ISO 12228-1:2014
(Main)Determination of individual and total sterols contents — Gas chromatographic method — Part 1: Animal and vegetable fats and oils
Determination of individual and total sterols contents — Gas chromatographic method — Part 1: Animal and vegetable fats and oils
ISO 12228-1:2014 specifies a procedure for the gas chromatographic determination of the content and composition of sterols in animal and vegetable fats and oils. However, the determination of the contents and composition of sterols in olive and olive pomace oils is to be carried out using ISO 12228-2.
Détermination de la teneur en stérols individuels et totaux — Méthode par chromatographie en phase gazeuse — Partie 1: Corps gras d'origines animale et végétale
L'ISO 12228-1:2014 spécifie un mode opératoire de détermination, par chromatographie en phase gazeuse, de la teneur et de la composition des stérols contenus dans les corps gras d'origines animale et végétale. Toutefois, la détermination de la teneur et de la composition des stérols contenus dans les huiles d'olive et de grignons d'olive doit être réalisée en utilisant l'ISO 12228-2.
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 12228-1
Первое издание
2014-07-15
Определение содержания и состава
стеринов. Метод газовой
хроматографии.
Часть 1.
Животные и растительные жиры и
масла
Determination of individual and total sterols contents — Gas
chromatographic method —
Part 1: Animal and vegetable fats and oils
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
ISO 12228-1:2014(R)
©
ISO 2014
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 12228-1:2014(R)
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO 2014
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO по соответствующему адресу, указанному ниже, или комитета-члена ISO в стране
заявителя.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2014 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 12228-1:2014(R)
Содержание Страница
Предисловие. iv
1 Область применения. 1
2 Нормативные ссылки . 1
3 Термины и определения . 1
4 Принцип . 1
5 Реактивы . 2
6 Аппаратура . 3
7 Проба. 3
7.1 Отбор проб. 3
7.2 Приготовление пробы для испытания . 4
8 Методика . 4
8.1 Приготовление колонки с оксидом алюминия . 4
8.2 Проба для анализа . 4
8.3 Экстракция неомыляемого вещества . 4
8.4 Тонкослойная хроматография. 4
8.5 Разделение стеринов . 5
8.6 Приготовление триметилсилиловых эфиров стеринов . 5
8.7 Газовая хроматография . 5
9 Выражение результатов . 5
9.1 Идентификация стеринов. 5
9.2 Состав стеринов . 6
9.3 Определение общего содержания стеринов . 6
10 Прецизионность . 7
10.1 Межлабораторное испытание . 7
10.2 Предел повторяемости, r . 7
10.3 Предел воспроизводимости, R . 7
11 Протокол испытания . 7
Приложение A (информативное) Рисунки . 8
Приложение B (информативное) Межлабораторное испытание . 15
Библиография . 23
© ISO 2014 – Все права сохраняются iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 12228-1:2014(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) всемирная федерация национальных органов
по стандартизации (комитеты-члены ISO). Работа по подготовке международных стандартов обычно
ведется через технические комитеты ISO. Каждый комитет-член ISO, проявляющий интерес к
тематике, по которой учрежден технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные организации, государственные и негосударственные, имеющие связи с ISO,
также принимают участие в работе. ISO тесно сотрудничает с Международной электротехнической
комиссией (IEC) по всем вопросам стандартизации в области электротехники.
Процедуры, используемые для разработки данного документа, и процедуры, предусмотренные для его
дальнейшего ведения, описаны в Части 1 Директив ISO/IEC. В частности, следует отметить различные
критерии утверждения, требуемые для различных типов документов ISO. Проект данного документа
был разработан в соответствии с редакционными правилами Части 2 Директив ISO/IEC
(см. www.iso.org/directives).
Необходимо обратить внимание на возможность того, что ряд элементов данного документа могут
быть предметом патентных прав. Международная организация ISO не должна нести ответственность
за идентификацию таких прав, частично или полностью. Сведения о патентных правах,
идентифицированных при разработке документа, будут указаны во Введении и/или в перечне
полученных ISO объявлений о патентном праве (см. www.iso.org/patents).
Любое торговое название, использованное в данном документе, является информацией,
предоставляемой для удобства пользователей, а не свидетельством в пользу того или иного товара
или той или иной компании.
Для пояснения значений конкретных терминов и выражений ISO, относящихся к оценке соответствия, а
также информация о соблюдении Международной организацией ISO принципов ВТО по техническим
барьерам в торговле (TВT), см. следующий унифицированный локатор ресурса (URL): Foreword —
Supplementary information.
Технический комитет, несущий ответственность за данный документ, ISO/TC 34, Пищевые продукты,
Подкомитет SC 11, Животные и растительные жиры и масла.
Настоящее первое издание ISO 12228-1 вместе с ISO 12228-2 отменяет и заменяет ISO 12228:1999,
которое подверглось техническому пересмотру.
ISO 12228 состоит из следующих частей под общим названием Определение содержания и состава
стеринов. Метод газовой хроматографии:
— Часть 1. Животные и растительные жиры и масла
— Часть 2. Оливковое масло и жмыховое оливковое масло
iv © ISO 2014 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 4 ----------------------
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 12228-1:2014(R)
Определение содержания и состава стеринов.
Метод газовой хроматографии.
Часть 1.
Животные и растительные жиры и масла
1 Область применения
Настоящая часть ISO 12228 устанавливает методику газохроматографического определения
содержания и состава стеринов в животных и растительных жирах и маслах. Однако определение
содержания и состава стеринов в оливковом масле и жмыховом оливковом масле должно выполняться
по методике, указанной в ISO 12228-2.
2 Нормативные ссылки
Следующие ссылочные нормативные документы, частично или полностью, являются обязательными
при применении данного документа. Для датированных ссылок применяется только цитированное
издание документа. Для недатированных ссылок необходимо использовать самое последнее издание
нормативного ссылочного документа (включая любые изменения).
ISO 661, Жиры и масла животные и растительные. Приготовление пробы для испытания
ISO 3696, Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний
3 Термины и определения
Применительно к настоящему документу используются следующие термины и определения.
3.1
состав стеринов
composition of sterols
состав отдельных стеринов в пробе, начиная с холестерина и заканчивая Δ7-авенастерином
(см. Таблицу 1) в условиях, установленных в настоящей части ISO 12228
ПРИМЕЧАНИЕ 1 к статье: Состав выражают в процентах от площадей всех пиков, нормализованных к 100 %.
3.2
общее содержание стеринов
total sterol content
массовая доля суммы всех отдельных стеринов, определенных в соответствии с методом,
установленным в настоящей части ISO 12228, начиная с холестерина и заканчивая Δ7-авенастерином
(см. Таблицу 1), деленная на массу пробы для анализа
ПРИМЕЧАНИЕ 1 к статье: Содержание выражают в миллиграммах на килограмм.
4 Принцип
Омыляют пробу для анализа при кипячении с обратным холодильником в этанольном растворе
гидроксида калия. Выделяют неомыляемое вещество путем твердофазной экстракции на колонке с
© ISO 2014 – Все права сохраняются 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 12228-1:2014(R)
оксидом алюминия. Колонку с оксидом алюминия используют для удерживания анионов жирных
кислот; стерины проходят через колонку. Разделяют фракцию стеринов из неомыляемого вещества с
помощью тонкослойной хроматографии. Определяют качественный и количественный состав фракции
стеринов с помощью газовой хроматографии, используя холестанол или бетулин в качестве
внутреннего стандарта.
5 Реактивы
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Необходимо принимать во внимание инструкции, которые
устанавливают правила обращения с опасными веществами. Необходимо соблюдать
технические, организационные и персональные меры безопасности.
Используют только реактивы признанной аналитической чистоты, если не оговорено иначе, и воду,
[1]
.
соответствующую классу чистоты 3 согласно ISO 3696
5.1 Гидроксид калия (KOH), этанольный раствор, молярная концентрация c(KOH) приблизительно
0,5 моль/л.
Растворяют 3 г гидроксида калия в 5 мл воды и разбавляют до 100 мл этанолом (5.3). Раствор должен
быть бесцветным или иметь желтоватую окраску.
5.2 Раствор внутреннего стандарта, холестанол (5α-холестан-3β-ол) или бетулин, объемная доля
1,0 мг/мл, раствор в этаноле (см. примечание в 5.10).
ПРИМЕЧАНИЕ В случае гидрогенизированных масел, которые могут содержать холестанол, рекомендуется
использовать бетулин (пик 17 в Таблице 1).
5.3 Этанол, минимальная объемная доля φ = 95 %.
5.4 Оксид алюминия, нейтральный, размер частиц от 0,063 мм до 0,200 мм, класс активности I
(содержание воды = 0 %).
5.5 Диэтиловый эфир, свежеперегнанный, не содержащий пероксидов и остатка.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ — Диэтиловый эфир легко воспламеняется и может образовывать
взрывчатые пероксиды. Пределы взрываемости на воздухе от 1,7 % до 48 % (объемная доля).
Необходимо соблюдать меры предосторожности при его использовании. Хранят вдали от
источников тепла и солнечного света.
5.6 Пластинки с силикагелем для тонкослойной хроматографии (TLC), имеющиеся в продаже,
размеры 20 см × 20 см, толщина слоя 0,25 мм.
