2:
Detection of species other than Vibrio parahaemolyticus and
Vibrio cholerae
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests for
detection of Vibrio spp., and the particularly toxigenic Vibrio cholerae, be conducted only in
laboratories equipped for this purpose and under the supervision of an experienced microbiologist,
and that great care be exercised in the disposal of contaminated material.
1 Scope
This part of ISO/TS 21872 specifies a horizontal method for detection of the enteropathogenic Vibrio species,
causing illness in or via the intestinal tract, other than Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae. The
1)
species detectable by the methods specified include Vibrio fluvialis, Vibrio mimicus and Vibrio vulnificus . It
is not suitable for the isolation of Vibrio hollisae. Strains of V. parahaemolyticus and V. cholerae may also be
detected during the application of this method.
This part of ISO/TS 21872 is applicable to
⎯ products intended for human consumption and the feeding of animals, and
⎯ environmental samples in the area of food production and food handling.
This method is not appropriate for the detection of Vibrio metschnikovii as this is oxidase negative.
NOTE 1 Vibrio metschnikovii has been occasionally isolated from human faecal samples and can be a cause of
diarrhoeal diseases.
NOTE 2 The identification of Vibrio species other than V. parahaemolyticus and V. cholerae is difficult, and needs
further development. The biochemical tests given in this part of ISO/TS 21872 enable only a presumptive confirmation of
these species.
NOTE 3 Reasons for not applying this method are discussed in the Introduction.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
1) See 9.4.4.
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ISO/TS 21872-2:2007(E)
ISO 6887 (all parts), Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial
suspension and decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 8261, Milk and milk products — General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions
and decimal dilutions for microbiological examination
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
potentially enteropathogenic Vibrio
microorganisms which form typical colonies on solid selective media and which possess the described
biochemical characteristics when the test is performed in accordance with this part of ISO/TS 21872
3.2
detection of potentially enteropathogenic Vibrio
determination of the presence or absence of presumptive, enteropathogenic Vibrio, in a specified quantity of
product, when the test is performed in accordance with this part of ISO/TS 21872
4 Principle
4.1 General
The detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. requires four successive phases (see also Annex A).
NOTE Vibrio can, indeed, be present in small numbers and are often accompanied by a much larger number of other
microorganisms belonging to the Vibrionaceae family or to other families. Consequently, two successive selective
enrichments are necessary.
4.2 First enrichment in a liquid selective medium
The enrichment medium (alkaline saline peptone water, ASPW) (5.1) is inoculated with the test portion at
ambient temperature. It is incubated at 37 °C for 6 h ± 1 h.
In the case of large quantities, the ASPW should be warmed to 37 °C before inoculation with the test portion.
4.3 Second enrichment in a liquid selective medium
The enrichment medium (ASPW) is then inoculated with the culture obtained in 4.2.
It is incubated at 37 °C for 18 h ± 1 h.
4.4 Isolation and identification
The following two solid selective media are inoculated with the cultures obtained in 4.2 and in 4.3:
⎯ thiosulfate citrate bile and sucrose agar (TCBS);
⎯ another appropriate solid selective medium (left to the choice of the laboratory) such as colistin polymixin
β-cellobiose agar (CPC), sodium dodecyl sulfate polymixin B sucrose agar (SDS) or modified colistin
polymixin cellobiose agar (mCPC) media.
The two isolation media are incubated at 37 °C, then examined after 24 h ± 3 h.
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ISO/TS 21872-2:2007(E)
4.5 Confirmation
The characteristic colonies of enteropathogenic Vibrio spp. isolated in 4.4 are subcultured, then confirmed by
means of appropriate biochemical tests.
5 Culture media, reagents
For general laboratory practice, see ISO 7218.
NOTE On account of the large number of culture media and reagents, for clarity of the text, their composition and
preparation are given in Annex B.
5.1 Enrichment medium: Alkaline saline peptone water (ASPW)
See B.1.
5.2 Solid selective isolation media
5.2.1 First medium: Thiosulfate, citrate, bile and sucrose (TCBS) agar
See B.2.
5.2.2 Second medium
Choose between:
a) sodium dodecyl sulfate polymixin sucrose agar (SDS), see B.3.
b) cellobiose polymixin colistin agar (CPC), see B.4;
c) modified cellobiose polymixin colistin agar (mCPC), see B.5.
5.3 Saline nutrient agar (SNA)
See B.6.
5.4 Reagent for detection of oxidase
See B.7.
5.5 Saline triple sugar iron (TSI) agar
See B.8.
5.6 Saline medium for detection of ornithine decarboxylase (ODC)
See B.9.
5.7 Saline medium for detection of lysine decarboxylase (LDC)
See B.10.
