ISO 10872:2020
(Main)Water and soil quality — Determination of the toxic effect of sediment and soil samples on growth, fertility and reproduction of Caenorhabditis elegans (Nematoda)
Water and soil quality — Determination of the toxic effect of sediment and soil samples on growth, fertility and reproduction of Caenorhabditis elegans (Nematoda)
This document specifies a method for determining the toxicity of environmental samples on growth, fertility and reproduction of Caenorhabditis elegans. The method applies to contaminated whole freshwater sediment (maximum salinity 5 g/l), soil and waste, as well as to pore water, elutriates and aqueous extracts that were obtained from contaminated sediment, soil and waste.
Qualité de l'eau et du sol — Détermination de l'effet toxique d'échantillons de sédiment et de sol sur la croissance, la fertilité et la reproduction de Caenorhabditis elegans (Nematodes)
Le présent document spécifie une méthode de détermination de la toxicité d'échantillons environnementaux sur la croissance, la fertilité et la reproduction de Caenorhabditis elegans. La méthode s'applique aux sédiments d'eau douce contaminés (salinité maximale de 5 g/l), sols et déchets, ainsi qu'à l'eau interstitielle, aux élutriats et aux extraits aqueux obtenus à partir de sédiments contaminés, sols et déchets.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10872
Second edition
2020-05
Water and soil quality —
Determination of the toxic effect
of sediment and soil samples on
growth, fertility and reproduction of
Caenorhabditis elegans (Nematoda)
Qualité de l'eau et du sol — Détermination de l'effet toxique
d'échantillons de sédiment et de sol sur la croissance, la fertilité et la
reproduction de Caenorhabditis elegans (Nematodes)
Reference number
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ISO 10872:2020(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents and media . 3
6 Apparatus . 5
7 Reference substance . 6
8 Organisms . 7
8.1 Test organism . 7
8.2 Food organism . 7
9 Stock- and pre-cultures . 7
9.1 Stock cultures . 7
9.1.1 Caenorhabditis elegans . 7
9.1.2 Escherichia coli. 7
9.2 Pre-culture . 8
10 Procedure. 8
10.1 Preparation of food medium . 8
10.2 Preparation of test material and controls . 8
10.2.1 Soil . 8
10.2.2 Sediment . 9
10.2.3 Pore water, elutriate, extract. 9
10.2.4 Solution of reference substance . . 9
10.3 Test .10
10.4 Nematode separation .10
10.5 Measurements and calculations .10
10.5.1 Recovery .10
10.5.2 Males .10
10.5.3 Growth and fertility .11
10.5.4 Reproduction .11
10.6 Timetable of the test .12
11 Validity criteria .13
12 Expression of results .13
13 Test report .14
Annex A (informative) Determination of maximal water holding capacity (WHC ) .15
max
Annex B (informative) Figures and photos of adult worms C. elegans .16
Annex C (informative) Micropipette method (10.3) .18
Annex D (informative) Performance data .19
Bibliography .22
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ISO 10872:2020(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological method.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 10872:2010), which has been technically
revised. The main changes compared to the previous edition are as follows:
— the title has been changed to achieve a better perception in the field soil toxicity testing;
— for soil testing, the method has been modified in terms of a reduced water content of the test
material;
— cited references and standards have been refreshed;
— information on the control soil and restrictions for tested soils has been added;
— the document has been editorially revised.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
iv © ISO 2020 – All rights reserved
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ISO 10872:2020(E)
Introduction
[1] [2]
Nematodes are one of the most abundant and species-rich metazoans in sediments and soils and
possess key positions in benthic and soil food webs due to the evolution of various feeding types
(bacterial, algal, fungal and plant feeders, omnivores, predators see References [3] and [4]). Moreover,
they are well acknowledged as environmental indicators for assessing the toxicity of chemicals and the
quality of sediments and soils (see References [5], [6], [7], [8] and [9]).
The test organism Caenorhabditis elegans (Maupas, N2 var. Bristol) is a bacterivorous nematode that is
found primarily in microbe-rich, decaying plant material (see Reference [10]) and belongs to the family
of Rhabditidae, frequently found in terrestrial soils and aquatic sediments (see References [11] and
[12]). Moreover, individuals of C. elegans were already found in sediments of polysaprobial fresh-water
[15]
systems (see References [13] and [14]). Due to its easy cultivation and short life cycle , C. elegans has
become a well-studied model organism in biomedical and ecotoxicological research (see References [16],
[17] and [18]).
[19]
The test is designed for measurement of the response to dissolved and particle-bound substances .
It applies to the testing of sediments, soils, waste, pore water, elutriates and aqueous extracts (see
e.g. References [20], [21], [22] and [23]).
