ISO 22959:2009

Animal and vegetable fats and oils — Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons by on-line donor-acceptor complex chromatography and HPLC with fluorescence detection

ISO 22959:2009 specifies a high performance liquid chromatographic (HPLC) procedure for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in edible fats and oils. The method has been validated for coconut, olive, sunflower, and soybean oil, and is possibly applicable to other oils, dependent on the determination of appropriate parameters. The lowest level of quantification for the PAHs is 0,1 µg/kg. The lowest possible amount of each PAH which can be distinguished from the baseline noise has not been determined. The validated concentration range of the method is 0,1 µg/kg to 3,5 µg/kg for each individual PAH. For samples containing (light) PAH contents > 3,5 µg/kg, dilution to bring the contents into the validated range is possible. It is also possible to adjust the range of the calibration curves. However, ranges exceeding 3,5 µg/kg have not been validated. PAHs which can be determined by this method are: anthracene, phenanthrene, fluoranthene, pyrene, chrysene, benzo[a]anthracene, benzo[e]pyrene, benzo[a]pyrene, perylene, benzo[ghi]perylene, anthanthrene, dibenzo[a,h]anthracene, coronene, indeno[1,2,3-cd]pyrene, benzo[a]fluoranthene, benzo[b]fluoranthene, benzo[k]fluoranthene.

Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination de la teneur en hydrocarbures aromatiques polycycliques par chromatographie de complexe donneur-accepteur et CLHP avec détection par fluorescence

L'ISO 22959:2009 spécifie un mode opératoire de chromatographie liquide à haute performance (CLHP) permettant de déterminer la teneur en hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) dans les corps gras comestibles. La méthode a été validée pour l'huile de coco (CN), l'huile d'olive (OV), l'huile de tournesol (SF) et l'huile de soja (BO) et peut être applicable à d'autres huiles après détermination des paramètres appropriés. La plus faible limite de quantification pour l'ensemble des HAP est fixée à 0,1 μg/kg. La plus petite quantité de chaque HAP qu'il est possible de distinguer des signaux parasites n'a pas été déterminée. La plage de concentration validée pour la méthode est comprise entre 0,1 μg/kg et 3,5 μg/kg pour chaque HAP. Dans le cas de teneurs en HAP (légers) supérieures à 3,5 μg/kg, il est possible de diluer les échantillons afin d'amener la teneur dans la plage validée. Il est également possible de régler le domaine de travail des courbes d'étalonnage. Cependant, les domaines supérieurs à 3,5 μg/kg n'ont pas été validés. La présente méthode permet de déterminer les HAP suivants: anthracène, phénanthrène, fluoranthène, pyrène, chrysène, benz[a]anthracène, benzo[e]pyrène, benzo[a]pyrène, pérylène, benzo[ghi]pérylène, anthanthrène, dibenz[a,h]anthracène, coronène, indéno[1,2,3-cd]pyrène, benzo[a]fluoranthène, benzo[b]fluoranthène, benzo[k]fluoranthène.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 12-May-2009
• ICS: 67.200.10 - Animal and vegetable fats and oils
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 21-Apr-2020

Relations

• Consolidates: ISO 14790:1997 - Snowboard plate-bindings without a release mechanism — Safety requirements and test methods
• Effective Date: 06-Jun-2022
• Consolidated By: ISO 16672:2015 - Ophthalmic implants — Ocular endotamponades
• Effective Date: 06-Jun-2022

Standards Content (Sample)

МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 22959
Первое издание
2009-05-15

Жиры и масла животные и
растительные. Определение
полициклических ароматических
углеводородов методом донорно-
акцепторной комплексной
хроматографии в режиме онлайн и
высокоэффективной жидкостной
хроматографией (HPLC) с
флуоресцентным обнаружением
Animal and vegetable fats and oils – Determination of polycyclic
aromatic hydrocarbons by on-line donor-acceptor complex
chromatography and HPLC with fluorescence detection



Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
ISO 22959:2009(R)
©
ISO 2009

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 22959:2009(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или смотреть на экране, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на интегрированные шрифты и они не будут установлены на компьютере, на котором ведется редактирование. В
случае загрузки настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение
лицензионных условий фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe - торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованные для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General Info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже.


ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ


©  ISO 2009
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO, которое должно быть получено после запроса о разрешении, направленного по
адресу, приведенному ниже, или в комитет-член ISO в стране запрашивающей стороны.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии

ii © ISO 2009 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 22959:2009(R)
Содержание Страница
Предисловие .iv
Введение .v
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Термины и определения .1
4 Сущность метода.2
5 Реактивы, материалы и стандарты .3
6 Аппаратура.5
7 Отбор проб и подготовка образцов для испытания .5
8 Подготовка образцов.6
9 Проведение испытания.7
9.1 Анализ HPLC.7
9.2 Идентификация PAH .7
10 Расчет отдельных PAH.8
11 Данные валидации метода.8
11.1 Точность.8
11.2 Внутрилабораторная прецизионность.8
11.3 Возврат.9
11.4 Динамический диапазон.9
11.5 Предел количественного анализа.9
12 Прецизионность.9
12.1 Международное межлабораторное испытание.9
12.2 Повторяемость .9
12.3 Воспроизводимость .9
13 Протокол испытания.9
Приложение A (информативное) Примеры отдельных частей системы HPLC.10
Приложение B (информативное) Пример рабочих условий для насосов системы HPLC .11
Приложение C (информативное) Пример рабочих условий термостата колонки и детектора
системы HPLC .12
Приложение D (информативное) Пример программы автоматического дозатора системы HPLC. 13
Приложение E (информативное) Соединение трубок в системе HPLC.14
Приложение F (информативное) Хроматограмма стандартного калибровочного образца.15
Приложение G (информативное) Прецизионность определения для подсолнечного масла,
диапазон концентраций от 0,1 мкг/кг до 3,5 мкг/кг .16
Приложение H (информативное) Прецизионность определения для оливкового масла,
диапазон концентраций от 0,1 мкг/кг до 3,5 мкг/кг .17
Приложение I (информативное) Прецизионность определения для соевого масла,
диапазон концентраций от 0,1 мкг/кг до 3,5 мкг/кг .18
Приложение J (информативное) Прецизионность определения для кокосового масла,
диапазон концентраций от 0,1 мкг/кг до 3,5 мкг/кг .19
Приложение K (информативное) Межлабораторное испытание.20
Библиография.22

© ISO 2009 – Все права сохраняются iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 22959:2009(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) представляет собой всемирную федерацию,
состоящую из национальных органов по стандартизации (комитеты-члены ISO). Работа по разработке
международных стандартов обычно ведется Техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член,
заинтересованный в теме, для решения которой образован данный технический комитет, имеет право
быть представленным в этом комитете. Международные организации, правительственные и
неправительственные, поддерживающие связь с ISO, также принимают участие в работе. ISO тесно
сотрудничает с Международной электротехнической комиссией (IEC) по всем вопросам
стандартизации в области электротехники.
Международные стандарты разрабатываются в соответствии с правилами, установленными в Части 2
Директив ISO/IEC.
Основное назначение технических комитетов заключается в разработке международных стандартов.
Проекты международных стандартов, принятые Техническими комитетами, направляются комитетам-
членам на голосование. Для их опубликования в качестве международных стандартов требуется
одобрение не менее 75 % комитетов-членов, участвовавших в голосовании.
Внимание обращается на тот факт, что отдельные элементы данного документы могут составлять
предмет патентных прав. ISO не несет ответственность за идентификацию каких–либо или всех
подобных патентных прав.
ISO 22959 был подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 34, Пищевые продукты, Подкомитетом
SC 11, Жиры и масла животные и растительные.
iv © ISO 2009 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 22959:2009(R)
Введение
Полициклические ароматические углеводороды (PAH) образуются во время пиролитических процессов,
таких как неполное сгорание органических веществ или имеют петрогенное происхождение
(минеральные масла). Пищевые жиры и масла могут быть загрязнены из окружающей среды и/или на
этапе обработки перед рафинированием. Присутствие PAH в жирах и маслах касается здоровья,
поскольку эти соединения являются канцерогенными. Различные уровни содержания PAH
наблюдаются в сырых пищевых маслах. Рафинирование масел (деодорирование, осветление,
обработка на активированном угле) в соответствующих условиях сокращает содержание отдельных
PAH в микрограммах на килограмм. Известные методы анализа PAH в пищевых жирах и маслах
включают сложную и трудоемкую экстракцию и процедуры очистки, чтобы выделить PAH,
присутствующие в очень маленьких концентрациях.
С помощью донорно-акцепторной комплексной хроматографии (DACC) PAH можно экстрагировать из
разных матриц. PAH являются донорами электронов (π-электронов), а сильное взаимодействие PAH со
стационарной фазой – акцептором электронов – дает в результате PAH и элюирование (в массе)
других компонентов масла. Настоящий международный стандарт устанавливает автоматический
метод в режиме он-лайн определения PAH в пищевых маслах и жирах, который можно легко
применять как практический анализ. Этот метод включает сочетание LC-LC очистительной колонки
DACC с аналитической колонкой для разделения. PAH количественно определяют с помощью
флуоресцентного обнаружения.
По сравнению с более старыми методами данный автоматический метод в режиме он-лайн
значительно сокращает количество используемого растворителя и сохраняет массу времени. Очистка
на колонке DACC происходит быстро и выполняется в течение прохождения предыдущей пробой
анализа с помощью HPLC (высокоэффективной жидкостной хроматографии). Общее время анализа
для одной пробы составляет порядка 90 мин, по сравнению с традиционными методами,
занимающими от 8 ч до 10 ч. Более того, система может работать по 24 ч/сутки. Наконец, устраняются
потери летучих PAH, например, при испарении растворителя. Пределы количественного анализа
0,1 мкг/кг отдельных PAH в методе DACC сохраняются, причет автоматически вносится поправка на
возможный неполный выход, поскольку калибровочные образцы подвергаются такой же обработке, как
и анализируемые пробы. Система использует традиционное оборудование для HPLC.

