ISO 10872:2020

Water and soil quality — Determination of the toxic effect of sediment and soil samples on growth, fertility and reproduction of Caenorhabditis elegans (Nematoda)

This document specifies a method for determining the toxicity of environmental samples on growth, fertility and reproduction of Caenorhabditis elegans. The method applies to contaminated whole freshwater sediment (maximum salinity 5 g/l), soil and waste, as well as to pore water, elutriates and aqueous extracts that were obtained from contaminated sediment, soil and waste.

Qualité de l'eau et du sol — Détermination de l'effet toxique d'échantillons de sédiment et de sol sur la croissance, la fertilité et la reproduction de Caenorhabditis elegans (Nematodes)

Le présent document spécifie une méthode de détermination de la toxicité d'échantillons environnementaux sur la croissance, la fertilité et la reproduction de Caenorhabditis elegans. La méthode s'applique aux sédiments d'eau douce contaminés (salinité maximale de 5 g/l), sols et déchets, ainsi qu'à l'eau interstitielle, aux élutriats et aux extraits aqueux obtenus à partir de sédiments contaminés, sols et déchets.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 28-May-2020
• ICS: 13.060.70 - Examination of biological properties of water
• Technical Committee: ISO/TC 147/SC 5 - Biological methods
• Drafting Committee: ISO/TC 147/SC 5 - Biological methods
• Current Stage: 6060 - International Standard published
• Start Date: 29-May-2020
• Due Date: 08-Aug-2019
• Completion Date: 29-May-2020

Relations

• Revises: ISO 10872:2010 - Water quality — Determination of the toxic effect of sediment and soil samples on growth, fertility and reproduction of Caenorhabditis elegans (Nematoda)
• Effective Date: 23-Apr-2020

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10872
Second edition
2020-05
Water and soil quality —
Determination of the toxic effect
of sediment and soil samples on
growth, fertility and reproduction of
Caenorhabditis elegans (Nematoda)
Qualité de l'eau et du sol — Détermination de l'effet toxique
d'échantillons de sédiment et de sol sur la croissance, la fertilité et la
reproduction de Caenorhabditis elegans (Nematodes)
Reference number
ISO 10872:2020(E)
ISO 2020
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ISO 10872:2020(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2020

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Published in Switzerland
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ISO 10872:2020(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Reagents and media .......................................................................................................................................................................................... 3

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 5

7 Reference substance ......................................................................................................................................................................................... 6

8 Organisms .................................................................................................................................................................................................................. 7

8.1 Test organism ........................................................................................................................................................................................... 7

8.2 Food organism ......................................................................................................................................................................................... 7

9 Stock- and pre-cultures .................................................................................................................................................................................. 7

9.1 Stock cultures ........................................................................................................................................................................................... 7

9.1.1 Caenorhabditis elegans .......................................................................................................................................... 7

9.1.2 Escherichia coli................................................................................................................................................................ 7

9.2 Pre-culture .................................................................................................................................................................................................. 8

10 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 8

10.1 Preparation of food medium ....................................................................................................................................................... 8

10.2 Preparation of test material and controls ........................................................................................................................ 8

10.2.1 Soil ................................................................................................................................................................................................ 8

10.2.2 Sediment ................................................................................................................................................................................. 9

10.2.3 Pore water, elutriate, extract.................................................................................................................................. 9

10.2.4 Solution of reference substance .................. ........................................................................................................ 9

10.3 Test .................................................................................................................................................................................................................10

10.4 Nematode separation .....................................................................................................................................................................10

10.5 Measurements and calculations ............................................................................................................................................10

10.5.1 Recovery ...............................................................................................................................................................................10

10.5.2 Males .......................................................................................................................................................................................10

10.5.3 Growth and fertility ....................................................................................................................................................11

10.5.4 Reproduction ...................................................................................................................................................................11

10.6 Timetable of the test .......................................................................................................................................................................12

11 Validity criteria ...................................................................................................................................................................................................13

12 Expression of results .....................................................................................................................................................................................13

13 Test report ................................................................................................................................................................................................................14

Annex A (informative) Determination of maximal water holding capacity (WHC ) ...................................15

max

Annex B (informative) Figures and photos of adult worms C. elegans ...........................................................................16

Annex C (informative) Micropipette method (10.3) ..........................................................................................................................18

Annex D (informative) Performance data ....................................................................................................................................................19

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................22

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ISO 10872:2020(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso .org/

iso/ foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,

Biological method.

This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 10872:2010), which has been technically

revised. The main changes compared to the previous edition are as follows:

— the title has been changed to achieve a better perception in the field soil toxicity testing;

— for soil testing, the method has been modified in terms of a reduced water content of the test

material;
— cited references and standards have been refreshed;

— information on the control soil and restrictions for tested soils has been added;

— the document has been editorially revised.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
iv © ISO 2020 – All rights reserved
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ISO 10872:2020(E)
Introduction
[1] [2]

Nematodes are one of the most abundant and species-rich metazoans in sediments and soils and

possess key positions in benthic and soil food webs due to the evolution of various feeding types

(bacterial, algal, fungal and plant feeders, omnivores, predators see References [3] and [4]). Moreover,

they are well acknowledged as environmental indicators for assessing the toxicity of chemicals and the

quality of sediments and soils (see References [5], [6], [7], [8] and [9]).

