ISO 6391:1997

Meat and meat products — Enumeration of Escherichia coli — Colony-count technique at 44 degrees C using membranes

Viande et produits à base de viande — Dénombrement des Escherichia coli — Méthode par comptage des colonies obtenues sur membranes à 44 degrés C

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 03-Dec-1997
• Withdrawal Date: 03-Dec-1997
• ICS: 07.100.30 - Food microbiology
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 6 - Meat, poultry, fish, eggs and their products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 6 - Meat, poultry, fish, eggs and their products
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Completion Date: 06-Oct-2006

Relations

• Revises: ISO 6391:1988 - Meat and meat products — Enumeration of Escherichia coli — Colony count technique at 44 degrees C using membranes
• Effective Date: 15-Apr-2008

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 6391
Second edition
1997-12-15
Meat and meat products — Enumeration of
Escherichia coli — Colony-count technique
at 44 °C using membranes
Viandes et produits à base de viande — Dénombrement des Escherichia
coli — Méthode par comptage des colonies obtenues sur membranes à
44 °C
A
Reference number
ISO 6391:1997(E)

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 6391:1997(E)
Page
Contents
1 Scope. 1
2 Normative references . 1
3 Definitions . 1
4 Principle . 2
5 Diluent, culture media and reagents . 2
6 Apparatus and glassware. 4
7 Sampling . 5
8 Preparation of test sample. 5
9 Procedure. 5
10 Expression of results . 7
11 Test report. 8
Annex A Bibliography . 9
©  ISO 1997
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Switzerland
Internet [e-mail]
X.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Printed in Switzerland
ii

---------------------- Page: 2 ----------------------
©
ISO ISO 6391:1997(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a world-
wide federation of national standards bodies (ISO member bodies).
The work of preparing International Standards is normally carried
out through ISO technical committees. Each member body
interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee.
International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees
are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the
member bodies casting a vote.
International Standard ISO 6391 was prepared by Technical
Committee ISO/TC 34, Agricultural food products, Subcommittee
SC 6, Meat and meat products.
This second edition cancels and replaces the first edition
(ISO 6391:1988), which has been technically revised.
Annex A of this International Standard is for information only.
iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
©
ISO 6391:1997(E) ISO
Introduction
Although, for well-accepted statistical reasons, the limit for the
lowest number of colonies counted per plate of selective medium is
set at 15, for practical purposes it is often desirable to establish an
estimated count of lower numbers of Escherichia coli. The confi-
dence limits of such determinations are to be found in ISO 7218.
iv

---------------------- Page: 4 ----------------------
©
INTERNATIONAL STANDARD  ISO ISO 6391:1997(E)
Meat and meat products — Enumeration of Escherichia coli —
Colony-count technique at 44 °C using membranes
1 Scope
This International Standard specifies a method for the enumeration of viable Escherichia coli
present in all kinds of meat and meat products, including poultry.
The method will detect Escherichia coli (biotype 1) and lactose non-fermenting or anaerogenic
[ ]
variants (see reference 1 ).
NOTE 1 This method may not be appropriate for the examination of processed meat having a high
content of aerobic spore-forming bacteria.
NOTE 2 Some pathogenic strains of Escherichia coli may not be detected by this method.
2 Normative references
The following standards contain provisions which, through reference in this text, constitute
provisions of this International Standard. At the time of the publication, the editions indicated were
valid. All standards are subject to revision, and parties to agreements based on this International
Standard are encouraged to investigate the possibility of applying the most recent editions of the
standards indicated below. Members of IEC and ISO maintain registers of currently valid
International Standards.
ISO 6887:1983, Microbiology — General guidance for the preparation of dilutions for
microbiological examination

ISO 7218:1996, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General rules for microbiological
examinations
3 Definitions
For the purposes of this International Standard, the following definition applies.
3.1
Escherichia coli
Bacteria which at 44 °C form indole-positive (pink) colonies on cellulose acetate membranes
overlaid on tryptone bile agar, under the conditions specified in this International Standard.
1