© ISO 2009 – Все права сохраняются v

---------------------- Page: 5 ----------------------
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 22959:2009(R)

Жиры и масла животные и растительные. Определение
полициклических ароматических углеводородов методом
донорно-акцепторной комплексной хроматографии в
режиме онлайн и высокоэффективной жидкостной
хроматографией (HPLC) с флуоресцентным обнаружением
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает метод высокоэффективной жидкостной
хроматографии (HPLC) для определения полициклических ароматических углеводородов (PAH) в
пищевых жирах и маслах.
Этот метод был подтвержден для кокосового (CN), оливкового (OV), подсолнечного (SF), и соевого
(BO) масла, и может применяться к другим маслам в зависимости от определения соответствующих
параметров.
Самый низкий уровень определяемой концентрации PAH составляет 0,1 мкг/кг. Самое низкое из
возможных количеств каждого PAH, который можно отличить от фонового шума, не определено.
Подтвержденный диапазон концентраций, определяемых описанным методом, составляет от 0,1 мкг/кг
до 3,5 мкг/кг для каждого отдельного PAH. Для проб, содержащих (легкие) PAH в концентрации
> 3,5 мкг/кг, возможно разбавление для приведения содержимого в подтвержденный диапазон
концентраций. Также возможно отрегулировать диапазон калибровочных кривых. Однако определение
концентраций выше 3,5 мкг/кг не подтверждено.
PAH, которые можно определить данным методом, включают: антрацен, фенантрен, флуорантен,
пирен, кризен, бензо[a]антрацен, бензо[e]пирен, бензо[a]пирен, перилен, бензо[ghi]перилен, антантрен,
дибензо[a,h]антрацен, коронен, индено[1,2,3-cd]пирелен, бензо[a]fфлуорантен, бензо[b]флуорантен,
бензо[k]флуорантен.
2 Нормативные ссылки
Нижеследующие документы являются обязательными для применения данного документа. Для
датированных ссылок действительно только указанное издание. В случае недатированных ссылок
используется последняя редакция документа, на который дается ссылка (включая все изменения).
ISO 661, Жиры и масла животные и растительные. Приготовление пробы для анализа
3 Термины и определения
Применительно к данному документу используются следующие термины и определения.
3.1
полициклический ароматический углеводород
polycyclic aromatic hydrocarbon
PAH
соединение, которое содержит два или более конденсированных (слитых) ароматических
углеводородных колец, содержание которых можно определить по методу, установленному в данном
международном стандарте.
© ISO 2009 – Все права сохраняются 1

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 22959:2009(R)
3.2
легкий полициклический ароматический углеводород
light polycyclic aromatic hydrocarbon
соединение, содержащее от двух до четырех конденсированных (слитых) ароматических
углеводородных колец
ПРИМЕРЫ
Соединение No. CAS Соединение No. CAS Соединение No. CAS
аценафтен 83-32-9 бензо[e]пирен 192-97-2 нафталин 50-32-8
аценафтилен 208-96-8 кризен 218-01-9 фенантрен 85-01-8
антрацен 120-12-7 флуорантен 206-44-0 пирен 129-00-0
бензо[a]антрацен
56-55-3 флуорен 86-73-7
(1,2-бензоантрацен)
3.3
тяжелый полициклический ароматический углеводород
heavy polycyclic aromatic hydrocarbon
соединение, содержащее пять и более конденсированных (слитых) ароматических углеводородных
колец
ПРИМЕРЫ
Соединение No. CAS Соединение No. CAS Соединение No. CAS
дибензо[a,h]антрацен
бензо[a]пирен
50-32-8 бензо[k]флуорантен 207-08-9 (1,2,5,6- 53-70-3
(1,2-бензопирен)
дибензоантрацен)
бензо[ghi]перилен
бензо[a]fфлуорантен 203-33-8 191-24-2 индено[1,2,3-cd]пирен 193-39-5
(1,12-бензоперилен)
бензо[b]fфлуорантен 205-99-2 коронен 191-07-1 перилен 198-55-0
3.4
содержание полициклических ароматических углеводородов
polycyclic aromatic hydrocarbon content
массовая доля полициклического ароматического углеводорода или смеси полициклических
ароматических углеводородов в матрице
ПРИМЕРЫ Содержание отдельного полициклического ароматического углеводорода; содержание легкого
полициклического ароматического углеводорода; содержание тяжелого полициклического ароматического
углеводорода.
ПРИМЕЧАНИЕ Содержание выражается как массовая доля в микрограммах на килограмм.
4 Сущность метода
Содержание PAH в пищевых маслах определяют посредством сочетания в режиме он-лайн донорно-
акцепторной комплексной хроматографии (DACC) и HPLC с флуоресцентным обнаружением. Пробы
масла элюируют через колонку с модифицированной стационарной фазой (колонка DACC), которая
действует как акцептор электронов. Эта колонка будет удерживать PAH (доноры электронов) при
взаимодействии π-π. После элюирования масла PAH переносят в режиме он-лайн в аналитическую
колонку с обратной фазой. Отдельные PAH обнаруживают при различных длинах волн. Время
удерживания PAH используются для идентификации отдельных соединений. Уровни концентрации
PAH в пробах масла рассчитывают по внешней калибровке.
2 © ISO 2009 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 22959:2009(R)
5 Реактивы, материалы и стандарты
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — В данном методе применяются вредные вещества. Необходимо
соблюдать обычную лабораторную технику безопасности. Все PAH считаются канцерогенными
веществами. Поэтому важно, чтобы подготовка исходных растворов, стандартных разведений
и образцов для калибровочной кривой (5.3) выполнялась преимущественно в лаборатории 2
класса. Кроме того, необходимо использовать защитные перчатки и халат на этих этапах.
Загрязненную ткань и перчатки необходимо собирать в пластиковый пакет и герметично
закрывать перед перемещением.
5.1 Реактивы.
5.1.1 Ацетонитрил, класса HPLC, массовая доля w[C H N] > 99,9 %.
2 3
5.1.2 Этилацетат, класса HPLC, массовая доля w[C H O ] > 99,8 %.
4 8 2
5.1.3 2-пропанол, класса HPLC, массовая доля w[C H O] > 99,9 %.
3 8
5.1.4 Toluene, класса HPLC, массовая доля w[C H ] > 99,9 %.
7 8
5.1.5 Вода, класса HPLC.
1)
5.2 Стандартные образцы.
5.2.1 Антрацен, массовая доля w[C H ] > 99 %.
14 10
5.2.2 Фенантрен, массовая доля w[C H ] > 99 %.
14 10
5.2.3 Флуорантен, массовая доля w[C H ] > 99 %.
16 10
5.2.4 Пирен, массовая доля w[C H ] > 99 %.
16 10
5.2.5 Кризен, массовая доля w[C H ] > 99 %.
18 12
5.2.6 Бензо [a]антрацен (1,2-бензоантрацен), массовая доля w[C H ] > 99 %.
18 12
5.2.7 Бензо [e]пирен, массовая доля w[C H ] > 99 %.
20 12
5.2.8 Бензо [a]пирен (1,2-бензопирен), массовая доля w[C H ] > 99 %.
20 12
5.2.9 Перилен, массовая доля w[C H ] > 99 %.
20 12
5.2.10 Бензо [ghi]перилен (1,12-бензоперилен), массовая доля w[C H ] > 99 %.
22 12
5.2.11 Антантрен, массовая доля w[C H ] > 99 %.
22 12
5.2.12 Дибензо[a,h]aантраценe (1,2,5,6-дибензоантрацен), массовая доля w[C H ] > 99 %.
22 14
5.2.13 Коронен, массовая доля w[C H ] > 99 %.
24 12
5.2.14 Индено[1,2,3-cd]пирен, массовая доля w[C H ] > 99 %.
22 12
5.2.15 Бензо[a]fфлуорантен, массовая доля w[C H ] > 99 %.
20 12
5.2.16 Бензо[b]флуорантен, массовая доля w[C H ] > 99 %.
20 12
5.2.17 Бензo[k]флуорантен, массовая доля w[C H ] > 99 %.
20 12

1) IRMM (http://www.irmm.jrc.be) и Sigma-Aldrich (http://www.sigmaaldrich.com) являются подходящими
поставщиками. Эта информация дается для удобства пользователей данного международного стандарта и не
указывает на предпочтение со стороны ISO в отношении данной продукции. Можно использовать продукцию
других производителей, если при этом получаются такие же результаты.
© ISO 2009 – Все права сохраняются 3