5.7 Проявляющий растворитель, гексан/диэтиловый эфир.
Объемная доля каждого из растворителей составляет 50 мл/100мл.
5.8 Стандартный раствор для тонкослойной хроматографии (TLC), объемная доля 1,0 мг/мл
для холестерина/холестанола в ацетоне или 5,0 мг/мл для бетулина в ацетоне.
ПРИМЕЧАНИЕ 1 В тонкослойной хроматографии холестерин и холестанол имеют одно и то же значение
Rf (0,35), в то время как значение Rf для бетулина составляет 0,30 (см. Рисунок А.1).
ПРИМЕЧАНИЕ 2 В случае гидрогенизированных масел, которые могут содержать холестанол, рекомендуется
использовать бетулин (пик 17 в Таблице 1).
5.9 Реактив для опрыскивания, метанол.
5.10 Реактив для силилирования, приготовленный путем добавления 50 мкл 1-метилимидазола к 1
мл N-метил N-(триметилсилил)гептафторбутирамида (MSHFBA).
2 © ISO 2014 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 12228-1:2014(R)
ПРИМЕЧАНИЕ Готовые к использованию растворы имеются в продаже. Другие реактивы для силилирования,
например, бис-триметилсилилтрифторацетамид с 1 % триметилхлорсиланом, также пригодны и могут
использоваться в том случае, если в качестве внутреннего стандарта применяется холестанол. Однако
необходимо соблюдать специальные меры предосторожности для бетулина, гарантирующие, что обе его
гидроксильные группы подверглись силилированию. Если этого не происходит, то бетулин может показать два
пика на хроматограмме.
6 Аппаратура
Обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее.
6.1 Круглодонные колбы, вместимостью 25 мл и 50 мл, с пришлифованным горлом.
6.2 Обратный холодильник, со стеклянным шлифом, пригнанным к колбе (6.1).
6.3 Стеклянная колонка, снабженная политетрафторэтиленовой пробкой (PTFE) и фильтром из
пористого стекла, вместимостью 100 мл, длиной 25 см и внутренним диаметром 1,5 см.
6.4 Роторный испаритель, соединенный с вакуумным насосом и водяной баней, отрегулированной
на температуру 40 °С.
6.5 Проявительная камера, изготовленная из стекла, с пришлифованной стеклянной крышкой,
пригодная для проявления пластинок размерами 20 см × 20 см.
6.6 Микрошприц, для подачи 100 мкл.
6.7 Сушильный шкаф, поддерживающий температуру 105 °С ± 3 °С.
6.8 Эксикатор, содержащий эффективный осушитель, для хранения пластинок.
6.9 Реакционные пробирки, вместимостью от 0,3 мл до (1,0 – 1,5) мл, с навинчивающимися
крышками и уплотнительными прокладками, облицованными PTFE, для приготовления производных
стерина.
6.10 Газовый хроматограф, для капиллярных колонок, с инжектором с делением потока, пламенно-
ионизационным детектором и соответствующим записывающим устройством.
6.11 Капиллярная колонка, изготовленная из плавленого диоксида кремния или стекла, длиной от
25 м до 60 м, внутренним диаметром от 0,2 мм до 0,25 мм, с неподвижной фазой SE-54 (или
эквивалентной неполярной фазой с диапазоном температур не менее 280 – 300 °С) и толщиной пленки
приблизительно 0,1 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ Наилучшую степень разделения пиков получают при толщине пленки 0,1 мкм.
6.12 Микрошприц для газовой хроматографии, для впрыска объемов 1 мкл.
6.13 Аналитические весы, способные взвешивать с точностью до 0,001 г и отображать показание
0,000 1 г.
7 Проба
7.1 Отбор проб
Отбор проб не является частью метода, рассматриваемого в данной части ISO 12228. Рекомендуемый
[1]
метод отбора проб приводится в стандарте ISO 5555 .
© ISO 2014 – Все права сохраняются 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 12228-1:2014(R)
Важно, чтобы лаборатория получила пробу, которая является представительной и не была
повреждена или изменена при транспортировке или хранении.
7.2 Приготовление пробы для испытания
Готовят пробу для испытания в соответствии с ISO 661.
8 Методика
8.1 Приготовление колонки с оксидом алюминия
Готовят суспензию 10 г оксида алюминия (5.4) в 20 мл этанола (5.3) и переливают ее в стеклянную
колонку (6.3). Оставляют для осаждения оксида алюминия и дают возможность растворителю проходить
через колонку до тех пор, пока его уровень не достигнет верхнего уровня слоя оксида алюминия.
8.2 Проба для анализа
Взвешивают с точностью до 1 мг приблизительно 250 мг пробы для испытания в колбе вместимостью
25 мл (6.1) и продолжают методику в соответствии с 8.3.
Для жиров и масел с низким содержанием стеринов (например, менее 2 000 мг на килограмм) или по
другим причинам продолжают методику, используя трехкратное количество пробы для испытания.
Соответственно корректируют реактивы и аппаратуру.
8.3 Экстракция неомыляемого вещества
Добавляют точно 1,00 мл раствора внутреннего стандарта (5.2) к пробе для анализа (8.2). Добавляют
5 мл этанольного раствора гидроксида калия (5.1) и несколько гранул, препятствующих пульсирующему
кипению. Присоединяют обратный холодильник (6.2) к колбе и выдерживают содержимое при умеренном
кипении в течение 15 мин. Прекращают кипение. Сразу же разбавляют содержимое колбы, пока оно все
еще горячее, 5 мл этанола (5.3) и взбалтывают или встряхивают для гомогенизации.
Отмеряют пипеткой 5 мл этого раствора на подготовленную колонку с оксидом алюминия (8.1).
Собирают элюат в круглодонную колбу вместимостью 50 мл (6.1) и дают возможность растворителю
проходить через колонку до тех пор, пока его уровень не достигнет верхнего уровня слоя оксида
алюминия. Элюируют неомыляемое вещество сначала 5 мл этанола (5.3), а затем 30 мл диэтилового
эфира (5.5) со скоростью потока приблизительно 2 мл/мин. Удаляют растворители из колбы с
помощью роторного испарителя (6.4).
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ — Использование колонки с оксидом алюминия является определяющим
условием для этой методики. Нельзя использовать силикагель или другие колонки либо
заменять эту процедуру на экстракцию растворителем.
8.4 Тонкослойная хроматография
Растворяют неомыляемое вещество, полученное в 8.3, в небольшом количестве (приблизительно
0,5 мл) диэтилового эфира (5.5). С помощью микрошприца (6.6) наносят этот раствор в виде линии на
расстоянии 2 см от нижнего края пластинки TLC (5.6). Оставляют зазор по меньшей мере 3 см от
каждого бокового края пластинки. Наносят пятно стандартного раствора TLC (5.8) объемом 5 мкл на
расстоянии 1,5 см от края. Заполняют проявительную камеру (6.5) приблизительно 100 мл
проявляющего растворителя (5.7). Помещают пластинку в камеру и проявляют ее до тех пор, пока
растворитель не достигнет верхнего края. Вынимают пластинку из камеры и оставляют ее в вытяжном
шкафу для испарения растворителя.
ПРИМЕЧАНИЕ Количественный перенос вещества (8.3) на пластинку TLC необязателен на этой стадии. Для
нанесения полос можно использовать автоматическое оборудование. Насыщения камеры не требуется.
4 © ISO 2014 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 12228-1:2014(R)
8.5 Разделение стеринов
Опрыскивают пластинки метанолом (5.9) до тех пор, пока зоны стеринов (и бетулина) не станут
белыми на полупрозрачном (темном) фоне. Холестанол является составной частью зоны Δ5-стеринов
(см. Рисунок А.1). Отмечают зоны, расположенные на 2 мм выше стандартного пятна и на 4 мм ниже
видимых зон (см. Рисунок А.1). Полностью соскабливают эту часть слоя с помощью шпателя и
количественно собирают силикагель в небольшом стакане.
ПРИМЕЧАНИЕ 1 В качестве необходимой меры предосторожности используют более широкую границу нижнего
края видимых зон (4 мм против 2 мм для верхнего края), чтобы избежать потери бетулина на этой стадии.
Подсолнечное масло может показывать три зоны (Δ5-стерины. Δ7-стерины и бетулин).
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Бетулин, если он используется в качестве внутреннего стандарта, проявляется немного ниже
зоны стеринов (см. Рисунок А.1).
Добавляют 0,5 мл этанола к собранному силикагелю. Три раза экстрагируют силикагель в стакане
порциями по 5 мл диэтилового эфира (5.5) и фильтруют в колбу (6.1). Отгоняют объединенный эфирный
экстракт приблизительно до 1 мл с помощью роторного испарителя (6.4) и переносят оставшийся
раствор в реакционную пробирку (6.9). Продувают растворитель в реакционной пробирке потоком азота.
8.6 Приготовление триметилсилиловых эфиров стеринов
Добавляют 100 мкл реактива для силилирования (5.10) в реакционную пробирку (6.9), содержащую
выделенные стерины. Укупоривают и нагревают пробирку в течение 15 мин в сушильном шкафу,
отрегулированном на температуру (105 ± 3) °С. Оставляют реакционную пробирку для охлаждения до
комнатной температуры и впрыскивают раствор непосредственно в газовый хроматограф (6.10).
