ISO 14718:1998

Animal feeding stuffs - Determination of aflatoxin B1 content of mixed feeding stuffs - Method using high-performance liquid chromatography

This International Standard specifies a high-performance liquid chromatographic (HPLC) method for the determination of aflatoxin B1 content of animal feeding stuffs including those containing citrus pulp. The lower limit of determination is 1 mg/kg. NOTE 1 This International Standard may be applicable for the determination of the aflatoxin B1 content of a number of raw materials and straight feeding stuffs such as corn gluten, groundnut, palm kernel, copra, citrus pulp, tapioca, soya bean, rice bran, pollard, rape seed, niger seed and cotton seed (see references [1] and [2]). These materials were, however, not included in the collaborative testing of the method. NOTE 2 This International Standard may also be applicable for the determination of the content of the sum of the aflatoxins B1, B2, G1 and G2. However, the method has not been validated for this parameter by collaborative testing.

Aliments des animaux — Détermination de la teneur en aflatoxine B1 dans les aliments composés — Méthode par chromatographie liquide à haute performance

La présente Norme internationale spécifie une méthode par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) pour la détermination de la teneur en aflatoxine B1 dans les aliments pour animaux, y compris ceux contenant de la pulpe d'agrumes. La limite inférieure de détection est de 1 µg/kg d'aflatoxine B1. NOTE 1 La présente Norme internationale peut s'appliquer à la détermination de la teneur en aflatoxine B1 dans un grand nombre de matières premières et d'aliments simples, tels que gluten de maïs, arachide, cœur de palmier, coprah, pulpe d'agrumes, farine de manioc, soja, son de riz, son, graines de colza, graines de niger et graines de coton (voir les références [1] et [2]). Ces matériaux n'ont cependant pas été inclus dans l'essai interlaboratoires de la méthode. NOTE 2 La présente Norme internationale peut également s'appliquer à la détermination de l'ensemble des aflatoxines B1, B2, G1 et G2. La méthode n'a cependant pas été validée pour ce paramètre par des essais interlaboratoires.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 16-Dec-1998
• ICS: 65.120 - Animal feeding stuffs
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 10 - Animal feeding stuffs
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 10 - Animal feeding stuffs
• Current Stage: 9060 - Close of review
• Completion Date: 04-Jun-2030

Overview

ISO 14718:1998 specifies a laboratory HPLC (high‑performance liquid chromatography) method for the determination of aflatoxin B1 (AFB1) in mixed animal feeding stuffs, including feeds containing citrus pulp. The standard defines sample preparation, extraction, cleanup and chromatographic determination procedures. The stated lower limit of determination is 1 mg/kg. The method supports reliable mycotoxin analysis in feed quality control and regulatory testing.

Key topics and technical requirements

• Scope and limits
  • Method targeted to determine aflatoxin B1 in mixed feeds; may be applicable to several raw materials (e.g., corn gluten, groundnut, citrus pulp) but these were not part of collaborative validation.
  • Not validated by collaborative testing for the sum of aflatoxins B1, B2, G1 and G2.
  • Lower limit of determination: 1 mg/kg.
• Sample preparation
  • Test sample preparation referenced to ISO 6498; grinding to pass a 1 mm sieve and representative subsampling are required.
• Extraction and cleanup
  • Sample extraction with chloroform, followed by filtration and cleanup using Florisil® and C18 (C) Sep‑Pak style cartridges (or equivalents).
• Chromatography and detection
  • Reverse‑phase HPLC with a C18 analytical column, post‑column derivatization (iodine or bromine/KOBRA® cell), and fluorescence detection (excitation ~365 nm, emission ~435 nm).
  • Example mobile phases are provided for iodine and bromine derivatization (compositions specified in the standard).
• Quality control
  • Use of calibration solutions and control samples, acid‑washed glassware, and precautions for working with toxic mycotoxins are detailed.
• Safety
  • Strong warnings: aflatoxins and solvents (e.g., chloroform) are hazardous - use fume hoods, amber glassware and decontamination procedures.

Applications and users

ISO 14718:1998 is primarily used by:

• Feed testing and analytical laboratories performing aflatoxin B1 testing.
• Regulatory agencies and enforcement laboratories verifying feed safety.
• Quality assurance teams in animal feed manufacturing and ingredient suppliers.
• Research groups studying mycotoxin contamination in feed raw materials.

Practical applications include routine surveillance of commercial feeds, validation of supplier batches, incident investigation of contaminated feeds, and support for compliance with national mycotoxin limits.

Related standards and notes

• Normative reference: ISO 6498:1998 (preparation of test sample).
• Sampling guidance referenced: ISO 6497 (recommended).
• Notes in ISO 14718 caution that applicability to some raw materials and the determination of the sum of aflatoxins requires further validation.

Keywords: ISO 14718:1998, aflatoxin B1, HPLC, animal feeding stuffs, mycotoxin analysis, feed testing, post‑column derivatization, Florisil, Sep‑Pak.

