ISO 18465:2017

Microbiology of the food chain — Quantitative determination of emetic toxin (cereulide) using LC-MS/MS

ISO 18465:2017 describes the quantitative analysis of the emetic toxin cereulide using high performance liquid chromatography (HPLC) or ultra performance liquid chromatography (UHPLC) connected to a tandem mass spectrometer (LC-MS/MS). ISO 18465:2017 is applicable to the analysis of the toxin in products intended for human consumption.

Microbiologie de la chaîne alimentaire — Détermination quantitative de la toxine émétique (céreulide) par CL-SM/SM

ISO 18465:2017 décrit l'analyse quantitative de la toxine émétique céreulide par chromatographie liquide haute performance (CLHP) couplée à la chromatographie liquide ultra performance (CLUHP), connectée à un système de spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM). ISO 18465:2017 s'applique à l'analyse de la toxine dans les produits destinés à la consommation humaine.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 10-Jan-2017
• ICS: 07.100.30 - Food microbiology
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 9 - Microbiology
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 9 - Microbiology
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 14-Jul-2022

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 18465
First edition
2017-01
Microbiology of the food chain —
Quantitative determination of emetic
toxin (cereulide) using LC-MS/MS
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Détermination quantitative
de la toxine émétique (céreulide) par CL-SM/SM
Reference number
ISO 18465:2017(E)
©
ISO 2017

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ISO 18465:2017(E)

COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
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or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
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Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 General principle . 1
5 Reagents . 1
6 Apparatus and equipment . 3
7 Procedure. 4
7.1 Sample preparation . 4
7.2 Standard preparation . 4
7.3 LC-MS analysis . 5
7.3.1 LC conditions . . 5
7.3.2 MS conditions and tuning parameters . 5
7.3.3 Transitions (multiple reaction monitoring, MRM) . 6
8 Calculation . 6
9 Quality controls . 7
10 Precision . 8
10.1 General . 8
10.2 Repeatability . 8
10.3 Reproducibility . 9
Annex A (informative) Results of the interlaboratory study .10
[3]
Annex B (informative) Possible transitions of cereulide in MS .12
Bibliography .14
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ISO 18465:2017(E)

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity assessment,
as well as information about ISO’s adherence to the World Trade Organization (WTO) principles in the
Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL: www . i so .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 275, Food Analysis — Horizontal methods, in collaboration with ISO Technical
Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the
agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
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ISO 18465:2017(E)

Introduction
Cereulide, the emetic toxin produced in foods by certain strains of Bacillus cereus, is a heat and acid
stable toxin that causes nausea and vomiting when ingested. In very rare cases, people can die after
ingestion of the toxin. Due to its stability, the toxin may still be present even when B. cereus can no
longer be detected. The presence of cereulide seems to be linked to starch-rich foods like rice (dishes)
and pasta (dishes). However, recent data suggest that the occurrence of food borne outbreaks due to
[9]
cereulide is more common to foods in general . The toxin has a cyclic structure and consists of in
total 12 monomers as a repeat of (D-O-Leucine-D-Alanine-L-O-Valine-L-Valine). Several methods
have been developed for the detection and/or quantification of the toxin. Some of these methods are
[3, 4]
nonspecific bio-assays and other methods are specifically based on the chemical analysis using
liquid chromatography with mass spectrometry (LC-MS/MS) for the detection and quantification of the
[5, 6, 7, 8]
toxin . The chemical methods are more specific for cereulide and have, therefore, been chosen as
the starting point for standardization of a method for the quantification of cereulide. Recently, research
has been done for the chemodiversity of cereulide. At least 18 cereulide variants were detected by
n
UHPLC-TOFMS and ion-trap MS sequencing, among which the previously unknown isocereulides
[10]
A–G .
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 18465:2017(E)
Microbiology of the food chain — Quantitative
determination of emetic toxin (cereulide) using LC-MS/MS
1 Scope
This document describes the quantitative analysis of the emetic toxin cereulide using high performance
liquid chromatography (HPLC) or ultra performance liquid chromatography (UHPLC) connected to a
tandem mass spectrometer (LC-MS/MS).
This document is applicable to the analysis of the toxin in products intended for human consumption.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 1042, Laboratory glassware — One-mark volumetric flasks
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org/ obp
3.1
cereulide
toxin cyclo[D-O-Leucine-D-Alanine-L-O-Valine-L-Valine] produced by certain strains of the species of
3
B. cereus
4 General principle
13
Cereulide is extracted from the food matrix by shaking the sample with acetonitrile. C -Cereulide
6
is used as an internal standard. The components in the solution are separated using HPLC or UHPLC
and subsequently detected using tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). For MS, the electro spray
ionization technique (ESI) is used, using the positive mode. The level of emetic toxin (cereulide) is
expressed as μg cereulide/kg product.
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
5.1 Water, according to ISO 3696.
5.2 Acetonitrile, LC-MS grade.
© ISO 2017 – All rights reserved 1