---------------------- Page: 5 ----------------------
©
ISO 6391:1997(E) ISO
4 Principle
In general, the detection of Escherichia coli requires three successive stages.
4.1 Resuscitation
Inoculation of a specified quantity of the initial suspension onto cellulose acetate membranes
overlaid on mineral-modified glutamate agar, and incubation at 37 °C for 4 h.
NOTE — This procedure enables Escherichia coli damaged by storage under frozen, dried or chill
conditions or damaged by heat or chemical processes to be resuscitated. It also permits the diffusion
of high concentrations of any fermentable carbohydrate, if present in the test sample, which would
otherwise interfere with indole production during the subsequent isolation stage.
4.2 Isolation
Transfer of membranes from the resuscitation stage on mineral-modified glutamate agar to
tryptone bile agar. Then incubation at 44 °C for 18 h to 20 h.
4.3 Detection
Demonstration of the presence of Escherichia coli on the membranes by the production of indole
by each colony.
4.4 Calculation
Escherichia coli
Calculation of the number of per millilitre or per gram of sample from the number
of indole-positive colonies obtained on membranes at dilution levels chosen to give a significant
result.
5 Diluent, culture media and reagents
5.1 General
For current laboratory practice, see ISO 7218.
5.2 Diluent
See ISO 6887 for the preparation of dilutions.
2

---------------------- Page: 6 ----------------------
©
ISO ISO 6391:1997(E)
5.3 Resuscitation media: Mineral-modified glutamate agar
5.3.1 Composition
Sodium glutamate 6,35 g
Lactose 10,0 g
Sodium formate 0,25 g
0,02 g
L(−)-cystine
− 0,024 g
L( )-aspartic acid
L(+)-arginine 0,02 g
Thiamine 0,001 g
Nicotinic acid 0,001 g
Pantothenic acid 0,001 g
Magnesium sulfate (MgSO .7H O) 0,100 g
4 2
m/m
Ammonium iron(III) citrate [at least 15 % Fe ( )] 0,010 g
Calcium chloride (CaCl .2H O) 0,010 g
2 2
Dipotassium hydrogen phosphate 0,90 g
Ammonium chloride 2,5 g
1)
Agar 12 g to 18 g
Water 1 000 ml
1) Depending on the gel strength of the agar.
5.3.2 Preparation
Dissolve the ammonium chloride in the water. Add the other components and heat to boiling.
Adjust the pH so that after sterilization it is 6,7 at 25 °C. Transfer 100 ml volumes of the medium to
suitable containers (6.5) and sterilize for 10 min in the autoclave (6.1) set at 121 °C.
5.3.3 Preparation of agar plates
Pour 12 ml to 15 ml of the medium, cooled to 47 °C in the water bath (6.10), into sterile Petri
dishes (6.6) and allow to solidify. The plates may be stored at between 0 °C and +5 °C for up to
one week.
Immediately before use, dry the agar plates carefully (e.g.in the cabinet or oven (6.4) set at 50 °C),
preferably with the lids off and agar surface downwards, until any droplets have disappeared from
the surface of the medium. Do not dry them any further.
NOTE — The agar should be dry enough so that 1 ml of inoculum is totally absorbed into the
membrane/agar within 15 min (see 9.2.3).
3

---------------------- Page: 7 ----------------------
©
ISO 6391:1997(E) ISO
5.4 Selective medium: Tryptone bile agar (see reference [3])
5.4.1 Composition
1)
Tryptone (peptic digest of casein) 20,0 g
2)
Bile salts (refined) 1,5 g
3)
Agar 12 g to 18 g
Water 1 000 ml
1) Commercial brands which favour indole formation should be used.
2) Oxoid Bile salts No. 3 is an example of a suitable product available commercially. This information is
given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement
by ISO of this product.
3) Depending on the gel strength of the agar.
5.4.2 Preparation
Dissolve the components in the water and heat to boiling. Adjust the pH so that after sterilization it
is 7,2 at 25 °C. Transfer 100 ml
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 6391
Deuxième édition
1997-12-15
Viandes et produits à base de viande —
Dénombrement des Escherichia coli —
Méthode par comptage des colonies
obtenues sur membranes à 44 °C
Meat and meat products — Enumeration of Escherichia coli —
Colony-count technique at 44 °C using membranes
A
Numéro de référence
ISO 6391:1997(F)