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14718
First edition
1998-12-15
Animal feeding stuffs — Determination of
aflatoxin B content of mixed feeding
stuffs — Method using high-performance
liquid chromatography
Aliments des animaux — Détermination de la teneur en aflatoxine B dans
les aliments composés — Méthode par chromatographie liquide à haute
performance
A
Reference number
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard ISO 14718 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Agricultural food products,
Subcommittee SC 10, Animal feeding stuffs.
Annexes A and B of this International Standard are for information only.
©  ISO 1998
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means, electronic
or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from the publisher.
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Printed in Switzerland
ii
INTERNATIONAL STANDARD  © ISO ISO 14718:1998(E)
Animal feeding stuffs — Determination of aflatoxin B content of
mixed feeding stuffs — Method using high-performance liquid
chromatography
1 Scope
This International Standard specifies a high-performance liquid chromatographic (HPLC) method for the
determination of aflatoxin B content of animal feeding stuffs including those containing citrus pulp.
The lower limit of determination is 1 mg/kg.
NOTE 1 This International Standard may be applicable for the determination of the aflatoxin B content of a number of raw
materials and straight feeding stuffs such as corn gluten, groundnut, palm kernel, copra, citrus pulp, tapioca, soya bean, rice
bran, pollard, rape seed, niger seed and cotton seed (see references [1] and [2]). These materials were, however, not included
in the collaborative testing of the method.
NOTE 2 This International Standard may also be applicable for the determination of the content of the sum of the
aflatoxins B , B , G and G . However, the method has not been validated for this parameter by collaborative testing.
1 2 1 2
2 Normative reference
The following normative document contains provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subseqent amendments to, or revisions of, this publication do not
apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to investigate the
possibility of applying the most recent edition of the normative document indicated below. For undated references,
the latest edition of the normative document referred to applies. Members of IEC and ISO editions maintain
registers of currently valid International Standards.
ISO 6498:1998, Animal feeding stuffs — Preparation of test sample.
3 Principle
1)
The sample is extracted with chloroform. The extract is filtered and an aliquot portion is purified on a Florisil®
cartridge and a C cartridge. The final separation and determination is achieved by high-performance liquid
chromatography (HPLC) using a reverse-phase C column, followed by post-column derivatization with iodine or
bromine, and fluorescence detection.
4 Reagents and materials
Use only reagents of recognized analytical grade.

1) Florisil® is the trade-name of a commercially available product. This information is given for the convenience of users of this
International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product. Equivalent products may be used if they
can be shown to lead to the same results.
© ISO
4.1  Water, demineralized or deionized, with resistivity of at least 10 MW�cm, or water of at least equivalent purity.
4.2  Concentrated sulfuric acid, c(H SO ) = 18 mol/l, r(H SO ) = 1,84 g/ml.
2 4 2 4
, c(H SO ) = 2 mol/l.
4.3 Sulfuric acid
2 4
Carefully add 105 ml of concentrated sulfuric acid (4.2) to 895 ml of water and mix well. Avoid excessive heating of
the solution.
4.4  Control sample.
Prepare a control sample of about 2 kg of compound feed with an aflatoxin B content of about 5 mg/kg by
combining samples of previous determinations with an aflatoxin B content of about 5 mg/kg. Mix thoroughly.
The aflatoxin B content of the control sample should be determined five times by two analysts following the
procedure described in clause 8. From the results the mean aflatoxin B content, the standard deviation and the
coefficient of variation should be calculated.
2)
4.5  Acid-washed Celite® 545, or product of equivalent quality .
3)
4.6  Florisil® Sep-Pak style cartridge, Waters No. 51960, or product of equivalent qualty .
3)
4.7  C Sep-Pak style cartridge, Waters No. 51910, or product of equivalent quality .
4.8  Acetone.
4.9  Methanol.
4.10  Acetonitrile.
4.11  Chloroform, stabilized with ethanol (mass fraction 0,5 % to 1,0 %).
WARNING: Chloroform is a toxic substance. Avoid inhalation of and exposure to chloroform. Work in a
fumehood when handling the solvent and solutions thereof.
The adsorption characteristics of the Florisil® cartridge (4.6) may change if stabilizers other than ethanol are used.
When chloroform as described is not available, the adsorption characteristics should be verified in accordance with
clause 8.
4.12  Mixture of acetone and water, 98 + 2 (by volume).
Combine 980 ml of acetone (4.8) and 20 ml of water (4.1). Mix well.
4.13  Mixture of acetone and water, 15 + 85 (by volume).
Combine 150 ml of acetone (4.8) and 850 ml of water (4.1). Mix well.
4.14  Mixture of acetone and water, 5 + 95 (by volume).