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ISO 18465:2017(E)

5.3 Methanol, LC-MS grade.
5.4 Formic acid, 98 % to 100 % pro analyse grade.
13 1)
5.5 Synthetic C -Cereulide.
6
1)
5.6 Synthetic Cereulide.
5.7 Ammonium formate, pro analyse grade.
5.8 Mobile phase A, consisting of 10 mmol/l ammonium formate (5.7) with 0,1 % (v/v) formic acid
(5.4) in water (5.1).
5.9 Mobile phase B, consisting of 0,1 % (v/v) formic acid (5.4) in acetonitrile (5.2).
13
5.10 C -Cereulide–stock solution IS-A, ρ = 100 000 ng/ml (in methanol).
6
13
Weigh 10 mg to the nearest 0,01 mg C -Cereulide (5.5) into a glass volumetric flask (6.11) of 100 ml
6
and dissolve, make up to the mark with methanol (5.3). This solution is not corrected for the purity of
the compound. Store the solution in the freezer (6.15).
NOTE Cereulide (labelled and non-labelled) stock and standard solutions are extremely stable, meaning
over three years when stored in a freezer (6.15)
13
5.11 C -Cereulide–standard solution IS-B, ρ = 1 000 ng/ml (in methanol).
6
13
Pipette (6.10) 1 000 μl C -Cereulide stock solution IS-A (5.10) in a glass volumetric flask (6.11)
6
of 100 ml, make up to the mark with methanol (5.3) and mix the solution. Store the solution in the
freezer (6.15).
13
5.12 C -Cereulide–standard solution IS-C, ρ = 100 ng/ml (in acetonitrile).
6
13
Pipette (6.10) 500 μl C -Cereulide stock solution IS-A (5.10) in a glass volumetric flask (6.11) of 500 ml,
6
make up to the mark with acetonitrile (5.2) and mix. Store the solution in the freezer (6.15).
13
5.13 C - Cereulide–standard solution IS-D, ρ = 10 ng/ml (in acetonitrile).
6
13
Pipette (6.10) 1 000 μl C -Cereulide standard solution IS-B (5.11) in a glass volumetric flask (6.11)
6
of 100 ml, make up to the mark with acetonitrile (5.2) and mix. Store the solution in the freezer (6.15).
5.14 Cereulide–stock solution Cer-A, ρ = 100 000 ng/ml (in methanol).
Weigh 5 mg to the nearest 0,01 mg synthetic cereulide (5.6) into a glass volumetric flask (6.11) of 50 ml
and dissolve, make up to the mark with methanol (5.3). This solution is not corrected for the purity of
the compound. Store the solution in the freezer (6.15).
5.15 Cereulide–standard solution Cer-B, ρ = 100 ng/ml (in acetonitrile).
Pipette (6.10) 500 μl cereulide stock solution A (5.14) in a glass volumetric flask (6.11) of 500 ml, make
up to the mark with acetonitrile (5.2) and mix the solution. Store the solution in the freezer (6.15).
1) Chiralix is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience
of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
2 © ISO 2017 – All rights reserved

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ISO 18465:2017(E)