The test organism Caenorhabditis elegans (Maupas, N2 var. Bristol) is a bacterivorous nematode that is

found primarily in microbe-rich, decaying plant material (see Reference [10]) and belongs to the family

of Rhabditidae, frequently found in terrestrial soils and aquatic sediments (see References [11] and

[12]). Moreover, individuals of C. elegans were already found in sediments of polysaprobial fresh-water

[15]

systems (see References [13] and [14]). Due to its easy cultivation and short life cycle , C. elegans has

become a well-studied model organism in biomedical and ecotoxicological research (see References [16],

[17] and [18]).
[19]

The test is designed for measurement of the response to dissolved and particle-bound substances .

It applies to the testing of sediments, soils, waste, pore water, elutriates and aqueous extracts (see

e.g. References [20], [21], [22] and [23]).
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 10872:2020(E)
Water and soil quality — Determination of the toxic effect
of sediment and soil samples on growth, fertility and
reproduction of Caenorhabditis elegans (Nematoda)

WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.

This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its

use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.

IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this document be

carried out by suitably trained staff.
1 Scope

This document specifies a method for determining the toxicity of environmental samples on growth,

fertility and reproduction of Caenorhabditis elegans. The method applies to contaminated whole

freshwater sediment (maximum salinity 5 g/l), soil and waste, as well as to pore water, elutriates and

aqueous extracts that were obtained from contaminated sediment, soil and waste.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples

ISO 7027-2, Water quality — Determination of turbidity — Part 2: Semi-quantitative methods for the

assessment of transparency of waters
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org ./ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
agar plate
Petri dish filled with Nematode Growth Medium (NGM) agar
3.2
aqueous control
water that serves as negative control for tests in aqueous samples
3.3
artificial control sediment
defined artificial sediment
3.4
bacterial stock culture
stock culture of food bacteria
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ISO 10872:2020(E)
3.5
blank replicate

additional replicate that contains no test organism, but is treated in the same way as the other replicates

of a sample
3.6
control

treatment that serves as negative control to which the effect in the respective test material is compared

3.7
control soil
defined standard soil
3.8
dauer larva
developmental stage adopted by C. elegans to endure periods of lack of food
Note 1 to entry: Dauer larvae continue normal development if food is supplied.
3.9
exposed test organisms
individuals of C. elegans that are introduced at the beginning of the test
3.10
food medium
defined aqueous bacterial suspension
3.11
J stage
first of four juvenile stages (J to J ) in the development of C. elegans
1 4
3.12
maximal water holding capacity
WHC
max

maximal amount of water a soil sample is able to take up and keep against gravity

3.13
overnight culture
defined culture of Escherichia coli in Lysogeny Broth (LB)-medium
3.14
starved plate
agar plate (3.1) with dauer larvae
3.15
test material

discrete portion of a contaminated environmental sample or solution of the reference substance

4 Principle

Juvenile organisms of the species C. elegans are exposed to the environmental sample over a period

of 96 h. In the controls, the exposed test organisms are able to complete a whole life cycle within this

period. Toxicity can be quantified by the intensity of the effect as percentage inhibition. A toxic effect

of an environmental sample occurs if the inhibition of growth, fertility or reproduction of C. elegans

in comparison to a control (aqueous control, control sediment or soil) exceeds a certain threshold

value (e.g. as proposed in the following publications: aqueous medium: 10 %, 20 %, 10 % inhibition,

respectively (see Reference [24]); freshwater sediments: 25 %, 20 %, 50 % inhibition, respectively

(see Reference [21]); soil: 10 %, 20 %, 40 % inhibition, respectively (see Reference [20]), and the

performance of toxicity endpoints in the test material is statistically significantly lower compared to

the control performance (p <0,05).
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ISO 10872:2020(E)
5 Reagents and media
Use only reagents of recognized analytical grade.

5.1 Water, distilled or deionized water or water of equivalent purity, conductivity ≤10 µS/cm.

5.2 LB-medium
Dissolve
— 0,5 g of casein peptone;
— 0,25 g of yeast extract;
— 0,5 g of sodium chloride (NaCl);
in 50 ml water in a 250 ml flask and autoclave for 20 min at 121 °C.
5.3 Cholesterol stock solution

Dissolve 500 mg of powdered cholesterol in 100 ml of absolute ethanol (>99 % purity) by stirring and

gentle heating (<50 °C). Replace ethanol lost through evaporation with ethanol.
5.4 Calcium chloride stock solution, 1 mol/l CaCl .
Dissolve 7,35 g of CaCl ∙2H O in 50 ml water and autoclave for 20 min at 121 °C.
2 2
5.5 Magnesium sulfate stock solution, 1 mol/l MgSO .

Dissolve 12,35 g of MgSO ∙7H O in 50 ml water and autoclave for 20 min at 121 °C.