2) Celite® is the trade-name of a commercially available product.
3 Florisil® is the trade-name of a commercially available product. Florisil® Sep-Pak style cartridge article number 51960 and
)
C Sep-Pak style catridge article number 51910, from Waters Associates (Milwaukee, USA), are examples of suitable
products available commercially.
This information is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by
ISO of these products. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
© ISO
Combine 50 ml of acetone (4.8) and 950 ml of water (4.1). Mix well.
4.15  Mixture of methanol and water, 20 + 80 (by volume).
Combine 200 ml of methanol (4.9) and 800 ml of water (4.1). Mix well.
, c(HNO ) = 14 mol/l, (HNO ) = 1,40 g/ml, for HPLC with bromine derivatization.
4.16 Concentrated nitric acid r
3 3
4.17  Potassium bromide (KBr), for HPLC with bromine derivatization.
4.18  Mobile phase for HPLC.
4.18.1  Mobile phase for HPLC with iodine derivatization.
Combine 120 ml of acetonitrile (4.10), 210 ml of methanol (4.9) and 390 ml of water (4.1) and mix. Filter the eluent
through a 0,45 mm PTFE membrane filter using the solvent filtration system (5.1) and degas for 10 min in the
ultrasonic bath (5.2) before use.
NOTE The composition of the mobile phase solvent may need adjustment depending on the characteristics of the HPLC
column used.
4.18.2  Mobile phase for HPLC with bromine derivatization.
Combine 400 ml of acetonitrile (4.10), 700 ml of methanol (4.9) and 1 300 ml of water (4.1) and mix. Add to the
mixture 286 mg of potassium bromide (4.17) and 152 ml of concentrated nitric acid (4.16). Mix well and degas with a
stream of inert gas for 15 min.
4.19  Saturated iodine solution for HPLC with iodine derivatization.
Add 2 g of iodine to 400 ml of water. Mix for at least 90 min and filter through a 0,45 mm PTFE membrane filter
(see 5.1). Prepare the solution fresh on the day of use.
Protect the saturated solution from light to prevent photodegradation.
4.20  Sodium hypochlorite solution (household quality), r(active chlorine) = 100 g/l.
4.21  Sodium hypochlorite solution, volume fraction 1 %.
Dilute 10 ml of sodium hypochlorite solution (4.20) with 990 ml of water-acetone mixture (4.14).
4.22  Inert gas, e.g. nitrogen.
4.23  Aflatoxin B standard material (C H O ), 2,3,6aa,9aa-tetrahydro-4-methoxycyclopenta[c]furo[3¢,2¢:4,5]-
1 17 12 6
furo[2,3-h][1]benzopyran-1,11-dione; Chemical Abstracts Service Registry (CAS) number 1162-65-8.
WARNINGS
1 Mycotoxins are extremely toxic substances. Perform all manipulations in a designated fume cupboard.
Take special precautions when toxins are in a dry form because of their electrostatic nature and resulting
tendency to disperse in working areas.
2 Aflatoxins are sensitive to UV radiation. Therefore, conduct all operations in the absence of sunlight or
artificial white light. Provide sufficient, but not excessive, illumination with tungsten filament lamps. Low-
energy lamps and fluorescent tubes may be used, but the use of amber glassware (vials, volumetric flasks)
is recommended.
3 Glassware that has been in contact with solutions of aflatoxin B has to be soaked overnight in a
hypochlorite solution (4.21), before cleaning, in order to remove traces of aflatoxin B .
© ISO
4.24  Aflatoxin B standard solution, r(aflatoxin B ) ≈ 10 mg/ml.
1 1
Transfer the content of an ampoule containing aflatoxin B (4.23) to a flask and dissolve in chloroform (4.11).
Transfer the solution to a convenient size volumetric flask and dilute to the mark with chloroform so as to obtain a
solution with an aflatoxin B content of about 10 mg/ml. Mix.
Transfer the solution to amber vials or an airtight screw-cap bottle and store in a cool place (4 °C) in the dark, well
sealed and wrapped in aluminium foil.
4.25  Aflatoxin B stock standard solution.
Transfer quantitatively 2,5 ml of the aflatoxin B standard solution (4.24) to a 50 ml volumetric flask and dilute to the
mark with chloroform (4.11).
Transfer the solution to amber vials or an airtight screw-cap bottle and store in a cool place (4 °C) in the dark, well
sealed and wrapped in aluminium foil.
4.26  Aflatoxin B calibration solutions for HPLC.
4.26.1  Calibration solution I, r(aflatoxin B ) ≈ 4 ng/ml.
Allow the volumetric flask with stock standard solution (4.25) to reach room temperature in the aluminium foil (a few
hours).
Transfer 400 ml of the stock standard solution (equivalent to about 200 ng of aflatoxin B ) to an acid-washed 50 ml
volumetric flask, and evaporate the solution to dryness in a stream of inert gas (4.22). Dissolve the residue in 20 ml
of the water-acetone mixture (4.13). Dilute to the mark with the water-acetone mixture and mix well.
4.26.2  Calibration solution II, r(aflatoxin B ) ≈ 3 ng/ml.
Transfer quantitatively 7,5 ml of the calibration solution I (4.26.1) to an acid-washed 10 ml volumetric flask. Dilute to
the mark with the water-acetone mixture (4.13) and mix well.
4.26.3  Reference calibration solution, r(aflatoxin B ) ≈ 2 ng/ml.
Transfer quantitatively 25 ml of the calibration solution I (4.26.1) to an acid-washed 50 ml volumetric flask. Dilute to
the mark with the water-acetone mixture (4.13) and mix well.
This solution is used for repetitive injection during HPLC (8.5).
4.26.4  Calibration solution III, r(aflatoxin B ) ≈ 1 ng/ml.
Transfer quantitatively 2,5 ml of the calibration solution I (4.26.1) to an acid-washed 10 ml volumetric flask. Dilute to
the mark with the water-acetone mixture (4.13) and mix well.
4.27  Chromatographic test solution.
Prepare an ampoule containing a mixture of aflatoxins B , B , G and G in 1 ml of chloroform with concentrations
1 2 1 2
of approximately 1,0 mg/ml, 0,5 mg/ml, 1,0 mg/ml and 0,5 mg/ml respectively.
Transfer the contents of the ampoule to a glass-stoppered test tube or screw-capped vial. Transfer 40 ml of this
solution to an acid-washed glass-stoppered test tube (5.4). Evaporate the chloroform in a stream of inert gas (4.22)
and dissolve the residue into 10 ml of the water-acetone mixture (4.13).
© ISO
5 Apparatus
Before use, laboratory glassware coming into contact with aqueous solutions of aflatoxins shall be soaked in sulfuric
acid (4.3) for several hours, then rinsed well (e.g. three times) with water to remove all traces of acid. Check the
absence of acid with pH paper.
In practice, this treatment is necessary for the round-bottomed flask of the rotary evaporator (5.12), the volumetric
flasks, measuring cylinders, vials or tubes used for calibration solutions and final extracts (particularly autosamplers
vials), and Pasteur pipettes, if these are used to transfer calibration solutions or extracts.
NOTE Laboratory glassware coming into contact with aqueous solutions of aflatoxins has to be soaked in dilute acid
because the use of non-acid-washed glassware may cause losses of aflatoxin B . Particular care should be taken with new
glassware and disposable glassware such as autosampler vials and Pasteur pipettes.
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
5.1  Solvent filtration system, suitable for PTFE membrane filters with a pore size of 0,45 mm.
5.2  Ultrasonic bath.
5.3  Microsyringe, of capacity 100 ml, for preparation of calibration solutions.
Check by weighing that the inaccuracy does not exceed 2 % of the mass.
5.4  Glass-stoppered calibrated tubes, of capacity 10 ml.
5.5  Spectrometer, suitable for measurements in the UV region of the spectrum, provided with quartz cuvettes of
optical path length 10 mm ± 0,1 mm.
5.6  Conical flask, of capacity 500 ml, made of borosilicate glass, with a wide neck and a glass stopper or a screw
cap fitted with a PTFE liner.
- -
1 1
, horizontal rotation or reciprocating, with frequency 250 min to 300 min .
5.7 Mechanical shaker
5.8  Fluted filter paper, of diameter 24 cm.
4)
5.9  Luer® chloroform-resistant threeway stopcock .
4)
5.10  Chemically resistant syringe, 10 ml, with Luer® connector .
5.11  Glass column, with internal diameter 10 mm to 15 mm, length about 30 cm to 50 cm, equipped with a Luer®
4)
tip .
NOTE When a glass column of internal diameter about 10 mm and length about 30 cm is used, it is advisable to use a
plastics reservoir (chemically resistant syringe barrel) of at least 70 ml capacity.
5.12  Rotary vacuum evaporator, equipped with a 150 ml to 250 ml round-bottomed flask.
5.13  General HPLC system.
See Figures 1 and 2 for a diagrammatic representation of the HPLC system for derivatization with iodine and
bromine respectively.
5.13.1  Pump, pulse free, capable of maintaining a volume flow rate of 0,1 ml/min to 1,0 ml/min.