5.16 Cereulide–stock solution Cer-C, ρ = 10 ng/ml (in acetonitrile).
Pipette (6.10) 10 ml cereulide standard solution B (5.15) in a glass volumetric flask (6.11) of 100 ml,
make up to the mark with acetonitrile (5.2) and mix the solution. Store the solution in the freezer (6.15).
5.17 Positive control sample or spiked sample (level approximately 10 ng/g).
6 Apparatus and equipment
6.1 Tandem mass spectrometer, equipped with ESI interface (in positive mode) and multiple
reaction monitoring (MRM) mode.
LC system, pump system (HPLC or UHPLC), degasser, autosampler, column oven.
LC-MS software, suitable of data collection, integration.
6.2 LC column (C-18)
2)
For HPLC, Supelco Discovery® C-18, 100 mm × 2,1 mm, 5 μm or equivalent.
3)
For UHPLC, Waters BEH C-18, 100 mm or 50 mm × 2,1 mm, 1,7 μm or equivalent.
6.3 Centrifuge, capable of a centrifugal force of 1 000g to 1 500g for 50 ml tubes.
6.4 Centrifuge, capable of a centrifugal force of 10 000g to 12 000g for 2 ml tubes.
6.5 Centrifuge tubes, (plastic) with closing cap, 2 ml disposable.
6.6 Centrifuge tubes, (glass) with leakage free screw cap 50 ml.
6.7 Horizontal mechanical shaker, capable of holding 50 ml centrifuge tubes.
6.8 Analytical balance, accuracy to the nearest 0,01 mg.
6.9 Grinder, e.g. mixer, blender, cryogenic mixer.
6.10 Calibrated plunger pipettes, ranges from 10 μl to 100 μl, 100 μl to 1 000 μl, and 1 000 μl
to 5 000 μl, 2 000 μl to 10 000 μl.
6.11 Glass volumetric flasks, volume of 50 ml, 100 ml and 500 ml according to ISO 1042.
6.12 Glass autosampler vials, with snap/screw cap 2 ml.
6.13 PTFE membrane filters, diameter of 25 mm and 0,45 μm pore size.
6.14 Vortex mixer.
6.15 Freezer, capable of temperatures below −15 °C, preferably below −18 °C.
2) Supelco Discovery® is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
3) Waters BEH C-18 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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ISO 18465:2017(E)

7 Procedure
7.1 Sample preparation
Store the samples (before and during the experiment) in the freezer (6.15) to prevent growth of micro-
organisms.
Take (100 ± 25) g of a representative part of the sample and transfer it to a sample jar. In case the
amount of sample is limited (for example in case of samples involved in food poisoning), take as much
sample as possible and treat identical as the other samples. In this case, a note should be mentioned
when reporting the result. Homogenize the sample by grinding (6.9).
Weigh 2,5 g, to the nearest mg (6.8), of the homogenized sample into a centrifuge tube (6.6) and
pipette (6.10) 500 μl internal standard solution IS-C (5.12); close the tube with the screw top. Mix
(6.14) about 10 s and let the tubes rest for 30 min. Glass tubes should be used especially when solutions
are stored for a longer time. For short contact times, plastic tubes can be used as well. Add 29,5 ml
acetonitrile (5.2) and close the tube again with the screw top.
Place the tube(s) horizontally on the shaker (6.7) and shake firmly for approximately 1 h. After shaking,
centrifuge the tubes for 10 min at 1 000g to 1 500g (6.3). If the solution is clear without floating
particles, no filtration step is necessary. If not, filter the liquid phase using PTFE membrane filters
(6.13), or transfer 2 ml in a centrifuge tube (6.5) and centrifuge the solution at 10 000g to 12 000g (6.4)
for 10 min.
Fill an auto sampler vial (6.12) and close the vial with a cap. The samples are now ready for analysis.
7.2 Standard preparation
The standards should be prepared directly in the vials. Pipette (6.10) the volumes as specified in
13
Table 1 with cereulide stock solution Cer-C (5.16), acetonitrile (5.2) (see NOTE) and C -cereulide
6
stock solution IS-D (5.13) into a vial (6.12) and close the vial with a cap. Mix (6.14) the solution for 20 s.
NOTE If additional clean up is needed, heptane extraction may be used to reduce the interfering (fatty)
components. After adding 29,5 ml acetonitrile, add 10,0 ml heptane and close the tubes with a screw top. Place
the tube(s) horizontally on the shaker (6.7) and shake firmly for approximately 1 h. Centrifuge the tubes for 10
min at 1 000g to 1 500g (6.3). Proceed with the sample preparation with the lower acetonitrile layer.
Table 1 — Preparation of calibration standard solutions
a
Standard Cer-C (5.16) Acetonitrile (5.2) IS-D (5.13) Cereulide std
concentration
μl μl μl ng/ml
Standard 0 0 1 000 200 0,00
Standard 1 10 990 200 0,08
Standard 2 50 950 200 0,4
Standard 3 100 900 200 0,8
Standard 4 200 800 200 1,7
Standard 5 500 500 200 4,2
Standard 6 1 000 0 200 8,3
a 13
The concentration C -Cereulide in the calibration standard solutions is 1,7 ng/ml when adding 200 μl solution IS-D
6
(5.13)
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 18465
Première édition
2017-01
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Détermination
quantitative de la toxine émétique
(céreulide) par CL-SM/SM
Microbiology of the food chain — Quantitative determination of
emetic toxin (cereulide) using LC-MS/MS
Numéro de référence
ISO 18465:2017(F)
©
ISO 2017