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ISO/TS 21872-2:2007(E)
5.8 Saline medium for detection of arginine dihydrolase (ADH)
See B.11.
5.9 Reagent for detection of β-galactosidase
See B.12.
5.10 Saline medium for detection of indole
See B.13.
5.11 Saline peptone waters
See B.14.
5.12 Sodium chloride solution
See B.15.
6 Apparatus and glassware
NOTE Disposable equipment is acceptable in the same way as reusable glassware, if the specifications are similar.
Usual microbiology laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
6.1 Incubator, adjustable to 37 °C ± 1 °C.
6.2 Incubator or water bath, adjustable to 41,5 °C ± 1 °C.
6.3 Water bath, adjustable from 44 °C to 47 °C.
6.4 Water bath, adjustable to 37 °C ± 1 °C.
It is recommended to use water baths (6.2, 6.3 and 6.4) containing an antibacterial agent.
7 Sampling
A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this part of ISO/TS 21872. See the International Standard
specific to the relevant product. If a specific International Standard does not exist, it is recommended that the
relevant parties reach agreement on this subject.
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with the relevant part of ISO 6887, and/or ISO 8261, and an
International Standard concerning the product to be examined. If a specific International Standard does not
exist, it is recommended that the relevant parties reach agreement on this subject.
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ISO/TS 21872-2:2007(E)
9 Procedure (see Annex A)
9.1 Test portion and initial suspension
For the preparation of the initial suspension, use the first enrichment medium (ASPW) specified in 5.1.
Take a test portion (x g or x ml), according to the sensitivity required, and homogenize it in 9x ml (or 9x g) of
enrichment medium.
In the case of large quantities, the ASPW should be warmed to 37 °C before inoculation with the test portion.
If the dilution and the incubation cannot be carried out the same day, store the initial suspension until the next
day at a temperature of 5 °C ± 3 °C.
In order to reduce the amount of examination work, where more than one 25 g test portion stemming from the
same batch of food is to be examined, and where proof is available indicating that a mixture (gathering
together the test portions) does not modify the results concerning this product in particular, the test portions
may be mixed.
EXAMPLE If 10 test portions of 25 g are to be examined, it is possible to combine these 10 units in order to obtain a
composite sample of 250 g and to add 2,25 l of enrichment medium.
Cell counts of potentially enteropathogenic Vibrio spp. decline significantly on storage at refrigeration
temperatures. Storage of samples and, to a lesser extent, of suspensions at such temperatures should be
avoided where possible and should otherwise be kept to a minimum.
9.2 First selective enrichment
Incubate the initial suspension (9.1) at 37 °C for 6 h ± 1 h.
Care should be taken to apply the whole method to products with a high salt content, as the final salt
concentration in the medium might alter the characteristics (see ISO 6887-4).
9.3 Second selective enrichment
9.3.1 Transfer 1 ml of the culture obtained in 9.2 taken from the surface into a tube containing 10 ml of
ASPW (5.1).
9.3.2 Incubate the ASPW at 37 °C for 18 h ± 1 h.
9.4 Isolation and identification
9.4.1 From the culture obtained in the ASPW (9.2 and 9.3.2), inoculate with a sampling loop the surface of
a TCBS agar plate (5.2.1), so as to permit the development of well-isolated colonies.
Proceed likewise with the chosen second selective isolation medium (5.2.2) using a new sampling loop.
9.4.2 Invert the agar plates (9.4.1) and place them in an incubator (6.1) set at 37 °C.
9.4.3 After 24 h ± 3 h of incubation, examine the dishes (9.4.1 and 9.4.2) for the presence of typical
colonies of Vibrio spp. Mark their positions on the bottom of the dish.
There are two typical morphologies for colonies of Vibrio spp. on TCBS agar (5.2.1) as follows:
⎯ typical colonies of V. mimicus and V. vulnificus are smooth, green (sucrose negative) and 2 mm to 3 mm
in diameter;
⎯ typical colonies of V. fluvialis are smooth, yellow (sucrose positive) and 2 mm to 3 mm in diameter.
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ISO/TS 21872-2:2007(E)
NOTE V. parahaemolyticus and V. cholerae, covered by ISO/TS 21872-1, form green and yellow colonies
respectively on TCBS.
There are two typical morphologies for colonies of Vibrio spp. on SDS medium [5.2.2 a)]:
⎯ typical colonies of V. mimicus and V. vulnificus are purple and 2 mm or greater in diameter with an
opaque halo;
⎯ typical colonies of V. cholerae O1 are yellow, 2 mm or greater in diameter, with an opaque halo;
V. cholerae non-O1 strains may or may not produce a halo.
Other Vibrio spp. will either not grow on SDS agar or will produce colonies without a halo.