4)
Luer® is the trade-name of a commercially available product. This information is given for the convenience of users of this
International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product. Equivalent products may be used if they
can be shown to lead to the same results
.
© ISO
Key
1 HPLC mobile phase 10 Reaction coil
2 HPLC pump 11 Fluorescence detector
3 Injector 12 Restrictor
4 Guard column 13 Waste
5 Analytical column 14 Recorder/integrator
6 Saturated iodine solution 15 Derivatization cell (KOBRA®)
7 Reagent pump 16 Tension meter
8 Tee joint 17 Power supply, 10 V d.c.
9 Water bath (60 °C) 18 Resistor, 100 kW
Figure 1 — Diagrammatic representation of the HPLC system for derivatization with iodine
NOTE See Figure 1 for Key.
Figure 2 — Diagrammatic representation of the HPLC system for derivatization with bromine
© ISO
5.13.2  Injection system, with loop suitable for the injection of 250 ml.
5.13.3  Fluorescence detector, with excitation at a wavelength of 365 nm and emission at wavelength of 435 nm
(for filter instruments: emission wavelength > 400 nm). Detection of at least 0,05 ng aflatoxin B shall be possible.
Some back pressure may be advisable [e.g. by applying a restrictor or a coil of stainless steel or
polytetrafluorethylene (PTFE) connected to the outlet of the detector] to suppress air bubbles in the flow cell.
5.13.4  Recorder.
5.13.5  Guard column: C packing, particle size 37 mm to 50 mm, length 10 mm to 20 mm, internal diameter
3,9 mm; or a guard column of equivalent quality.
5.13.6  Analytical column: C packing, particle size 3 mm or 5 mm, length 200 mm, internal diameter 3,0 mm; or
an analytical column of equivalent quality.
5.13.7  Electronic integrator (optional).
5.14  HPLC system for HPLC with iodine derivatization.
, pulse free, for delivery of the iodine post-column reagent.
5.14.1 Pump
5.14.2  Zero dead volume Tee, stainless steel, 1,59 mm · 0,75 mm.
5.14.3  Spiral reaction coil, polytetrafluorethylene (PTFE) or stainless steel.
Dimensions of 3 000 mm · 0,5 mm to 5 000 mm · 0,5 mm have been found to be appropriate in combination with
5 mm or 3 mm HPLC columns.
5.14.4  Thermostatically controlled water bath or solid-state heating device, adjusted to 60 °C, capable of
temperature regulation to the nearest 0,1 °C.
5.15  HPLC system for HPLC with bromine derivatization.
5)
: Kok’s Bromine Apparatus (KOBRA® ).
5.15.1 Electrochemical derivatization cell
5.15.2  Power supply, 0 V to 20 V d.c.
5.15.3  Tension meter, range 0 V to 10 V d.c., impedance > 50 kW.
5.15.4  Resistor, 100 kW.
5.16  Syringe, suitable for HPLC injection of 250 ml.
6 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method is
given in ISO 6497 [7].
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.