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 10872:2020(E)
Water and soil quality — Determination of the toxic effect
of sediment and soil samples on growth, fertility and
reproduction of Caenorhabditis elegans (Nematoda)
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this document be
carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This document specifies a method for determining the toxicity of environmental samples on growth,
fertility and reproduction of Caenorhabditis elegans. The method applies to contaminated whole
freshwater sediment (maximum salinity 5 g/l), soil and waste, as well as to pore water, elutriates and
aqueous extracts that were obtained from contaminated sediment, soil and waste.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
ISO 7027-2, Water quality — Determination of turbidity — Part 2: Semi-quantitative methods for the
assessment of transparency of waters
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org ./ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
agar plate
Petri dish filled with Nematode Growth Medium (NGM) agar
3.2
aqueous control
water that serves as negative control for tests in aqueous samples
3.3
artificial control sediment
defined artificial sediment
3.4
bacterial stock culture
stock culture of food bacteria
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ISO 10872:2020(E)
3.5
blank replicate
additional replicate that contains no test organism, but is treated in the same way as the other replicates
of a sample
3.6
control
treatment that serves as negative control to which the effect in the respective test material is compared
3.7
control soil
defined standard soil
3.8
dauer larva
developmental stage adopted by C. elegans to endure periods of lack of food
Note 1 to entry: Dauer larvae continue normal development if food is supplied.
3.9
exposed test organisms
individuals of C. elegans that are introduced at the beginning of the test
3.10
food medium
defined aqueous bacterial suspension
3.11
J stage
1
first of four juvenile stages (J to J ) in the development of C. elegans
1 4
3.12
maximal water holding capacity
WHC
max
maximal amount of water a soil sample is able to take up and keep against gravity
3.13
overnight culture
defined culture of Escherichia coli in Lysogeny Broth (LB)-medium
3.14
starved plate
agar plate (3.1) with dauer larvae
3.15
test material
discrete portion of a contaminated environmental sample or solution of the reference substance
4 Principle
Juvenile organisms of the species C. elegans are exposed to the environmental sample over a period
of 96 h. In the controls, the exposed test organisms are able to complete a whole life cycle within this
period. Toxicity can be quantified by the intensity of the effect as percentage inhibition. A toxic effect
of an environmental sample occurs if the inhibition of growth, fertility or reproduction of C. elegans
in comparison to a control (aqueous control, control sediment or soil) exceeds a certain threshold
value (e.g. as proposed in the following publications: aqueous medium: 10 %, 20 %, 10 % inhibition,
respectively (see Reference [24]); freshwater sediments: 25 %, 20 %, 50 % inhibition, respectively
(see Reference [21]); soil: 10 %, 20 %, 40 % inhibition, respectively (see Reference [20]), and the
performance of toxicity endpoints in the test material is statistically significantly lower compared to
the control performance (p <0,05).
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ISO 10872:2020(E)
5 Reagents and media
Use only reagents of recognized analytical grade.
5.1 Water, distilled or deionized water or water of equivalent purity, conductivity ≤10 µS/cm.
5.2 LB-medium
Dissolve
— 0,5 g of casein peptone;
— 0,25 g of yeast extract;
— 0,5 g of sodium chloride (NaCl);
in 50 ml water in a 250 ml flask and autoclave for 20 min at 121 °C.
5.3 Cholesterol stock solution
Dissolve 500 mg of powdered cholesterol in 100 ml of absolute ethanol (>99 % purity) by stirring and
gentle heating (<50 °C). Replace ethanol lost through evaporation with ethanol.
5.4 Calcium chloride stock solution, 1 mol/l CaCl .
2
Dissolve 7,35 g of CaCl ∙2H O in 50 ml water and autoclave for 20 min at 121 °C.
2 2
5.5 Magnesium sulfate stock solution, 1 mol/l MgSO .
4
Dissolve 12,35 g of MgSO ∙7H O in 50 ml water and autoclave for 20 min at 121 °C.
4 2
5.6 Potassium hydroxide, KOH, pellets.
5.7 Potassium phosphate buffer, 1 mol/l KH PO .
2 4
Dissolve 13,6 g of KH PO in 100 ml of water, adjust with KOH (5.6) to pH 6,0 ± 0,2, and autoclave for
2 4
20 min at 121 °C.
5.8 Nematode growth-medium agar (NGM agar)
Dissolve
— 2,5 g of casein peptone;
— 17 g of bacteriological agar;
— 3 g of NaCl;
in 900 ml water in a 1 000 ml flask and autoclave for 20 min at 121 °C. After cooling down to 55 °C, add
the following sterile solutions:
— 1 ml of cholesterol stock solution (see 5.3);
— 1 ml of calcium chloride stock solution (see 5.4);
— 1 ml of magnesium sulfate stock solution (see 5.5);
— 25 ml of potassium phosphate buffer (see 5.7);
and fill up to 1 000 ml with sterile water.
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ISO 10872:2020(E)
Transfer portions of NGM agar (about 20 ml to 25 ml) to sterile Petri dishes.
5.9 M9-medium
Dissolve
— 6 g of Na HPO ;
2 4
— 3 g of KH PO ;
2 4
— 5 g of NaCl;
— 0,25 g of MgSO ∙7H O;
4 2
in 1 000 ml of water in a 1 000 ml flask.
5.10 Bengal Rose stock solution
Add approximately 30 mg of Bengal Rose to 100 ml of water and stir thoroughly.