There are two typical morphologies for colonies of Vibrio spp. on CPC and mCPC [5.2.2 b) and c)]:
⎯ typical colonies of V. vulnificus are yellow, 2 mm or greater in diameter, and surrounded by a yellow zone;
⎯ typical colonies of V. cholerae are purple, 2 mm or greater in diameter, and surrounded by a blue zone.
Some strains of other Vibrio spp. can grow on CPC or mCPC agars, producing colonies similar to those
described above.
9.4.4 To recover V. vulnificus, attention shall be paid to the performance of CPC or mCPC media.
9.5 Confirmation
9.5.1 General
Current commercially available biochemical identification kits may be used to identify Vibrio to a species level,
provided they are inoculated with a suspension of the bacteria to be identified in a sufficiently saline medium
or dilution fluid, and provided the database or identification table for the product has been based on reactions
obtained using similar media to those described in this part of ISO/TS 21872. These kits shall be used in
accordance with the manufacturer's instructions.
NOTE Recognition of colonies of Vibrio is largely a question of experience and their appearance can sometimes vary
not only from one species to another, but also from one batch of culture medium to another.
9.5.2 Selection of colonies for confirmation and preparation of pure cultures
For confirmation, subculture from each selective medium (see 9.4), at least five colonies considered to be
typical or similar to each of the potentially pathogenic Vibrio spp. sought. If there are less than five colonies of
the target type on a plate, subculture all of these colonies.
NOTE Foods, especially seafoods, can contain large numbers of bacteria, including non-pathogenic Vibrio spp.
which may grow through the selective culture process. The subculture of small numbers of colonies may result in
potentially pathogenic species being missed.
Inoculate the selected colonies onto the surface of plates of saline nutrient agar or inclined saline nutrient agar
(5.3), to obtain isolated colonies. Incubate the inoculated plates (9.4.2) at 37 °C for 24 h ± 3 h.
Use pure cultures for biochemical confirmations.
9.5.3 Tests for presumptive identification
9.5.3.1 Oxidase test
Using a sampling loop, platinum iridium straight wire or a glass rod, take a portion of the pure culture from the
saline nutrient agar (9.5.2) and streak onto the filter paper moistened with oxidase reagent (5.4), or use a
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ISO/TS 21872-2:2007(E)
commercially available test following the manufacturer's instructions. Neither a nickel-chromium sampling loop
nor a metallic wire shall be used. The test is positive if the colour turns to mauve, violet or deep purple within
10 s.
9.5.3.2 Microscopic examination
For each pure culture obtained in 9.4.2, test according to a) and b) as follows.
a) Prepare a film for Gram staining (see ISO 7218). After staining, examine the morphology and the Gram
reaction using a microscope and record the results.
b) Inoculate a tube of alkaline saline peptone water (ASPW) (5.1). Incubate at 37 °C for 1 h to 6 h. Deposit a
drop of the culture onto a clean slide, cover with a coverslip and examine for motility under the
microscope. Note the cultures showing a positive result for motility.
9.5.3.3 Selection of cultures for biochemical tests
Retain, for biochemical confirmation, the oxidase-positive and Gram-negative colonies which give a positive
result in the motility test.
9.5.4 Biochemical confirmation
9.5.4.1 General
Using an inoculation loop, inoculate the media indicated in 9.5.4.2 to 9.5.4.8 with each of the cultures obtained
from the colonies retained in 9.5.3.3.
9.5.4.2 Test with saline TSI agar (5.5)
Inoculate the agar slope by stabbing to the bottom of the agar butt and streaking longitudinally along the
slope. Incubate at 37 °C for 24 h ± 3 h.
Interpret the reactions as follows.
a) Agar medium butt
⎯ yellow: glucose positive (fermentation of the glucose);
⎯ red or unchanged: glucose negative (no fermentation of the glucose);
⎯ black: formation of hydrogen sulfide;
⎯ bubbles or cracks: formation of gas from the glucose.
b) Agar medium slant
⎯ yellow: lactose and/or sucrose positive (utilization of lactose and/or sucrose);
⎯ red or unchanged: lactose and sucrose negative (no utilization of lactose or sucrose).
Typical reactions of V. vulnificus and V. fluvialis correspond to an acid slant (yellow) and an acid butt (yellow),
without formation of gas or hydrogen sulfide.
Typical reactions of V. mimicus correspond to an alkaline slant (red) (occasionally acid: yellow) and an acid
butt (yellow) without formation of gas or hydrogen sulfide.
© ISO 2007 – All rights reserved 7
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ISO/TS 21872-2:2007(E)
9.5.4.3 Detection of ornithine decarboxylase
Inoculate the liquid saline medium (5.6) just below the surface. Add about 1 ml of sterile mineral oil to the top
of the medium. Incubate at 37 °C for 24 h ± 3 h.