8.7 Газовая хроматография
Оптимизируют температурную программу и скорость потока газа-носителя таким образом, чтобы
получить хроматограммы, аналогичные хроматограммам, представленным на Рисунках А.2 – А.7.
Контролируют разделение с помощью фракций силилированных стеринов, полученных из известных
масел, как показано на Рисунках А.2 – А.7.
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Были проверены и признаны эффективными следующие параметры (см. хроматограммы в
Приложении А): колонка для газовой хроматографии (GC): SE-54, длина 50 м, внутренний диаметр 0,25 мм,
толщина пленки 0,10 мкм; газ-носитель — Н2, скорость потока газа-носителя 36 см/с, отношение деления потока
1:20, температура детектора/инжектора 320 °С, температурная программа от 245° С до 265 °С при скорости
5 °С/мин, изотермический режим при температуре 265 °С в течение 40 мин; объем впрыска 1 мкл. Можно
использовать капиллярные колонки эквивалентного качества.
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Контрольный раствор, содержащий холестерин, кампестерин, стигмастерин и ситостерин,
можно использовать для проверки времени удерживания. Проводят контрольный опыт для проверки возможного
загрязнения (например, холестерином) от растворителей, стеклянных стенок фильтра, отпечатков пальцев и т.д.
9 Выражение результатов
9.1 Идентификация стеринов
Для идентификации стеринов, присутствующих в пробе для испытания, определяют относительное
время удерживания (RRT) путем деления времени удерживания (RT) рассматриваемого стерина на RT
холестерина и/или бетулина. В Таблице 1 даются значения RRT различных стеринов по отношению к
холестерину (RRTC) и бетулину (RRTB) при использовании неподвижной фазы SE-54.
ПРИМЕЧАНИЕ Значения RRT в Таблице 1 (определенные в условиях, установленных в Примечании 1 к 8.7)
указываются только в качестве помощи для идентификации конкретных стеринов и для иллюстрации
последовательности элюирования (см. также Рисунок А.1). Фактическое значение RRT может незначительно
отклоняться от значения RRT, приведенного в Таблице 1, так как это значение зависит от условий эксперимента (типа и
длины колонки для газожидкостной хроматографии, температурной программы и качества неподвижной фазы).
© ISO 2014 – Все права сохраняются 5
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 12228-1:2014(R)
9.2 Состав стеринов
Рассчитывают массовую долю, wi, отдельного стерина, i, в г/100 г (процент), по Формуле (1):
A
i
w = ⋅100 (1)
i
A
∑
где
A площадь пика стерина i;
i
ΣA сумма площадей пиков всех стеринов (пики 1, 3 – 16 или 1 – 16, если используют бетулин).
Таблица 1 — Идентификация газохроматографических пиков отдельных стеринов и бетулина
согласно значению RRT (неподвижная фаза SE-54)
№ Общее наименование стеринов Систематическое наименование стеринов RRT RRT
C B
пика
1 Холестерин Холест-5-ен-3β-ол 1,00 0,44
2 Холестанол 5α-Холестан-3β-ол 1,02 0,45
3 Брассикастерин [24S]-24-Метилхолеста-5,22-диен-3β-ол 1,09 0,48
4 24-Метиленхолестерин 24-Метиленхолеста-5,24-диен-3β-ол 1,21 0,53
5 Кампестерин [24R]-24-Метилхолест-5-ен-3β-ол 1,23 0,54
6 Кампестанол [24R]-24- Метиленхолестан-3β-ол 1,25 0,55
7 Стигмастерин [24S]-24-Этилхолеста-5,22-диен-3β-ол 1,31 0,57
8 ∆7-Кампестерин [24R]-24-Метилхолест-7-ен-3β-ол 1,38 0,59
9 ∆5,23-Стигмастадиенол [24R,S]-24-Этилхолеста -5,23-диен-3β-ол 1,40 0,60
10 Клеростерин [24S]-24-Этилхолеста-5,25-диен-3β-ол 1,42 0,62
11 Ситостерин [24R]-24-Этилхолест-5-ен-3β-ол 1,47 0,64
12 Ситостанол [24R]-24-Этилхолестан-3β-ол 1,50 0,65
13 ∆5-Авенастерин [24Z]-24(28)-Этилиденхолест-5-ен-3β-ол 1,52 0,66
14 ∆5,24-Стигмастадиенол [24R,S]-24-Этилхолеста-5,24-диен-3β-ол 1,59 0,69
15 ∆7-Стигмастенол [24R,S]-24-Этилхолест-7-ен-3β-ол 1,65 0,72
16 ∆7-Авенастерин [24Z]-24(28)-Этилиденхолест-7-ен-3β-ол 1,70 0,74
X (Эритродиол) 2,03 0,88
Y (Уваол) 2,17 0,95
17 Бетулин Луп-20[29]-ен-3β,28-диол 2,30 1,00
RRT : — относительное время удерживания на основе холестерина = 1,00
C
RRT : — относительное время удерживания на основе бетулина = 1,00
B
ПРИМЕЧАНИЕ Ситостерин может совместно элюироваться с α-спинастерином и ∆7,22,25-стигмастатриенолом.
[24R]-24-Этил-холеста-7,25(27)-диен-3β-ол присутствует в стеринах подсолнечного и тыквенного масел и может совместно
элюироваться с пиком 14 (∆5,24-стигмастадиенол).
9.3 Определение общего содержания стеринов
Применительно к настоящему методу предполагают, что коэффициенты отклика всех стеринов и
бетулина равны.
ПРИМЕЧАНИЕ В результате проведения нескольких испытаний силилированных стеринов и силилированного
бетулина в равных количествах был получен одинаковый отклик при использовании пламенно-ионизационного
детектора в этих условиях.
6 © ISO 2014 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 12228-1:2014(R)
Рассчитывают общее содержание стеринов, w, в миллиграммах на килограмм жира, по Формуле (2):
( A)⋅ m ⋅1000
IS
∑
(2)
w=
A ⋅ m
IS
где
m масса внутреннего стандарта (холестанола), в миллиграммах;
IS
Σ(A) сумма площадей пиков всех стеринов (пики 1, 3 – 16 или 1 – 16, если используют бетулин);
AIS площадь пика внутреннего стандарта;
m масса пробы для анализа, в граммах.
Для расчета общего содержания стеринов учитывают все пики стеринов, начиная с холестерина и
заканчивая ∆7-авенастерином (пик 16), но без учета эритродиола и уваола (пики X и Y).
10 Прецизионность
10.1 Межлабораторное испытание
Подробности межлабораторного испытания по определению прецизионности метода суммируются в
Приложении В. Значения, полученные в ходе этих межлабораторных испытаний, не могут быть
применимы к диапазонам концентраций и матрицам, кроме указанных.
10.2 Предел повторяемости, r
Предел повторяемости (r) — это значение менее или равное значению, при котором абсолютное
расхождение между результатами двух испытаний, полученными в условиях повторяемости, может
ожидаться с вероятностью 95 %.
Условия повторяемости — условия, при которых независимые результаты испытаний получены при
использовании одного и того же метода, на идентичном испытуемом материале, в одной лаборатории,
одним и тем же оператором, на одном и том же оборудовании, в короткий промежуток времени.
10.3 Предел воспроизводимости, R
Предел воспроизводимости (R) — это значение менее или равное значению, при котором абсолютное
расхождение между результатами двух испытаний, полученными в условиях воспроизводимости,
может ожидаться с вероятностью 95 %.
Условия воспроизводимости — условия, при которых независимые результаты испытаний получены
при использовании одного и того же метода, на идентичном испытуемом материале, в разных
лабораториях, разными операторами, на разном оборудовании, в короткий промежуток времени.
11 Протокол испытания
Протокол испытания должен устанавливать:
a) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;
b) применяемый метод отбора проб, если известен;
c) применяемый метод испытания со ссылкой на данную часть ISO 12228 (т.е. ISO 12228-1);
d) все рабочие подробности, не указанные в данном международном стандарте, или считающиеся
необязательными, а также подробности о любых инцидентах, которые могут повлиять на результат(ы);
e) полученный результат(ы) испытания и, если проверялась повторяемость, окончательный
полученный и объявленный результат.
© ISO 2014 – Все права сохраняются 7
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 12228-1:2014(R)
Приложение A
(информативное)
Рисунки
Обозначение
1 тритерпены
2 метилстерины
3 холестанол и ∆5-стерины
4 ∆7-стерины
5 бетулин
6 старт
ПРИМЕЧАНИЕ Зоны стеринов становятся белыми на полупрозрачном фоне. Заштрихованная зона
соскабливается; отмечают более широкую границу снизу (4 мм против 2 мм сверху). Значения Rf зон: бетулина
0,30; ∆7-стеринов 0,33; ∆5-стеринов 0,35; метилстеринов 0,45; тритерпенов 0,53.
Рисунок А.1 — Разделение стеринов из неомыляемого вещества с помощью тонкослойной
хроматографии (TLC) (стадии 8.3 и 8.4)
8 © ISO 2014 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 12228-1:2014(R)
ПРИМЕЧАНИЕ Идентификация номеров пиков соответствует Таблице 1. Условия соответствуют условиям,
приведенным в Примечании 1 к 8.7.