---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 22959:2009(R)
5.2.18 BCR аттестованный стандартный образец 458, кокосовое масло, содержащее 6 PAH.
5.3 Стандартные растворы.
5.3.1 Стандартные растворы PAH в толуоле, массовая концентрация порядка 0,2 мг/мл. Берут
навески с точностью до 0,01 мг, примерно 10 мг всех PAH (5.2.1 - 5.2.17) в отдельные мерные колбы
вместимостью 50 мл с одной меткой (6.7) и доводят до объема толуолом (5.1.4).
5.3.2 Стандартный раствор PAH в масле, массовая доля порядка 125 мкг/кг. Готовят стандартный
раствор PAH в масле такого же типа (5.3.3) , как и анализируемые пробы.
Переносят с помощью шприца (6.2), 10,0 мкл каждого стандартного раствора (5.3.1) в один флакон
вместимостью 20 мл (6.1) с обжимной крышкой. Выдерживают, пока большая часть толуола не
испарится, и берут навеску 16 г масла с точностью до 0,1 мг во флакон. Тщательно перемешивают.
5.3.3 Приготовление мала, используемого для стандартных растворов (холостых и
разбавленных). Взвешивают приблизительно 400 г (предпочтительно) рафинированного масла в
2)
круглодонной колбе вместимостью 1 л. Добавляют 20 г активированного угла . нагревают в течение
2 ч при температуре 90 °C в роторном испарителе под вакуумом, центрифугируют смесь и фильтруют
надосадочную жидкость через фильтр с размером отверстий 0,45 мкм (6.3).
Анализируют масло, чтобы проверить фоновые PAH, которые должны быть значительно меньше чем
0,1 мкг/кг. Если необходимо, уровень содержания легких PAH можно понизить выпариванием в течение
примерно 3 ч при температуре 240 °C с 3 % -ной объемной долей пара/час под давлением ниже 3 kПa.
5.3.4 Образцы для калибровочной кривой PAH. Образцы калибровочной кривой готовят для
масла такого же типа, как масло, которое подлежит анализу. Фон PAH в используемом масле должен
быть гораздо меньше 0,1 мкг/кг.
Готовят шесть калибровочных образцов путем взвешивания различных количеств стандартных
растворов PAH в масле (5.3.2) с точностью до 0,1 мг во флаконах вместимостью 20 мл с обжимной
крышкой (6.1) и добавляют рафинированного масла (5.3.3) с точностью до 0,1 мг в соответствии с
Таблицей 1.
Таблица 1 — Количество стандартных растворов PAH в масле и рафинированном масле для
использования
Образец для Взвешенное количество Общая масса после
калибровочной стандартных растворов PAH в добавления
кривой масле рафинированного масла
мкг/кг мг г
0,1 10,0 12,500 0
0,8 32,0 5,000 0
1,5 60,0 5,000 0
2,1 84,0 5,000 0
2,8 56,0 2,500 0
3,5 70,0 2,500 0


® ®
2) Norit SA 4PAH и все другие типы активированного угля Norit являются примером имеющейся в продаже
подходящей продукции. Эта информация дается для удобства пользователей данного международного стандарта
и не указывает на предпочтение со стороны ISO в отношении данной продукции. Можно использовать продукцию
других производителей, если при этом получаются такие же результаты.
4 © ISO 2009 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 22959:2009(R)
Если ожидается, что уровень концентрации легких PAH в большинстве образцов, подлежащих анализу,
больше 3,5 мкг/кг, регулируют диапазон калибровочной кривой. Однако, концентрации, превышающие
3,5 мкг/кг не подтверждены.
5.4 Элюенты для анализа HPLC.
5.4.1 Растворитель A: ацетонитрил-вода (объемная доля ацетонитрила 85 %, воды15 %).
Смешивают 663 г ацетонитрила (5.1.1) и 150 г воды (5.1.5).
5.4.2 Растворитель B: ацетонитрил (5.1.1).
5.4.3 Растворители C/E: этилацетат-ацетонитрил (объемная доля этилацетата 70 %, ацетонитрила
30 %). Смешивают 630 г этилацетата (5.1.2) и 234 г ацетонитрила (5.1.1).
5.4.4 Растворитель D: 2-пропанол (5.1.3).
6 Аппаратура
Обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее.
6.1 Флаконы HPLC с обжимными крышками, подходящие для автоматического дозатора.
6.2 Шприцы, вместимостью: 10 мкл; 250 мкл.
3)
6.3 Фильтры , 0,45 мкм.
6.4 Шприцы однократного использования, 5 мл
6.5 Система HPLC, предпочтительно с нагреваемым автоматическим дозатором.
Для анализа пальмовых масел, кокосовых масел и затвердевших жиров, которые готовят в
соответствии с 8.1.2, рекомендуется применять нагреваемый автоматический дозатор. Если такового
не имеется, вводят приготовленную пробу немедленно в соответствии с 8.1.2.
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Пример отдельных частей системы HPLC дается в Приложении A. Соединения трубок в
4)
системе HPLC даются в Приложении E .
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Примеры рабочих условий для отдельных частей системы HPLC даются в Приложениях B - D.
6.6 Системы обработки данных хроматографии.
[1]
6.7 Мерная колба с одной отметкой и с пробкой, вместимостью 50 мл, ISO 1042 класс A.
7 Отбор проб и подготовка образцов для испытания
В лабораторию должна поступить репрезентативная проба. Она не должна быть повреждена или
изменена в процессе транспортирования и хранения.

3) Dynagard DG 4P/110/200 является примером имеющейся в продаже подходящей продукции. Эта информация
дается для удобства пользователей данного международного стандарта и не указывает на предпочтение со
стороны ISO в отношении данной продукции. Можно использовать продукцию других производителей, если при
этом получаются такие же результаты.
4) Подходящие системы имеются в продаже у Dionex (http://www.dionex.com), Separations Analytical Instruments
(http://www.separations.nl), Spark (http://www.sparkholland.com) и VWR-Hitachi (http://www.vwr.com). Эта информация
дается для удобства пользователей данного международного стандарта и не указывает на предпочтение со
стороны ISO в отношении данной продукции. Можно использовать продукцию других производителей, если при
этом получаются такие же результаты.
© ISO 2009 – Все права сохраняются 5

---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 22959:2009(R)
Отбор проб не является частью метода, установленного в данном международном стандарте.
[2]
Рекомендуемый метод отбора проб дается в ISO 5555 .
Готовят пробу для анализа в соответствии с ISO 661.
8 Подготовка образцов
8.1 Стандартные калибровочные образцы.
8.1.1 Жидкие масла.
Встряхивают стандартный калибровочный образец, чтобы полностью гомогенизировать его.
Открывают крышку флакона и переносят стандартный калибровочный образец в шприц однократного
использования (6.4), оснащенный фильтром0,45 мкм (6.3). Фильтруют стандартный калибровочный
образец в другой флакон (6.1) и закрывают флакон обжимной крышкой. Готовят три дополнительных
стандартных калибровочных образца концентрацией 1,5 мкг/кг. Такие стандартные калибровочные
образцы анализируют в первую очередь для приведения системы в равновесие.
8.1.2 Пальмовое масло, кокосовое масло и затвердевшие жиры.
Чтобы предотвратить кристаллизацию, разбавляют кокосовое масло, используя коэффициент
разбавления, как минимум 1, взяв в качестве холостой пробы подсолнечное масло (5.3.3). Разбавляют
пальмовое масло, используя коэффициент разбавления 5, взяв в качестве холостой пробы
подсолнечное масло (5.3.3). Коэффициент разбавления для затвердевших жиров зависит от йодного
числа жира (степени затвердевания).
Нагревают пальмовое масло, кокосовое масло или затвердевший жир следующим образом.
Предварительно нагревают закрытый флакон с кокосовым или пальмовым маслом до температуры
60 °C на водяной бане или в сушильной печи в течение 20 мин. Встряхивают каждые несколько минут,
чтобы гомогенизировать масло.
Затвердевшие жиры разбавляют теплым подсолнечным маслом (5.3.3), используя коэффициент
разбавления от 1 до 5. Если один раз разбавленный жир снова закристаллизовался, используют
подсолнечное масло в больших пропорциях. Выполняют предварительное испытание для
затвердевших жиров, чтобы получить оптимальный коэффициент разбавления.
Взвешивают с точностью до 0,000 1 г, количество масла, соответствующее 1 мл теплой смеси жиров в
флаконе (6.1).
ПРИМЕЧАНИЕ Относительные плотности различных масел приведены в Таблице 2.
Добавляют125 мкл 2-пропанола (5.1.3) с помощью шприца (6.2) и закрывают флакон обжимной
крышкой. Встряхивают стандартный калибровочный образец, чтобы гомогенизировать его. Открывают
крышку флакона и переносят стандартный калибровочный образец в шприц однократного
использования (6.4), оснащенный фильтром 0,45 мкм (6.3).
Фильтруют стандартный калибровочный образец в другой флакон (6.1) и закрывают флакон крышкой.
Если отмечается кристаллизация, нагревают флакон со стандартным калибровочным образцом, пока
образец снова не расплавится (см. 6.5).
ВНИМАНИЕ! — Если не имеется нагреваемого автоматического дозатора, вводят жидкую пробу
сразу же. Флакон не должен оставаться в дозаторе.
Готовят три дополнительных стандартных калибровочных образца концентрацией 1,5 мкг/кг. Эти
стандартные калибровочные образцы анализируют в первую очередь, чтобы привести систему в
равновесие.
6 © ISO 2009 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 22959:2009(R)
Таблица 2 — Относительные плотности различных типов масел
Масса 1 мл
Относительная
Тип масла
плотность
мг
Оливковое (OV) 914 0,914
Кокосовое(CN) 923 0,923
Соевое (BO) 916 0,916
Подсолнечное (SF) 914 0,914
Рапсовое (RP) 913 0,913
Косточковое пальмовое (PK) 918 0,918
8.2 Анализируемые пробы.
Готовят пробы для анализа из образцов жиров и масел для испытания, используя процедуры,
установленные для стандартных калибровочных образцов в 8.1.1 или 8.1.2, в зависимости от типа
жира. Разбавляют образцы для испытания с концентрациями PAH выше 3,5 мкг/кг и анализируют
второй раз.
Готовят разбавленные пробы для анализа, перемешивая соответствующую массу образца для
испытания с холостым маслом (5.3.3) или маслом аналогичного типа до общей массы,
соответствующей 1 мл.
Если ожидается, что концентрация (легких) PAH в большинстве образцов для испытания, подлежащих
анализу, будет выше 3,5 мкг/кг, регулируют диапазон калибровочной кривой. Необходимо помнить, что
определение концентраций выше 3,5 мкг/кг не подтверждено.
9 Проведение испытания
9.1 Анализ HPLC
С помощью системы обработки хроматографических данных (6.6) создают файл последоват
...