Turbidity and a violet colour after incubation indicate a positive reaction (bacterial growth and decarboxylation
of the ornithine). A yellow colour indicates a negative reaction.
9.5.4.4 Detection of L-lysine decarboxylase
Inoculate the liquid saline medium (5.7) just below the surface. Add about 1 ml of sterile mineral oil to the top
of the medium. Incubate at 37 °C for 24 h ± 3 h.
Turbidity and a violet colour after incubation indicate a positive reaction (bacterial growth and decarboxylation
of the lysine). A yellow colour indicates a negative reaction.
9.5.4.5 Detection of arginine dihydroxylase
Inoculate the liquid saline medium (5.8) just below the surface. Add about 1 ml of sterile mineral oil to the top
of the medium. Incubate at 37 °C for 24 h ± 3 h.
Turbidity and a violet colour after incubation indicate a positive reaction (bacterial growth and dihydrolation of
arginine). A yellow colour indicates a negative reaction.
9.5.4.6 Detection of β-galactosidase
Inoculate the suspect colony into a tube containing 0,25 ml of the saline solution (5.12). Add 1 drop of toluene
and shake the tube.
Place the tube in the water bath (6.4) set at 37 °C and leave it to stand for approximately 5 min.
Add 0,25 ml of the reagent for the detection of β-galactosidase(5.9) and mix. Replace the tube in the water
bath set at 37 °C, leave it to stand for 24 h ± 3 h, examining it from time to time.
A yellow colour indicates a positive reaction (presence of β-galactosidase). The reac
...
SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 21872-2
Première édition
2007-04-15
Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour la recherche des Vibrio
spp. potentiellement entéropathogènes —
Partie 2:
Recherche des espèces autres que Vibrio
parahaemolyticus et Vibrio cholerae
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for
the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. —
Part 2: Detection of species other than Vibrio parahaemolyticus and
Vibrio cholerae
Numéro de référence
ISO/TS 21872-2:2007(F)
©
ISO 2007
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ISO/TS 21872-2:2007(F)
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ISO/TS 21872-2:2007(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 2
4 Principe. 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Premier enrichissement en milieu sélectif liquide . 2
4.3 Second enrichissement en milieu sélectif liquide. 2
4.4 Isolement et identification . 2
4.5 Confirmation. 3
5 Milieux de culture, réactifs. 3
5.1 Milieu d’enrichissement: eau peptonée alcaline salée (EPAS). 3
5.2 Milieux d’isolement sélectifs solides. 3
5.3 Gélose nutritive salée (GNS) . 3
5.4 Réactif pour la recherche de l’oxydase. 3
5.5 Gélose salée au citrate de fer et aux trois sucres (TSI). 3
5.6 Milieu salé pour la recherche de l’ornithine décarboxylase (ODC) . 3
5.7 Milieu salé pour la recherche de la lysine décarboxylase (LDC). 4
5.8 Milieu salé pour la recherche de l’arginine dihydrolase (ADH) . 4
5.9 Réactif pour la recherche de la β-galactosidase . 4
5.10 Milieu salé pour la recherche de l’indole. 4
5.11 Eaux peptonées salées . 4
5.12 Solution de chlorure de sodium. 4
6 Appareillage et verrerie. 4
7 Échantillonnage . 4
8 Préparation de l'échantillon pour essai. 5
9 Mode opératoire (Voir Annexe A) . 5
9.1 Prise d'essai et suspension mère . 5
9.2 Premier enrichissement sélectif. 5
9.3 Second enrichissement sélectif . 5
9.4 Isolement et identification . 5
9.5 Confirmation. 6
10 Expression des résultats . 10
11 Rapport d'essai . 10
Annexe A (normative) Schéma du mode opératoire . 11
Annexe B (normative) Composition et préparation des milieux de culture et des réactifs . 12
Bibliographie . 24
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
Dans d'autres circonstances, en particulier lorsqu'il existe une demande urgente du marché, un comité
technique peut décider de publier d'autres types de documents normatifs:
⎯ une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts dans
un groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 % des
membres votants du comité dont relève le groupe de travail;
⎯ une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d'un comité technique
et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.
Une ISO/PAS ou ISO/TS fait l'objet d'un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour trois
nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu'une ISO/PAS ou
ISO/TS a été confirmée, elle fait l'objet d'un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa
transformation en Norme internationale, soit de son annulation.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO/TS 21872-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie.