Рисунок А.2 — Газожидкостная хроматография (GLC) стеринов из кукурузного масла (Проба А)
© ISO 2014 – Все права сохраняются 9
---------------------- Page: 13 ----------------------
ISO 12228-1:2014(R)
ПРИМЕЧАНИЕ Идентификация номеров пиков соответствует Таблице 1. Условия соответствуют условиям,,
приведенным в Примечании 1 к 8.7.
Рисунок А.3 — Газожидкостная хроматография (GLC) стеринов из рафинированного
подсолнечного масла (Проба В)
10 © ISO 2014 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 14 ----------------------
ISO 12228-1:2014(R)
ПРИМЕЧАНИЕ Идентификация номеров пиков соответствует Таблице 1. Условия соответствуют условиям,
приведенным в Примечании 1 к 8.7.
Рисунок А.4 — Газожидкостная хроматография (GLC) стеринов из рафинированного
сафлорового масла (Проба С)
© ISO 2014 – Все права сохраняются 11
---------------------- Page: 15 ----------------------
ISO 12228-1:2014(R)
ПРИМЕЧАНИЕ Идентификация номеров пиков соответствует Таблице 1. Условия соответствуют условиям,
приведенным в Примечании 1 к 8.7.
Рисунок А.5 — Газожидкостная хроматография (GLC) стеринов из рафинированного рапсового
масла (Проба D)
12 © ISO 2014 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 16 ----------------------
ISO
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 12228-1
First edition
2014-07-15
Corrected version
2015-05-15
Determination of individual
and total sterols contents — Gas
chromatographic method —
Part 1:
Animal and vegetable fats and oils
Détermination de la teneur en stérols individuels et totaux —
Méthode par chromatographie en phase gazeuse —
Partie 1: Corps gras d’origines animale et végétale
Reference number
ISO 12228-1:2014(E)
©
ISO 2014
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 12228-1:2014(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2014, Published in Switzerland
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Ch. de Blandonnet 8 • CP 401
CH-1214 Vernier, Geneva, Switzerland
Tel. +41 22 749 01 11
Fax +41 22 749 09 47
copyright@iso.org
www.iso.org
ii © ISO 2014 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 12228-1:2014(E)
Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 2
6 Apparatus . 3
7 Sample . 3
7.1 Sampling . 3
7.2 Preparation of the test sample . 3
8 Procedure. 4
8.1 Preparation of the aluminium oxide column . 4
8.2 Test portion . 4
8.3 Extraction of the unsaponifiable matter . 4
8.4 Thin-layer chromatography . 4
8.5 Isolation of the sterols . 4
8.6 Preparation of sterol trimethylsilyl ethers . 5
8.7 Gas chromatography . 5
9 Expression of results . 5
9.1 Identification of sterols . 5
9.2 Composition of sterols . 5
9.3 Determination of the total sterol content . 6
10 Precision . 7
10.1 Interlaboratory test. 7
10.2 Repeatability limit, r . 7
10.3 Reproducibility limit, R . 7
11 Test report . 7
Annex A (informative) Figures . 8
Annex B (informative) Interlaboratory trial .15
Bibliography .24
© ISO 2014 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 12228-1:2014(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of any
patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or on
the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11, Animal
and vegetable fats and oils.
This first edition of ISO 12228-1, together with ISO 12228-2, cancels and replaces ISO 12228:1999, which
has been technically revised.
ISO 12228 consists of the following parts, under the general title Determination of individual and total
sterols content — Gas chromatographic method:
— Part 1: Animal and vegetable fats and oils
— Part 2: Olive oils and olive pomace oils
This corrected version of ISO 12228-1:2014 incorporates the following corrections:
— In Annex B, the data in the tables have been revised and a new table for ß-Sitosterol (Table B.11) has
been added.
iv © ISO 2014 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 12228-1:2014(E)
Determination of individual and total sterols contents —
Gas chromatographic method —
Part 1:
Animal and vegetable fats and oils
1 Scope
This part of ISO 12228 specifies a procedure for the gas chromatographic determination of the content
and composition of sterols in animal and vegetable fats and oils. However, the determination of the
contents and composition of sterols in olive and olive pomace oils is to be carried out using ISO 12228-2.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 661, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
composition of sterols
composition of individual sterols in the sample, beginning with cholesterol and ending with Δ7-
avenasterol (see Table 1) under the conditions specified in this part of ISO 12228
Note 1 to entry: The composition is expressed as a percentage of all peak areas, normalized to 100 %.
3.2
total sterol content
mass fraction of the sum of all individual sterols, as determined in accordance with the method specified
in this part of ISO 12228, beginning with cholesterol and ending with Δ7-avenasterol (see Table 1),
divided by the mass of the test portion
Note 1 to entry: The content is expressed in milligrams per kilogram.
4 Principle
A test portion is saponified by boiling under reflux with an ethanolic potassium hydroxide solution.
The unsaponifiable matter is isolated by solid-phase extraction on an aluminium oxide column. The
aluminium oxide column is used to retain the fatty acid anions; sterols pass through the column.
The sterol fraction from the unsaponifiable matter is separated by thin-layer chromatography. The
qualitative and quantitative compositions of the sterol fraction are determined by gas chromatography
using cholestanol or betulin as the internal standard.
© ISO 2014 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 12228-1:2014(E)
5 Reagents
WARNING — Attention is drawn to the regulations which specify the handling of hazardous
substances. Technical, organizational, and personal safety measures shall be followed.
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise stated, and water complying with
[1]
grade 3 of ISO 3696 .
5.1 Potassium hydroxide (KOH), ethanolic solution, molar concentration c(KOH) approximately
0,5 mol/l.
Dissolve 3 g of potassium hydroxide in 5 ml of water and dilute to 100 ml with ethanol (5.3). The solution
should be colourless or straw-coloured.
5.2 Internal standard solution, cholestanol (5α-cholestan-3β-ol) or betulin, volume fraction of
1,0 mg/ml solution in ethanol (see note to 5.10).
NOTE In case of hydrogenated oils, which may contain cholestanol, the use of betulin (peak 17 in Table 1) is
recommended.
5.3 Ethanol, of minimum volume fraction φ = 95 %.
5.4 Aluminium oxide, neutral, particle size 0,063 mm to 0,200 mm, activity grade I (water
content = 0 %).
5.5 Diethyl ether, freshly distilled, free from peroxides and residue.
WARNING — Diethyl ether is highly flammable and can form explosive peroxides. Explosive
limits in air are 1,7 % to 48 % (volume fraction). Take special precautions when using it. Keep
away from heat sources and sunlight.
5.6 Silica gel thin-layer chromatography (TLC) plates, commercially available, dimensions
20 cm × 20 cm, thickness of layer 0,25 mm.
5.7 Developing solvent, hexane/diethyl ether.
Volume fraction of each solvent is 50 ml/100 ml.
5.8 Standard solution for thin-layer chromatography, volume fraction of 1,0 mg/ml
cholesterol/cholestanol in acetone or 5,0 mg/ml betulin in acetone.
NOTE 1 Cholesterol and cholestanol have the same Rf value (0,35) in TLC while the Rf value for betulin is 0,30
(see Figure A.1).
NOTE 2 In case of hydrogenated oils, which may contain cholestanol, the use of betulin (peak 17 in Table 1) is
recommended.
5.9 Spraying reagent, methanol.
5.10 Silylating reagent, prepared by adding 50 µl of 1-methyl imidazole to 1 ml of N-methyl-N-
(trimethylsilyl)-hepta-fluorobutyramide (MSHFBA).
NOTE Ready-to-use solutions are commercially available. Other silylation reagents, e.g. bis trimethylsilyl
trifluoroacetamide with 1 % trimethylchlorosilane, are also available and can be used when cholestanol is used
as internal standard. However for betulin special precautions are taken to ensure that both hydroxyl groups of
betulin are silylated. If not, betulin may show two peaks in the chromatogram.
2 © ISO 2014 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 12228-1:2014(E)
6 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1 Round-bottomed flasks, of 25 ml and 50 ml capacity, with ground neck.
6.2 Reflux condenser, with ground glass joint to fit a flask (6.1).
6.3 Glass column, with polytetrafluoroethylene (PTFE) stopper, sintered glass filter and reservoir for
100 ml, length 25 cm, internal diameter 1,5 cm.
6.4 Rotary evaporator, attached to a vacuum pump and water bath maintained at 40 °C.
6.5 Developing tank, made of glass, with a ground glass lid, suitable for use with plates of dimensions
20 cm × 20 cm.
6.6 Microsyringe, to deliver 100 µl.
6.7 Oven, maintained at 105 °C ± 3 °C.
6.8 Desiccator, containing an efficient desiccant, for storing the plates.
6.9 Reaction vials, of 0,3 ml to (1,0 to 1,5) ml capacity, with screw caps and PTFE-lined seals, for
preparation of sterol derivatives.
6.10 Gas chromatograph, for capillary columns, with split injector, flame ionization detector and
suitable recorder.
6.11 Capillary column, made of fused silica or glass, length 25 m to 60 m, internal diameter 0,2 mm
to 0,25 mm, stationary phase SE-54 (or equivalent non-polar phase with a temperature limit of at least
280 °C to 300 °C); film thickness about 0,1 µm.
