ISO/TS 21569-2:2012

Horizontal methods for molecular biomarker analysis - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Part 2: Construct-specific real-time PCR method for detection of event FP967 in linseed and linseed products

This method describes a procedure for the detection of a DNA sequence present in a genetically modified linseed (Linum usitatissimum) line (event FP967, also named as "CDC Triffid"). For this purpose, extracted DNA is used in a real-time PCR and the genetic modification (GM) is specifically detected by amplification of a 105 bp DNA sequence representing the transition between the nopalin synthase gene terminator (Tnos) from Agrobacterium tumefaciens and the dihydrofolate reductase gene (dfrA1) from a Class 1 integron of Escherichia coli. The method described is applicable for the analysis of DNA extracted from foodstuffs. It may also be suitable for the analysis of DNA extracted from other products such as feedstuffs and seeds. The application of this method requires the extraction of an adequate amount of amplifiable DNA from the relevant matrix for the purpose of analysis.

Méthodes horizontales d'analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés — Partie 2: Méthode PCR en temps réel spécifique de la construction pour la détection d'un évènement FP967 dans les graines de lin et les produits à base de graines de lin

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 02-Sep-2012
• Withdrawal Date: 02-Sep-2012
• ICS: 67.050 - General methods of tests and analysis for food products
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 16 - Horizontal methods for molecular biomarker analysis
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 16 - Horizontal methods for molecular biomarker analysis
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Start Date: 05-Jul-2021
• Completion Date: 13-Dec-2025

Relations

• Consolidated By: ISO 14918:2018 - Thermal spraying - Qualification testing of thermal sprayers
• Effective Date: 06-Jun-2022
• Revised: ISO/TS 21569-2:2021 - Molecular biomarker analysis - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Part 2: Construct-specific real-time PCR method for detection of event FP967 in linseed and linseed products
• Effective Date: 23-Apr-2020

Standards Content (Sample)

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 21569-2
First edition
2012-09-01
Horizontal methods for molecular
biomarker analysis — Methods
of analysis for the detection of
genetically modified organisms and
derived products —
Part 2:
Construct-specific real-time PCR
method for detection of event FP967
in linseed and linseed products
Méthodes horizontales d’analyse moléculaire de biomarqueurs —
Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés —
Partie 2: Méthode PCR en temps réel spécifique de la construction
pour la détection d’un évènement FP967 dans les graines de lin et les
produits à base de graines de lin
Reference number
©
ISO 2012
© ISO 2012
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any
means, electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the
address below or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2012 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents and materials . 2
5.1 PCR reagents . 2
6 Apparatus . 3
6.1 General . 3
6.2 PCR device . 3
7 Sampling . 3
8 Procedure. 3
8.1 Test sample preparation . 3
8.2 Preparation of the DNA extracts . 3
8.3 DNA extraction . 3
8.4 PCR setup . 3
8.5 Temperature .
time programme . 4
9 Accept/reject criteria . 4
9.1 General . 4
9.2 Identification . 5
10 Validation status and performance criteria . 5
10.1 Robustness of the method . 5
10.2 Intralaboratory trial . 5
10.3 Collaborative trial . 5
10.4 Sensitivity . 7
10.5 Specificity . 7
11 Test report . 8
Bibliography . 9
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International
Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies
casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a
technical committee may decide to publish other types of document:
— an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) represents an agreement between technical
experts in an ISO working group and is accepted for publication if it is approved by more than 50 %
of the members of the parent committee casting a vote;
— an ISO Technical Specification (ISO/TS) represents an agreement between the members of a
technical committee and is accepted for publication if it is approved by 2/3 of the members of the
committee casting a vote.
An ISO/PAS or ISO/TS is reviewed after three years in order to decide whether it will be confirmed for
a further three years, revised to become an International Standard, or withdrawn. If the ISO/PAS or
ISO/TS is confirmed, it is reviewed again after a further three years, at which time it must either be
transformed into an International Standard or be withdrawn.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 21569-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,
Horizontal methods for molecular biomarker analysis.
ISO/TS 21569 consists of the following parts, under the general title Horizontal methods for molecular
biomarker analysis — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products:
— Part 2: Construct-specific real-time PCR method for detection of event FP967 in linseed and linseed products
iv © ISO 2012 – All rights reserved

TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 21569-2:2012(E)
Horizontal methods for molecular biomarker analysis —
Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products —
Part 2:
Construct-specific real-time PCR method for detection of
event FP967 in linseed and linseed products
1 Scope
This method describes a procedure for the detection of a DNA sequence present in a genetically
modified linseed (Linum usitatissimum) line (event FP967, also named as “CDC Triffid”). For this purpose,
extracted DNA is used in a real-time PCR and the genetic modification (GM) is specifically detected by
amplification of a 105 bp DNA sequence representing the transition between the nopalin synthase gene
terminator (Tnos) from Agrobacterium tumefaciens and the dihydrofolate reductase gene (dfrA1) from a
Class 1 integron of Escherichia coli.
The method described is applicable for the analysis of DNA extracted from foodstuffs. It may also
be suitable for the analysis of DNA extracted from other products such as feedstuffs and seeds. The
application of this method requires the extraction of an adequate amount of amplifiable DNA from the
relevant matrix for the purpose of analysis.
2 Normative references
ISO 21569, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products — Qualitative nucleic acid based methods
ISO 21571:2005, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products — Nucleic acid extraction
ISO 24276, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products — General requirements and definitions
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 24276 apply.
4 Principle
DNA is extracted from the test sample applying a suitable method. The DNA analysis consists of two parts:
a) Verification of the amount, quality and amplifiability of the extracted DNA, e.g. by means of a target
taxon specific real-time PCR with primers amplifying a 68 bp long fragment from the linseed-specific
(Linum usitatissimum) stearoyl-acyl carrier protein desaturase 2 gene (SAD) (Reference [1]).
b) Detection of the Tnos-dfr construct in a real-time PCR (Reference [1]).
5 Reagents and materials
Chemicals of recognized analytical grade, appropriate for molecular biology shall be used, as a rule. The
water used shall be double distilled or of an adequate quality. Unless stated otherwise, solutions should
be prepared by dissolving the corresponding reagents in water and autoclaved. For all operations in
which gloves are used, it should be ensured that these are powder-free. The use of aerosol-protected
pipette tips serves as protection against cross-contamination.
5.1 PCR reagents
5.1.1 Thermostable DNA polymerase (for hot-start PCR).
5.1.2 PCR buffer solution (contains magnesium chloride and deoxyribonucleoside triphosphate dATP,
dCTP, dGTP and dUTP).
Ready-to-use reagent mixtures or individual components can be used. Reagents and polymerases which
lead to equal or better results may also be used.
5.1.3 Oligonucleotides (see Table 1).
Table 1 — Oligonucleotides
Final concentration
Name DNA sequence of the oligonucleotide
in the PCR
Tnos-dfr construct as the target sequence (Reference [1]):
NOST-Spec FW 5’-AgC gCg CAA ACT Agg ATA AA-3’ 800 nmol/l
NOST-Spec RV 5’-ACC TTC Cgg CTC gAT gTC TA-3’ 800 nmol/l
a
NOST-Spec Probe 5’-(FAM)-CgC gCg Cgg TgT CAT CTA Tg-(BHQ)-3’ 100 nmol/l
a
FAM: 6-Carboxyfluorescein, BHQ: black hole quencher.
NOTE Equivalent reporter dyes and/or quencher dyes can be used for the probe if they can be shown to yield
similar or better results.
5.1.4 Standard DNA for calibration
A standard DNA solution of a known concentration (ng/µl) is used to calculate the copy numbers of the
Tnos-dfr target sequence.
When using genomic linseed DNA as the standard DNA, the number of haploid genome equivalents per
microlitre, n , shall be calculated on the basis of the molecular mass of the linseed haploid genome
hgEq
which is approximately 0,7 pg (Reference [2]) and by applying Equation (1):
[DNA]×1000
n = (1)
hgEq
m
hg
where
[DNA] is the DNA concentration in nanograms per microlitre;
m is the haploid genome mass, in picograms.
hg
In the collaborative trial, a plasmid was used as standard DNA which contains a copy of the 105 bp Tnos-dfr
fragment and the 68 bp large SAD gene fragment, respectively. Because the exact number of integrations
of the Tnos-dfr construct in event FP967 in linseed is not known at the time of the specification of this
document, the calculated GM-content only represents an estimation which is based on the assumption
that the target sequence is present as a single copy per haploid genome.
2 © ISO 2012 – All rights reserved