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 22959
First edition
2009-05-15

Animal and vegetable fats and oils —
Determination of polycyclic aromatic
hydrocarbons by on-line donor-acceptor
complex chromatography and HPLC with
fluorescence detection
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination de la teneur
en hydrocarbures aromatiques polycycliques par chromatographie de
complexe donneur-accepteur et CLHP avec détection par fluorescence




Reference number
ISO 22959:2009(E)
©
ISO 2009

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 22959:2009(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat
accepts no liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In
the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.


COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT


©  ISO 2009
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Published in Switzerland

ii © ISO 2009 – All rights reserved

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 22959:2009(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle. 2
5 Reagents, materials and standards . 3
6 Apparatus . 5
7 Sampling and preparation of the test sample. 5
8 Sample preparation . 6
9 Procedure . 7
9.1 HPLC analysis . 7
9.2 Identification of PAHs. 7
10 Calculation of individual PAHs. 7
11 Method validation data. 8
11.1 Accuracy. 8
11.2 Within-laboratory precision . 8
11.3 Recovery. 8
11.4 Dynamic range . 8
11.5 Limit of quantification . 8
12 Precision. 9
12.1 International collaborative trial . 9
12.2 Repeatability. 9
12.3 Reproducibility. 9
13 Test report . 9
Annex A (informative) Example of the individual parts of an HPLC system. 10
Annex B (informative) Example of the operating conditions of the pumps of the HPLC system. 11
Annex C (informative) Example of the operating conditions of the column thermostat and
the detector of the HPLC system . 12
Annex D (informative) Example of the autosampler programme of the HPLC system. 13
Annex E (informative) Tubing connections of the HPLC system. 14
Annex F (informative) Chromatogram of a standard calibration sample . 15
Annex G (informative) Determination precision for a sunflower oil, range 0,1 µg/kg to 3,5 µg/kg. 16
Annex H (informative) Determination precision for an olive oil, range 0,1 µg/kg to 3,5 µg/kg. 17
Annex I (informative) Determination precision for a soybean oil, range 0,1 µg/kg to 3,5 µg/kg. 18
Annex J (informative) Determination precision for a coconut oil, range 0,1 µg/kg to 3,5 µg/kg. 19
Annex K (informative) Interlaboratory test . 20
Bibliography . 22

© ISO 2009 – All rights reserved iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 22959:2009(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 22959 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11, Animal
and vegetable fats and oils.
iv © ISO 2009 – All rights reserved

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 22959:2009(E)
Introduction
Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are formed during pyrolytic processes such as the incomplete
combustion of organic substances or have a petrogenic origin (mineral oils). Edible fats and oils may be
contaminated by environmental pollution and/or processing steps prior to refining. The presence of PAHs in
fats and oils is a health concern due to their carcinogenicity. Different levels of PAHs have been observed in
crude edible oils. Refining of the oils (deodorization, bleaching, charcoal treatment) under the appropriate
conditions reduces the content of the individual PAHs to the microgram per kilogram level. The known
methods of analysis of PAHs in edible fats and oils include complex and laborious extraction and clean-up
procedures to isolate the low levels of PAHs present.
With the donor-acceptor complex-chromatography (DACC) technique, PAHs can be extracted from different
matrices. PAHs are electron donors (π-electrons) and the strong interaction of the PAHs with an electron
acceptor stationary phase results in retention of the PAHs and elution of (the bulk of) the other components of
the oil. This International Standard specifies an automated on-line method for the determination of PAHs in
edible oils and fats, which can easily be applied as a routine analysis. The method consists of an LC-LC
coupling of a clean-up DACC column to an analytical column for the separation. PAHs are quantified by
fluorescence detection.
Compared to older techniques, this automated on-line method significantly reduces the amount of solvent
used and saves considerable time. The DACC column clean-up is fast and is carried out during the HPLC run
of the previous sample. The total analysis time for one sample is approximately 90 min, compared with the
traditional methods which require 8 h to 10 h. Moreover, the system can run 24 h/day. Finally, losses of
volatile PAHs during solvent evaporation, for example, are eliminated. The quantification limits of 0,1 µg/kg of
the individual PAHs have been retained with the DACC method, which automatically corrects for possibly
incomplete recoveries because the calibration samples are subjected to the same treatment as the samples to
be analysed. The system uses conventional HPLC instrumentation.

© ISO 2009 – All rights reserved v

---------------------- Page: 5 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 22959:2009(E)

Animal and vegetable fats and oils — Determination of
polycyclic aromatic hydrocarbons by on-line donor-acceptor
complex chromatography and HPLC with fluorescence
detection
1 Scope
This International Standard specifies a high performance liquid chromatographic (HPLC) procedure for the
determination of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in edible fats and oils.
The method has been validated for coconut (CN), olive (OV), sunflower (SF), and soybean (BO) oil, and is
possibly applicable to other oils, dependent on the determination of appropriate parameters.
The lowest level of quantification for the PAHs is 0,1 µg/kg. The lowest possible amount of each PAH which
can be distinguished from the baseline noise has not been determined. The validated concentration range of
the method is 0,1 µg/kg to 3,5 µg/kg for each individual PAH. For samples containing (light) PAH contents
> 3,5 µg/kg, dilution to bring the contents into the validated range is possible. It is also possible to adjust the
range of the calibration curves. However, ranges exceeding 3,5 µg/kg have not been validated.
PAHs which can be determined by this method are: anthracene, phenanthrene, fluoranthene, pyrene,
chrysene, benzo[a]anthracene, benzo[e]pyrene, benzo[a]pyrene, perylene, benzo[ghi]perylene, anthanthrene,
dibenzo[a,h]anthracene, coronene, indeno[1,2,3-cd]pyrene, benzo[a]fluoranthene, benzo[b]fluoranthene,
benzo[k]fluoranthene.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 661, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
polycyclic aromatic hydrocarbon
PAH
compound that contains two or more condensed (fused) aromatic hydrocarbon rings and whose content can
be determined according to the method specified in this International Standard
© ISO 2009 – All rights reserved 1

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 22959:2009(E)
3.2
light polycyclic aromatic hydrocarbon
compound with two to four condensed (fused) aromatic hydrocarbon rings
EXAMPLES
Compound CAS No. Compound CAS No. Compound CAS No.
acenaphthene 83-32-9 benzo[e]pyrene 192-97-2 naphthalene 50-32-8
acenaphthylene 208-96-8 chrysene 218-01-9 phenanthrene 85-01-8
anthracene 120-12-7 fluoranthene 206-44-0 pyrene 129-00-0
benzo[a]anthracene
56-55-3 fluorene 86-73-7
(1,2-benzoanthracene)

3.3
heavy polycyclic aromatic hydrocarbon
compound with five and more condensed (fused) aromatic hydrocarbon rings
EXAMPLES
Compound CAS No. Compound CAS No. Compound CAS No.
dibenzo[a,h]anthracene
benzo[a]pyrene
50-32-8 benzo[k]fluoranthene 207-08-9 (1,2,5,6- 53-70-3
(1,2-benzopyrene)
dibenzoanthracene)
benzo[ghi]perylene
benzo[a]fluoranthene 203-33-8 191-24-2 indeno[1,2,3-cd]pyrene 193-39-5
(1,12-benzoperylene)
benzo[b]fluoranthene 205-99-2 coronene 191-07-1 perylene 198-55-0