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 6391:1997(F)
Page
Sommaire
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Définitions . 1
4 Principe . 2
5 Diluant, milieux de culture et réactif . 2
6 Appareillage et verrerie . 5
7 Echantillonnage . 5
8 Préparation de l'échantillon pour essai . 5
9 Mode opératoire. 6
10 Expression des résultats . 7
11 Rapport d'essai. 8
Annexe A (informative) Bibliographie. 9
©  ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord
écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
Internet [e-mail]
X.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Imprimé en Suisse
ii

---------------------- Page: 2 ----------------------
©
ISO ISO 6391:1997(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédé-
ration mondiale d'organismes nationaux de normalisation (comités
membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en
général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité
membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gou-
vernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO par-
ticipent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la
Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui con-
cerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités
techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de
75 % au moins des comités membres votants.
La Norme internationale ISO 6391 a été élaborée par le comité
technique ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité
SC 6, Viande et produits à base de viande.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition
(ISO 6391:1988), dont elle constitue une révision technique.
L'annexe A de la présente Norme internationale est donnée unique-
ment à titre d'information.
iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
©
ISO 6391:1997(F) ISO
Introduction
Bien que, pour des raisons d'ordre statistique bien admises, le plus
petit nombre de colonies susceptible d'être compté sur boîte de
milieu sélectif a été fixé à 15, il est souvent souhaitable, à des fins
pratiques, d'estimer la présence d'Escherichia coli en dessous de
ce seuil. Les limites de confiance de telles estimations peuvent être
trouvées dans l'ISO 7218.
iv

---------------------- Page: 4 ----------------------
©
NORME INTERNATIONALE  ISO ISO 6391:1997(F)
Viandes et produits à base de viande — Dénombrement des
Escherichia coli
— Méthode par comptage des colonies
obtenues sur membranes à 44 °C
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale prescrit une méthode pour le dénombrement des Escherichia
coli pour tous les types de viandes et les produits à base de viande, y compris la volaille.
La méthode permet de rechercher les Escherichia coli typiques (biotype 1) et les variantes lactose
[ ]
négatif ou anaérogènes 1 .
NOTE 1 La méthode peut ne pas être adaptée à l'examen de viandes transformées ayant une teneur
élevée en bactéries formant des spores en aérobiose.
NOTE 2 Quelques souches pathogènes d'Escherichia coli peuvent ne pas être détectées par cette
méthode.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente norme internationale. Au moment de la
publication, les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les
parties prenantes des accords fondés sur la présente norme internationale sont invitées à
rechercher la possibilité d'appliquer les éditions les plus récentes des normes indiquées ci-après.
Les membres de la CEI et de l'ISO possèdent le registre des normes internationales en vigueur à
un moment donné.
ISO 6887:1983, Microbiologie —- Directives générales pour la préparation des dilutions en vue de l'examen
microbiologique.
ISO 7218:1996, Microbiologie des aliments —- Règles générales pour les examens microbiologiques.
3 Définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, la définition suivante s'applique.
3.1
Escherichia coli
Bactéries qui, à 44 °C, forment des colonies indole-positives (roses) caractéristiques sur
membranes en acétate de cellulose appliquées sur gélose tryptonée biliées, dans les conditions
spécifiées dans la présente Norme internationale.
1