4 2
5.6 Potassium hydroxide, KOH, pellets.
5.7 Potassium phosphate buffer, 1 mol/l KH PO .
2 4

Dissolve 13,6 g of KH PO in 100 ml of water, adjust with KOH (5.6) to pH 6,0 ± 0,2, and autoclave for

2 4
20 min at 121 °C.
5.8 Nematode growth-medium agar (NGM agar)
Dissolve
— 2,5 g of casein peptone;
— 17 g of bacteriological agar;
— 3 g of NaCl;

in 900 ml water in a 1 000 ml flask and autoclave for 20 min at 121 °C. After cooling down to 55 °C, add

the following sterile solutions:
— 1 ml of cholesterol stock solution (see 5.3);
— 1 ml of calcium chloride stock solution (see 5.4);
— 1 ml of magnesium sulfate stock solution (see 5.5);
— 25 ml of potassium phosphate buffer (see 5.7);
and fill up to 1 000 ml with sterile water.
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ISO 10872:2020(E)
Transfer portions of NGM agar (about 20 ml to 25 ml) to sterile Petri dishes.
5.9 M9-medium
Dissolve
— 6 g of Na HPO ;
2 4
— 3 g of KH PO ;
2 4
— 5 g of NaCl;
— 0,25 g of MgSO ∙7H O;
4 2
in 1 000 ml of water in a 1 000 ml flask.
5.10 Bengal Rose stock solution
Add approximately 30 mg of Bengal Rose to 100 ml of water and stir thoroughly.
5.11 Ludox suspension
1) 3

Dilute Ludox TM 50 (colloidal silica; density: 1,4 g/cm ) with water to a density of (1,13 ± 0,005) g/

3 1)

cm [mix approximately 1 part Ludox TM 50 with 2 parts of water and control the density by weighing

1 ml of the suspension on a balance; 1 ml of the suspension weighs (1,13 ± 0,005) g]. For one 12 or 24-

well multidish, approximately 75 ml or 150 ml of Ludox-suspension are required, respectively.

5.12 Artificial control sediment
Mix the following components thoroughly in the given proportions:
— Al O , 20 % mass fraction;
2 3
— CaCO , 1 % mass fraction;
— dolomite (clay), 0,5 % mass fraction;
— Fe O , 4,5 % mass fraction;
2 3

— silica sand (for example: W4, mean particle size: 0,063 mm), 30 % mass fraction;

— silica sand (0,1 mm to 0,4 mm), 40 % mass fraction;

— peat (decomposed peat from a raised bog, untreated; finely ground and <1 mm sieved), 4 % mass

fraction.
The dry sediment is maintainable without restraint.
This sediment serves as negative control for tests with sediments.

WARNING — Artificial sediments with a kaolin content of >5 % mass fraction (e.g. OECD 218) can

cause deleterious effects on growth, fertility and reproduction of C. elegans. If using a different

artificial control sediment than proposed in this standard, the kaolin content shall be ≤5 %

mass fraction.

WARNING — If available, the use of a site-specific reference sediment is advised, additionally

to the artificial control sediment; the reference sediment shall match following criteria: limit

of contamination; important sediment properties shall be similar to the tested sample (e.g.

particle size distribution, organic content).

1) Ludox 50 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the

convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.

4 © ISO 2020 – All rights reserved
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ISO 10872:2020(E)
5.13 Control soil
Standard soil St. 2.2 from LUFA:
— soil type: loamy sand;
— organic carbon: (2,0 ± 0,5) % mass fraction;
— pH (CaCl ): 5,5 ± 0,5;
— cation exchange capacity: (10,0 ± 0,4) mmol /100 g;
NOTE mmol /100 g is synonymous with meq/100 g.
— water holding capacity: (48,2 ± 5) %;
— clay content: (7,5 ± 2,5) % mass fraction particles <0,002 mm;
— silt content: (12,5 ± 2,5) % mass fraction particles 0,002 mm to 0,063 mm;
— sand content: (80,0 ± 5,0) % mass fraction particles 0,063 mm to 2 mm.
This soil serves as negative control for tests with soil.

NOTE LUFA refers to Landwirtschaftliche Untersuchungs- und Forschungsanstalt Speyer.

WARNING — If tested soils contain >30 % clay even in uncontaminated soils, inhibiting effects

on C. elegans’ growth and reproduction might exceed the toxicity threshold. In these cases, a

reference soil with a similar clay content shall be tested additionally to the control soil.

WARNING — Artificial soils with a kaolin content of >5 % mass fraction (e.g. OECD 207) can

cause deleterious effects on growth, fertility and reproduction of C. elegans. If using a different

artificial control soil than proposed in this standard, the kaolin content shall be ≤5 % mass

fraction.
5.14 Benzylcetyldimethylammonium chloride monohydrate (BAC-C16) stock solution
Dissolve 30 mg of BAC-C16 (C H CIN∙H O; CAS No.: 122-18-9) in 1 000 ml of water.
25 46 2
5.15 Glycerol (>98 %; Ph.Eu., water free)
5.16 Formazin: Turbidity 4000 NTU calibration standard
6 Apparatus
6.1 Autoclave.

6.2 Facilities, with constant temperature for 20 °C and 37 °C, for example incubator or temperature-

controlled chamber.
6.3 Drigalski spatula, glass spatula for distributing bacteria on an agar plate.
6.4 Erlenmeyer flasks, for example volume 250 ml.
6.5 Plastic vials, autoclavable and sealed, volume 1,5 ml.
6.6 Filter gauze, 5 µm, 10 µm.
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ISO 10872:2020(E)
6.7 Freezer, capable of maintaining temperature at −20 °C.
6.8 Micropipette (see Annex C).