NOTE A better resolution of the peaks is obtained with a film thickness of 0,1 µm.
6.12 Microsyringe for gas chromatography, for injecting volumes of 1 µl.
6.13 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,001 g and displaying 0,000 1 g.
7 Sample
7.1 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this part of ISO 12228. A recommended sampling method
[1]
is given in ISO 5555 .
It is important that the laboratory receives a sample which is truly representative and has not been
damaged or changed during transport or storage.
7.2 Preparation of the test sample
Prepare the test sample in accordance with ISO 661.
© ISO 2014 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 12228-1:2014(E)
8 Procedure
8.1 Preparation of the aluminium oxide column
Suspend 10 g of aluminium oxide (5.4) in 20 ml of ethanol (5.3) and pour the slurry into the glass column
(6.3). Allow the aluminium oxide to settle and let the solvent run out of the column until the level of the
solvent reaches the top level of the aluminium oxide layer.
8.2 Test portion
Weigh, to the nearest 1 mg, about 250 mg of the test sample into a 25 ml flask (6.1), proceed with 8.3.
For fats and oils with a low sterol content (for example less than 2 000 mg per kilogram) or for other
reasons, proceed using a threefold amount of the test sample. Adjust reagents and apparatus accordingly.
8.3 Extraction of the unsaponifiable matter
Add exactly 1,00 ml of internal standard solution (5.2) to the test portion (8.2). Add 5 ml of ethanolic
potassium hydroxide solution (5.1) and a few anti-bumping granules. Attach the reflux condenser (6.2)
to the flask and keep the contents gently boiling for 15 min. Stop heating. Immediately dilute the contents
of the flask while still hot with 5 ml of ethanol (5.3) and swirl or shake to homogenize.
Pipette 5 ml of this solution onto the prepared aluminium oxide column (8.1). Collect the eluate in a
50 ml round-bottom flask (6.1) and allow the column to run off until the solvent level has reached the top
level of the aluminium oxide layer. Elute the unsaponifiable matter first with 5 ml of ethanol (5.3) and
then with 30 ml of diethyl ether (5.5), with a flow rate of about 2 ml/min. Remove the solvents from the
flask by means of the rotary evaporator (6.4).
WARNING — The aluminium oxide column is essential for this procedure. It shall not be replaced
by silica or other columns or by solvent extraction.
8.4 Thin-layer chromatography
Dissolve the unsaponifiable matter obtained in 8.3 in a small amount (approximately 0,5 ml) of diethyl
ether (5.5). Apply the solution as a line at a distance of 2 cm from the lower edge onto a TLC plate (5.6)
using the microsyringe (6.6). Leave a gap of at least 3 cm from each side edge of the plate. Apply a spot of
5 µl of the TLC standard solution (5.8) at 1,5 cm from the edge. Fill the developing tank (6.5) with about
100 ml of developing solvent (5.7). Place the plate into the tank and develop it until the solvent reaches
the upper edge. Remove the plate from the tank and allow the solvent to evaporate in a fume cupboard.
NOTE Quantitative transfer of the material (8.3) to the TLC plate is not necessary in this step. Automatic
apparatus for applying streaks may be used. Saturation of the chamber is not required.
8.5 Isolation of the sterols
Spray the plates with methanol (5.9) until the sterol (and betulin) zones appear white on a translucent
(darker) background. The cholestanol is part of the Δ5-sterol zone (see Figure A.1). Mark the zones at
the height of the standard spots 2 mm above and 4 mm below the visible zones (see Figure A.1). Scratch
off this part of the layer completely using a spatula and quantitatively collect the silica in a small beaker.
NOTE 1 The wider margin at the lower edge of the visible zones (4 mm vs. 2 mm at the upper edge) is a precaution
to avoid partial loss of betulin in this step. Sunflower seed oil may show three bands (∆5-sterols, ∆7-sterols and
betulin).
NOTE 2 Betulin, if used as internal standard, appears slightly below the sterol zone (see Figure A.1).
Add 0,5 ml of ethanol to the collected silica gel. Extract the silica gel in the beaker three times with 5 ml
of diethyl ether (5.5) and filter into a flask (6.1). Reduce the combined ether extracts to about 1 ml in
4 © ISO 2014 – All rights reserved
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 12228-1:2014(E)
the rotary evaporator (6.4) and transfer the remaining solution into the reaction vial (6.9). Blow off the
solvent in the reaction vial with a stream of nitrogen.
8.6 Preparation of sterol trimethylsilyl ethers
Add 100 µl of the silylation reagent (5.10) to the reaction vial (6.9) containing the isolated sterols. Seal
and heat the vial for 15 min in the oven set at (105 ± 3) °C. Allow the reaction vial to cool to room
temperature and inject the solution directly into the gas chromatograph (6.10).
8.7 Gas chromatography
Optimize the temperature programme and the carrier gas flow rate so that chromatograms similar to
Figures A.2 to A.7 are obtained. Test the separation with silylated sterol fractions obtained from known
oils, as shown in Figures A.2 to A.7.
NOTE 1 The following parameters were tested and found useful (see chromatograms in Annex A): GC column:
SE-54, 50 m length, 0,25 mm internal diameter, 0,10 µm film thickness; carrier gas H , carrier gas flow rate 36 cm/s,
2
split 1:20, detector/injector 320° C, temperature programme 245 °C to 265 °C at 5 °C/min, 40 min isothermal at
265 °C; injection volume 1 µl. Capillary columns of equivalent quality can be used.
NOTE 2 A standard solution containing cholesterol, campesterol, stigmasterol, and sitosterol may be used to
check the retention times. Use a blank run to test for possible contamination (e.g. cholesterol) from solvents, glass
walls, filter, fingerprints, etc.
9 Expression of results
9.1 Identification of sterols
To identify the sterols present in the test sample, determine the relative retention times (RRT) by
dividing the retention time (RT) of the sterol in question by the RT of cholesterol and/or betulin. Table 1
shows the RRT of the various sterols corresponding to cholesterol (RRT ) and betulin (RRT ), with SE-
C B
54 stationary phase.
NOTE The RRT in Table 1 (determined under the conditions of note 1 in 8.7) are mentioned as an aid for the
identification of the individual sterols only, and to illustrate the elution sequence (cf. also Figure A.1). The actual
RRT found may deviate slightly from the RRT given in Table 1 because the RRT depends on the experimental
conditions (type and length of GLC column, temperature programme, and quality of stationary phase).
9.2 Composition of sterols
Calculate the mass fraction w , of the individual sterol i, in g/100 g (percent), according to the following
i
equation:
A
i
w =⋅100 (1)
i
A
∑
where
A is the area of the peak of sterol i;
i
∑A is the sum of the peak areas of all sterols (peaks 1, 3 to 16 or 1 to 16, if betulin is used).
© ISO 2014 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 12228-1:2014(E)
Table 1 — Gas chromatograhic peak identification of individual sterols and betulin by RRT (SE-
54 stationary phase)
P e a k
Common names of sterols Systematic names of sterols RRT RRT
C B
No
1 Cholesterol Cholest-5-en-3β-ol 1,00 0,44
2 Cholestanol 5α-Cholestan-3β-ol 1,02 0,45
3 Brassicasterol [24S]-24-Methyl cholesta-5,22-dien-3β-ol 1,09 0,48
4 24-Methylene cholesterol 24-Methylene cholesta-5,24-dien-3β-ol 1,21 0,53
5 Campesterol [24R]-24-Methyl cholest-5-en-3β-ol 1,23 0,54
6 Campestanol [24R]-24-Methyl cholestan-3β-ol 1,25 0,55
7 Stigmasterol [24S]-24-Ethyl cholesta-5,22-dien-3β-ol 1,31 0,57
8 ∆7-Campesterol [24R]-24-Methyl cholest-7-en-3β-ol 1,38 0,59
9 ∆5,23-Stigmastadienol [24R,S]-24-Ethyl cholesta-5,23-dien-3β-ol 1,40 0,60
10 Clerosterol [24S]-24-Ethyl cholesta-5,25-dien-3β-ol 1,42 0,62
11 Sitosterol [24R]-24-Ethyl cholest-5-en-3β-ol 1,47 0,64
12 Sitostanol [24R]-24-Ethyl cholestan-3β-ol 1,50 0,65
13 ∆5-Avenasterol [24Z]-24(28)-Ethylidene cholest-5-en-3β-ol 1,52 0,66
14 ∆5,24-Stigmastadienol [24R,S]-24-Ethyl cholesta-5,24-dien-3β-ol 1,59 0,69
15 ∆7-Stigmastenol [24R,S]-24-Ethyl cholest-7-en-3β-ol 1,65 0,72
16 ∆7-Avenasterol [24Z]-24(28)-Ethylidene cholest-7-en-3β-ol 1,70 0,74
X (Erythrodiol) 2,03 0,88
Y (Uvaol) 2,17 0,95
17 Betulin Lup-20[29]-ene-3β,28-diol 2,30 1,00
RRT : relative retention time based on cholesterol = 1,00
C
RRT : relative retention time based on betulin = 1,00
B
NOTE Sitosterol may coelute together with α-spinasterol and ∆7,22,25-stigmastatrienol. [24R]-24-Ethyl cholesta-7,25(27)-
dien-3β-ol is present in sterols of sunflower and pumpkin seed oil and may coelute with peak 14 (∆5,24- stigmastadienol).