6 Apparatus
6.1 General
Regarding the apparatus and materials, see ISO 21569. In addition to the usual laboratory equipment
the following equipment is required.
6.2 PCR device
Real-time PCR device, suitable for the excitation of fluorescent molecules and the detection of fluorescence
signals generated during PCR.
7 Sampling
All samples shall be identified unambiguously.
8 Procedure
8.1 Test sample preparation
It should be ensured that the test sample used for DNA extraction is representative of the laboratory
sample, e.g. by grinding or homogenizing the samples. Take into consideration the measures and
operational steps specified in ISO 21571 and ISO 24276.
8.2 Preparation of the DNA extracts
Concerning the preparation of DNA from the test sample, the general instructions and measures
described in ISO 21571 should be followed. It is recommended that one of the DNA extraction methods
described in ISO 21571:2005, Annex A be chosen.
8.3 DNA extraction
It is recommended that the DNA extraction be performed by means of the CTAB method with a test
portion of 1 g of the homogenized sample (see ISO 21571:2005, A.3.1).
Due to problems of purity, an additional purification step (gel filtration, e.g. by means of micro spin
columns) may be necessary.
As long as comparability is ensured, other extraction and purification methods (e.g. kit systems) can be
applied, using lower test portions, if necessary (Reference [1]).
8.4 PCR setup
The method is described for a total volume of 25 μl per PCR. The reagents given in Table 2 should be used.
Reagents are completely thawed at room temperature and should be briefly centrifuged before use.
Each reagent should be carefully mixed immediat
...

ТЕХНИЧЕСКИЕ ISO/TS
УСЛОВИЯ 21569-2
Первое издание
2012-09-01
Горизонтальные методы
молекулярного анализа с применением
биомаркеров. Методы анализа для
обнаружения генетически
модифицированных организмов и
полученных из них продуктов.
Часть 2.
Метод PCR, специфичный для
определения генетической
конструкции в реальном времени, для
обнаружения события FP967 в льне и
продуктах из него
Horizontal methods for molecular biomarker analysis — Methods of
analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products —
Part 2: Construct-specific real-time PCR method for detection of event
FP967 in linseed and linseed products

Ответственность за подготовку русской версии несѐт GOST R

(Российская Федерация) в соответствии со статьѐй 18.1 Устава ISO

Ссылочный номер
©
ISO 2012
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или смотреть на экране, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на установку интегрированных шрифтов в компьютере, на котором ведется редактирование. В случае загрузки
настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение лицензионных условий
фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe – торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованным для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General Info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже.

ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ

Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO, которое должно быть получено после запроса о разрешении, направленного по
адресу, приведенному ниже, или в комитет-член ISO в стране запрашивающей стороны.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright @ iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2012 – Все права сохраняются

Содержание Страница
Предисловие . iv
1 Область применения . 1
2 Нормативные ссылки . 1
3 Термины и определения . 1
4 Принцип . 1
5 Реактивы и материалы . 2
5.1 Реактивы для проведения PCR . 2
6 Аппаратура . 3
6.1 Общие положения . 3
6.2 Прибор для проведения PCR . 3
7 Отбор проб . 3
8 Методика . 3
8.1 Приготовление пробы для анализа . 3
8.2 Приготовление экстрактов DNA . 3
8.3 Экстракция DNA . 3
8.4 Порядок проведения PCR . 4
8.5 Температурно-временная программа . 4
9 Критерии приемки/отбраковки. 5
9.1 Общие положения . 5
9.2 Идентификация . 5
10 Статус валидации и критерии обеспечения качества . 5
10.1 Устойчивость метода . 5
10.2 Межлабораторные испытания . 5
10.3 Совместные испытания . 6
10.4 Чувствительность . 7
10.5 Специфичность . 8
11 Протокол испытаний . 8
Библиография. 9

Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в
деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие связи с
ISO, также принимают участие в работах. ISO тесно сотрудничает с Международной
электротехнической комиссией (IEC) по всем вопросам стандартизации в области электротехники.
Международные стандарты разрабатываются в соответствии с правилами, приведенными в
Директивах ISO/IEC, Часть 2.
Основная задача технических комитетов состоит в разработке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам на
голосование. Для опубликования их в качестве международного стандарта требуется одобрение не
менее 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
При других обстоятельствах, особенно при наличии настоятельной необходимости такого документа
для рынка, технический комитет может решить опубликовать другие типы нормативных документов:
— общедоступные технические условия ISO (ISO/PAS), представляющие собой соглашение между
техническими экспертами рабочей группы ISO, и публикуемые при условии получения одобрения
более чем 50% голосов членов головного технического комитета, принимавших участие в
голосовании;
— технические условия ISO (ISO/TS), представляющие собой соглашение между членами технического
комитета и публикуемые при условии утверждения 2/3 голосов членов комитета, принимавших
участие в голосовании.
Документы ISO/PAS или ISO/TS пересматриваются через три года с целью принятия решения либо о
продлении их действия на следующие три года, либо о пересмотре и публикации в качестве
международного стандарта, либо о прекращении действия. Если принимается решение о продлении
действия ISO/PAS и ISO/TS, они должны быть пересмотрены через следующие три года, когда они
должны быть либо преобразованы в международный стандарт, либо отменены.
Следует учитывать возможность того, что некоторые элементы настоящего документа могут быть
предметом патентного права. ISO не несет ответственности за идентификацию любого из таких
патентных прав.
Технические условия ISO/TS 21569-2 были разработаны Техническим комитетом ISO/TC 34, Пищевые
продукты, Подкомитетом SC 16, Горизонтальные методы молекулярного анализа с применением
биомаркеров.
Технические условия ISO/TS 21569 состоят из следующих частей под общим наименованием
Горизонтальные методы молекулярного анализа с применением биомаркеров. Методы анализа для
обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов:
— Часть 2. Метод PCR, специфичный для определения генетической конструкции в реальном
времени, для обнаружения события FP967 в льне и продуктах из него
iv © ISO 2012 – Все права сохраняются

ТЕХНИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ ISO/TS 21569-2:2012(R)

Горизонтальные методы молекулярного анализа с
применением биомаркеров. Методы анализа для
обнаружения генетически модифицированных организмов
и полученных из них продуктов.
Часть 2.
Метод PCR, специфичный для определения генетической
конструкции в реальном времени, для обнаружения
события FP967 в льне и продуктах из него
1 Область применения
Настоящий метод описывает методику обнаружения последовательности дезоксирибонуклеиновой
кислоты (DNA), присутствующей в генетически модифицированной линии льна (Linum usitatissimum)
(событие FP967, также называемое "CDC Triffid"). С этой целью экстрагированную DNA используют в
полимеразной цепной реакции (PCR) в реальном времени и генетическую модификацию (GM)
специфически обнаруживают путем амплификации последовательности DNA, включающей 105 пар
нуклеотидных оснований (bp), которая представляет собой транзицию между терминатором гена
нопалинсинтазы (Tnos) из Agrobacterium tumefaciens и геном дигидрофолатредуктазы (dfrA1) из
интегрона Escherichia coli класса 1.
Описываемый метод применяется для анализа DNA, экстрагированной из пищевых продуктов. Данный
метод также применим для анализа DNA, экстрагированной из других продуктов, таких как корма и
семена. Для применения этого метода необходима экстракция адекватного количества
амплифицируемой DNA из соответствующей матрицы, предназначенной для анализа.
2 Нормативные ссылки
ISO 21569, Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных
организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на качественном определении
нуклеиновых кислот
ISO 21571:2005, Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически
модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот
ISO 24276, Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных
организмов и полученных из них продуктов. Общие требования и определения
3 Термины и определения
Применительно к этому документу используются термины и определения, приведенные в ISO 24276.
4 Принцип
DNA экстрагируют из анализируемой пробы, применяя соответствующий метод. Анализ DNA состоит
из двух частей:
a) Верификация количества, качества и способности к амплификации экстрагированной DNA,
например, путем проведения специфичной для целевого таксона PCR в реальном времени с
помощью праймеров, которые амплифицируют длинный фрагмент, включающий 68 пар
нуклеотидных оснований, из специфичного для льна (Linum usitatissimum) гена, кодирующего
стеароил-ацильный белок-носитель десатуразы 2 (SAD) (Ссылка [1]).
b) Обнаружение генетической конструкции Tnos-dfr в PCR в реальном времени (Ссылка [1]).
5 Реактивы и материалы
Как правило, следует использовать реактивы признанного аналитического качества, пригодные для
молекулярной биологии. Используемая вода должна быть бидистиллированной или сопоставимого
качества. Растворы следует готовить растворением соответствующих реактивов в воде с
последующим автоклавированием, если не определено иначе. При проведении всех операций, в
которых используются перчатки, следует гарантировать, что они не посыпаны пудрой. Использование
защищенных от аэрозолей наконечников для пипеток служит защитой от перекрестной контаминации.
5.1 Реактивы для проведения PCR
5.1.1 Термостабильная DNA-полимераза (для PCR с горячим стартом).
5.1.2 Буферный раствор для проведения PCR (содержит хлорид магния и дезоксирибонуклеозид-
трифосфат dATP, dCTP, dGTP and dUTP).
Могут использоваться готовые к употреблению смеси реактивов или отдельные компоненты. Также
могут применяться реактивы и полимеразы, которые дают равные или лучшие результаты.
5.1.3 Олигонуклеотиды (см. Таблицу 1).
Таблица 1 — Олигонуклеотиды
Окончательная
Наименование DNA-последовательность олигонуклеотида
концентрация при PCR
Конструкция Tnos-dfr как целевая последовательность (Ссылка [1]):
NOST-Spec FW 5’-AgC gCg CAA ACT Agg ATA AA-3’ 800 нмоль/л
NOST-Spec RV 5’-ACC TTC Cgg CTC gAT gTC TA-3’ 800 нмоль/л