Draw a Pasteur pipette over a Bunsen burner to a thin capillary. Plug the Pasteur pipette in a suction

cup at the thicker end.
6.9 Microscope, 100-fold magnification, with measurement scale.
6.10 Thermometer, minimum-maximum.
6.11 Shaker, for 250 ml Erlenmeyer flasks.
6.12 Stereo microscope, 4-fold to 20-fold magnification, with transmitted light.
6.13 Clean bench.
6.14 Sterile Petri dishes, of diameters 3 cm, 6 cm or 10 cm.
6.15 Spectrophotometer, capable of operating at wavelength 600 nm.
6.16 Test tube mixer.
6.17 Balance, 0,001 g readability.
6.18 Drying oven, approximately 80 °C.
2 2

6.19 Multidishes, with 12 wells, 3,5 cm /well (sediment, water); with 24 wells, 1,9 cm /well (soil).

6.20 Centrifuge tubes, 10 ml to 15 ml.
6.21 Centrifuge with swing-out rotor.
6.22 Piston pipettes, 10 ml to 100 ml, 100 ml to 1 000 ml.
6.23 Sieves, 1 mm and 2 mm.
6.24 Magnetic stirrer and magnetic stirring bar.
6.25 pH-meter.
6.26 Inoculating loop.
7 Reference substance

To ensure that the laboratory test conditions (including the condition and sensitivity of the exposed

test organisms) are adequate and have not changed significantly, the laboratory shall test a reference

substance as a positive control in parallel with each test, using one concentration near the EC for

growth. The test parameters “fertility” and “reproduction” are not analysed when testing the reference

substance. Use benzylcetyldimethylammonium chloride monohydrate (BAC-C16; 5.14), which has been

shown to affect growth of C. elegans, as reference substance. The positive control is tested in water

according to the instructions for testing aqueous substrates (10.1, 10.2.2, 10.3). The inhibition of

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ISO 10872:2020(E)

growth at a concentration of 15 mg/l (EC for BAC-C16, 5.14) compared to the control should be in the

range of 20 % to 80 %.

Additionally, the EC of the reference substance shall be determined at least every 12 months. The

EC (growth) in water shall be in the range of 8 mg to 22 mg BAC/l using an EC design as specified

50 x

in ISO 5667-16. Stock solutions of BAC in the concentrations of 7,1 mg/l, 10,6 mg/l, 16 mg/l, 24 mg/l,

36 mg/l, 54 mg/l and 81 mg/l are prepared in water and tested according to the instructions for testing

aqueous substrates (see 10.1, 10.2.2, 10.3).
8 Organisms
8.1 Test organism

Caenorhabditis elegans (Maupas, 1899) is a widespread, free-living soil nematode that feeds primarily

on bacteria. Adult worms are about 1,0 mm to 1,5 mm in length and can be distinguished into

hermaphrodites and rarely occurring males (see Annex B). Hermaphrodites usually reproduce by

self-fertilization although they can also be fertilized by males. After hatching, C. elegans develops to

the adult stage through four juvenile stages separated by moults. Under starvation conditions, a

developmentally arrested stage, the dauer larva, can be formed as an alternative third larval stage. The

life cycle for worms grown on E. coli is about 3 d at 20 °C. The biology of C. elegans has been extensively

studied and, in many respects, it is the most thoroughly characterized animal. The “wild type” strain

N2 is used as test organism.
8.2 Food organism

As food organism for C. elegans, the bacterium E. coli (OP50; uracil-deficient strain) is used.

9 Stock- and pre-cultures
9.1 Stock cultures
9.1.1 Caenorhabditis elegans

C. elegans is maintained on agar plates (3.1) with a bacterial lawn (E. coli OP 50; 8.2) at (20 ± 2) °C.

When bacteria are used up, C. elegans forms dauer larvae (3.8) due to lack of food. These starved plates

(3.14) serve as stock cultures for C. elegans that should be replenished every two months. If too many

males occur (≥10 % in tests), new stock cultures should be ordered.
9.1.2 Escherichia coli

Inoculate under sterile conditions 50 ml of LB-medium (5.2) in a 250 ml Erlenmeyer flask (6.4) with

E. coli from a bacterial lawn on agar [as sent by the supplier] using an inoculating loop (6.25) and

incubate for 17 h at (37 ± 2) °C on a shaker (6.11) (overnight culture). Transfer 200 µl glycerol (5.15)

into each 1,5 ml plastic vial (6.5) and sterilize in an autoclave (6.1) at 121 °C for 20 min. Add under

sterile conditions 800 µl of the E. coli overnight culture (3.13), vortex and freeze immediately at −20 °C.

Bacterial stock cultures are thawed only once and discarded after use. Bacterial stock cultures should

be replenished after six months.

2) Caenorhabditis elegans and Escherichia coli can for example be supplied by: Caenorhabditis Genetic Center,

Theresa Stiernagle, University of Minnesota, 6-160 Jackson Hall, 321 Church Street S.E., Minneapolis, MN 55455,

E-mail: cgc@umn .edu, http:// www .cbs .umn .edu/ CGC/ . This information is given for the convenience of users of this

document and does not constitute an endorsement by ISO of these products.
© ISO 2020 – All rights reserved 7
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ISO 10872:2020(E)
9.2 Pre-culture

Inoculate under sterile conditions an agar plate (3.1) with approximately 200 µl of an overnight

culture (3.13) of E. coli, distribute equally using a Drigalski spatula (6.3) and incubate for at least 8 h

at (37 ± 2) °C. Cut two or three small pieces (approximately 1 cm ) out of a starved plate (3.14) and

transfer them under sterile conditions to an agar plate with a fresh lawn of E. coli. After about 3 d at

20 °C, a lot of gravid hermaphrodites as well as juveniles of stages 1 and 2 are found on the pl

...