5.11 Ludox suspension
1) 3
Dilute Ludox TM 50 (colloidal silica; density: 1,4 g/cm ) with water to a density of (1,13 ± 0,005) g/
3 1)
cm [mix approximately 1 part Ludox TM 50 with 2 parts of water and control the density by weighing
1 ml of the suspension on a balance; 1 ml of the suspension weighs (1,13 ± 0,005) g]. For one 12 or 24-
well multidish, approximately 75 ml or 150 ml of Ludox-suspension are required, respectively.
5.12 Artificial control sediment
Mix the following components thoroughly in the given proportions:
— Al O , 20 % mass fraction;
2 3
— CaCO , 1 % mass fraction;
3
— dolomite (clay), 0,5 % mass fraction;
— Fe O , 4,5 % mass fraction;
2 3
— silica sand (for example: W4, mean particle size: 0,063 mm), 30 % mass fraction;
— silica sand (0,1 mm to 0,4 mm), 40 % mass fraction;
— peat (decomposed peat from a raised bog, untreated; finely ground and <1 mm sieved), 4 % mass
fraction.
The dry sediment is maintainable without restraint.
This sediment serves as negative control for tests with sediments.
WARNING — Artificial sediments with a kaolin content of >5 % mass fraction (e.g. OECD 218) can
cause deleterious effects on growth, fertility and reproduction of C. elegans. If using a different
artificial control sediment than proposed in this standard, the kaolin content shall be ≤5 %
mass fraction.
WARNING — If available, the use of a site-specific reference sediment is advised, additionally
to the artificial control sediment; the reference sediment shall match following criteria: limit
of contamination; important sediment properties shall be similar to the tested sample (e.g.
particle size distribution, organic content).
TM
1) Ludox 50 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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ISO 10872:2020(E)
5.13 Control soil
Standard soil St. 2.2 from LUFA:
— soil type: loamy sand;
— organic carbon: (2,0 ± 0,5) % mass fraction;
— pH (CaCl ): 5,5 ± 0,5;
2
— cation exchange capacity: (10,0 ± 0,4) mmol /100 g;
c
NOTE mmol /100 g is synonymous with meq/100 g.
c
— water holding capacity: (48,2 ± 5) %;
— clay content: (7,5 ± 2,5) % mass fraction particles <0,002 mm;
— silt content: (12,5 ± 2,5) % mass fraction particles 0,002 mm to 0,063 mm;
— sand content: (80,0 ± 5,0) % mass fraction particles 0,063 mm to 2 mm.
This soil serves as negative control for tests with soil.
NOTE LUFA refers to Landwirtschaftliche Untersuchungs- und Forschungsanstalt Speyer.
WARNING — If tested soils contain >30 % clay even in uncontaminated soils, inhibiting effects
on C. elegans’ growth and reproduction might exceed the toxicity threshold. In these cases, a
reference soil with a similar clay content shall be tested additionally to the control soil.
WARNING — Artificial soils with a kaolin content of >5 % mass fraction (e.g. OECD 207) can
cause deleterious effects on growth, fertility and reproduction of C. elegans. If using a different
artificial control soil than proposed in this standard, the kaolin content shall be ≤5 % mass
fraction.
5.14 Benzylcetyldimethylammonium chloride monohydrate (BAC-C16) stock solution
Dissolve 30 mg of BAC-C16 (C H CIN∙H O; CAS No.: 122-18-9) in 1 000 ml of water.
25 46 2
5.15 Glycerol (>98 %; Ph.Eu., water free)
5.16 Formazin: Turbidity 4000 NTU calibration standard
6 Apparatus
6.1 Autoclave.
6.2 Facilities, with constant temperature for 20 °C and 37 °C, for example incubator or temperature-
controlled chamber.
6.3 Drigalski spatula, glass spatula for distributing bacteria on an agar plate.
6.4 Erlenmeyer flasks, for example volume 250 ml.
6.5 Plastic vials, autoclavable and sealed, volume 1,5 ml.
6.6 Filter gauze, 5 µm, 10 µm.
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ISO 10872:2020(E)
6.7 Freezer, capable of maintaining temperature at −20 °C.
6.8 Micropipette (see Annex C).
Draw a Pasteur pipette over a Bunsen burner to a thin capillary. Plug the Pasteur pipette in a suction
cup at the thicker end.
6.9 Microscope, 100-fold magnification, with measurement scale.
6.10 Thermometer, minimum-maximum.
6.11 Shaker, for 250 ml Erlenmeyer flasks.
6.12 Stereo microscope, 4-fold to 20-fold magnification, with transmitted light.
6.13 Clean bench.
6.14 Sterile Petri dishes, of diameters 3 cm, 6 cm or 10 cm.
6.15 Spectrophotometer, capable of operating at wavelength 600 nm.
6.16 Test tube mixer.
6.17 Balance, 0,001 g readability.
6.18 Drying oven, approximately 80 °C.
2 2
6.19 Multidishes, with 12 wells, 3,5 cm /well (sediment, water); with 24 wells, 1,9 cm /well (soil).
6.20 Centrifuge tubes, 10 ml to 15 ml.
6.21 Centrifuge with swing-out rotor.
6.22 Piston pipettes, 10 ml to 100 ml, 100 ml to 1 000 ml.
6.23 Sieves, 1 mm and 2 mm.
6.24 Magnetic stirrer and magnetic stirring bar.
6.25 pH-meter.