L'ISO/TS 21872 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Microbiologie des
aliments — Méthode horizontale pour la recherche des Vibrio spp. potentiellement entéropathogènes:
⎯ Partie 1: Recherche de Vibrio parahaemolyticus et Vibrio cholerae
⎯ Partie 2: Recherche des espèces autres que Vibrio parahaemolyticus et Vibrio cholerae
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ISO/TS 21872-2:2007(F)
Introduction
En raison de la diversité des produits alimentaires, il est possible que cette méthode horizontale ne soit pas
applicable dans tous ses détails à certains d'entre eux. Dans ce cas, des méthodes différentes, spécifiques à
ces produits, pourront être utilisées si cela s'avère absolument nécessaire pour des raisons techniques
justifiées. Néanmoins, tous les efforts doivent être faits pour appliquer cette méthode horizontale chaque fois
que cela est possible.
Lors du réexamen périodique de la présente Spécification technique, il sera tenu compte de toutes les
évolutions intervenues depuis sa publication et, notamment, dans quelle mesure cette méthode horizontale
aura été suivie ainsi que les raisons des dérogations dans le cas de produits particuliers.
L'harmonisation des méthodes d'essai ne peut être réalisée de façon immédiate; de ce fait, il peut déjà exister,
pour certains groupes de produits, des Normes internationales et/ou nationales qui ne concordent pas avec
cette méthode horizontale. Lorsque de telles normes viendront en révision, il serait souhaitable de les aligner
avec la présente Spécification technique et de ne conserver que les seules divergences justifiées,
indispensables pour des raisons techniques.
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SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 21872-2:2007(F)
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la
recherche des Vibrio spp. potentiellement entéropathogènes —
Partie 2:
Recherche des espèces autres que Vibrio parahaemolyticus et
Vibrio cholerae
AVERTISSEMENT — Afin de sauvegarder la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel que les
essais de recherche des Vibrio spp. et particulièrement des Vibrio cholerae toxinogènes ne soient
réalisés que dans des laboratoires équipés à cet effet et sous la surveillance d’un microbiologiste
expérimenté, et qu’un grand soin soit pris pour se débarrasser des éléments contaminés.
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO/TS 21872 décrit une méthode horizontale de recherche d’espèces
entéropathogènes de Vibrio, provoquant des maladies dans ou via le tractus intestinal et autres que
Vibrio parahaemolyticus et Vibrio cholerae. Les espèces détectées par les méthodes spécifiées incluent
1)
Vibrio fluvialis, Vibrio mimicus et Vibrio vulnificus . Elle ne convient pas pour l’isolement du Vibrio hollisae.
Les souches de V. parahaemolyticus et de V. cholerae peuvent être aussi recherchées au cours de
l’application de cette méthode.
La présente partie de l'ISO/TS 21872 est applicable
⎯ aux produits destinés à la consommation humaine et à l'alimentation animale, et
⎯ aux échantillons d’environnement prélevés dans la zone de production et de traitement des produits
alimentaires.
Cette méthode n'est pas appropriée pour la recherche de Vibrio metschnikovii, qui est oxydase négative.
NOTE 1 Vibrio metschnikovii a été occasionnellement isolé d'échantillons de fèces humains et peut être une cause de
maladies diarrhéiques.
NOTE 2 L’identification des espèces de Vibrio autres que V. parahaemolyticus et V. cholerae est difficile et nécessite
d’autres développements. Les tests biochimiques donnés dans la présente partie de l'ISO/TS 21872 permettent
seulement une confirmation présomptive de ces espèces.
NOTE 3 Les raisons pour lesquelles la présente méthode peut ne pas être applicable sont signalées dans l'Introduction.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
1) Voir 9.4.4.
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ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension
mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Recommandations et règles générales pour les examens
microbiologiques
ISO 8261, Lait et produits laitiers — Lignes directrices générales pour la préparation des échantillons pour
essai, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
Vibrio potentiellement entéropathogènes
micro-organismes formant des colonies caractéristiques sur des milieux sélectifs solides et possédant les
caractéristiques biochimiques décrites, lorsque l'essai est exécuté selon la présente partie de l'ISO/TS 21872
3.2
recherche des Vibrio potentiellement entéropathogènes
détermination de la présence ou de l'absence de Vibrio présumés entéropathogènes dans une quantité
déterminée de produit, lorsque l'essai est exécuté selon la présente partie de l'ISO/TS 21872
4 Principe
4.1 Généralités
La recherche de Vibrio potentiellement entéropathogènes nécessite quatre phases successives (voir
également Annexe A).
NOTE Les Vibrio peuvent, en effet, être présents en petit nombre et sont souvent accompagnés d'un nombre
beaucoup plus grand d'autres micro-organismes appartenant à la famille des Vibrionacées ou à d'autres familles. En
conséquence, deux enrichissements sélectifs successifs sont nécessaires.