5)
KOBRA® is the trade-name of a commercially available apparatus. This information is given for the convenience of users of
this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product. Equivalent apparatus may be used
if it can be shown to lead to the same results.
© ISO
7 Preparation of the test sample
Prepare the test sample in accordance with ISO 6498.
Grind the laboratory sample (usually 500 g) so that it passes completely through a sieve with 1 mm apertures. Mix
thoroughly.
8 Procedure
8.1 General
To each series, add a spiked blank sample with an aflatoxin B content of 10 mg/kg and a certified reference
material or a control sample (4.4). Addition of a blank sample to each series is strongly recommended to check for
contamination from the glassware.
The results shall comply with the criteria in clause 10.
8.2 Determination of the absorption spectrum of the aflatoxin B standard solution
In cuvettes, determine the absorption spectrum of the aflatoxin B standard solution (4.24) between wavelengths of
330 nm and 370 nm by means of the spectrometer (5.5), using chloroform as blank. Measure the absorbance (A) at
the maximum near a wavelength of 363 nm.
8.3 Extraction
Weigh, to the nearest 0,1 g, 50,0 g of the prepared test sample (see clause 7) into the conical flask (5.6).
Consecutively add 25 g of Celite® (4.5), 250 ml of chloroform (4.11) and 25 ml of water. Stopper the flask, swirl and
release th
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 14718
Première édition
1998-12-15
Aliments des animaux — Détermination de
la teneur en aflatoxine B dans les aliments
composés — Méthode par chromatographie
liquide à haute performance
Animal feeding stuffs — Determination of aflatoxin B content of mixed
feeding stuffs — Method using high-performance liquid chromatography
A
Numéro de référence
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 14718 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits agricoles
alimentaires, sous-comité SC 10, Aliments des animaux.
Les annexes A et B de la présente Norme internationale sont données uniquement à titre d’information.
©  ISO 1998
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
Internet [e-mail]
Imprimé en Suisse
ii
NORME INTERNATIONALE  © ISO ISO 14718:1998(F)
Aliments des animaux — Détermination de la teneur en aflatoxine
B dans les aliments composés — Méthode par chromatographie
liquide à haute performance
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode par chromatographie en phase liquide à haute performance
(CLHP) pour la détermination de la teneur en aflatoxine B dans les aliments pour animaux, y compris ceux
contenant de la pulpe d’agrumes.
La limite inférieure de détection est de 1 μg/kg d'aflatoxine B .
NOTE 1 La présente Norme internationale peut s’appliquer à la détermination de la teneur en aflatoxine B dans un grand
nombre de matières premières et d’aliments simples, tels que gluten de maïs, arachide, cœur de palmier, coprah, pulpe
d’agrumes, farine de manioc, soja, son de riz, son, graines de colza, graines de niger et graines de coton (voir les références
[1] et [2]). Ces matériaux n’ont cependant pas été inclus dans l’essai interlaboratoires de la méthode.
NOTE 2 La présente Norme internationale peut également s’appliquer à la détermination de l’ensemble des aflatoxines B ,
B , G et G . La méthode n’a cependant pas été validée pour ce paramètre par des essais interlaboratoires.
2 1 2
2 Référence normative
Le document normatif suivant contient des dispositions qui par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme internationale. Pour les références datées, les amendements
ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes aux accords
fondés sur la présente Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer l’édition la plus
récente du document normatif indiqué ci-après. Pour les références non datées, la dernière édition du document
normatif en référence s’applique. Les membres de la CEI et de l'ISO possèdent le registre des Normes
internationales en vigueur à un moment donné.
ISO 6498:1998, Aliments pour animaux — Préparation des échantillons pour essai.
3 Principe
L’échantillon est extrait au chloroforme. L’extrait est filtré et une partie aliquote est purifiée sur une cartouche de
1)
Florisil et sur une cartouche de C . La séparation finale et la détermination sont réalisées par chromatographie
en phase liquide à haute performance (CLHP), en utilisant une colonne C à polarité de phases inversée, suivie, à
la sortie de la colonne, de la formation de dérivés avec de l’iode ou du brome, et d’une mesure de la fluorescence.