9.3 Determination of the total sterol content
For the purposes of this method, it is assumed that the response factors of all sterols and of betulin are
equal.
NOTE In several tests silylated sterols and silylated betulin in equal amounts gave the same detector response
using an FID detector under these conditions.
6 © ISO 2014 – All rights reserved
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 12228-1:2014(E)
Calculate the total sterol content w, in milligrams per kilogram of fat, according to Formula (2):
()Am⋅⋅1000
IS
∑
w= (2)
Am⋅
IS
where
m is the mass of the internal standard (cholestanol) in milligrams;
IS
∑ (A) is the sum of the peak areas of all sterols (peaks 1, 3 to 16 or 1 to 16, if betulin is used);
A is the peak area of the internal standard;
IS
m is the mass of the test sample, in grams.
For calculation of the total sterol content, consider all peaks of sterols beginning with cholesterol and
ending with ∆7-avenasterol (peak 16), but without erythrodiol and uvaol (peaks X and Y).
10 Precision
10.1 Interlaboratory test
Details of an interlaboratory test on the precision of the method are summarized in Annex B. The values
derived from this interlaboratory test may not be applicable to concentration ranges and matrices other
than those given.
10.2 Repeatability limit, r
The repeatability limit (r) is the value less than or equal to which the absolute difference between two
test results obtained under repeatability conditions may be expected to be with a probability of 95 %.
Repeatability conditions are conditions where independent test results are obtained with the same
method on identical test items in the same laboratory by the same operator using the same equipment
within short intervals of time.
10.3 Reproducibility limit, R
The reproducibility limit (R) is the value less than or equal to which the absolute difference between two
test results obtained under reproducibility conditions may be expected to be with a probability of 95 %.
Reproducibility conditions are conditions where independent test results are obtained with the
same method on identical test items in different laboratories with different operators using different
equipment within short intervals of time.
11 Test report
The test report shall specify:
a) all information necessary for the complete identification of the sample;
b) the sampling method used, if known;
c) the test method used, together with reference to this part of ISO 12228 (i.e. ISO 12228-1);
d) all operating details not specified in this International Standard, or regarded as optional, together
with details of any incidents which may have influenced the test result(s);
e) the test result(s) obtained; or if the repeatability has been checked, the final quoted result obtained.
© ISO 2014 – All rights reserved 7
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 12228-1:2014(E)
Annex A
(informative)
Figures
Key
1 triterpenes
2 methyl sterols
3 cholestanol and Δ5-sterols
4 Δ7-sterols
5 betulin
6 start
NOTE Zones appear white on a transparent background. The hatched area is scratched off; note wider margin
at the bottom (4 mm vs. 2 mm at the top). Rf values of the bands: betulin 0,30; ∆7-sterols 0,33; ∆5-sterols 0,35;
methyl sterols 0,45; triterpenes 0,53.
Figure A.1 — TLC isolation of sterols from unsaponifiable matter (steps 8.3 and 8.4)
8 © ISO 2014 – All rights reserved
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 12228-1:2014(E)
NOTE Identification of the peak numbers is according to Table 1. Conditions are as in NOTE 1 of 8.7.
Figure A.2 — GLC of sterols from corn oil (Sample A)
© ISO 2014 – All rights reserved 9
---------------------- Page: 13 ----------------------
ISO 12228-1:2014(E)
NOTE Identification of the peak numbers is according to Table 1. Conditions are as in NOTE 1 of 8.7.
Figure A.3 — GLC of sterols from refined sunflower seed oil (Sample B)
10 © ISO 2014 – All rights reserved
---------------------- Page: 14 ----------------------
ISO 12228-1:2014(E)
NOTE Identification of the peak numbers is according to Table 1. Conditions are as in NOTE 1 of 8.7.
Figure A.4 — GLC of sterols from refined safflower seed oil (Sample C)
© ISO 2014 – All rights reserved 11
---------------------- Page: 15 ----------------------
ISO 12228-1:2014(E)
NOTE Identification of the peak numbers is according to Table 1. Conditions are as in NOTE 1 of 8.7.
Figure A.5 — GLC of sterols from refined rapeseed oil (Sample D)
12 © ISO 2014 – All rights reserved
---------------------- Page: 16 ----------------------
ISO 12228-1:2014(E)
NOTE
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 12228-1
Première édition
2014-07-15
Version corrigée
2015-05-15
Détermination de la teneur en stérols
individuels et totaux — Méthode par
chromatographie en phase gazeuse —
Partie 1:
Corps gras d’origines animale et
végétale
Determination of individual and total sterols contents — Gas
chromatographic method —
Part 1: Animal and vegetable fats and oils
Numéro de référence
ISO 12228-1:2014(F)
©
ISO 2014
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 12228-1:2014(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2014
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2014 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 12228-1:2014(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 3
7 Échantillon . 3
7.1 Échantillonnage . 3
7.2 Préparation de l’échantillon pour essai . 4
8 Mode opératoire. 4
8.1 Préparation de la colonne d’oxyde d’aluminium . 4
8.2 Prise d’essai . 4
8.3 Extraction de l’insaponifiable . 4
8.4 Chromatographie sur couche mince . 4
8.5 Isolement des stérols . 4
8.6 Préparation des triméthylsilyléthers stéroliques . 5
8.7 Chromatographie en phase gazeuse . 5
9 Expression des résultats. 5
9.1 Identification des stérols . 5
9.2 Composition des stérols . 6
9.3 Détermination de la teneur en stérols totaux . 6
10 Fidélité . 7
10.1 Essai interlaboratoires . 7
10.2 Limite de répétabilité, r . 7
10.3 Limite de reproductibilité, R . 7
11 Rapport d’essai . 7
Annexe A (informative) Figures . 9
Annexe B (informative) Essai interlaboratoires .16
Bibliographie .25
© ISO 2014 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 12228-1:2014(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de
la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’OMC concernant
les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos — Informations
supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 11, Corps gras d’origines animale et végétale.
Conjointement avec l’ISO 12228-2, cette première édition de l’ISO 12228-1 annule et remplace
l’ISO 12228:1999, qui a fait l’objet d’une révision technique.
L’ISO 12228 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Détermination de la teneur
en stérols individuels et totaux — Méthode par chromatographie en phase gazeuse:
— Partie 1: Corps gras d’origines animale et végétale
— Partie 2: Huile d’olive et huile de grignons d’olive
La présente version corrigée de l’ISO 12228-1: 2014 incorpore les corrections suivantes:
— À l’Annexe B, les données figurant dans les tableaux ont été modifiées et un nouveau tableau pour le
ß-Sitostérol (Tableau B.11) a été ajouté.
iv © ISO 2014 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 12228-1:2014(F)
Détermination de la teneur en stérols individuels et
totaux — Méthode par chromatographie en phase
gazeuse —
Partie 1:
Corps gras d’origines animale et végétale
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 12228 spécifie un mode opératoire de détermination, par chromatographie
en phase gazeuse, de la teneur et de la composition des stérols contenus dans les corps gras d’origines
animale et végétale. Toutefois, la détermination de la teneur et de la composition des stérols contenus
dans les huiles d’olive et de grignons d’olive doit être réalisée en utilisant l’ISO 12228-2.
2 Références normatives
Les documents suivants, en tout ou partie, sont référencés de manière normative dans le présent
document et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée
s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y
compris les éventuels amendements).
ISO 661, Corps gras d’origines animale et végétale — Préparation de l’échantillon pour essai
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
composition des stérols
composition des stérols individuels contenus dans l’échantillon, en commençant par le cholestérol et en
terminant par le ∆7-avénastérol (voir le Tableau 1), dans les conditions spécifiées par la présente partie
de l’ISO 12228
Note 1 à l’article: La composition est exprimée en pourcentage d’aire de pic, ramenée à 100 %.
3.2
teneur en stérol total
masse de la somme de tous les stérols individuels, déterminée selon la méthode spécifiée dans la présente
partie de l’ISO 12228, en commençant par le cholestérol et en terminant par le ∆7-avénastérol (voir le
Tableau 1), divisée par la masse de la prise d’essai
Note 1 à l’article: La teneur est exprimée en milligrammes par kilogramme.
4 Principe
Saponification à reflux d’une prise d’essai par une solution éthanolique d’hydroxyde de potassium.
Isolement de l’insaponifiable par extraction en phase solide sur une colonne d’oxyde d’aluminium.
Utilisation de cette colonne pour retenir les anions d’acides gras tandis que les stérols traversent la
colonne. Séparation de la fraction stérolique de l’insaponifiable par chromatographie sur couche
© ISO 2014 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 12228-1:2014(F)
mince, puis détermination de la composition qualitative et quantitative de la fraction stérolique par
chromatographie en phase gazeuse, en utilisant du cholestanol ou de la bétuline comme étalon interne.
5 Réactifs
AVERTISSEMENT — L’attention est attirée sur les réglementations qui spécifient la manipulation
des substances dangereuses. Les mesures de sécurité d’ordre technique, organisationnel et
personnel doivent être respectées.
Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue, et de l’eau de
[1]
qualité 3, conformément à l’ISO 3696 .
5.1 Hydroxyde de potassium (KOH), solution éthanolique, avec une concentration molaire c(KOH)
d’environ 0,5 mol/l.