3.4
polycyclic aromatic hydrocarbon content
mass fraction of a polycyclic aromatic hydrocarbon or polycyclic aromatic hydrocarbon mixture in a matrix
EXAMPLES Individual polycyclic aromatic hydrocarbon content; light polycyclic aromatic hydrocarbon content; heavy
polycyclic aromatic hydrocarbon content.
NOTE The content is expressed as a mass fraction in micrograms per kilogram.
4 Principle
The PAHs in edible oils are determined by on-line coupling of donor-acceptor complex chromatography
(DACC) and HPLC with fluorescence detection. The oil samples are eluted over a column with a modified
stationary phase (DACC column) which will act as an electron acceptor. This column will retain the PAHs
(electron donors) by π-π interactions. After elution of the oil, the PAHs are transferred on-line to the analytical
reversed phase column. The individual PAHs are detected at different wavelengths. The retention times of the
PAHs are used to identify the individual compounds. The levels of the PAHs in the oil samples are calculated
by external calibration.
2 © ISO 2009 – All rights reserved

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 22959:2009(E)
5 Reagents, materials and standards
WARNING — The method requires harmful reagents. Respect normal laboratory safety regulations. All
PAHs are suspected carcinogenic compounds. Therefore, it is essential that the preparation of the
stock solutions, the standard dilutions and the samples of the calibration curve (5.3) are performed by
preference in a class-2 laboratory. Furthermore, a laboratory coat and safety gloves are essential for
these steps. Contaminated tissues and gloves shall be collected in a plastic bag and removed after
sealing the bag.
5.1 Reagents.
5.1.1 Acetonitrile, HPLC grade, mass fraction w[C H N] > 99,9 %.
2 3
5.1.2 Ethyl acetate, HPLC grade, mass fraction w[C H O ] > 99,8 %.
4 8 2
5.1.3 2-Propanol, HPLC grade, mass fraction w[C H O] > 99,9 %.
3 8
5.1.4 Toluene, HPLC grade, mass fraction w[C H ] > 99,9 %.
7 8
5.1.5 Water, HPLC grade.
1)
5.2 Standards.
5.2.1 Anthracene, mass fraction w[C H ] > 99 %.
14 10
5.2.2 Phenanthrene, mass fraction w[C H ] > 99 %.
14 10
5.2.3 Fluoranthene, mass fraction w[C H ] > 99 %.
16 10
5.2.4 Pyrene, mass fraction w[C H ] > 99 %.
16 10
5.2.5 Chrysene, mass fraction w[C H ] > 99 %.
18 12
5.2.6 Benzo[a]anthracene (1,2-Benzoanthracene), mass fraction w[C H ] > 99 %.
18 12
5.2.7 Benzo[e]pyrene, mass fraction w[C H ] > 99 %.
20 12
5.2.8 Benzo[a]pyrene (1,2-Benzopyrene), mass fraction w[C H ] > 99 %.
20 12
5.2.9 Perylene, mass fraction w[C H ] > 99 %.
20 12
5.2.10 Benzo[ghi]perylene (1,12-Benzoperylene), mass fraction w[C H ] > 99 %.
22 12
5.2.11 Anthanthrene, mass fraction w[C H ] > 99 %.
22 12
5.2.12 Dibenzo[a,h]anthracene (1,2,5,6-Dibenzoanthracene), mass fraction w[C H ] > 99 %.
22 14
5.2.13 Coronene, mass fraction w[C H ] > 99 %.
24 12
5.2.14 Indeno[1,2,3-cd]pyrene, mass fraction w[C H ] > 99 %.
22 12
5.2.15 Benzo[a]fluoranthene, mass fraction w[C H ] > 99 %.
20 12
5.2.16 Benzo[b]fluoranthene, mass fraction w[C H ] > 99 %.
20 12
5.2.17 Benzo[k]fluoranthene, mass fraction w[C H ] > 99 %.
20 12
5.2.18 BCR certified reference material 458, coconut oil with 6 PAHs.

1) IRMM (http://www.irmm.jrc.be) and Sigma-Aldrich (http://www.sigmaaldrich.com) are suitable suppliers. This
information is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by
ISO of products so supplied. Products from other sources may be used if they can be shown to lead to the same results.
© ISO 2009 – All rights reserved 3

---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 22959:2009(E)
5.3 Standard solutions.
5.3.1 PAH standard solutions in toluene, mass concentration approx. 0,2 mg/ml. Weigh, to the nearest
0,01 mg, approx. 10 mg of all PAHs (5.2.1 to 5.2.17) into separate 50 ml one-mark volumetric flasks (6.7) and
make up to the mark with toluene (5.1.4).
5.3.2 PAH standard solution in oil, mass fraction approx. 125 µg/kg. Prepare a PAH standard solution in
oil of the same type of oil (5.3.3) as the samples to be analysed.
Transfer, with a syringe (6.2), 10,0 µl of each standard solution (5.3.1) to one 20 ml vial (6.1) with crimp cap.
Wait until (most of) the toluene is evaporated and weigh 16 g of oil to the nearest 0,1 mg in the vial. Mix
thoroughly.
5.3.3 Preparation of the oils used for standard solutions (blank and dilutions). Weigh approximately
2)
400 g of (preferably) refined oil into a 1 l round-bottomed flask. Add 20 g of activated charcoal . Heat for 2 h
at 90 °C in a rotary evaporator under vacuum, centrifuge the mixture and filter the supernatant over a 0,45 µm
filter (6.3).
Analyse the oil to check whether the background of PAHs is much smaller than 0,1 µg/kg. If necessary, the
level of the light PAHs can be lowered by steaming for approx. 3 h at 240 °C with 3 % volume fraction
steam/hour at a pressure lower than 3 kPa.
5.3.4 Samples for PAH calibration curve. The calibration curve samples are prepared for the same type
of oil as the samples to be analysed. The background of PAHs in the oil used should be much smaller than
0,1 µg/kg.
Prepare six calibration samples by weighing different amounts of the PAH standard solution in oil (5.3.2) to the
nearest 0,1 mg in 20 ml vials with crimp cap (6.1) and adding refined oil (5.3.3) to the nearest 0,1 mg in
accordance with Table 1.
Table 1 — Amounts of PAH standard solutions in oil and refined oil to be used
Calibration Weighed amount of Total mass
curve sample PAH standard solutions in oil after adding refined oil
µg/kg mg g
0,1 10,0 12,500 0
0,8 32,0 5,000 0
1,5 60,0 5,000 0
2,1 84,0 5,000 0
2,8 56,0 2,500 0
3,5 70,0 2,500 0

If it is expected that the level of the (light) PAHs in most of the samples to be analysed is greater than
3,5 µg/kg, adjust the range of the calibration curve. However, ranges exceeding 3,5 µg/kg have not been
validated.

® ®
2) Norit SA 4PAH and any other Norit charcoal are examples of suitable products available commercially. This
information is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by
ISO of this product. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
4 © ISO 2009 – All rights reserved

---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 22959:2009(E)
5.4 Eluents for HPLC analysis.
5.4.1 Solvent A: acetonitrile-water (volume fraction acetonitrile 85 %, water 15 %). Mix 663 g of acetonitrile
(5.1.1) and 150 g of water (5.1.5).
5.4.2 Solvent B: acetonitrile (5.1.1).
5.4.3 Solvents C/E: ethyl acetate-acetonitrile (volume fraction ethyl acetate 70 %, acetonitrile 30 %). Mix
630 g of ethyl acetate (5.1.2) and 234 g of acetonitrile (5.1.1).
5.4.4 Solvent D: 2-propanol (5.1.3).
6 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1 HPLC vials with crimp caps, suitable for an autosampler.
6.2 Syringes, capacities: 10 µl; 250 µl.
3)
6.3 Filters , 0,45 µm.
6.4 Disposable syringes for single use, 5 ml.
6.5 HPLC system, preferably with a heated autosampler.
For the analyses of palm fats, coconut fats or hardened fats, which are prepared in accordance with 8.1.2, a
heated sampler is recommended. If no heated autosampler is available, inject the sample preparation
immediately, as specified in 8.1.2.
NOTE 1 An example of the individual parts of an HPLC system is given in Annex A. The tubing connections of the
4)
HPLC system are given in Annex E .
NOTE 2 An example of the operating conditions of the individual parts of an HPLC system is given in Annexes B to D.
6.6 Chromatography data processing system.
[1]
6.7 One-mark volumetric flask with stopper, capacity 50 ml, ISO 1042 class A.
7 Sampling and preparation of the test sample
A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method
[2]
is given in ISO 5555 .
Prepare the test sample in accordance with ISO 661.