4.2 Premier enrichissement en milieu sélectif liquide
Ensemencement de la prise d'essai dans le premier milieu d'enrichissement (eau peptonée alcaline salée,
EPAS) (5.1) à température ambiante, puis incubation à 37 °C pendant 6 h ± 1 h.
Il est recommandé de chauffer l'EPAS à 37 °C avant l'ensemencement de la prise d'essai en cas de grandes
quantités.
4.3 Second enrichissement en milieu sélectif liquide
Ensemencement du milieu d'enrichissement (EPAS) avec la culture obtenue en 4.2.
Incubation à 37 °C pendant 18 h ± 1 h.
4.4 Isolement et identification
À partir des cultures obtenues en 4.2 et en 4.3, ensemencement de deux milieux sélectifs solides:
⎯ TCBS (thiosulfate citrate bile saccharose);
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⎯ un autre milieu sélectif solide approprié (dont le choix est laissé au laboratoire) tel que le milieu gélose
cellobiose-polymyxine-colistine (CPC), le milieu gélose sodium dodécyl sulfate polymyxine saccharose
(SDS) ou le milieu gélose cellobiose-polymyxine-colistine modifiée (mCPC).
Incubation des deux milieux d’isolement à 37 °C, puis examen au bout de 24 h ± 3 h.
4.5 Confirmation
Repiquage des colonies caractéristiques de Vibrio spp. entéropathogènes, isolées en 4.4, et confirmation
présomptive de l’espèce bactérienne au moyen d’essais biochimiques appropriés.
5 Milieux de culture, réactifs
Pour les pratiques générales de laboratoire, voir l'ISO 7218.
NOTE En raison du nombre important de milieux de culture et de réactifs, il a été jugé préférable, pour la clarté du
texte, de donner leur composition et leur préparation dans l’Annexe B.
5.1 Milieu d’enrichissement: eau peptonée alcaline salée (EPAS)
Voir B.1.
5.2 Milieux d’isolement sélectifs solides
5.2.1 Premier milieu: milieu gélosé au thiosulfate, au citrate, à la bile et au saccharose (TCBS)
Voir B.2.
5.2.2 Second milieu
Choisir entre:
a) gélose sodium dodécyl sulfate polymyxine saccharose (SDS), voir B.3;
b) gélose cellobiose-polymyxine-colistine (CPC), voir B.4;
c) gélose cellobiose-polymyxine-colistine modifiée (mCPC), voir B.5.
5.3 Gélose nutritive salée (GNS)
Voir B.6.
5.4 Réactif pour la recherche de l’oxydase
Voir B.7.
5.5 Gélose salée au citrate de fer et aux trois sucres (TSI)
Voir B.8.
5.6 Milieu salé pour la recherche de l’ornithine décarboxylase (ODC)
Voir B.9.
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5.7 Milieu salé pour la recherche de la lysine décarboxylase (LDC)
Voir B.10.
5.8 Milieu salé pour la recherche de l’arginine dihydrolase (ADH)
Voir B.11.
5.9 Réactif pour la recherche de la β-galactosidase
Voir B.12.
5.10 Milieu salé pour la recherche de l’indole
Voir B.13.
5.11 Eaux peptonées salées
Voir B.14.
5.12 Solution de chlorure de sodium
Voir B.15.
6 Appareillage et verrerie
NOTE Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, si les spécifications sont
similaires.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l'ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Étuve, réglable à 37 °C ± 1 °C.
6.2 Étuve, ou bain d’eau, réglable à 41,5 °C ± 1 °C.
6.3 Bain d'eau, réglable de 44 °C à 47 °C.
6.4 Bain d'eau, réglable à 37 °C ± 1 °C.
Il est recommandé d'utiliser des bains d'eau (6.2, 6.3 et 6.4) contenant un agent antibactérien.
7 Échantillonnage
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié
lors du transport et de l'entreposage.
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente partie de l'ISO/TS 21872. Voir la
Norme internationale spécifique du produit concerné. S'il n’existe pas de Norme internationale spécifique, il
est recommandé que les parties concernées se mettent d'accord à ce sujet.
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8 Préparation de l'échantillon pour essai
Préparer l'échantillon pour essai conformément à l'ISO 6887 et/ou à l’ISO 8261 ainsi que la Norme
internationale concernant le produit à examiner. S'il n'existe pas de Norme Internationale spécifique, il est
recommandé que les parties concernées se mettent d'accord à ce sujet.
9 Mode opératoire (Voir Annexe A)
9.1 Prise d'essai et suspension mère
Pour la préparation de la suspension mère, utiliser le premier milieu d’enrichissement (EPAS) spécifié en 5.1.