Dissoudre 3 g d’hydroxyde de potassium dans 5 ml d’eau et diluer à 100 ml avec de l’éthanol (5.3). Il
convient que la solution soit incolore ou de couleur paille.
5.2 Solution étalon interne, cholestanol (5α-cholestan-3β-ol) ou bétuline, avec une fraction volumique
de la solution à 1,0 mg/ml dans de l’éthanol (voir la Note en 5.10).
NOTE En cas d’huiles hydrogénées, susceptibles de contenir du cholestanol, il est recommandé d’utiliser de
la bétuline (pic 17 du Tableau 1).
5.3 Éthanol, de fraction volumique minimale φ = 95 %.
5.4 Oxyde d’aluminium, neutre, de granulométrie comprise entre 0,063 mm et 0,200 mm, d’activité I
(teneur en eau = 0 %).
5.5 Éther diéthylique, fraîchement distillé, exempt de peroxydes et de résidus.
AVERTISSEMENT — L’éther diéthylique est hautement inflammable et peut engendrer la
formation de peroxydes explosifs. Les limites d’explosion dans l’air sont comprises entre 1,7 % et
48 % (fraction volumique). Des précautions particulières doivent être prises lors de l’utilisation
de cette substance. Tenir à l’écart des sources de chaleur et des rayons du soleil.
5.6 Plaques de chromatographie sur couche mince (CCM) au gel de silice, disponibles dans le
commerce mesurant 20 cm x 20 cm, l’épaisseur de la couche étant de 0,25 mm.
5.7 Solvant de développement, hexane/éther diéthylique.
La fraction volumique de chaque solvant est de 50 ml/100 ml.
5.8 Solution étalon pour chromatographie sur couche mince, avec une fraction volumique de
1,0 mg/ml de cholestérol/cholestanol dans de l’acétone ou 5,0 mg/l de bétuline dans de l’acétone.
NOTE 1 Le cholestérol et le cholestanol ont la même valeur Rf (0,35) en CCM tandis que la valeur Rf de la
bétuline est de 0,30 (voir la Figure A.1).
NOTE 2 En cas d’huiles hydrogénées, susceptibles de contenir du cholestanol, il est recommandé d’utiliser de
la bétuline (pic 17 du Tableau 1).
5.9 Réactif de révélation, méthanol.
5.10 Réactif silylant, préparé en ajoutant 50 μl de 1-méthylimidazole à 1 ml de N-méthyl-N-
(triméthylsilyl)-heptafluorobutyramide (MSHFBA).
2 © ISO 2014 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 12228-1:2014(F)
NOTE Des solutions prêtes à l’emploi sont disponibles dans le commerce. D’autres réactifs de silylation, par
exemple le bis(triméthylsilyl)trifluoroacétamide avec 1 % de triméthylchlorosilane, sont également disponibles
et peuvent être utilisés lorsque le cholestanol est utilisé comme étalon interne. Toutefois, des précautions
particulières doivent être prises avec la bétuline pour s’assurer que les deux groupes hydroxyle de la bétuline
sont silylés. Dans le cas contraire, la bétuline peut présenter deux pics sur le chromatogramme.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Ballons, de 25 ml et 50 ml de capacité, à col rodé.
6.2 Réfrigérant à reflux, muni d’un joint rodé s’adaptant aux ballons (6.1).
6.3 Colonne en verre, munie d’un robinet en polytétrafluoroéthylène (PTFE), d’un verre fritté et d’un
réservoir d’une capacité de 100 ml, mesurant 25 cm de longueur et 1,5 cm de diamètre interne.
6.4 Évaporateur rotatif, relié à une pompe à vide, avec un bain-marie maintenu à 40 °C.
6.5 Cuve de développement, en verre, muni d’un couvercle en verre rodé, pouvant être utilisé avec des
plaques de 20 cm x 20 cm.
6.6 Microseringue, de 100 μl de capacité.
6.7 Étuve, maintenue à 105 °C ± 3 °C.
6.8 Dessiccateur, contenant un déshydratant pour la conservation des plaques.
6.9 Tubes de réaction, de 0,3 ml à (1,0 à 1,5) ml de capacité, munie d’un bouchon à vis et d’un joint
d’étanchéité en PTFE, servant à la préparation des dérivés des stérols.
6.10 Chromatographe en phase gazeuse, équipé pour colonnes capillaires, avec injecteur-diviseur,
détecteur à ionisation de flamme et enregistreur adéquat.
6.11 Colonne capillaire, en silice fondue ou en verre, de 25 m à 60 m de longueur, de 0,2 mm à 0,25 mm
de diamètre intérieur, à phase stationnaire SE-54 (ou phase non polaire équivalente, avec une température
limite d’au moins 280 °C à 300 °C); film d’environ 0,1 μm d’épaisseur.
NOTE Une meilleure résolution des pics est obtenue avec un film de 0,1 µm d’épaisseur.
6.12 Microseringue pour chromatographie en phase gazeuse, destinée à injecter des volumes de
1 µl.
6.13 Balance analytique, capable de peser à 0,001 g près et d’afficher les valeurs à 0,000 1 g près.
7 Échantillon
7.1 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente partie de l’ISO 12228. Une
[1]
méthode d’échantillonnage recommandée est indiquée dans l’ISO 5555 .
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou
modifié lors du transport ou de l’entreposage.
© ISO 2014 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 12228-1:2014(F)
7.2 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai conformément à l’ISO 661.
8 Mode opératoire
8.1 Préparation de la colonne d’oxyde d’aluminium
Mettre en suspension 10 g d’oxyde d’aluminium (5.4) dans 20 ml d’éthanol (5.3) et verser la bouillie
obtenue dans la colonne en verre (6.3). Laisser reposer l’oxyde d’aluminium et le solvant s’écouler hors
de la colonne, jusqu’à ce que le niveau du solvant atteigne le sommet de la couche d’oxyde d’aluminium.
8.2 Prise d’essai
Peser, à 1 mg près, environ 250 mg de l’échantillon pour essai et les introduire dans un ballon de 25 ml
(6.1). Passer au paragraphe 8.3.
Dans le cas des corps gras présentant une faible teneur en stérols (par exemple, moins de 2 000 mg
par kilogramme) ou pour d’autres raisons, poursuivre en utilisant une quantité trois fois plus élevée
d’échantillon pour essai. Ajuster les réactifs et l’appareillage en conséquence.
8.3 Extraction de l’insaponifiable
Ajouter exactement 1,00 ml de solution étalon interne (5.2) à la prise d’essai (8.2). Ajouter 5 ml de solution
éthanolique d’hydroxyde de potassium (5.1), ainsi que quelques granulés régulateurs d’ébullition. Relier
le réfrigérant à reflux (6.2) au ballon et porter lentement son contenu à ébullition pendant 15 min.
Arrêter de chauffer. Diluer immédiatement le contenu du ballon, pendant qu’il est encore chaud, avec
5 ml d’éthanol (5.3) et faire tournoyer ou agiter pour obtenir l’homogénéisation.
Prélever, à l’aide d’une pipette, 5 ml de cette solution et les verser dans la colonne d’oxyde d’aluminium
(8.1). Recueillir la substance résultant de l’élution dans un ballon de 50 ml (6.1) et laisser reposer la
colonne jusqu’à ce que le niveau du solvant ait atteint la tête de la colonne d’oxyde d’aluminium. Procéder
à l’élution de l’insaponifiable, en utilisant tout d’abord 5 ml d’éthanol (5.3), puis avec 30 ml d’éther
diéthylique (5.5), en appliquant un débit d’environ 2 ml/min. Évaporer les solvants contenus dans le
ballon, à l’aide de l’évaporateur rotatif (6.4).
AVERTISSEMENT — L’emploi de la colonne d’oxyde d’aluminium est fondamental pour ce mode
opératoire. Elle ne doit pas être remplacée par des colonnes de silice ou d’autres colonnes ni par
d’autres solvants d’extraction.
8.4 Chromatographie sur couche mince
Dissoudre l’insaponifiable obtenu en 8.3 dans une petite quantité (environ 0,5 ml) d’éther diéthylique
(5.5). Appliquer la solution sous forme de bande, à une distance de 2 cm du bord inférieur d’une plaque
CCM (5.6), en utilisant la microseringue (6.6). Laisser un espace d’au moins 3 cm de chaque bord de la
plaque. Appliquer une goutte de 5 μl de solution étalon CCM (5.8) à 1,5 cm du bord. Remplir la cuve de
développement (6.5) avec environ 100 ml de solvant de développement (5.7). Mettre la plaque dans la
cuve et procéder au développement jusqu’à ce que le solvant atteigne le bord supérieur. Ôter la plaque de
la cuve et laisser le solvant s’évaporer sous une hotte aspirante.
NOTE Il n’est pas nécessaire, à ce stade, de procéder au transvasement quantitatif du matériau (8.3) sur la
plaque CCM. Il est possible d’utiliser un appareillage automatique pour l’application des dépôts d’échantillons.
Aucune chambre de saturation n’est nécessaire.