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ISO 18465:2017(F)

DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ii © ISO 2017 – Tous droits réservés

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ISO 18465:2017(F)

Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe général . 1
5 Réactifs . 2
6 Appareillage et matériel . 3
7 Mode opératoire. 4
7.1 Préparation de l’échantillon . 4
7.2 Préparation des étalons . 4
7.3 Analyse par CL-SM . 5
7.3.1 Conditions CL . 5
7.3.2 Conditions SM et paramètres d’optimisation . 5
7.3.3 Transitions (MRM, multiple reaction monitoring) . 6
8 Calcul . 7
9 Contrôles de la qualité . 8
10 Fidélité . 8
10.1 Généralités . 8
10.2 Répétabilité . 9
10.3 Reproductibilité .10
Annexe A (informative) Résultats de l’étude interlaboratoires .11
[3]
Annexe B (informative) Transitions possibles du céreulide en spectrométrie de masse (SM) .13
Bibliographie .15
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ISO 18465:2017(F)

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet
de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO et l’IEC ne sauraient être tenues pour
responsables de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails
concernant les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés
lors de l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations
de brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation
de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation
mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien
suivant: http://www.iso.org/iso/fr/foreword.html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits
alimentaires — Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec
le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à
l’accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
iv © ISO 2017 – Tous droits réservés

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ISO 18465:2017(F)

Introduction
Le céreulide, la toxine émétique produite dans les aliments par certaines souches de Bacillus cereus, est
une toxine stable à la chaleur et aux acides qui entraîne des nausées et des vomissements lorsqu’elle est
ingérée. Dans des cas très rares, l’ingestion de la toxine peut entraîner la mort. En raison de sa stabilité,
la toxine peut être toujours présente même lorsque B. cereus ne peut plus être détecté. La présence
de céreulide semble liée aux aliments riches en amidon tels que le riz (et les plats à base de riz) et les
pâtes (et les plats à base de pâtes). Toutefois, des données récentes tendent à indiquer que la survenue
de toxi-infections alimentaires dues au céreulide est plus fréquente dans les aliments d’une manière
[9]
générale . La toxine, de structure cyclique, est constituée de 12 monomères au total, sous la forme
d’une répétition de la séquence (D-O-Leucine-D-Alanine-L-O-Valine-L-Valine). Plusieurs méthodes ont
été développées pour détecter et/ou quantifier la toxine. Certaines de ces méthodes sont des dosages
[3, 4]
biologiques non spécifiques et d’autres sont basées sur l’analyse chimique par chromatographie
[5, 6, 7, 8]
liquide couplée à la spectrométrie de masse (CL-SM/SM) pour détecter et quantifier la toxine .
Les méthodes chimiques étant plus spécifiques pour le céreulide, elles ont été choisies comme point
de départ pour la normalisation d’une méthode de quantification du céreulide. Récemment, des
recherches ont été menées sur la diversité chimique du céreulide. Au moins 18 variants de céreulide ont
n
été détectés par séquençage par SM à piège ionique et CLHUP-TOF-SM, parmi lesquels les isocéreulides
[10]
A–G précédemment inconnus.
© ISO 2017 – Tous droits réservés v