Utiliser une prise d'essai (x g or x ml) selon la sensibilité requise et homogénéiser dans 9x ml (ou 9x g) de
milieu d’enrichissement.
En cas de grandes quantités, il est recommandé de chauffer l’EPAS à 37 °C avant ensemencement avec la
prise d’essai.
Si la dilution et l’incubation ne peuvent pas être réalisées le même jour, la suspension initiale doit être
conservée jusqu’au lendemain à une température de 5 °C ± 3 °C.
Afin de réduire la somme de travail d'examen, lorsqu'on doit examiner plus d'une prise d'essai de 25 g
provenant d'un lot déterminé de produit alimentaire et lorsqu'on dispose de preuves indiquant qu'un mélange
(réunissant les prises d'essai) ne modifie pas les résultats en ce qui concerne ce produit en particulier, les
prises d'essai peuvent être mélangées.
EXEMPLE Si l'on doit examiner 10 prises d'essai de 25 g, il est possible de combiner ces 10 unités afin d'obtenir un
échantillon composite de 250 g et d’ajouter 2,25 l de milieu d’enrichissement.
Le nombre de cellules de Vibrio spp., potentiellement entéropathogènes, diminue sensiblement lors du
stockage à des températures de réfrigération. Il convient donc d’éviter, dans la mesure du possible, de
stocker les échantillons et, dans une moindre mesure, les suspensions à ces températures et sinon de les y
maintenir un minimum de temps.
9.2 Premier enrichissement sélectif
Incuber la suspension mère (9.1) à 37 °C pendant 6 h ± 1 h.
Une attention particulière devrait être portée lorsque l’on applique la méthode complète à des produits à haute
teneur en sel, car la concentration finale en sels dans le milieu peut en altérer les caractéristiques (voir
l’ISO 6887-4).
9.3 Second enrichissement sélectif
9.3.1 Transférer 1 ml de la culture obtenue en 9.2 et prélevée en surface dans un tube contenant 10 ml
d’EPAS (5.1).
9.3.2 Incuber l’EPAS à 37 °C pendant 18 h ± 1 h.
9.4 Isolement et identification
9.4.1 À partir de la culture obtenue dans l’EPAS (9.2 et 9.3.2), ensemencer avec une anse la surface d'une
boîte de gélose TCBS (5.2.1), de façon à permettre le développement de colonies bien isolées.
Procéder de la même façon avec le second milieu d'isolement sélectif (5.2.2) en utilisant une nouvelle anse.
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9.4.2 Retourner les boîtes de gélose (9.4.1), les placer dans une étuve (6.1) réglée à 37 °C.
9.4.3 Après 24 h ± 3 h d'incubation, examiner les boîtes (9.4.1 et 9.4.2), afin de rechercher la présence de
colonies caractéristiques de Vibrio spp. Marquer leur position sur le dessous de la boîte.
Il existe deux morphologies caractéristiques des colonies de Vibrio spp. sur gélose TCBS (5.2.1) comme suit:
⎯ les colonies caractéristiques de V. mimicus et de V. vulnificus sont lisses, vertes (saccharose négatif) et
d’un diamètre de 2 mm à 3 mm;
⎯ les colonies caractéristiques de V. fluvialis sont lisses, jaunes (saccharose positif) et d’un diamètre
de 2 mm à 3 mm.
NOTE Les V. parahaemolyticus et les V. cholerae, traités dans l'ISO/TS 21872-1, forment, respectivement, des
colonies vertes et jaunes sur gélose TCBS.
Il existe deux morphologies caractéristiques des colonies de Vibrio spp. cultivées sur milieu SDS [5.2.2 a)]:
⎯ les colonies caractéristiques de V. mimicus et de V. vulnificus sont pourpres et d’un diamètre égal ou
supérieur à 2 mm, avec un halo opaque;
⎯ les colonies caractéristiques de V. cholerae O1 sont jaunes et d’un diamètre égal ou supérieur à 2 mm,
avec un halo opaque. Les souches de V. cholerae non O1 peuvent produire un halo ou pas.
Les autres Vibrio spp. ne se développeront pas sur gélose SDS ou bien donneront des colonies sans halo.
Il existe deux morphologies caractéristiques des colonies de Vibrio spp. cultivées sur CPC et
mCPC [5.2.2 b) et c)]:
⎯ les colonies caractéristiques de V. vulnificus sont jaunes, d’un diamètre égal ou supérieur à 2 mm et
entourées d’une zone jaune;
⎯ les colonies caractéristiques de V. cholerae sont pourpres, d’un diamètre égal ou supérieur à 2 mm et
entourées d’une zone bleue.
Certaines souches d’autres Vibrio spp. peuvent se développer sur des géloses CPC ou mCPC formant des
colonies analogues à celles décrites ci-dessus.