8.5 Isolement des stérols
Vaporiser les plaques avec du méthanol (5.9) jusqu’à ce que la couleur blanche des zones stérolique (et
bétulinique) ressorte sur un fond translucide (plus sombre). Le cholestanol fait partie de la zone des Δ5-
4 © ISO 2014 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 12228-1:2014(F)
stérols (voir la Figure A.1). Marquer les zones à hauteur des dépôts d’étalon, 2 mm au-dessus et 4 mm
au-dessous des zones visibles (voir la Figure A.1). Gratter entièrement cette partie de la couche à l’aide
d’une spatule et recueillir quantitativement la silice dans un bécher de faible capacité.
NOTE 1 La marge plus grande prise sur le bord inférieur des zones visibles (4 mm contre 2 mm sur le bord
supérieur) est une précaution visant à éviter les pertes partielles de bétuline à ce stade. L’huile de tournesol peut
présenter trois bandes (∆5-stérols, ∆7-stérols et bétuline).
NOTE 2 La bétuline, si elle est utilisée comme étalon interne, apparaît légèrement en dessous de la zone des
stérols (voir la Figure A.1).
Ajouter 0,5 ml d’éthanol au gel de silice recueilli. Procéder à l’extraction du gel de silice à l’intérieur du
bécher, à trois reprises, en utilisant 5 ml d’éther diéthylique (5.5) et en le filtrant dans un ballon (6.1).
Réduire les extraits d’éther combinés à environ 1 ml à l’aide de l’évaporateur rotatif (6.4) et transvaser
la solution restante dans le tube de réaction (6.9). Éliminer le solvant contenu dans le tube de réaction
en appliquant un courant d’azote.
8.6 Préparation des triméthylsilyléthers stéroliques
Ajouter 100 μl de réactif silylant (5.10) dans le tube de réaction (6.9) contenant les stérols isolés. Obturer
et faire chauffer le tube pendant 15 min à l’intérieur de l’étuve à (105 ± 3) °C. Laisser le flacon de réaction
refroidir à la température ambiante et injecter directement la solution dans le chromatographe en phase
gazeuse (6.10).
8.7 Chromatographie en phase gazeuse
Optimiser le programme de température et le débit du courant gazeux, de façon à obtenir des
chromatogrammes similaires à ceux des Figures A.2 à A.7. Faire un essai de séparation à l’aide des
fractions de stérols silylés provenant d’huiles connues, comme indiqué aux Figures A.2 à A.7.
NOTE 1 Les paramèt res suivant s ont fait l’objet d’essais et se sont révélés sat isfaisant s (voir les chromatogrammes
de l’Annexe A): colonne de CPG: SE-54, 50 m de longueur, 0,25 mm de diamètre intérieur, 0,10 μm d’épaisseur de
film; gaz vecteur: H , vélocité du gaz vecteur: 36 cm/s, division: 1:20, détecteur/injecteur: 320 °C, programme
2
de température: entre 245 °C et 265 °C à 5 °C/min, isotherme à 265 °C pendant 40 min; volume injecté: 1 μl. Des
colonnes capillaires de qualité équivalente peuvent être utilisées.
NOTE 2 Il est possible d’employer une solution étalon contenant du cholestérol, du campestérol, du stigmastérol
et du sitostérol pour contrôler les temps de rétention. Effectuer un essai à blanc (par exemple cholestérol) afin de
dépister une contamination éventuelle provenant des solvants, des parois de verre, du filtre, des empreintes de
doigts, etc.
9 Expression des résultats
9.1 Identification des stérols
Pour identifier les stérols présents dans l’échantillon pour essai, déterminer les temps de rétention
relatifs (TRR) en divisant le temps de rétention (TR) du stérol concerné par le TR du cholestérol et/ou
de la bétuline. Le Tableau 1 indique les TRR des différents stérols correspondant respectivement au
cholestérol (TRR ) et à la bétuline (TRR ), avec la phase stationnaire SE-54.
C B
NOTE Les TRR mentionnés dans le Tableau 1 (déterminés selon les conditions de la Note 1 en 8.7) ont
uniquement pour but de favoriser l’identification des stérols individuels et d’illustrer la séquence d’élution (voir
également la Figure A.1). Les valeurs de TRR réelles peuvent s’écarter légèrement des TRR mentionnés dans
le Tableau 1, du fait de la variabilité du TRR en fonction des conditions expérimentales (type et longueur de la
colonne CPG, programme de température et qualité de la phase stationnaire).
© ISO 2014 – Tous droits réservés 5
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 12228-1:2014(F)
9.2 Composition des stérols
Calculer la masse w , du stérol i, en g/100 g (pourcentage), à l’aide de l’équation suivante:
i
A
i
w =⋅100 (1)
i
A
∑
où
A est l’aire de pic du stérol i;
i
∑A est la somme des aires de pic relatives à l’ensemble des stérols (pics 1, 3 à 16 ou 1 à 16, si de la
bétuline est utilisée).
Tableau 1 — Identification par TRR des pics de chromatographie en phase gazeuse des stérols
individuels et de la bétuline (phase stationnaire SE-54)
Pic n° Dénominations usuelles des stérols Dénominations systématiques des stérols TRR TRR
C B
1 Cholestérol Cholest-5-en-3β-ol 1,00 0,44
2 Cholestanol 5α-Cholestan-3β-ol 1,02 0,45
3 Brassicastérol [24S]-24-Méthyl-cholesta-5,22-dien-3β-ol 1,09 0,48
4 24-Méthylène cholestérol 24-Méthylène-cholesta-5,24-dien-3β-ol 1,21 0,53
5 Campestérol [24R]-24-Méthyl-cholest-5-en-3β-ol 1,23 0,54
6 Campestanol [24R]-24-Méthyl-cholestan-3β-ol 1,25 0,55
7 Stigmastérol [24S]-24-Éthyl-cholesta-5,22-dien-3β-ol 1,31 0,57
8 ∆7-Campestérol [24R]-24-Méthyl-cholest-7-en-3β-ol 1,38 0,59
9 ∆5,23-Stigmastadiénol [24R,S]-24-Éthyl-cholesta-5,23-dien-3β-ol 1,40 0,60
10 Clérostérol [24S]-24-Éthyl-cholesta-5,25-dien-3β-ol 1,42 0,62
11 Sitostérol [24R]-24-Éthyl-cholest-5-en-3β-ol 1,47 0,64
12 Sitostanol [24R]-24-Éthyl-cholestan-3β-ol 1,50 0,65
13 ∆5-Avenastérol [24Z]-24(28)-Éthylidène-cholest-5-en-3β-ol 1,52 0,66
14 ∆5,24-Stigmastadiénol [24R,S]-24-Éthyl-cholesta-5,24-dien-3β-ol 1,59 0,69
15 ∆7-Stigmasténol [24R,S]-24-Éthyl-cholest-7-en-3β-ol 1,65 0,72
16 ∆7-Avénastérol [24Z]-24(28)-Éthylidène-cholest-7-en-3β-ol 1,70 0,74
X (Érythrodiol) 2,03 0,88
Y (Uvaol) 2,17 0,95
17 Bétuline Lup-20[29]-ene-3β,28-diol 2,30 1,00
TRR : Temps de rétention relatif calculé sur la base du cholestérol = 1,00.
C
TRR : Temps de rétention relatif calculé sur la base de la bétuline = 1,00.
B
NOTE Le sitostérol peut se trouver en coélution avec l’α-spinastérol et avec le ∆7,22,25-stigmastatriénol. Le [24R]-24-
Éthyl-cholesta-7,25(27)-dien-3β-ol est présent dans les stérols de l’huile de tournesol et de graine de potiron et peut se
trouver en coélution avec le pic 14 (∆5,24-stigmastadiénol).
9.3 Détermination de la teneur en stérols totaux
Pour les besoins de la présente méthode, on suppose que les facteurs de réponse de tous les stérols et de
la bétuline sont égaux.
NOTE Lors de plusieurs essais, les stérols et la bétuline silylés ont, en quantité égale, donné une réponse
identique sur le détecteur, en utilisant un détecteur FID dans ces conditions.
6 © ISO 2014 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 12228-1:2014(F)
Calculer la teneur en stérols totaux, w, en milligrammes par kilogramme de matière grasse, à l’aide de
la Formule (2):
()Am⋅⋅1000
IS
∑
w= (2)
Am⋅
IS
où
m est la masse de l’étalon interne (cholestanol), en milligrammes;
IS
∑(A) est la somme des aires de pic relatives à l’ensemble des stérols (pics 1, 3 à 16 ou 1 à 16, si de
la bétuline est utilisée);
A est l’aire de pic de l’étalon interne;
IS
m est la masse de l’échantillon pour essai, en grammes.
Pour calculer la teneur en stérols totaux, prendre en compte tous les pics de stérols, en commençant par
le cholestérol et en terminant par le ∆7-avénastérol (pic 16), exceptés l’érythrodiol et l’uvaol (pics X et Y).
10 Fidélité
10.1 Essai interlaboratoires
Les détails d’un essai interlaboratoires relatif à la fidélité de la méthode sont résumés dans l’Annexe B. Les
valeurs dérivées de cet essai interlaboratoires peuvent ne pas s’appliquer aux plages de concentrations
et aux matrices autres que celles indiquées.
10.2 Limite de répétabilité, r
La limite de répétabilité (r) est la valeur au-dessous de laquelle ou à laquelle on doit s’attendre à ce que
se situe, avec une probabilit
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.