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NORME INTERNATIONALE ISO 18465:2017(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Détermination
quantitative de la toxine émétique (céreulide) par CL-SM/
SM
1 Domaine d’application
Le présent document décrit l’analyse quantitative de la toxine émétique céreulide par chromatographie
liquide haute performance (CLHP) couplée à la chromatographie liquide ultra performance (CLUHP),
connectée à un système de spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM).
Le présent document s’applique à l’analyse de la toxine dans les produits destinés à la consommation
humaine.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
ISO 1042, Verrerie de laboratoire — Fioles jaugées à un trait
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http://www.electropedia.org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http://www.iso.org/obp
3.1
céreulide
toxine cyclo[D-O-Leucine-D-Alanine-L-O-Valine-L-Valine] produite par certaines souches des espèces
3
de B. cereus
4 Principe général
Le céreulide est extrait de la matrice alimentaire par agitation de l’échantillon avec de l’acétonitrile. Le
13
C -céreulide est utilisé en tant qu’étalon interne. Les composants en solution sont séparés par CLHP
6
ou CLUHP, puis détectés par spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM). Le spectromètre de masse
est équipé d’une source d’ionisation par électronébulisation (ESI) utilisée en mode positif. Le taux de
toxine émétique (céreulide) est exprimé en µg de céreulide par kg de produit.
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ISO 18465:2017(F)