a
NOST-Spec Probe 5’-(FAM)-CgC gCg Cgg TgT CAT CTA Tg-(BHQ)-3’ 100 нмоль/л
a
FAM: 6-карбоксифлуоресцеин, BHQ: темновой гаситель.
ПРИМЕЧАНИЕ Для зонда можно использовать репортерные красители и/или красители-гасители, если они
приводят к аналогичным или лучшим результатам испытания.
5.1.4 Стандартный раствор DNA для калибровки
Стандартный раствор DNA известной концентрации (нг/мкл) используется для расчета числа копий
целевой последовательности Tnos-dfr.
Если в качестве стандартной DNA используется геномная DNA льна, то количество эквивалентов
гаплоидного генома на микролитр, n , должно рассчитываться на основе молекулярной массы
hgEq
гаплоидного генома льна, которая составляет приблизительно 0,7 пг (Ссылка [2]), применяя Формулу (1):
[DNA]×1000
(1)
n 
hgEq
m
hg
где
[DNA] концентрация DNA, в нанограммах на микролитр;
m масса гаплоидного генома, в пикограммах.
hg
При проведении совместных межлабораторных испытаний в качестве стандартной DNA
использовалась плазмида, которая содержит копию фрагмента Tnos-df, включающего 105 пар
нуклеотидных оснований, и большого фрагмента гена SAD, включающего 68 пар нуклеотидных
оснований, соответственно. Поскольку точное количество интеграций конструкции Tnos-dfr в событии
FP967 в льне было неизвестно во время разработки этого документа, рассчитанное GM-содержание
(содержание ГМО) представляет собой только оценку, которая основывается на предположении о том,
что целевая последовательность присутствует в виде единственной копии на гаплоидный геном.
6 Аппаратура
6.1 Общие положения
Относительно аппаратуры и материалов см. ISO 21569. В дополнение к обычной лабораторной
аппаратуре необходимо следующее оборудование.
6.2 Прибор для проведения PCR
Прибор для проведения PCR в реальном времени, пригодный для возбуждения флуоресцирующих
молекул и обнаружения сигналов флуоресценции, генерируемых во время проведения PCR.
7 Отбор проб
Все пробы должны быть однозначно идентифицированы.
8 Методика
8.1 Приготовление пробы для анализа
Следует убедиться в том, что проба для анализа, используемая для экстракции DNA, является
репрезентативной для лабораторной пробы, например, путем измельчения или гомогенизации проб.
Принимают во внимание критерии и последовательность операций, установленные в ISO 21571 и
ISO 24276.
8.2 Приготовление экстрактов DNA
Относительно приготовления экстрактов DNA из пробы для анализа, необходимо следовать общим
инструкциям и критериям, описанным в ISO 21571. Рекомендуется выбрать один из методов
экстракции DNA, описанных в ISO 21571:2005, Приложение A.
8.3 Экстракция DNA
Рекомендуется выполнять экстракцию DNA с применением метода CTAB, используя пробу для
анализа, масса которой равняется 1 г гомогенизированной пробы (см. ISO 21571:2005, A.3.1).
Из-за проблем, связанных с чистотой может потребоваться дополнительная стадия очистки (гель-
фильтрация, например, с применением колонок Micro-spin).
До тех пор, пока обеспечивается сравнимость результатов, могут применяться другие методы
экстракции и очистки (например, системы наборов) с использованием меньших проб для анализа, если
необходимо (Ссылка [1]).
8.4 Порядок проведения PCR
Описанный метод применим для суммарного объема 25 мкл на PCR. Следует использовать реактивы,
приведенные в Таблице 2.
Реактивы следует подвергнуть полному оттаиванию при комнатной температуре и недолговременному
центрифугированию перед использованием. Каждый реактив следует тщательно перемешать перед
отмериванием пипеткой. Готовят реакционную смесь, которая содержит все компоненты, кроме пробы
DNA. Требуемое количество реакционной смеси для проведения PCR зависит от количества
выполняемых реакций, включая по меньшей мере одну дополнительную реакцию в качестве резерва,
необходимого для возмещения потерь при отмеривании реактивов пипеткой. Используют объем,
равный 5 мкл пробы DNA.
Таблица 2 — Добавление реактивов
Суммарный реакционный объем 25 мкл
Проба DNA (до 200 нг) или контроли 5 мкл
a
Буферный раствор для
...