9.4.4 Afin de retrouver V. vulnificus, un grand soin doit être accordé à la performance des milieux CPC ou
mCPC.
9.5 Confirmation
9.5.1 Généralités
Les kits d'identification biochimique, actuellement disponibles dans le commerce, peuvent être utilisés pour
identifier les espèces de Vibrio, à condition de les ensemencer avec une suspension des bactéries à identifier
dans un milieu ou un diluant suffisamment salé et que la base de données ou le tableau d’identification du kit
soit basé sur des réactions obtenues en utilisant des milieux similaires à ceux décrits dans la présente partie
de l'ISO/TS 21872. Ces kits doivent être utilisés en suivant les instructions du fabricant.
NOTE La reconnaissance de colonies de Vibrio est en grande partie une question d'expérience et leur aspect peut
quelquefois varier non seulement d'une espèce à une autre, mais également d'un lot de milieu de culture à un autre.
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9.5.2 Choix des colonies pour la confirmation et la préparation de cultures pures
Pour la confirmation, prélever, à partir de chaque milieu sélectif (voir 9.4), au moins cinq colonies considérées
comme caractéristiques ou analogues à chacun des Vibrio spp. potentiellement pathogènes recherchés. S’il y
a moins de cinq colonies de l’un des types sur une gélose, repiquer la totalité de ces colonies.
NOTE Les produits alimentaires, notamment les aliments d’origine marine, peuvent contenir de grandes quantités de
bactéries, y compris des Vibrio spp. non pathogènes par voie digestive, qui peuvent se développer malgré l’utilisation de
milieux sélectifs. Le repiquage de colonies en faible nombre peut empêcher de déceler des espèces potentiellement
pathogènes.
Ensemencer les colonies sélectionnées sur la surface de boîtes de gélose nutritive salée ou de tubes de
gélose nutritive salée inclinée (5.3), afin d'obtenir des colonies isolées. Incuber les boîtes ensemencées
(9.4.2) à 37 °C durant 24 h ± 3 h.
Utiliser des cultures pures pour les confirmations biochimiques.
9.5.3 Essais d'identification présomptive
9.5.3.1 Essai à l’oxydase
À l’aide d'une anse bouclée, d'un fil droit en platine iridié ou d'une baguette de verre, prélever une portion de
la culture pure sur la gélose nutritive salée (9.5.2) et la déposer en stries sur le papier-filtre humecté de réactif
à l’oxydase (5.4) ou utiliser un test disponible dans le commerce, en suivant les instructions du fabricant. Il ne
faut utiliser ni anse en nickel-chrome ni fil métallique. L’essai est positif si la couleur vire au mauve, au violet
ou au violet intense dans les 10 s.
9.5.3.2 Examen microscopique
Soumettre chaque culture pure obtenue en 9.4.2 à un essai selon a) et b) comme suit.
a) Préparer une lame pour une coloration de Gram (voir l'ISO 7218). Procéder à la coloration, examiner la
morphologie et la réaction de Gram des micro-organismes au microscope, et noter le résultat.
b) Ensemencer un tube d’eau peptonée alcaline salée (EPAS) (5.1). Incuber à 37 °C pendant 1 h à 6 h.
Déposer une goutte de la culture sur une lame propre, couvrir avec une lamelle et rechercher la mobilité
par examen microscopique. Noter les cultures montrant des cellules mobiles.
9.5.3.3 Sélection des cultures pour les essais biochimiques
Retenir, pour la confirmation biochimique, les colonies oxydase positif et les colonies Gram négatif qui
donnent un résultat positif à l’essai de mobilité.
9.5.4 Confirmation biochimique
9.5.4.1 Généralités
À l'aide d’un fil ou d'une anse à ensemencer, ensemencer les milieux indiqués de 9.5.4.2 à 9.5.4.8 avec
chacune des cultures obtenues à partir des colonies retenues en 9.5.3.3.
9.5.4.2 Essai avec gélose TSI salée (5.5)
Ensemencer la pente de la gélose par une strie longitudinale et le culot par piqûre jusqu’au fond du tube.
Incuber à 37 °C durant 24 h ± 3 h.
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Interpréter les réactions de la façon suivante.
a) Culot du milieu de gélose
⎯ jaune: glucose positif (fermentation du glucose);
⎯ rouge ou inchangé: glucose négatif (pas de fermentation du glucose);
⎯ noir: formation d'hydrogène sulfuré;
⎯ bulles ou fissures: formation de gaz à partir du glucose.
b) Pente de la gélose
⎯ jaune: lactose et/ou saccharose positifs (utilisation du lactose et/ou du saccharose
...
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