5 Réactifs
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
5.1 Eau, conformément à l’ISO 3696.
5.2 Acétonitrile, de qualité CL-SM.
5.3 Méthanol, de qualité CL-SM.
5.4 Acide formique, 98 % à 100 %, de qualité analytique.
13 1)
5.5 C -céreulide synthétique.
6
1)
5.6 Céreulide synthétique.
5.7 Formiate d’ammonium, de qualité analytique.
5.8 Phase mobile A, constituée de 10 mmol/l de formate d’ammonium (5.7) avec 0,1 % (v/v) d’acide
formique (5.4) dans l’eau (5.1).
5.9 Phase mobile B, constituée de 0,1 % (v/v) d’acide formique (5.4) dans l’acétonitrile (5.2).
13
5.10 Solution mère IS-A de C -céreulide, ρ = 100 000 ng/ml (dans le méthanol).
6
13
Introduire 10 mg à 0,01 mg près de C -céreulide (5.5) dans une fiole jaugée en verre (6.11) de 100 ml,
6
dissoudre le produit et ajuster au volume avec du méthanol (5.3). Cette solution n’est pas corrigée en
fonction de la pureté du composé. Conserver la solution au congélateur (6.15).
NOTE Les solutions mères et étalons (marquées et non marquées) de céreulide sont extrêmement stables,
c’est-à-dire pendant plus de trois ans lorsqu’elles sont conservées au congélateur (6.15).
13
5.11 Solution étalon IS-B de C -céreulide, ρ = 1 000 ng/ml (dans le méthanol).
6
13
Introduire à la pipette (6.10) 1 000 µl de solution mère IS-A (5.10) de C -céreulide dans une fiole
6
jaugée en verre (6.11) de 100 ml. Ajuster au volume avec du méthanol (5.3) et homogénéiser la solution.
Conserver la solution au congélateur (6.15).
13
5.12 Solution étalon IS-C de C -céreulide, ρ = 100 ng/ml (dans l’acétonitrile).
6
13
Introduire à la pipette (6.10) 500 µl de solution mère IS-A (5.10) de C -céreulide dans une fiole jaugée
6
en verre (6.11) de 500 ml. Ajuster au volume avec de l’acétonitrile (5.2) et homogénéiser. Conserver la
solution au congélateur (6.15).
13
5.13 Solution étalon IS-D de C -céreulide, ρ = 10 ng/ml (dans l’acétonitrile).
6
13
Introduire à la pipette (6.10) 1 000 µl de solution étalon IS-B (5.11) de C -céreulide dans une fiole
6
jaugée en verre (6.11) de 100 ml. Ajuster au volume avec de l’acétonitrile (5.2) et homogénéiser.
Conserver la solution au congélateur (6.15).
1) Chiralix est un exemple de produit adéquat et disponible dans le commerce. Cette information est donnée
à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande
l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
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5.14 Solution mère Cer-A de céreulide, ρ = 100 000 ng/ml (dans le méthanol).
Introduire 5 mg à 0,01 mg près de céreulide synthétique (5.6) dans une fiole jaugée en verre (6.11) de
50 ml, dissoudre le produit et ajuster au volume avec du méthanol (5.3). Cette solution n’est pas corrigée
en fonction de la pureté du composé. Conserver la solution au congélateur (6.15).
5.15 Solution étalon Cer-B de céreulide, ρ = 100 ng/ml (dans l’acétonitrile).
Introduire à la pipette (6.10) 500 µl de solution mère A de céreulide (5.14) dans une fiole jaugée en verre
(6.11) de 500 ml. Ajuster au volume avec de l’acétonitrile (5.2) et homogénéiser la solution. Conserver la
solution au congélateur (6.15).
5.16 Solution mère Cer-C de céreulide, ρ = 10 ng/ml (dans l’acétonitrile).
Introduire à la pipette (6.10) 10 ml de solution étalon B de céreulide (5.15) dans une fiole jaugée en verre
(6.11) de 100 ml. Ajuster au volume avec de l’acétonitrile (5.2) et homogénéiser la solution. Conserver la
solution au congélateur (6.15).
5.17 Échantillon témoin positif ou échantillon dopé (niveau 10 ng/g environ).
6 Appareillage et matériel
6.1 Spectromètre de masse en tandem, équipé d’une interface ESI (en mode positif) et du mode de
suivi de réactions multiples (multiple reaction monitoring, ou MRM).
Système CL, système de pompe (CLHP ou CLUHP), dégazeur, passeur d’échantillons, four pour colonne.
Logiciel CL-SM, adapté pour collecter et intégrer les données.
6.2 CL colonne (C-18)
2)
®
Pour l’CLHP, colonne Supelco Discovery C-18, 100 mm × 2,1 mm de 5 µm ou équivalente.
3)
Pour l’CLUHP, colonne Waters BEH C-18, 100 mm ou 50 mm × 2,1 mm, 1,7 μm ou équivalente.
6.3 Centrifugeuse, capable de centrifuger des tubes de 50 ml entre 1 000g et 1 500g.
6.4 Centrifugeuse, capable de centrifuger des tubes de 2 ml entre 10 000g et 12 000g.
6.5 Tubes à centrifuger, (en plastique) avec bouchon obturateur, 2 ml, jetables.
6.6 Tubes à centrifuger, (en verre) avec bouchon vissé sans fuite, 50 ml.