6.26 Inoculating loop.
7 Reference substance
To ensure that the laboratory test conditions (including the condition and sensitivity of the exposed
test organisms) are adequate and have not changed significantly, the laboratory shall test a reference
substance as a positive control in parallel with each test, using one concentration near the EC for
50
growth. The test parameters “fertility” and “reproduction” are not analysed when testing the reference
substance. Use benzylcetyldimethylammonium chloride monohydrate (BAC-C16; 5.14), which has been
shown to affect growth of C. elegans, as reference substance. The positive control is tested in water
according to the instructions for testing aqueous substrates (10.1, 10.2.2, 10.3). The inhibition of
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ISO 10872:2020(E)
growth at a concentration of 15 mg/l (EC for BAC-C16, 5.14) compared to the control should be in the
50
range of 20 % to 80 %.
Additionally, the EC of the reference substance shall be determined at least every 12 months. The
50
EC (growth) in water shall be in the range of 8 mg to 22 mg BAC/l using an EC design as specified
50 x
in ISO 5667-16. Stock solutions of BAC in the concentrations of 7,1 mg/l, 10,6 mg/l, 16 mg/l, 24 mg/l,
36 mg/l, 54 mg/l and 81 mg/l are prepared in water and tested according to the instructions for testing
aqueous substrates (see 10.1, 10.2.2, 10.3).
2)
8 Organisms
8.1 Test organism
Caenorhabditis elegans (Maupas, 1899) is a widespread, free-living soil nematode that feeds primarily
on bacteria. Adult worms are about 1,0 mm to 1,5 mm in length and can be distinguished into
hermaphrodites and rarely occurring males (see Annex B). Hermaphrodites usually reproduce by
self-fertilization although they can also be fertilized by males. After hatching, C. elegans develops to
the adult stage through four juvenile stages separated by moults. Under starvation conditions, a
developmentally arrested stage, the dauer larva, can be formed as an alternative third larval stage. The
life cycle for worms grown on E. coli is about 3 d at 20 °C. The biology of C. elegans has been extensively
studied and, in many respects, it is the most thoroughly characterized animal. The “wild type” strain
N2 is used as test organism.
8.2 Food organism
As food organism for C. elegans, the bacterium E. coli (OP50; uracil-deficient strain) is used.
9 Stock- and pre-cultures
9.1 Stock cultures
9.1.1 Caenorhabditis elegans
C. elegans is maintained on agar plates (3.1) with a bacterial lawn (E. coli OP 50; 8.2) at (20 ± 2) °C.
When bacteria are used up, C. elegans forms dauer larvae (3.8) due to lack of food. These starved plates
(3.14) serve as stock cultures for C. elegans that should be replenished every two months. If too many
males occur (≥10 % in tests), new stock cultures should be ordered.
9.1.2 Escherichia coli
Inoculate under sterile conditions 50 ml of LB-medium (5.2) in a 250 ml Erlenmeyer flask (6.4) with
E. coli from a bacterial lawn on agar [as sent by the supplier] using an inoculating loop (6.25) and
incubate for 17 h at (37 ± 2) °C on a shaker (6.11) (overnight culture). Transfer 200 µl glycerol (5.15)
into each 1,5 ml plastic vial (6.5) and sterilize in an autoclave (6.1) at 121 °C for 20 min. Add under
sterile conditions 800 µl of the E. coli overnight culture (3.13), vortex and freeze immediately at −20 °C.
Bacterial stock cultures are thawed only once and discarded after use. Bacterial stock cultures should
be replenished after six months.
2) Caenorhabditis elegans and Escherichia coli can for example be supplied by: Caenorhabditis Genetic Center,
Theresa Stiernagle, University of Minnesota, 6-160 Jackson Hall, 321 Church Street S.E., Minneapolis, MN 55455,
E-mail: cgc@umn .edu, http:// www .cbs .umn .edu/ CGC/ . This information is given for the convenience of users of this
document and does not constitute an endorsement by ISO of these products.