1)
Florisil est l’appellation commerciale d’un produit disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif
du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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4 Réactifs et matériaux
Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
4.1  Eau, déminéralisée ou désionisée, d’une résistivité d’au moins 10 MΩ·cm, ou de l’eau de pureté au moins
équivalente.
4.2  Acide sulfurique concentré, c(H SO ) = 18 mol/l, ρ(H SO ) = 1,84 g/ml.
2 4 2 4
4.3  Acide sulfurique, c(H SO ) = 2 mol/l.
2 4
Ajouter avec précaution 105 ml d’acide sulfurique concentré (4.2) à 895 ml d’eau, puis mélanger soigneusement.
Éviter de chauffer la solution de façon excessive.
4.4  Échantillon témoin.
Préparer un échantillon témoin d’environ 2 kg d’aliments composés, présentant une teneur en aflatoxine B
d’environ 5 μg/kg, en combinant des échantillons ayant subi un dosage préalable et présentant une teneur en
aflatoxine B d’environ 5 μg/kg. Mélanger soigneusement.
Il est souhaitable que la teneur en aflatoxine B de l’échantillon témoin soit déterminée cinq fois par deux analystes,
en suivant le mode opératoire décrit à l’article 8. Il convient ensuite, à partir des résultats, de calculer la teneur
moyenne en aflatoxine B , l’écart-type et le coefficient de variation.
2)
4.5  Celite 545, lavé à l’acide, ou produit de qualité équivalente.
3)
4.6  Cartouche de type Florisil Sep-Pak n° 51960, de Waters , ou produit de qualité équivalente.
3)
4.7  Cartouche de type C Sep-Pak n° 51910, de Waters , ou produit de qualité équivalente.
4.8  Acétone.
4.9  Méthanol.
4.10  Acétonitrile.
4.11  Chloroforme, stabilisé avec de l’éthanol (fraction massique de 0,5 % à 1,0 %).
AVERTISSEMENT — Le chloroforme est une substance toxique. Éviter l’inhalation de chloroforme et
l’exposition au chloroforme. Travailler sous hotte ventilée lors de la manipulation du solvant ou de ses
solutions.
Les caractéristiques d’adsorption de la cartouche de Florisil (4.6) peuvent varier si des stabilisants autres que
l’éthanol sont utilisés. Lorsque le chloroforme décrit n’est pas disponible, il convient de vérifier ses propriétés
conformément à l’article 8.
2)
Celite est l’appellation commerciale d’un produit disponible sur le marché.