NORME ISO
INTERNATIONALE 10872
Deuxième édition
2020-05
Qualité de l'eau et du sol —
Détermination de l'effet toxique
d'échantillons de sédiment et de
sol sur la croissance, la fertilité et
la reproduction de Caenorhabditis
elegans (Nematodes)
Water and soil quality — Determination of the toxic effect of
sediment and soil samples on growth, fertility and reproduction of
Caenorhabditis elegans (Nematoda)
Numéro de référence
ISO 10872:2020(F)
ISO 2020
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ISO 10872:2020(F)
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être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d'application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Réactifs et milieux ............................................................................................................................................................................................... 3

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 6

7 Substance de référence .................................................................................................................................................................................. 7

8 Organismes ................................................................................................................................................................................................................. 7

8.1 Organisme d’essai ................................................................................................................................................................................. 7

8.2 Source nutritive ...................................................................................................................................................................................... 7

9 Cultures mères et pré-cultures .............................................................................................................................................................. 8

9.1 Cultures mères ........................................................................................................................................................................................ 8

9.1.1 Caenorhabditis elegans .......................................................................................................................................... 8

9.1.2 Escherichia coli................................................................................................................................................................ 8

9.2 Pré-culture .................................................................................................................................................................................................. 8

10 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 8

10.1 Préparation du milieu nutritif.................................................................................................................................................... 8

10.2 Préparation du matériau d’essai et des témoins ....................................................................................................... 9

10.2.1 Sol ................................................................................................................................................................................................. 9

10.2.2 Sédiment ................................................................................................................................................................................. 9

10.2.3 Eau interstitielle, élutriat, extrait ...................................................................................................................10

10.2.4 Solution de substance de référence ..............................................................................................................10

10.3 Essai ...............................................................................................................................................................................................................10

10.4 Séparation des nématodes .........................................................................................................................................................10

10.5 Mesurages et calculs ........................................................................................................................................................................11

10.5.1 Taux de récupération ................................................................................................................................................11

10.5.2 Mâles .......................................................................................................................................................................................11

10.5.3 Croissance et fertilité ................................................................................................................................................11

10.5.4 Reproduction ...................................................................................................................................................................12

10.6 Planification de l’essai ...................................................................................................................................................................13

11 Critères de validité ..........................................................................................................................................................................................13

12 Expression des résultats............................................................................................................................................................................14

13 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................14

Annexe A (informative) Détermination de la capacité maximale de rétention d’eau (CRE ) ...........16

max

Annexe B (informative) Illustrations et photos de vers adultes C. elegans ................................................................17

Annexe C (informative) Méthode micropipette (10.3) ....................................................................................................................19

Annexe D (informative) Données relatives à la performance..................................................................................................20

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................24

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ISO 10872:2020(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.

L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion

de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/ iso/ fr/ avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité

SC 5, Méthodes biologiques.

Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 10872:2010), qui a fait l’objet d’une

révision technique. Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivantes:

— modification du titre afin d’atteindre une meilleure perception dans le domaine de la toxicité du sol;

— pour les essais sur sols, modification de la méthode en termes de réduction de la teneur en eau du

matériau d’essai;
— réactualisation des références et normes citées;

— ajout d’informations sur le sol témoin et de limitations applicables aux sols soumis à essai;

— révision éditoriale du document.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
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ISO 10872:2020(F)
Introduction

Les nématodes comptent parmi les métazoaires les plus abondants et les plus riches en espèces dans

[1] [2]

les sédiments et les sols et occupent des positions clés dans les réseaux trophiques benthiques

et les réseaux trophiques terrestres, en raison du développement des différents types d’alimentation

(bactérivores, alguivores, fongivores et herbivores, omnivores, prédateurs, voir Références [3] et [4]).

De plus, ils sont tous reconnus comme des indicateurs environnementaux pour évaluer la toxicité des

produits chimiques et la qualité des sédiments et des sols (voir Références [5], [6], [7], [8] et [9]).

L’organisme d’essai Caenorhabditis elegans (Maupas, N2 var. Bristol) est un nématode bactérivore que

l’on trouve principalement dans les matières végétales en décomposition riches en microbes (voir

Référence [10]) et appartient à la famille des Rhabditidae, souvent présents dans les sols terrestres

et les sédiments aquatiques (voir Références [11] et [12]). De plus, des individus de C. elegans ont déjà

être trouvés dans les sédiments de systèmes d’eau douce polysaprobes (voir Références [13] et [14]). En

[15]

raison de sa facilité de culture et de son cycle de vie court, C. elegans est devenu un organisme modèle

bien étudié dans le domaine de la recherche biomédicale et écotoxicologique (voir Références [16], [17]

et [18]).
[19]

L’essai est conçu pour mesurer la réponse aux substances dissoutes et liées à des particules. Il

s’applique aux sédiments, aux sols, aux déchets, à l’eau interstitielle, aux élutriats et aux extraits aqueux

(voir, par exemple, Références [20], [21], [22] et [23]).
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NORME INTERNATIONALE ISO 10872:2020(F)
Qualité de l'eau et du sol — Détermination de l'effet
toxique d'échantillons de sédiment et de sol sur la
croissance, la fertilité et la reproduction de Caenorhabditis
elegans (Nematodes)

AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les

pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter de tous les

problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur

d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité.

IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément au présent

document soient effectués par du personnel ayant suivi une formation appropriée.
1 Domaine d'application

Le présent document spécifie une méthode de détermination de la toxicité d’échantillons

environnementaux sur la croissance, la fertilité et la reproduction de Caenorhabditis elegans. La méthode

s’applique aux sédiments d’eau douce contaminés (salinité maximale de 5 g/l), sols et déchets, ainsi qu’à

l’eau interstitielle, aux élutriats et aux extraits aqueux obtenus à partir de sédiments contaminés, sols

et déchets.
2 Références normatives

Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des

exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 5667-16, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques

des échantillons

ISO 7027-2, Qualité de l'eau — Détermination de la turbidité — Partie 2: Méthodes semi-quantitatives pour

l'évaluation de la transparence des eaux
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org ./ obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
3.1
boîte de gélose
boîte de Petri remplie de gélose de croissance des nématodes (NGM)
3.2
témoin aqueux
eau servant de témoin négatif pour les essais sur échantillons aqueux
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ISO 10872:2020(F)
3.3
sédiment témoin artificiel
sédiment artificiel défini
3.4
culture mère bactérienne
culture mère de bactéries utilisée comme nourriture
3.5
blanc

réplicat supplémentaire ne contenant pas d’organisme d’essai mais traité de la même façon que les

autres réplicats d’un échantillon
3.6
témoin

traitement servant de témoin négatif auquel est comparé l’effet sur le matériau d’essai correspondant

3.7
sol témoin
sol standard défini
3.8
larve dauer

stade de développement adopté par C. elegans pour supporter des périodes de pénurie alimentaire

Note 1 à l'article: à l’article Les larves dauer poursuivent leur développement normal en cas d’apport de

nourriture.
3.9
organismes d’essai exposés
individus de C. elegans introduits au début de l’essai
3.10
milieu nutritif
suspension bactérienne aqueuse définie
3.11
stade J

premier des quatre stades juvéniles (J à J ) au cours du développement de C. elegans

1 4
3.12
capacité maximale de rétention d’eau
CRE
max

quantité maximale d’eau qu’un échantillon de sol est capable d’absorber et de retenir malgré la gravité

3.13
culture nocturne
culture définie d’Escherichia coli dans du milieu Bouillon de Lysogénie (LB)
3.14
boîte sans nourriture
boîte de gélose (3.1) avec des larves dauer
3.15
matériau d’essai

portion discrète d’un échantillon environnemental contaminé ou solution de la substance de référence

4 Principe

Les organismes juvéniles de l’espèce C. elegans sont exposés à l’échantillon environnemental pendant

une période de 96 h. Dans les témoins, les organismes d’essai exposés peuvent accomplir un cycle de

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vie complet au cours de cette période. La toxicité peut être quantifiée par l’intensité de l’effet sous la

forme d’un pourcentage d’inhibition. Un effet toxique de l’échantillon environnemental est observé

si l’inhibition de la croissance, de la fertilité ou de la reproduction de C. elegans comparée au témoin

(témoin aqueux, sédiment ou sol témoin) dépasse une certaine valeur seuil (par exemple, comme

proposé dans les publications suivantes: milieu aqueux: 10 %, 20 %, 10 % d’inhibition, respectivement

(voir Référence [24]); sédiments d’eau douce: 25 %, 20 %, 50 % d’inhibition, respectivement (voir

Référence [21]); sol: 10 %, 20 %, 40 % d’inhibition, respectivement (voir Référence [20]), et le résultat

des critères de toxicité dans le matériau d’essai est statistiquement significativement moins élevé que

celui des témoins (p < 0,05).
5 Réactifs et milieux
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.

5.1 Eau, distillée ou déionisée ou eau d’une pureté équivalente, conductivité ≤ 10 µS/cm.

5.2 Milieu LB
Dissoudre
— 0,5 g de peptone de caséine;
— 0,25 g d’extrait de levure;
— 0,5 g de chlorure de sodium (NaCl);
dans 50 ml d’eau dans une fiole de 250 ml et autoclaver pendant 20 min à 121 °C.
5.3 Solution mère de cholestérol

Dissoudre 500 mg de cholestérol en poudre dans 100 ml d’éthanol absolu (pureté > 99 %) en agitant et

en chauffant légèrement (< 50 °C). Remplacer l’éthanol perdu par évaporation.
5.4 Solution mère de chlorure de calcium, 1 mol/l CaCl

Dissoudre 7,35 g de CaCl , 2H O dans 50 ml d’eau et autoclaver pendant 20 min à 121 °C.

2 2
5.5 Solution mère de sulfate de magnésium, 1 mol/l MgSO

Dissoudre 12,35 g de MgSO ∙7H O dans 50 ml d’eau et autoclaver pendant 20 min à 121 °C.