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ISO 10872:2020(E)
9.2 Pre-culture
Inoculate under sterile conditions an agar plate (3.1) with approximately 200 µl of an overnight
culture (3.13) of E. coli, distribute equally using a Drigalski spatula (6.3) and incubate for at least 8 h
2
at (37 ± 2) °C. Cut two or three small pieces (approximately 1 cm ) out of a starved plate (3.14) and
transfer them under sterile conditions to an agar plate with a fresh lawn of E. coli. After about 3 d at
20 °C, a lot of gravid hermaphrodites as well as juveniles of stages 1 and 2 are found on the pl
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 10872
Deuxième édition
2020-05
Qualité de l'eau et du sol —
Détermination de l'effet toxique
d'échantillons de sédiment et de
sol sur la croissance, la fertilité et
la reproduction de Caenorhabditis
elegans (Nematodes)
Water and soil quality — Determination of the toxic effect of
sediment and soil samples on growth, fertility and reproduction of
Caenorhabditis elegans (Nematoda)
Numéro de référence
ISO 10872:2020(F)
©
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y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ISO 10872:2020(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d'application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs et milieux . 3
6 Appareillage . 6
7 Substance de référence . 7
8 Organismes . 7
8.1 Organisme d’essai . 7
8.2 Source nutritive . 7
9 Cultures mères et pré-cultures . 8
9.1 Cultures mères . 8
9.1.1 Caenorhabditis elegans . 8
9.1.2 Escherichia coli. 8
9.2 Pré-culture . 8
10 Mode opératoire. 8
10.1 Préparation du milieu nutritif. 8
10.2 Préparation du matériau d’essai et des témoins . 9
10.2.1 Sol . 9
10.2.2 Sédiment . 9
10.2.3 Eau interstitielle, élutriat, extrait .10
10.2.4 Solution de substance de référence .10
10.3 Essai .10
10.4 Séparation des nématodes .10
10.5 Mesurages et calculs .11
10.5.1 Taux de récupération .11
10.5.2 Mâles .11
10.5.3 Croissance et fertilité .11
10.5.4 Reproduction .12
10.6 Planification de l’essai .13
11 Critères de validité .13
12 Expression des résultats.14
13 Rapport d’essai .14
Annexe A (informative) Détermination de la capacité maximale de rétention d’eau (CRE ) .16
max
Annexe B (informative) Illustrations et photos de vers adultes C. elegans .17
Annexe C (informative) Méthode micropipette (10.3) .19
Annexe D (informative) Données relatives à la performance.20
Bibliographie .24
© ISO 2020 – Tous droits réservés iii
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ISO 10872:2020(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/ iso/ fr/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité
SC 5, Méthodes biologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 10872:2010), qui a fait l’objet d’une
révision technique. Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivantes:
— modification du titre afin d’atteindre une meilleure perception dans le domaine de la toxicité du sol;
— pour les essais sur sols, modification de la méthode en termes de réduction de la teneur en eau du
matériau d’essai;
— réactualisation des références et normes citées;
— ajout d’informations sur le sol témoin et de limitations applicables aux sols soumis à essai;
— révision éditoriale du document.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
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ISO 10872:2020(F)
Introduction
Les nématodes comptent parmi les métazoaires les plus abondants et les plus riches en espèces dans
[1] [2]
les sédiments et les sols et occupent des positions clés dans les réseaux trophiques benthiques
et les réseaux trophiques terrestres, en raison du développement des différents types d’alimentation
(bactérivores, alguivores, fongivores et herbivores, omnivores, prédateurs, voir Références [3] et [4]).
De plus, ils sont tous reconnus comme des indicateurs environnementaux pour évaluer la toxicité des
produits chimiques et la qualité des sédiments et des sols (voir Références [5], [6], [7], [8] et [9]).
L’organisme d’essai Caenorhabditis elegans (Maupas, N2 var. Bristol) est un nématode bactérivore que
l’on trouve principalement dans les matières végétales en décomposition riches en microbes (voir
Référence [10]) et appartient à la famille des Rhabditidae, souvent présents dans les sols terrestres
et les sédiments aquatiques (voir Références [11] et [12]). De plus, des individus de C. elegans ont déjà
être trouvés dans les sédiments de systèmes d’eau douce polysaprobes (voir Références [13] et [14]). En
[15]
raison de sa facilité de culture et de son cycle de vie court, C. elegans est devenu un organisme modèle
bien étudié dans le domaine de la recherche biomédicale et écotoxicologique (voir Références [16], [17]
et [18]).
[19]
L’essai est conçu pour mesurer la réponse aux substances dissoutes et liées à des particules. Il
s’applique aux sédiments, aux sols, aux déchets, à l’eau interstitielle, aux élutriats et aux extraits aqueux
(voir, par exemple, Références [20], [21], [22] et [23]).
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NORME INTERNATIONALE ISO 10872:2020(F)
Qualité de l'eau et du sol — Détermination de l'effet
toxique d'échantillons de sédiment et de sol sur la
croissance, la fertilité et la reproduction de Caenorhabditis
elegans (Nematodes)
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les
pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter de tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur
d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément au présent
document soient effectués par du personnel ayant suivi une formation appropriée.