---------------------- Page: 5 ----------------------
©
ISO 6391:1997(F) ISO
4 Principe
En général, la recherche d'Escherichia coli nécessite trois étapes successives.
4.1 Revivification
Inoculation d'une quantité spécifiée de suspension mère sur des membranes en acétate de
cellulose appliquées soit sur gélose au glutamate modifiée soit sur une gélose tryptone soja, et
incubation à 37 °C pendant 4 h.
NOTE — Ce mode opératoire permet la revivification des Escherichia coli ayant été endommagés par
le froid ou la dessiccation au cours d'un stockage, ou ayant subi l'action de la chaleur ou un traitement
chimique. Il permet également la diffusion de concentrations élevées d'hydrates de carbone
fermentescibles s'ils sont présents dans l'échantillon pour essai, ce qui évite leur interférence avec la
production d'indole au moment de l'isolement.
4.2 Isolement
Après la revivification, transfert des membranes de la gélose au glutamate modifiée, sur la gélose
au tryptone-soja. Incubation à 44 °C pendant 18 h à 20 h.
4.3 Recherche
Mise en évidence de la présence Escherichia coli sur membranes par la production d'indole à
partir de chaque colonie.
4.4 Calcul
Calcul du nombre Escherichia coli par millilitre ou par gramme d'échantillon à partir du nombre de
colonies indole-positives obtenues sur les membranes à des niveaux de dilutions choisis pour
donner un résultat significatif.
5 Diluant, milieux de culture et réactifs
5.1 Généralités
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir l'ISO 7218.
5.2 Diluant
Pour la préparation des dilutions, voir l'ISO 6887.
2

---------------------- Page: 6 ----------------------
©
ISO ISO 6391:1997(F)
5.3 Milieu de revivification : Gélose au glutamate modifiée
5.3.1 Composition
Glutamate de sodium 6,35 g
Lactose 10,0 g
Formate de sodium 0,25 g
L(-)-cystine 0,02 g
L(-)-acide aspartique 0,024 g
L(+)-arginine 0,02 g
Thiamine 0,001 g
Acide nicotinique 0,001 g
Acide pantothénique 0,001 g
Sulfate de magnésium (MgSO ,7H O) 0,100 g
4 2
0,010 g
Citrate ammoniacal de fer(III) [au moins 15 % Fe (m/m)]
Chlorure de calcium (CaCl ,2H O) 0,010 g
2 2
Monohydrogénophosphate de potassium 0,90 g
Chlorure d'ammonium 2,5 g
1)
Agar-agar 12 g à 18 g
Eau 1 000 ml
1) Selon le pouvoir gélifiant de l'agar-agar.
5.3.2 Préparation
Dissoudre le chlorure d'ammonium dans l'eau. Ajouter les autres composants et les dissoudre en
portant à ébullition. Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 6,7 à 25 °C. Répartir, par
quantités de 100 ml, dans des récipients appropriés (6.5), et stériliser pendant 15 min à l'autoclave
(6.1) réglé à 121 °C.
5.3.3 Préparation des boîtes de gélose
Répartir le milieu refroidi à environ 47 °C dans le bain d'eau, par quantités de 12 ml à 15 ml dans
les boîtes de Petri stériles (6.6) et laisser se solidifier. Les boîtes peuvent être conservées entre
0°C et + 5 °C jusqu'à une semaine.
Immédiatement avant utilisation sécher soigneusement les boîtes de gélose (par exemple dans
une étuve (6.4) réglée à 50 °C), de préférence avec les couvercles enlevé et la surface de la
gélose tournée vers le bas, jusqu'à disparition des goutteletteà la surface du milieu. Ne pas les
sécher davantage.
NOTE — La gélose doit être suffisamment sèche pour que 1 ml d’inoculum soit totalement absorbé
dans l’ensemble membrane/agar-agar en 15 min (voir 9.2.3).
3

---------------------- Page: 7 ----------------------
©
ISO 6391:1997(F) ISO
5.4 Milieu sélectif : Gélose tryptonée biliée (voir la référence [3]
5.4.1 Composition
1)
Tryptone 20,0 g
2)
Sels biliaires (purifiés) 1,5 g
3)
Agar-agar 12 g à 18 g
Eau 1 000 ml
1) Il convient d’utiliser des marques qui favorisent la production d'indole.
2) Le sel biliaire Oxoid N° 3 est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information
est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que
l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
3) Selon le pouvoir gélifiant de l'agar-agar.
5.4.2 Préparation
Dissoudre les composants dans l'eau en portant à ébullition. Ajuster le pH de sorte qu'après
stérilisation il soit de 7,2 à 25 °C. Répartir le milieu, par quantités de 100 ml, dans des fioles
appropriées, et stériliser pendant 15 min à l'autoclave (6.1) r
...