3) Dynagard DG 4P/110/200 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
4) Suitable systems are commercially available from Dionex (http://www.dionex.com), Separations Analytical Instruments
(http://www.separations.nl), Spark (http://www.sparkholland.com) and VWR-Hitachi (http://www.vwr.com). This information
is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of
products so supplied. Products from other sources may be used if they can be shown to lead to the same results.
© ISO 2009 – All rights reserved 5

---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 22959:2009(E)
8 Sample preparation
8.1 Standard calibration samples.
8.1.1 Liquid oils.
Shake the standard calibration sample to homogenize it completely. Open the cap of the vial and transfer the
standard calibration sample to a disposable single use syringe (6.4) equipped with a 0,45 µm filter (6.3). Filter
the standard calibration sample into another vial (6.1) and close the vial with a crimp cap. Prepare three extra
standard calibration samples of 1,5 µg/kg. These standard calibration samples are analysed first to equilibrate
the system.
8.1.2 Palm oil, coconut oil, and hardened fats.
To prevent crystallization, dilute coconut oil, using a dilution factor of 1 as minimum, with the blank sunflower
oil (5.3.3). Dilute palm oil, using a dilution factor of 5, with the blank sunflower oil (5.3.3). The dilution factor for
hardened fats depends on the iodine value of the fat (degree of hardening).
Heat the palm oil, coconut oil or hardened fat as follows.
Preheat the closed vial with coconut or palm oil at about 60 °C in a heated water bath or drying oven for about
20 min. Shake every few minutes to homogenize the oil.
Dilute hardened fats with warm sunflower oil (5.3.3), using a dilution factor between 1 and 5. If the once-
diluted fat is still crystallized, use a greater ratio of sunflower oil. Carry out a pre-test for hardened oils to find
the optimal dilution factor.
Weigh, to the nearest 0,000 1 g, an amount of oil corresponding to 1 ml of the warm fat mixture into a
vial (6.1).
NOTE The relative densities of various oils are given in Table 2.
Add 125 µl of 2-propanol (5.1.3) with a syringe (6.2) and close the vial with a crimp cap. Shake the standard
calibration sample to homogenize it. Open the cap of the vial and transfer the standard calibration sample to a
single use disposable syringe (6.4) equipped with a 0,45 µm filter (6.3).
Filter the standard calibration sample into another vial (6.1) and close the vial with a crimp cap. If
crystallization is noticed, heat the vial with the standard calibration sample until it is melted again (see 6.5).
IMPORTANT — If no heated autosampler is available, inject the liquid sample immediately. The vial
should not rest in the sampler.
Prepare three extra standard calibration samples of 1,5 µg/kg. These standard calibration samples are
analysed first to equilibrate the system.
Table 2 — Relative densities of different types of oil
Mass of 1 ml
Type of oil Relative density
mg
Olive (OV) 914 0,914
Coconut (CN)
923 0,923
Soybean (BO) 916 0,916
Sunflower (SF)
914 0,914
Rapeseed (RP) 913 0,913
Palm kernel (PK)
918 0,918
6 © ISO 2009 – All rights reserved

---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 22959:2009(E)
8.2 Test portions.
Prepare test portions from the fats and oils test samples using the procedures specified for standard
calibration samples in 8.1.1 or 8.1.2, depending on the type of fat. Dilute test samples with PAH
concentrations greater than 3,5 µg/kg and analyse a second time.
Prepare diluted test portions by mixing the appropriate mass of test sample with a blank oil (5.3.3) of the same
type to the total mass corresponding to 1 ml.
If it is expected that the level of the (light) PAHs in most of the test samples to be analysed is greater than
3,5 µg/kg, adjust the range of the calibration curve. However, ranges exceeding 3,5 µg/kg have not been
validated.
9 Procedure
9.1 HPLC analysis
Create a sequence file with the chromatography data processing system (6.6). Place the standard calibration
samples and test portions in the autosampler and start the HPLC system. The sequence shall be:
a) 2-propanol (5.1.3) — the chromatogram should be free of relevant peaks, spikes, drift or noise;
b) three extra standard calibration samples to stabilize the system;
c) standard calibration samples (8.1);
d) test portions of oils and fats (8.2);
e) if necessary, standard calibration samples resulting from dilutions (8.1.2).
9.2 Identification of PAHs
Identify the PAHs present in the chromatograms by their retention times. An example of a chromatogram for a
standard calibration sample is given in Annex F.
If there is doubt about the identity of a peak, analyse the test sample again. During that analysis, record the
excitation and emission spectra of the peak of interest. These spectra can be compared with the model
spectra of the PAHs. If the wavelengths applied (Annex C) cannot be used, analyse the test portion(s) and
standard calibration samples at different wavelengths.
10 Calculation of individual PAHs
The mass fraction of the individual PAHs, w , is calculated using an external calibration. For this reason, a
PAH
linear regression curve
A=+aw b (1)
PAH PAH
is fitted for each individual PAH. Equation (1) can be rearranged to give the mass fraction of each individual
PAH, w , in micrograms per kilogram:
PAH
A − b
PAH
w = (2)
PAH
a
© ISO 2009 – All rights reserved 7

---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 22959:2009(E)
where:
A is the peak area of an individual PAH;
PAH
w is the PAH content, in micrograms per kilogram, of the sample from the calibration curve;
PAH
a is the slope of the calibration curve,
b is the intercept of the calibration curve.
The mass fraction of the individual PAHs, w , is expressed in micrograms per kilogram to one place of
PAH
decimals.
11 Method validation data
11.1 Accuracy
BCR certified reference material 458 (5.2.18) has been analysed six times. The results are listed in Table 3.
Table 3 — Analysis results for BCR certified reference material 458
Mean of six analyses Content given by BCR
PAH
µg/kg µg/kg
Pyrene 10,02 9,4 ± 1,5
Chrysene 5,00 4,9 ± 0,4
Benzo[k]fluoranthene 2,00 1,87 ± 0,18
Benzo[a]pyrene 0,99 0,93 ± 0,09
Benz
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 22959
Première édition
2009-05-15

Corps gras d'origines animale et
végétale — Détermination de la teneur
en hydrocarbures aromatiques
polycycliques par chromatographie
de complexe donneur-accepteur et CLHP
avec détection par fluorescence
Animal and vegetable fats and oils — Determination of polycyclic
aromatic hydrocarbons by on-line donor-acceptor complex
chromatography and HPLC with fluorescence detection




Numéro de référence
ISO 22959:2009(F)
©
ISO 2009

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 22959:2009(F)
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées
acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute
responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info
du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir
l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,
veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.


DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT


©  ISO 2009
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Publié en Suisse

ii © ISO 2009 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 22959:2009(F)
Sommaire Page
Avant-propos. v
Introduction . vi
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principe. 2
5 Réactifs, matériaux et étalons . 3
6 Appareillage . 5
7 Échantillonnage et préparation de l'échantillon pour essai. 6
8 Préparation des échantillons. 6
9 Mode opératoire . 7
9.1 Analyse CLHP . 7
9.2 Identification des HAP. 7
10 Calculs des différents HAP. 8
11 Données de validation de la méthode . 8
11.1 Exactitude. 8
11.2 Fidélité intralaboratoire. 8
11.3 Récupération . 9
11.4 Plage dynamique . 9
11.5 Limite de quantification. 9
12 Fidélité . 9
12.1 Essai interlaboratoires international . 9
12.2 Répétabilité. 9
12.3 Reproductibilité. 9
13 Rapport d'essai . 9
Annexe A (informative) Exemple des parties constitutives d'un système de CLHP. 10
Annexe B (informative) Exemple de conditions de fonctionnement des pompes du système
de CLHP . 11
Annexe C (informative) Exemple de conditions de fonctionnement du thermostat de colonne et
du détecteur du système de CLHP . 12
Annexe D (informative) Exemple de programme de l'échantillonneur automatique du système de
CLHP . 13
Annexe E (informative) Raccords de tubulures du système de CLHP . 14
Annexe F (informative) Chromatogramme d'un échantillon étalon . 15
Annexe G (informative) Fidélité de la détermination pour une huile de tournesol, plage allant de
0,1 µg/kg à 3,5 µg/kg . 16
Annexe H (informative) Fidélité de la détermination pour une huile d'olive, plage allant de
0,1 µg/kg à 3,5 µg/kg . 17
Annexe I (informative) Fidélité de la détermination pour une huile de soja, plage allant de
0,1 µg/kg à 3,5 µg/kg . 18
© ISO 2009 – Tous droits réservés iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 22959:2009(F)
Annexe J (informative) Fidélité de la détermination pour une huile de coco, plage allant de
0,1 µg/kg à 3,5 µg/kg . 19
Annexe K (informative) Essai interlaboratoires. 20
Bibliographie . 22

iv © ISO 2009 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 22959:2009(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 22959 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 11,
Corps gras d'origines animale et végétale.
© ISO 2009 – Tous droits réservés v