1 Domaine d'application
Le présent document spécifie une méthode de détermination de la toxicité d’échantillons
environnementaux sur la croissance, la fertilité et la reproduction de Caenorhabditis elegans. La méthode
s’applique aux sédiments d’eau douce contaminés (salinité maximale de 5 g/l), sols et déchets, ainsi qu’à
l’eau interstitielle, aux élutriats et aux extraits aqueux obtenus à partir de sédiments contaminés, sols
et déchets.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 5667-16, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques
des échantillons
ISO 7027-2, Qualité de l'eau — Détermination de la turbidité — Partie 2: Méthodes semi-quantitatives pour
l'évaluation de la transparence des eaux
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org ./ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
3.1
boîte de gélose
boîte de Petri remplie de gélose de croissance des nématodes (NGM)
3.2
témoin aqueux
eau servant de témoin négatif pour les essais sur échantillons aqueux
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ISO 10872:2020(F)
3.3
sédiment témoin artificiel
sédiment artificiel défini
3.4
culture mère bactérienne
culture mère de bactéries utilisée comme nourriture
3.5
blanc
réplicat supplémentaire ne contenant pas d’organisme d’essai mais traité de la même façon que les
autres réplicats d’un échantillon
3.6
témoin
traitement servant de témoin négatif auquel est comparé l’effet sur le matériau d’essai correspondant
3.7
sol témoin
sol standard défini
3.8
larve dauer
stade de développement adopté par C. elegans pour supporter des périodes de pénurie alimentaire
Note 1 à l'article: à l’article Les larves dauer poursuivent leur développement normal en cas d’apport de
nourriture.
3.9
organismes d’essai exposés
individus de C. elegans introduits au début de l’essai
3.10
milieu nutritif
suspension bactérienne aqueuse définie
3.11
stade J
1
premier des quatre stades juvéniles (J à J ) au cours du développement de C. elegans
1 4
3.12
capacité maximale de rétention d’eau
CRE
max
quantité maximale d’eau qu’un échantillon de sol est capable d’absorber et de retenir malgré la gravité
3.13
culture nocturne
culture définie d’Escherichia coli dans du milieu Bouillon de Lysogénie (LB)
3.14
boîte sans nourriture
boîte de gélose (3.1) avec des larves dauer
3.15
matériau d’essai
portion discrète d’un échantillon environnemental contaminé ou solution de la substance de référence
4 Principe
Les organismes juvéniles de l’espèce C. elegans sont exposés à l’échantillon environnemental pendant
une période de 96 h. Dans les témoins, les organismes d’essai exposés peuvent accomplir un cycle de
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ISO 10872:2020(F)
vie complet au cours de cette période. La toxicité peut être quantifiée par l’intensité de l’effet sous la
forme d’un pourcentage d’inhibition. Un effet toxique de l’échantillon environnemental est observé
si l’inhibition de la croissance, de la fertilité ou de la reproduction de C. elegans comparée au témoin
(témoin aqueux, sédiment ou sol témoin) dépasse une certaine valeur seuil (par exemple, comme
proposé dans les publications suivantes: milieu aqueux: 10 %, 20 %, 10 % d’inhibition, respectivement
(voir Référence [24]); sédiments d’eau douce: 25 %, 20 %, 50 % d’inhibition, respectivement (voir
Référence [21]); sol: 10 %, 20 %, 40 % d’inhibition, respectivement (voir Référence [20]), et le résultat
des critères de toxicité dans le matériau d’essai est statistiquement significativement moins élevé que
celui des témoins (p < 0,05).
5 Réactifs et milieux
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
5.1 Eau, distillée ou déionisée ou eau d’une pureté équivalente, conductivité ≤ 10 µS/cm.
5.2 Milieu LB
Dissoudre
— 0,5 g de peptone de caséine;
— 0,25 g d’extrait de levure;
— 0,5 g de chlorure de sodium (NaCl);
dans 50 ml d’eau dans une fiole de 250 ml et autoclaver pendant 20 min à 121 °C.
5.3 Solution mère de cholestérol
Dissoudre 500 mg de cholestérol en poudre dans 100 ml d’éthanol absolu (pureté > 99 %) en agitant et
en chauffant légèrement (< 50 °C). Remplacer l’éthanol perdu par évaporation.
5.4 Solution mère de chlorure de calcium, 1 mol/l CaCl
2
Dissoudre 7,35 g de CaCl , 2H O dans 50 ml d’eau et autoclaver pendant 20 min à 121 °C.
2 2
5.5 Solution mère de sulfate de magnésium, 1 mol/l MgSO
4
Dissoudre 12,35 g de MgSO ∙7H O dans 50 ml d’eau et autoclaver pendant 20 min à 121 °C.
4 2
5.6 Hydroxyde de potassium, KOH, pastilles.
5.7 Solution tampon de phosphate de potassium, 1 mol/l KH PO
2 4
Dissoudre 13,6 g de KH PO dans 100 ml d’eau, ajuster le pH à 6,0 ± 0,2 avec du KOH (5.6) et autoclaver
2 4
pendant 20 min à 121 °C.
5.8 Milieu gélosé de croissance des nématodes (gélose NGM)
Dissoudre
— 2,5 g de peptone de caséine;
— 17 g de gélose bactériologique;
— 3 g de NaCl;
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ISO 10872:2020(F)
dans 900 ml d’eau dans une fiole de 1 000 ml et autoclaver pendant 20 min à 121 °C. Après
refroidissement à 55 °C, ajouter les solutions stériles suivantes:
— 1 ml de solution mère de cholestérol (voir en 5.3);
— 1 ml de solution mère de chlorure de calcium (voir en 5.4);
— 1 ml de solution mère de sulfate de magnésium (voir en 5.5);
— 25 ml de solution tampon de phosphate de potassium (voir en 5.7);
et compléter à 1 000 ml avec de l’eau stérile.