3)
Florisil l’appellation commerciale d’un produit disponible sur le marché. La cartouche Florisil Sep-Pak, numéro de
référence 51960 et la cartouche C Sep-Pak, numéro de référence 51910, de Waters Associates (Milwaukee, USA) sont des
exemples de produits appropriés disponibles sur le marché
Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l’ISO
approuve ou recommande l’emploi exclusif des produits ainsi désignés. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est
démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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4.12  Mélange d’acétone et d’eau, 98 + 2 (par volume).
Combiner 980 ml d’acétone (4.8) et 20 ml d’eau (4.1). Mélanger soigneusement.
4.13  Mélange d’acétone et d’eau, 15 + 85 (par volume).
Combiner 150 ml d’acétone (4.8) et 850 ml d’eau (4.1). Mélanger soigneusement.
4.14  Mélange d’acétone et d’eau, 5 + 95 (par volume).
Combiner 50 ml d’acétone (4.8) et 950 ml d’eau (4.1). Mélanger soigneusement.
4.15  Mélange de méthanol et d’eau, 20 + 80 (par volume).
Combiner 200 ml de méthanol (4.9) et 800 ml d’eau (4.1). Mélanger soigneusement.
4.16  Acide nitrique concentré, c(HNO ) = 14 mol/l, ρ(HNO ) = 1,40 g/ml, pour CLHP avec formation de dérivés
3 3
de brome.
4.17  Bromure de potassium (KBr), pour CLHP avec formation de dérivés de brome.
4.18  Phase mobile pour CLHP.
4.18.1  Phase mobile pour CLHP avec formation de dérivés d’iode.
Mélanger 120 ml d’acétonitrile (4.10), 210 ml de méthanol (4.9) et 390 ml d’eau (4.1), puis homogénéiser. Filtrer
l’éluant sur un filtre à membrane de PTFE de 0,45 μm en utilisant le système de filtration de solvant (5.1), puis
dégazer pendant 10 min dans le bain à ultrasons (5.2) avant utilisation.
NOTE La composition du solvant de la phase mobile peut nécessiter un ajustement en fonction des caractéristiques de la
colonne pour CLHP utilisée.
4.18.2  Phase mobile pour CLHP avec formation de dérivés de brome.
Mélanger 400 ml d’acétonitrile (4.10), 700 ml de méthanol (4.9) et 1 300 ml d’eau (4.1), puis homogénéiser. Ajouter
à ce mélange 286 mg de bromure de potassium (4.17) et 152 μl d’acide nitrique (4.16). Mélanger soigneusement et
dégazer sous un courant de gaz inerte pendant 15 min.
4.19  Solution aqueuse saturée en iode pour CLHP avec formation de dérivés d’iode.
Ajouter 2 g d’iode à 400 ml d’eau. Mélanger pendant au moins 90 min, puis filtrer sur un filtre à membrane de PTFE
de 0,45 μm (voir 5.1). Préparer une solution fraîche le jour de son utilisation.
Protéger la solution saturée de la lumière afin d’empêcher toute décomposition photochimique.
4.20  Solution d’hypochlorite de sodium (qualité domestique), ρ(chlore actif) = 100 g/l.
4.21  Solution d’hypochlorite de sodium, à 1 % de fraction volumique.
Diluer 10 ml de solution d’hypochlorite de sodium (4.20) avec 990 ml de mélange acétone-eau (4.14).
4.22  Gaz inerte, par exemple azote.
4.23  Aflatoxine B étalon (C H O ), 2,3,6aα,9aα-tétrahydro-4-méthoxycyclopenta[c]furo[3¢,2¢:4,5]furo[2,3-h][1]
1 17 12 6
benzopyran-1,11-dione; numéro 1162-65-8 du Registre du Chemical Abstracts Service (CAS).
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AVERTISSEMENTS
1  Les mycotoxines sont des substances extrêmement toxiques. Il convient d’effectuer toutes les
manipulations dans une hotte fermée conçue à cet effet. Il est recommandé de prendre des précautions
particulières lorsque les toxines sont sous forme sèche, en raison de leur nature électrostatique qui fait
qu’elles ont tendance à se disperser dans les zones de travail.
2  Étant donné la sensibilité des aflatoxines aux ultraviolets, réaliser tous les essais à l’abri de la lumière
du jour ou de toute lumière blanche artificielle. Utiliser un éclairement suffisant, mais non excessif, avec
des lampes à filament de tungstène. Des lampes basse énergie ou des tubes fluorescents peuvent être
utilisés, mais l’utilisation de verrerie ambrée (fioles, fioles jaugées) est recommandée.
3  La verrerie ayant été en contact avec des solutions d’aflatoxine B doit être plongée pendant toute une
nuit dans une solution d’hypochlorite (4.21), avant d’être nettoyée, afin de supprimer toute trace
d’aflatoxine B .
4.24  Solution étalon d’aflatoxine B , ρ(aflatoxine B ) ≈ 10 μg/ml.
1 1
Transférer le contenu d’une ampoule d’aflatoxine B (4.23) dans une fiole et dissoudre à l’aide de chloroforme
(4.11). Transvaser cette solution dans une fiole jaugée d’un volume permettant d’obtenir une solution à une teneur
en aflatoxine B d’environ 10 μg/ml. Diluer au trait avec du chloroforme (4.11). Mélanger.
Transférer dans des fioles ambrées ou dans un récipient à bouchon vissé étanche à l’air. Conserver bien fermé et
enroulé dans une feuille d’aluminium et dans un endroit frais (4 °C) et dans l’obscurité.
4.25  Solution mère étalon d’aflatoxine B .
Transférer quantitativement 2,5 ml de la solution étalon d’aflatoxine B (4.24) dans une fiole jaugée de 50 ml, puis
diluer au trait avec du chloroforme (4.11).
Transférer cette solution dans des fioles ambrées ou dans un récipient à bouchon vissé étanche à l’air. Conserver
bien fermé et enroulé dans une feuille d’aluminium et dans un endroit frais (4 °C) et dans l’obscurité.
4.26  Solutions d’étalonnage d’aflatoxine B pour CLHP.
4.26.1  Solution d’étalonnage I, ρ(aflatoxine B ) ≈ 4 ng/ml.
Laisser la fiole jaugée, contenant la solution mère étalon (4.25) et placée dans une feuille d’aluminium, atteindre la
température ambiante (quelques heures).
Transférer 400 μl de solution mère étalon (équivalent à 200 ng d’aflatoxine B ) dans une fiole jaugée de 50 ml lavée
à l’acide, et évaporer la solution jusqu’à siccité sous un courant de gaz inerte (4.22). Dissoudre le résidu dans 20 ml
de mélange acétone-eau (4.13). Diluer au trait avec du mélange acétone-eau et mélanger soigneusement.
4.26.2  Solution d’étalonnage II, ρ(aflatoxine B ) ≈ 3 ng/ml.
Transférer quantitativement 7,5 ml de la solution d’étalonnage I (4.26.1) dans une fiole jaugée de 10 ml lavée à
l’acide, compléter au trait avec du mélange acétone-eau (4.13) et mélanger soigneusement.
4.26.3  Solution d’étalonnage de référence, ρ(aflatoxine B ) ≈ 2 ng/ml.