---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 22959:2009(F)
Introduction
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) se forment lors des processus de pyrolyse, comme la
combustion incomplète des substances organiques ou d'origine pétrolière (huiles minérales). Les corps gras
comestibles peuvent être contaminés par la pollution environnementale et/ou lors des étapes de traitement
précédant le raffinage. La présence d'hydrocarbures aromatiques polycycliques dans les corps gras
présentent un danger pour la santé en raison de leur carcinogénicité. Différents niveaux d'hydrocarbures
aromatiques polycycliques ont été observés dans les corps gras comestibles bruts. Le raffinage des huiles
(désodorisation, blanchiment/décoloration, traitement au charbon actif) dans les conditions appropriées réduit
la teneur des différents hydrocarbures aromatiques polycycliques à un niveau de l'ordre de quelques
microgrammes par kilogramme. Parmi les méthodes connues d'analyse des hydrocarbures aromatiques
polycycliques dans les corps gras comestibles figurent des modes opératoires complexes d'extraction et de
purification permettant d'isoler les hydrocarbures aromatiques polycycliques présents à l'état de traces.
La technique par chromatographie de complexe donneur-accepteur (DACC) permet d'extraire les
hydrocarbures aromatiques polycycliques à partir de plusieurs matrices. Les hydrocarbures aromatiques
polycycliques sont des donneurs d'électrons (électrons π) et la forte interaction qui existe entre les
hydrocarbures aromatiques polycycliques et une phase stationnaire acceptant les électrons se traduit par la
rétention des hydrocarbures aromatiques polycycliques et l'élution du plus gros des autres composants de
l'huile. La présente Norme internationale spécifie une méthode en ligne automatisée de détermination de la
teneur en hydrocarbures aromatiques polycycliques des corps gras comestibles pouvant être utilisée
facilement comme analyse de routine. Cette méthode est réalisée par couplage LC-LC d'une colonne de
chromatographie de complexe donneur-accepteur de purification et d'une colonne d'analyse pour la
séparation. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques sont quantifiés par détection par fluorescence.
Comparée à des techniques plus anciennes, cette méthode en ligne automatisée réduit de manière
significative la quantité de solvant utilisée et permet un gain de temps substantiel. La purification par colonne
de chromatographie de complexe donneur-accepteur est rapide et est réalisée en même temps que la CLHP
de l'échantillon précédent. L'analyse complète d'un échantillon s'effectue en 90 min environ, contre 8 h à 10 h
par les méthodes classiques. En outre, le système peut tourner 24h/24. Enfin, cette méthode élimine les
pertes d'hydrocarbures aromatiques polycycliques volatils se produisant par exemple lors de l'évaporation du
solvant. Une limite de quantification de 0,1 µg/kg pour chaque hydrocarbure aromatique polycyclique a été
retenue avec la méthode par chromatographie de complexe donneur-accepteur, qui corrige automatiquement
les éventuelles récupérations incomplètes car les échantillons pour étalonnage sont soumis au même
traitement que les échantillons pour analyse. Le système utilise des appareils de CLHP classiques.

vi © ISO 2009 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 6 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 22959:2009(F)

Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination de
la teneur en hydrocarbures aromatiques polycycliques par
chromatographie de complexe donneur-accepteur et CLHP
avec détection par fluorescence
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie un mode opératoire de chromatographie liquide à haute
performance (CLHP) permettant de déterminer la teneur en hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP)
dans les corps gras comestibles.
La méthode a été validée pour l'huile de coco (CN), l'huile d'olive (OV), l'huile de tournesol (SF) et l'huile de
soja (BO) et peut être applicable à d'autres huiles après détermination des paramètres appropriés.
La plus faible limite de quantification pour l'ensemble des HAP est fixée à 0,1 µg/kg. La plus petite quantité de
chaque HAP qu'il est possible de distinguer des signaux parasites n'a pas été déterminée. La plage de
concentration validée pour la méthode est comprise entre 0,1 µg/kg et 3,5 µg/kg pour chaque HAP. Dans le
cas de teneurs en HAP (légers) supérieures à 3,5 µg/kg, il est possible de diluer les échantillons afin
d'amener la teneur dans la plage validée. Il est également possible de régler le domaine de travail des
courbes d'étalonnage. Cependant, les domaines supérieurs à 3,5 µg/kg n'ont pas été validés.
La présente méthode permet de déterminer les HAP suivants: anthracène, phénanthrène, fluoranthène,
pyrène, chrysène, benz[a]anthracène, benzo[e]pyrène, benzo[a]pyrène, pérylène, benzo[ghi]pérylène,
anthanthrène, dibenz[a,h]anthracène, coronène, indéno[1,2,3-cd]pyrène, benzo[a]fluoranthène,
benzo[b]fluoranthène, benzo[k]fluoranthène.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 661, Corps gras d'origines animale et végétale — Préparation de l'échantillon pour essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
hydrocarbure aromatique polycyclique
HAP
composé contenant au moins deux noyaux d'hydrocarbures aromatiques condensés (accolés) et dont la
teneur peut être déterminée à l'aide de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale
© ISO 2009 – Tous droits réservés 1

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 22959:2009(F)
3.2
hydrocarbure aromatique polycyclique léger
composé ayant entre deux et quatre noyaux d'hydrocarbures aromatiques condensés (accolés)
EXEMPLES
Composé N° CAS Composé N° CAS Composé N° CAS
acénaphtène 83-32-9 benzo[e]pyrène 192-97-2 naphtalène 50-32-8
acénaphtylène 208-96-8 chrysène 218-01-9 phénanthrène 85-01-8
anthracène 120-12-7 fluoranthène 206-44-0 pyrène 129-00-0
benz[a]anthracène
56-55-3 fluorène 86-73-7
(1,2-benzanthracène)

3.3
hydrocarbure aromatique polycyclique lourd
composé ayant cinq noyaux et plus d'hydrocarbures aromatiques condensés (accolés)
EXEMPLES
Composé N° CAS Composé N° CAS Composé N° CAS
dibenz[a,h]anthracène
benzo[a]pyrène
50-32-8 benzo[k]fluoranthène 207-08-9 (1,2,5,6- 53-70-3
(1,2-benzopyrène)
dibenzanthracène)
benzo[ghi]pérylène
benzo[a]fluoranthène indéno[1,2,3-cd]pyrène
203-33-8 191-24-2 193-39-5
(1,12-benzopérylène)
benzo[b]fluoranthène 205-99-2 coronène 191-07-1 pérylène 198-55-0

3.4
teneur en hydrocarbures aromatiques polycycliques
fraction massique d'un hydrocarbure aromatique polycyclique ou d'un mélange d'hydrocarbures aromatiques
polycycliques dans une matrice
EXEMPLES Teneur en chaque hydrocarbure aromatique polycyclique; teneur en hydrocarbures aromatiques
polycycliques légers; teneur en hydrocarbures aromatiques polycycliques lourds.
NOTE La teneur est exprimée en fraction massique en microgrammes par kilogramme.
4 Principe
Les HAP présents dans les huiles alimentaires sont déterminés par couplage en ligne d'un appareil de
chromatographie de complexe donneur-accepteur à un appareil de chromatographie liquide à haute
performance avec détection par fluorescence. Les échantillons d'huile sont élués dans une colonne contenant
une phase stationnaire modifiée (colonne de chromatographie de complexe donneur-accepteur DACC) qui
agit comme un accepteur d'électrons. La colonne retient les HAP (donneurs d'électrons) par des
interactions π-π. Après élution de l'huile, les HAP sont transférés en ligne dans la colonne en phase inverse
prévue pour l'analyse. Chaque HAP est détecté à une longueur d'onde différente. Les temps de rétention des
HAP sont utilisés pour identifier chacun des composés. Le niveau des HAP présents dans les échantillons
d'huile est calculé par étalonnage externe.
2 © ISO 2009 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 22959:2009(F)
5 Réactifs, matériaux et étalons
AVERTISSEMENT — La méthode nécessite l'emploi de réactifs nocifs pour la santé. Respecter les
règles générales de sécurité en vigueur dans les laboratoires. Tous les HAP sont soupçonnés d'être
cancérigènes. Par conséquent, il est indispensable de préparer les solutions mères, les dilutions
étalons et les échantillons de la courbe étalon (5.3) dans un laboratoire de classe 2. Il est également
indispensable de porter une blouse de laboratoire et des gants de sécurité lors de ces étapes. Les
tissus et les gants contaminés doivent être collectés dans un sac en plastique à mettre au rebut après
l'avoir fermé hermétiquement.
5.1 Réactifs.
5.1.1 Acétonitrile, de qualité CLHP, de fraction massique w[C H N] > 99,9 %.
2 3
5.1.2 Acétate d'éthyle, de qualité CLHP, de fraction massique w[C H O ] > 99,8 %.
4 8 2
5.1.3 Propanol-2, de qualité CLHP, de fraction massique w[C H O] > 99,9 %.
3 8
5.1.4 Toluène, de qualité CLHP, de fraction massique w[C H ] > 99,9 %.
7 8
5.1.5 Eau, de qualité CLHP.
1)
5.2 Étalons.
5.2.1 Anthracène, de fraction massique w[C H ] > 99 %.
14 10
5.2.2 Phénanthrène, de fraction massique w[C H ] > 99 %.
14 10
5.2.3 Fluoranthène, de fraction massique w[C H ] > 99 %.
16 10
5.2.4 Pyrène, de fraction massique w[C H ] > 99 %.
16 10
5.2.5 Chrysène, de fraction massique w[C H ] > 99 %.
18 12
5.2.6 Benz[a]anthracène, (1,2-Benzanthracène), de fraction massique w[C H ] > 99 %.
18 12
5.2.7 Benzo[e]pyrène, de fraction massique w[C H ] > 99 %.
20 12
5.2.8 Benzo[a]pyrène, (1,2-Benzopyrène), de fraction massique w[C H ] > 99 %.
20 12
5.2.9 Pérylène, de fraction massique w[C H ] > 99 %.
20 12
5.2.10 Benzo[ghi]pérylène, (1,12-Benzopérylène), de fraction massique w[C H ] > 99 %.
22 12
5.2.11 Anthanthrène, de fraction massique w[C H ] > 99 %.
22 12
5.2.12 Dibenz[a,h]anthracène, (1,2,5,6-Dibenzanthracène), de fraction massique w[C H ] > 99 %.
22 14
5.2.13 Coronène, de fraction massique w[C H ] > 99 %.
24 12
5.2.14 Indéno[1,2,3-cd]pyrène, de fraction massique w[C H ] > 99 %.
22 12
5.2.15 Benzo[a]fluoranthène, de fraction massique w[C H ] > 99 %.
20 12
5.2.16 Benzo[b]fluoranthène, de fraction massique w[C H ] > 99 %.
20 12
5.2.17 Benzo[k]fluoranthène, de fraction massique w[ H ] > 99 %.
C20 12
5.2.18 Matériau de référence certifié BCR 458, huile de coco avec 6 hydrocarbures aromatiques
polycycliques.