4 2
5.6 Hydroxyde de potassium, KOH, pastilles.
5.7 Solution tampon de phosphate de potassium, 1 mol/l KH PO
2 4

Dissoudre 13,6 g de KH PO dans 100 ml d’eau, ajuster le pH à 6,0 ± 0,2 avec du KOH (5.6) et autoclaver

2 4
pendant 20 min à 121 °C.
5.8 Milieu gélosé de croissance des nématodes (gélose NGM)
Dissoudre
— 2,5 g de peptone de caséine;
— 17 g de gélose bactériologique;
— 3 g de NaCl;
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dans 900 ml d’eau dans une fiole de 1 000 ml et autoclaver pendant 20 min à 121 °C. Après

refroidissement à 55 °C, ajouter les solutions stériles suivantes:
— 1 ml de solution mère de cholestérol (voir en 5.3);
— 1 ml de solution mère de chlorure de calcium (voir en 5.4);
— 1 ml de solution mère de sulfate de magnésium (voir en 5.5);
— 25 ml de solution tampon de phosphate de potassium (voir en 5.7);
et compléter à 1 000 ml avec de l’eau stérile.

Transférer des portions de gélose NGM (20 ml à 25 ml environ) dans des boîtes de Petri stériles.

5.9 Milieu M9
Dissoudre
— 6 g de Na HPO ;
2 4
— 3 g de KH PO ;
2 4
— 5 g de NaCl;
— 0,25 g de MgSO , 7H O;
4 2
dans 1 000 ml d’eau dans une fiole de 1 000 ml.
5.10 Solution mère de rose Bengale
Ajouter environ 30 mg de rose Bengale à 100 ml d’eau et agiter soigneusement.
5.11 Suspension de Ludox
1) 3

Diluer du Ludox TM 50 (silice colloïdale; masse volumique: 1,4 g/cm ) avec de l’eau, jusqu’à une masse

3 1)

volumique de (1,13 ± 0,005) g/cm [mélanger environ 1 part de Ludox TM 50 avec 2 parts d’eau et

contrôler la masse volumique en pesant 1 ml de la suspension sur une balance; 1 ml de la suspension

pèse (1,13 ± 0,005) g]. Pour une plaque multi-puits de 12 ou 24 puits, environ 75 ml ou 150 ml de

suspension de Ludox sont respectivement nécessaires.
5.12 Sédiment témoin artificiel
Mélanger soigneusement les composés suivants dans les proportions indiquées:
— Al O , 20 % (fraction massique);
2 3
— CaCO , 1 % (fraction massique);
— dolomite (argile), 0,5 % (fraction massique);
— Fe O , 4,5 % (fraction massique);
2 3

— sable de silice (par exemple: W4, granulométrie moyenne: 0,063 mm), 30 % (fraction massique);

— sable de silice (de 0,1 mm à 0,4 mm), 40 % (fraction massique);

1) Ludox 50 est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée par

souci de commodité à l'intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de

l'ISO à l’égard de ce produit.
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ISO 10872:2020(F)

— tourbe (tourbe décomposée à partir de haute tourbière, non traitée, finement moulue et tamisée

à < 1 mm), 4 % (fraction massique).
Le sédiment sec peut être conservé sans limitation.
Ce sédiment sert de témoin négatif pour les essais sur sédiments.

AVERTISSEMENT — Les sédiments artificiels ayant une teneur en kaolin supérieure à 5 %

(OCDE 218 par exemple) peuvent provoquer des effets négatifs sur la croissance, la fertilité et

la reproduction de C. elegans. Si un sédiment témoin artificiel différent de celui proposé dans

la présente norme est utilisé, la teneur en kaolin doit être inférieure ou égale à 5 % (fraction

massique).

AVERTISSEMENT — Si possible, il est conseillé d’utiliser un sédiment de référence spécifique

du site, en plus du sédiment témoin artificiel; le sédiment de référence doit remplir les critères

suivants: limite de contamination; les propriétés importantes du sédiment doivent être

similaires à celles de l’échantillon soumis à essai (par exemple, distribution granulométrique,

teneur en matière organique).
5.13 Sol témoin
Sol standard St. 2.2, de l’institut LUFA:
— type de sol: sable limoneux;
— carbone organique: (2,0 ± 0,5) % (fraction massique);
— pH (CaCl ): 5,5 ± 0,5;
— capacité d’échange cationique: (10,0 ± 0,4) mmol /100 g;
NOTE mmol /100 g est synonyme de meq/100 g.
— capacité de rétention d’eau: (48,2 ± 5) %;
— teneur en argile: (7,5 ± 2,5) % (fraction massique) de particules < 0,002 mm;

— teneur en limon: (12,5 ± 2,5) % (fraction massique) de particules de 0,002 mm à 0,063 mm;

— teneur en sable: (80,0 ± 5,0) % (fraction massique) de particules de 0,063 mm à 2 mm.

Ce sol sert de témoin négatif pour les essais sur sols.

NOTE LUFA signifie Landwirtschaftliche Untersuchungs- und Forschungsanstalt Speyer.

AVERTISSEMENT — Si les sols soumis à essai contiennent plus de 30 % d’argile (même dans les

sols non contaminés), des effets inhibiteurs sur la croissance et la reproduction de C. elegans

peuvent dépasser le seuil de toxicité. Dans ce cas, un sol de référence ayant une teneur en argile

similaire doit être soumis à essai en complément du sol témoin.