Transférer des portions de gélose NGM (20 ml à 25 ml environ) dans des boîtes de Petri stériles.
5.9 Milieu M9
Dissoudre
— 6 g de Na HPO ;
2 4
— 3 g de KH PO ;
2 4
— 5 g de NaCl;
— 0,25 g de MgSO , 7H O;
4 2
dans 1 000 ml d’eau dans une fiole de 1 000 ml.
5.10 Solution mère de rose Bengale
Ajouter environ 30 mg de rose Bengale à 100 ml d’eau et agiter soigneusement.
5.11 Suspension de Ludox
1) 3
Diluer du Ludox TM 50 (silice colloïdale; masse volumique: 1,4 g/cm ) avec de l’eau, jusqu’à une masse
3 1)
volumique de (1,13 ± 0,005) g/cm [mélanger environ 1 part de Ludox TM 50 avec 2 parts d’eau et
contrôler la masse volumique en pesant 1 ml de la suspension sur une balance; 1 ml de la suspension
pèse (1,13 ± 0,005) g]. Pour une plaque multi-puits de 12 ou 24 puits, environ 75 ml ou 150 ml de
suspension de Ludox sont respectivement nécessaires.
5.12 Sédiment témoin artificiel
Mélanger soigneusement les composés suivants dans les proportions indiquées:
— Al O , 20 % (fraction massique);
2 3
— CaCO , 1 % (fraction massique);
3
— dolomite (argile), 0,5 % (fraction massique);
— Fe O , 4,5 % (fraction massique);
2 3
— sable de silice (par exemple: W4, granulométrie moyenne: 0,063 mm), 30 % (fraction massique);
— sable de silice (de 0,1 mm à 0,4 mm), 40 % (fraction massique);
TM
1) Ludox 50 est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée par
souci de commodité à l'intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de
l'ISO à l’égard de ce produit.
4 © ISO 2020 – Tous droits réservés
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ISO 10872:2020(F)
— tourbe (tourbe décomposée à partir de haute tourbière, non traitée, finement moulue et tamisée
à < 1 mm), 4 % (fraction massique).
Le sédiment sec peut être conservé sans limitation.
Ce sédiment sert de témoin négatif pour les essais sur sédiments.
AVERTISSEMENT — Les sédiments artificiels ayant une teneur en kaolin supérieure à 5 %
(OCDE 218 par exemple) peuvent provoquer des effets négatifs sur la croissance, la fertilité et
la reproduction de C. elegans. Si un sédiment témoin artificiel différent de celui proposé dans
la présente norme est utilisé, la teneur en kaolin doit être inférieure ou égale à 5 % (fraction
massique).
AVERTISSEMENT — Si possible, il est conseillé d’utiliser un sédiment de référence spécifique
du site, en plus du sédiment témoin artificiel; le sédiment de référence doit remplir les critères
suivants: limite de contamination; les propriétés importantes du sédiment doivent être
similaires à celles de l’échantillon soumis à essai (par exemple, distribution granulométrique,
teneur en matière organique).
5.13 Sol témoin
Sol standard St. 2.2, de l’institut LUFA:
— type de sol: sable limoneux;
— carbone organique: (2,0 ± 0,5) % (fraction massique);
— pH (CaCl ): 5,5 ± 0,5;
2
— capacité d’échange cationique: (10,0 ± 0,4) mmol /100 g;
c
NOTE mmol /100 g est synonyme de meq/100 g.
c
— capacité de rétention d’eau: (48,2 ± 5) %;
— teneur en argile: (7,5 ± 2,5) % (fraction massique) de particules < 0,002 mm;
— teneur en limon: (12,5 ± 2,5) % (fraction massique) de particules de 0,002 mm à 0,063 mm;
— teneur en sable: (80,0 ± 5,0) % (fraction massique) de particules de 0,063 mm à 2 mm.
Ce sol sert de témoin négatif pour les essais sur sols.
NOTE LUFA signifie Landwirtschaftliche Untersuchungs- und Forschungsanstalt Speyer.
AVERTISSEMENT — Si les sols soumis à essai contiennent plus de 30 % d’argile (même dans les
sols non contaminés), des effets inhibiteurs sur la croissance et la reproduction de C. elegans
peuvent dépasser le seuil de toxicité. Dans ce cas, un sol de référence ayant une teneur en argile
similaire doit être soumis à essai en complément du sol témoin.
AVERTISSEMENT — Les sols artificiels ayant une teneur en kaolin supérieure à 5 % (OCDE 207 par
exemple) peuvent provoquer des effets négatifs sur la croissance, la fertilité et la reproduction
de C. elegans. Si un sol témoin artificiel différent de celui proposé dans la présente norme est
utilisé, la teneur en kaolin doit être inférieure ou égale à 5 % (fraction massique).
5.14 Chlorure d’hexadécylbenzyldiméthylammonium monohydrate, solution mère (BAC-C16)
Dissoudre 30 mg de BAC-C16 (C H CIN, H O; numéro CAS: 122-18-9) dans 1 000 ml d’eau.