6.7 Agitateur mécanique horizontal, pouvant contenir des tubes à centrifuger de 50 ml.
6.8 Balance analytique, permettant des pesées à 0,01 mg.
6.9 Broyeur, par exemple mixeur, broyeur-mélangeur, broyeur cryogénique.
2) Supelco Discovery® est un exemple de produit adéquat et disponible dans le commerce. Cette information
est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou
recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
3) Waters BEH C-18 est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée
à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande
l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
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6.10 Pipettes à piston étalonnées, de capacités 10 μl à 100 μl, 100 μl à 1 000 μl et 1 000 μl à 5 000 μl,
2 000 μl à 10 000 μl.
6.11 Fioles jaugées en verre, de volumes 50 ml, 100 ml et 500 ml, etc. conformes à l’ISO 1042.
6.12 Flacons en verre pour passeur d’échantillons, avec bouchon vissé/à pression, 2 ml.
6.13 Filtres à membrane en PTFE, diamètre de 25 mm et taille de pore de 0,45 µm.
6.14 Agitateur vortex.
6.15 Congélateur, pouvant atteindre des températures inférieures à −15 °C, de préférence inférieures
à −18 °C.
7 Mode opératoire
7.1 Préparation de l’échantillon
Conserver les échantillons (avant et pendant l’expérience) au congélateur (6.15) afin d’éviter la
croissance des micro-organismes.
Prélever (100 ± 25) g d’une portion représentative de l’échantillon et les placer dans un flacon à
échantillon. Lorsque la quantité d’échantillon disponible est limitée (par exemple lorsque les échantillons
sont liés à une intoxication alimentaire), prélever autant d’échantillon que possible et procéder comme
pour les autres échantillons. Dans ce cas, il convient d’ajouter une note lors de l’expression du résultat.
Homogénéiser l’échantillon par broyage (6.9).
Introduire 2,5 g, au mg près (6.8), d’échantillon homogénéisé dans un tube à centrifuger (6.6). Ajouter
à la pipette (6.10) 500 μl de solution étalon interne IS-C (5.12) et boucher le tube avec le bouchon à vis.
Mélanger (6.14) pendant environ 10 s puis le laisser reposer pendant 30 min. Il convient d’utiliser des
tubes en verre, en particulier lorsque les solutions sont conservées longtemps. Quand le temps de contact
est réduit, des tubes en plastique peuvent également être employés. Ajouter 29,5 ml d’acétonitrile (5.2)
et fermer de nouveau le tube avec le bouchon vissé.
Placer le ou les tubes horizontalement sur l’agitateur (6.7) et agiter fermement pendant environ 1 h.
Après agitation, centrifuger les tubes pendant 10 min entre 1 000g et 1 500g (6.3). Si la solution est
claire sans particules flottantes, aucune étape de filtration n’est nécessaire. Sinon, filtrer la phase
liquide sur des filtres à membrane en PTFE (6.13), ou transférer 2 ml dans un tube à centrifuger (6.5) et
centrifuger la solution entre 10 000g et 12 000g (6.4) pendant 10 min.
Remplir un flacon pour passeur d’échantillons (6.12) et boucher le flacon. L’échantillon est alors prêt à
être analysé.
7.2 Préparation des étalons
Il convient de préparer les étalons directement dans les flacons. Transférer à la pipette (6.10) les
volumes précisés dans le Tableau 1 de solution mère Cer-C (5.16) de céreulide, d’acétonitrile (5.2)
13
(voir NOTE) et de solution mère IS-D (5.13) de C -céreulide dans un flacon (6.12). Boucher le flacon.
6
Mélanger (6.14) la solution pendant 20 s.
NOTE Si une clarification supplémentaire est nécessaire, il est possible d’utiliser une extraction à l’heptane
afin de réduire les composants produisant des interférences (gras). Après avoir ajouté 29,5 ml d’acétonitrile,
ajouter 10,0 ml d’heptane et boucher les tubes avec un bouchon vissé. Placer le ou les tubes horizontalement sur
l’agitateur (6.7) et agiter fermement pendant environ 1 h. Centrifuger les tubes pendant 10 min entre 1 000g et
1 500g (6.3). Poursuivre la préparation de l’échantillon avec la couche d’acétonitrile inférieure.
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Tableau 1 — Préparation des solutions étalons pour l’étalonnage
a
Norme Cer-C (5.16) Acétonitrile (5.2) IS-D (5.13) Concentration
étalon céreulide
μl μl μl ng/ml
Étalon 0 0 1 000 200 0,00
Étalon 1 10 990 200 0,08
Étalon 2 50 950 200 0,4
Étalon 3 100 900 200 0,8
Étalon 4 200 800 200 1,7
Étalon 5 500 500 200 4,2
Étalon 6 1 000 0 200 8,3
a 13
La concentration du C -
...