1) IRMM (http://www.irmm.jrc.be) et Sigma-Aldrich (http://www.sigmaaldrich.com) sont des exemples de fournisseurs
appropriés. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie
nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif des produits fournis. Des produits équivalents peuvent
être utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent aux mêmes résultats.
© ISO 2009 – Tous droits réservés 3

---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 22959:2009(F)
5.3 Solutions étalons.
5.3.1 Solutions étalons d'hydrocarbures aromatiques polycycliques dans du toluène, de
concentration en masse d'environ 0,2 mg/ml: peser à 0,01 mg près, 10 mg de tous les HAP (5.2.1 à 5.2.17)
dans des fioles jaugées (6.7) séparées et compléter au trait avec du toluène (5.1.4).
5.3.2 Solution étalon d'hydrocarbures aromatiques polycycliques dans de l'huile, de fraction
massique d'environ 125 µg/kg: préparer une solution étalon de HAP dans la même huile (5.3.3) que celle des
échantillons à analyser.
À l'aide d'une seringue (6.2), transférer 10,0 µl de chacune des solutions mères (5.3.1) dans une seule et
même fiole de 20 ml à bouchon serti (6.1). Attendre jusqu'à évaporation de la majeure partie du toluène et
peser 16 g d'huile à 0,1 mg près dans la fiole. Bien mélanger.
5.3.3 Préparation des huiles utilisées pour les solutions étalons (blanc et dilutions). Peser environ
2)
400 g d'huile de préférence raffinée dans un ballon à fond rond de 1 l. Ajouter 20 g de charbon actif .
Chauffer pendant 2 h à 90 °C dans un évaporateur rotatif sous vide, centrifuger le mélange et filtrer le
surnageant à l'aide d'un filtre de 0,45 µm (6.3).
Analyser l'huile pour déterminer si le niveau parasite d'hydrocarbures aromatiques polycycliques est
sensiblement inférieur à 0,1 µg/kg. Si nécessaire, le niveau des HAP légers peut être diminué par évaporation
pendant environ 3 h à 240 °C en le soumettant à 3 % de vapeur/heure sous une pression inférieure ou égale
à 3 kPa.
5.3.4 Échantillons pour la courbe étalon des hydrocarbures aromatiques polycycliques. Les
échantillons pour la courbe étalon sont préparés pour la même huile que celles des échantillons à analyser. Il
convient que le niveau parasite des HAP présents dans l'huile utilisée soit sensiblement inférieur à 0,1 µg/kg.
Préparer six échantillons étalons en pesant à 0,1 mg près différentes quantités de solution étalon de HAP
dans l'huile (5.3.2) dans des fioles de 20 ml à bouchon serti (6.1) et en ajoutant de l'huile raffinée (5.3.3) à
0,1 mg près, conformément aux valeurs indiquées dans le Tableau 1.
Tableau 1 — Quantités de solution étalon de HAP dans l'huile et d'huile raffinée à utiliser
Échantillon de la courbe Quantité pesée de solution Masse totale après
étalon étalon de HAP dans l'huile addition d'huile raffinée
µg/kg mg g
0,1 10,0 12,500 0
0,8 32,0 5,000 0
1,5 60,0 5,000 0
2,1 84,0 5,000 0
2,8 56,0 2,500 0
3,5 70,0 2,500 0

S'il est prévu, dans la plupart des échantillons à analyser, un niveau de HAP (légers) supérieur à 3,5 µg/kg,
régler le domaine de travail de la courbe étalon en conséquence. Cependant les domaines supérieurs à
3,5 µg/kg n'ont pas été validés.

® ®
2) Norit SA 4PAH ou tout autre charbon Norit sont des exemples de produits appropriés disponibles sur le marché.
Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que
l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif des produits ainsi désignés. Des produits équivalents peuvent être
utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent aux mêmes résultats.
4 © ISO 2009 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 22959:2009(F)
5.4 Éluants pour l'analyse par CLHP.
5.4.1 Solvant A: acétonitrile/eau (fraction volumique de 85 % pour l'acétonitrile et de 15 % pour l'eau).
Mélanger 663 g d'acétonitrile (5.1.1) et 150 g d'eau (5.1.5).
5.4.2 Solvant B: acétonitrile (5.1.1).
5.4.3 Solvants C/E: acétate d'éthyle/acétonitrile (fraction volumique de 70 % pour l'acétate d'éthyle et de
30 % pour l'acétonitrile). Mélanger 630 g d'acétate d'éthyle (5.1.2) et 234 g d'acétonitrile (5.1.1).
5.4.4 Solvant D: propanol-2 (5.1.3).
6 Appareillage
Appareillage courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Fioles pour CLHP à bouchon serti, adaptées à un échantillonneur automatique.
6.2 Seringues, de capacités 10 µl, 250 µl.
3)
6.3 Filtres , de 0,45 µm.
6.4 Seringues jetables à usage unique, de 5 ml.
6.5 Système de CLHP, de préférence muni d'un échantillonneur automatique chauffant.
Pour l'analyse de l'huile de palme, de l'huile de coco ou des huiles solidifiées, préparées conformément
à 8.1.2, il est recommandé d'utiliser un échantillonneur automatique chauffant. À défaut, injecter la
préparation de l'échantillon immédiatement, comme spécifié en 8.1.2.
NOTE 1 Un exemple des différentes parties d'un système de CLHP est donné à l'Annexe A. L'Annexe E traite des
4)
raccords de tubulures du système CLHP .
NOTE 2 Les Annexes B à D présentent à titre d'exemple les conditions de fonctionnement des différentes parties d'un
système CLHP.
6.6 Système de traitement des données de chromatographie.
[1]
6.7 Fiole jaugée à un trait avec bouchon rodé, de capacité 50 ml, ISO 1042 , classe A.

3) Dynagard DG 4P/110/200 est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est
donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou
recommande l'emploi exclusif des produits fournis. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils
conduisent aux mêmes résultats.
4) Des systèmes appropriés sont disponibles dans le commerce auprès de Dionex (http://www.dionex.com), Separations
Analytical Instruments (http://www.separations.nl), Spark (http://www.sparkholland.com) et VWR-Hitachi
(http://www.vwr.com). Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne
signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné. Un produit équivalent
peut être utilisé s'il est démontré qu'il peut conduire aux mêmes résultats.
© ISO 2009 – Tous droits réservés 5

---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 22959:2009(F)
7 Échantillonnage et préparation de l'échantillon pour essai
Il convient qu'un échantillon représentatif ait été envoyé au laboratoire. Il convient qu'il n'ait été ni endommagé
ni modifié lors du transport ou de l'entreposage.
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
[2]
méthode d'échantillonnage recommandée est donnée dans l'ISO 5555 .
Préparer l'échantillon pour essai conformément à l'ISO 661.
8 Préparation des échantillons
8.1 Échantillons de la courbe étalon.
8.1.1 Huiles liquides.
Agiter l'échantillon étalon pour l'homogénéiser complètement. Ouvrir le bouchon de la fiole et transférer
l'échantillon étalon dans une seringue jetable à usage unique (6.4) munie d'un filtre de 0,45 µm (6.3). Filtrer
l'échantillon étalon dans une autre fiole (6.1) et la refermer hermétiquement avec un bouchon serti. Préparer
trois échantillons étalons supplémentaires de 1,5 µg/kg. Ces échantillons étalons sont analysés en premier
pour équilibrer le système.
8.1.2 Huile de palme, huile de coco et huiles solidifiées.
Pour éviter la cristallisation, diluer l'huile de coco, en appliquant un facteur de dilution d'au moins 1, avec
l'huile de tournesol à blanc (5.3.3). Diluer l'huile de palme en appliquant un facteur de dilution de 5 avec de
l'huile de tournesol à blanc (5.3.3). Le facteur de dilution à appliquer aux huiles solidifiées dépend de leur
indice d'iode (degré de solidification).
Chauffer l'huile de palme, l'huile de coco et l'huile solidifiée comme indiqué ci-après.
Préchauffer la fiole bouchée contenant l'huile de palme ou l'huile de coco à environ 60 °C dans un bain-marie
ou dans une étuve pendant environ 20 min. Secouer la fiole régulièrement pour homogénéiser l'huile.
Diluer les huiles solidifiées avec de l'huile de tournesol tiède (5.3.3), en appliquant un facteur de dilution
compris entre 1 et 5. Si, après dilution, l'huile est toujours cristallisée, utiliser un ratio plus élevé d'huile de
tournesol. Réaliser un essai préliminaire pour les huiles solidifiées afin de déterminer le facteur de dilution
optimal.
Peser, à 0
...