25 46 2
5.15 Glycérol (>98 %; Ph. Eu., anhydre)
© ISO 2020 – Tous droits réservés 5
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ISO 10872:2020(F)
5.16 Formazine: solution d’étalonnage de turbidité 4 000 NTU
6 Appareillage
6.1 Autoclave
6.2 Installations, à température constante à 20 °C et 37 °C, par exemple incubateur ou chambre
thermostatée.
6.3 Spatule de Drigalski, spatule en verre pour répartir les bactéries sur une boîte de gélose.
6.4 Erlenmeyers, d’un volume de 250 ml, par exemple.
6.5 Flacons en plastique, autoclavables et hermétiquement clos, d’un volume de 1,5 ml.
6.6 Gaze filtrante, 5 µm, 10 µm.
6.7 Congélateur, pouvant être maintenu à une température de −20 °C.
6.8 Micropipette (voir Annexe C).
Étirer une pipette Pasteur sur un bec Bunsen pour former un fin capillaire. Raccorder la pipette Pasteur
à une poire à son extrémité la plus épaisse.
6.9 Microscope, grossissement 100x, avec graduation.
6.10 Thermomètre, minimum-maximum.
6.11 Agitateur, pour les Erlenmeyers de 250 ml.
6.12 Microscope stéréoscopique, grossissement de 4x à 20x, à lumière transmise.
6.13 Paillasse propre
6.14 Boîtes de Petri stériles, de 3 cm, 6 cm ou 10 cm de diamètre.
6.15 Spectromètre, capable de fonctionner à une longueur d’onde de 600 nm.
6.16 Agitateur pour tubes à essai
6.17 Balance, lisible à 0,001 g.
6.18 Étuve, à une température d’environ 80 °C.
2 2
6.19 Plaque multi-puits, avec 12 puits, 3,5 cm /puits (sédiment, eau); avec 24 puits, 1,9 cm /puits (sol).
6.20 Tubes à centrifuger, de 10 ml à 15 ml.
6.21 Centrifugeuse à rotor oscillant
6.22 Pipettes à piston, de 10 ml à 100 ml et de 100 ml à 1 000 ml.
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ISO 10872:2020(F)
6.23 Tamis, de 1 mm et 2 mm.
6.24 Agitateur magnétique et barreau aimanté
6.25 pH-mètre
6.26 Boucle d’inoculation
7 Substance de référence
Afin de s’assurer que les conditions d’essai du laboratoire (y compris l’état et la sensibilité des
organismes d’essai exposés) sont adéquates et n’ont pas subi de variation significative, le laboratoire
doit soumettre à essai, en parallèle de chaque essai, une substance de référence en tant que témoin
positif, à une concentration proche de la CE pour le paramètre «croissance». Les paramètres d’essai
50
«fertilité» et «reproduction» ne sont pas analysés lors de l’essai de la substance de référence. Comme
substance de référence, utiliser du chlorure d’hexadécylbenzyldiméthylammonium (BAC-16; 5.14) qui
s’est avéré avoir une incidence sur la croissance de C. elegans. Le témoin positif est soumis à essai dans
l’eau conformément aux instructions relatives aux essais sur substrats aqueux (10.1, 10.2.2, 10.3). À
une concentration de 15 mg/l (CE pour le BAC-C16, 5.14) il convient que l’inhibition de la croissance,
50
comparée au témoin, soit comprise entre 20 % et 80 %.
En outre, la CE de la substance de référence doit être déterminée au moins tous les 12 mois. La CE
50 50
(croissance) dans l’eau doit être comprise entre 8 mg et 22 mg de BAC/l, en utilisant un dispositif de type
CE , comme spécifié dans l’ISO 5667-16. Des solutions mères de BAC aux concentrations de 7,1 mg/l,
x
10,6 mg/l, 16 mg/l, 24 mg/l, 36 mg/l, 54 mg/l et 81 mg/l sont préparées dans l’eau et soumises à essai
conformément aux instructions pour les essais sur substrats aqueux (voir en 10.1, 10.2.2, 10.3).
2)
8 Organismes
8.1 Organisme d’essai
Caenorhabditis elegans (Maupas, 1899) est un nématode libre du sol très répandu qui se nourrit
principalement de bactéries. Les vers adultes mesurent environ 1,0 mm à 1,5 mm de long et sont
hermaphrodites et, dans de rares cas, des mâles (voir Annexe B). Les hermaphrodites se reproduisent
généralement par auto-fertilisation bien qu’ils puissent également être fécondés par des mâles. Après
l’éclosion, C. elegans se développe jusqu’à l’âge adulte en passant par quatre stades juvéniles séparés
par des mues. Dans des conditions de pénurie alimentaire, un stade quiescent, les larves dauer, peut
remplacer le troisième stade larvaire. Le cycle de vie des vers cultivés sur E. coli est d’environ 3 jours
à 20 °C. La biologie de C. elegans a été largement étudiée et, à de nombreux égards, il s’agit
...
Questions, Comments and Discussion
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