AVERTISSEMENT — Les sols artificiels ayant une teneur en kaolin supérieure à 5 % (OCDE 207 par

exemple) peuvent provoquer des effets négatifs sur la croissance, la fertilité et la reproduction

de C. elegans. Si un sol témoin artificiel différent de celui proposé dans la présente norme est

utilisé, la teneur en kaolin doit être inférieure ou égale à 5 % (fraction massique).

5.14 Chlorure d’hexadécylbenzyldiméthylammonium monohydrate, solution mère (BAC-C16)

Dissoudre 30 mg de BAC-C16 (C H CIN, H O; numéro CAS: 122-18-9) dans 1 000 ml d’eau.

25 46 2
5.15 Glycérol (>98 %; Ph. Eu., anhydre)
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5.16 Formazine: solution d’étalonnage de turbidité 4 000 NTU
6 Appareillage
6.1 Autoclave

6.2 Installations, à température constante à 20 °C et 37 °C, par exemple incubateur ou chambre

thermostatée.

6.3 Spatule de Drigalski, spatule en verre pour répartir les bactéries sur une boîte de gélose.

6.4 Erlenmeyers, d’un volume de 250 ml, par exemple.

6.5 Flacons en plastique, autoclavables et hermétiquement clos, d’un volume de 1,5 ml.

6.6 Gaze filtrante, 5 µm, 10 µm.
6.7 Congélateur, pouvant être maintenu à une température de −20 °C.
6.8 Micropipette (voir Annexe C).

Étirer une pipette Pasteur sur un bec Bunsen pour former un fin capillaire. Raccorder la pipette Pasteur

à une poire à son extrémité la plus épaisse.
6.9 Microscope, grossissement 100x, avec graduation.
6.10 Thermomètre, minimum-maximum.
6.11 Agitateur, pour les Erlenmeyers de 250 ml.
6.12 Microscope stéréoscopique, grossissement de 4x à 20x, à lumière transmise.
6.13 Paillasse propre
6.14 Boîtes de Petri stériles, de 3 cm, 6 cm ou 10 cm de diamètre.
6.15 Spectromètre, capable de fonctionner à une longueur d’onde de 600 nm.
6.16 Agitateur pour tubes à essai
6.17 Balance, lisible à 0,001 g.
6.18 Étuve, à une température d’environ 80 °C.
2 2

6.19 Plaque multi-puits, avec 12 puits, 3,5 cm /puits (sédiment, eau); avec 24 puits, 1,9 cm /puits (sol).

6.20 Tubes à centrifuger, de 10 ml à 15 ml.
6.21 Centrifugeuse à rotor oscillant
6.22 Pipettes à piston, de 10 ml à 100 ml et de 100 ml à 1 000 ml.
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6.23 Tamis, de 1 mm et 2 mm.
6.24 Agitateur magnétique et barreau aimanté
6.25 pH-mètre
6.26 Boucle d’inoculation
7 Substance de référence

Afin de s’assurer que les conditions d’essai du laboratoire (y compris l’état et la sensibilité des

organismes d’essai exposés) sont adéquates et n’ont pas subi de variation significative, le laboratoire

doit soumettre à essai, en parallèle de chaque essai, une substance de référence en tant que témoin

positif, à une concentration proche de la CE pour le paramètre «croissance». Les paramètres d’essai

«fertilité» et «reproduction» ne sont pas analysés lors de l’essai de la substance de référence. Comme

substance de référence, utiliser du chlorure d’hexadécylbenzyldiméthylammonium (BAC-16; 5.14) qui

s’est avéré avoir une incidence sur la croissance de C. elegans. Le témoin positif est soumis à essai dans

l’eau conformément aux instructions relatives aux essais sur substrats aqueux (10.1, 10.2.2, 10.3). À

une concentration de 15 mg/l (CE pour le BAC-C16, 5.14) il convient que l’inhibition de la croissance,

comparée au témoin, soit comprise entre 20 % et 80 %.

En outre, la CE de la substance de référence doit être déterminée au moins tous les 12 mois. La CE

50 50

(croissance) dans l’eau doit être comprise entre 8 mg et 22 mg de BAC/l, en utilisant un dispositif de type

CE , comme spécifié dans l’ISO 5667-16. Des solutions mères de BAC aux concentrations de 7,1 mg/l,

10,6 mg/l, 16 mg/l, 24 mg/l, 36 mg/l, 54 mg/l et 81 mg/l sont préparées dans l’eau et soumises à essai

conformément aux instructions pour les essais sur substrats aqueux (voir en 10.1, 10.2.2, 10.3).

8 Organismes
8.1 Organisme d’essai

Caenorhabditis elegans (Maupas, 1899) est un nématode libre du sol très répandu qui se nourrit

principalement de bactéries. Les vers adultes mesurent environ 1,0 mm à 1,5 mm de long et sont

hermaphrodites et, dans de rares cas, des mâles (voir Annexe B). Les hermaphrodites se reproduisent

généralement par auto-fertilisation bien qu’ils puissent également être fécondés par des mâles. Après

l’éclosion, C. elegans se développe jusqu’à l’âge adulte en passant par quatre stades juvéniles séparés

par des mues. Dans des conditions de pénurie alimentaire, un stade quiescent, les larves dauer, peut

remplacer le troisième stade larvaire. Le cycle de vie des vers cultivés sur E. coli est d’environ 3 jours

à 20 °C. La biologie de C. elegans a été largement étudiée et, à de nombreux égards, il s’agit

...