Transférer quantitativement 25 ml de la solution d’étalonnage I (4.26.1) dans une fiole jaugée de 50 ml lavée à
l’acide. Diluer au trait avec du mélange acétone-eau (4.13) et mélanger soigneusement.
Cette solution est utilisée pour toutes les injections prévues lors de l'analyse CLHP (8.5).
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4.26.4  Solution d’étalonnage III, ρ(aflatoxine B ) ≈ 1 ng/ml.
Transférer quantitativement 2,5 ml de la solution d’étalonnage I (4.26.1) dans une fiole jaugée de 10 ml lavée à
l’acide. Diluer au trait avec du mélange acétone-eau (4.13) et mélanger soigneusement.
4.27  Solution d’essai pour chromatographie.
Préparer une ampoule contenant un mélange d’aflatoxines B , B , G et G dans 1 ml de chloroforme, à des
1 2 1 2
concentrations respectives d’environ 1,0 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1,0 μg/ml et 0,5 μg/ml.
Transvaser le contenu de l’ampoule dans un tube à essai bouché à l’émeri ou dans une fiole à bouchon à vis.
Transvaser 40 μl de cette solution dans un tube à essai lavé à l’acide (5.4) et bouché à l’émeri. Évaporer le
chloroforme sous un courant de gaz inerte (4.22) et dissoudre dans 10 ml de mélange acétone-eau (4.13).
5 Appareillage
Avant son utilisation, la verrerie de laboratoire entrant en contact avec des solutions aqueuses d’aflatoxines doit
être plongée pendant plusieurs heures dans de l’acide sulfurique (4.3), puis rincée soigneusement (par exemple
trois fois) à l’eau afin d’éliminer toutes les traces d’acide. Vérifier l’absence d’acide à l’aide d’un papier indicateur de
pH.
En pratique, ce traitement est requis pour les ballons à fond rond de l’évaporateur rotatif (5.12), les fioles jaugées,
les éprouvettes graduées, les flacons ou tubes utilisés pour les solutions d’étalonnage et les extraits finaux (en
particulier les flacons autoéchantillonneurs), et les pipettes de Pasteur, si elles sont utilisées pour transvaser les
solutions d'étalonnage ou les extraits.
NOTE Il convient que la verrerie de laboratoire entrant en contact avec des solutions aqueuses d’aflatoxines soit plongée
dans un acide dilué, car l’utilisation d’une verrerie non lavée à l’acide peut engendrer des pertes d’aflatoxine B . Il convient de
prendre des précautions particulières lorsqu’on utilise une verrerie neuve ou une verrerie à usage unique telle que des flacons
autoéchantillonneurs et des pipettes Pasteur.
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
5.1  Système de filtration du solvant, adapté pour les filtres membrane en PTFE de 0,45 μm de porosité.
5.2  Bain à ultrasons.
5.3  Microseringue, de capacité 100 μl, pour la préparation des solutions d’étalonnage.
Vérifier par pesée que l’inexactitude n’est pas supérieure à 2 % de la masse.
5.4  Tubes gradués à bouchon en verre rodé, de capacité 10 ml.
5.5  Spectromètre, permettant d’effectuer des mesures dans la région ultraviolette du spectre, muni de cuves en
quartz de 10 mm ± 0,1 mm de parcours optique.
5.6  Fiole conique, de capacité 500 ml, en verre borosilicaté avec un large col, à bouchon rodé ou à bouchon
vissé avec joint en PTFE.
5.7  Agitateur mécanique, à rotation horizontale ou à mouvement alternatif, présentant une fréquence de
–1 –1
250 min à 300 min .
, de 24 cm de diamètre.
5.8 Papier-filtre plissé
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4)
5.9  Robinet d’arrêt Luer , à trois voies, résistant au chloroforme.
4)
5.10  Seringue, de capacité 10 ml, résistante aux attaques chimiques, et munie d’un connecteur Luer .
5.11  Colonne en verre, de 10 mm à 15 mm de diamètre intérieur, d’environ 30 cm à 50 cm de longueur, et munie
4)
à son extrémité d’un bout de tube Luer .
NOTE Quand une colonne de verre de 10 mm de diamètre interne et d’environ 30 cm de longueur est utilisée, il est
conseillé d’utiliser un réservoir en plastique (corps de seringue chimiquement résistante) d’au moins 70 ml de capacité.
5.12  Évaporateur rotatif à vide, muni d’un ballon à fond rond de capacité 150 ml à 250 ml.
5.13  Appareillage pour CLHP.
Se reporter aux Figures 1 et 2 pour une représentation schématique des appareillages pour CLHP utilisés
respectivement pour la formation de dérivés avec l’iode et le brome.
5.13.1  Pompe, sans pulsation, capable de maintenir un débit-volume compris entre 0,1 ml/min et 1,0 ml/min.
5.13.2  Système d’injection à boucle, adapté pour l’injection de 250 μl.
5.13.3  Détecteur de fluorescence, caractérisé par une excitation à une longueur d’onde de 365 nm et une
émission à une longueur d’onde de 435 nm (pour les instruments à filtre, la longueur d’onde d’émission est
supérieure à 400 nm). La limite de détection doit au moins être de 0,05 ng d’aflatoxine B . Il est recommandé
d’exercer une contre-pression [par exemple en installant un réducteur ou un serpentin en acier inoxydable ou en
polytétrafluoréthylène (PTFE), raccordé à la sortie du détecteur] afin de supprimer les bulles d’air dans la cellule de
mesure.
5.13.4  Enregistreur.
5.13.5  Colonne de garde, garnie de C , de 37 μm à 50 μm de dimensions de particules, de 10 mm à 20 mm de
longueur, et de 3,9 mm de diamètre intérieur, ou colonne de garde de qualité équivalente.
5.13.6  Colonne analytique, garnie de C , de 3 μm ou 5 μm de dimensions de particules, de 200 mm de
longueur, de 3,0 mm de diamètre intérieur, ou colonne analytique de qualité équivalente.
5.13.7  Intégrateur électronique (facultatif).
5.14  Appareillage pour CLHP avec formation de dérivés d’iode.
5.14.1  Pompe, sans pulsation, pour le réactif post-colonne à l’iode.
5.14.2  Pièce en T, à volume mort nul, en acier inoxydable, de 1,59 mm · 0,75 mm.
5.14.3  Bobine de réaction, en polytétrafluoréthylène (PTFE) ou en acier inoxydable.
Les dimensions comprises entre 3 000 mm · 0,5 mm et 5 000 mm · 0,5 mm se sont avérées adaptées en
combinaison avec des colonnes CLHP de 5 μm ou de 3 μm.
ou , thermorégulé à 60 °C et pouvant être réglé à 0,1 °C près.
5.14.4 Bain-marie bloc de chauffage

4)
Luer est l’appellation commerciale d’un produit disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif
du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
© ISO
Légende
1 Phase mobile pour CLHP 10 Bobine de réaction
2 Pompe pour CLHP 11 Détecteur de fluorescence
3 Injecteur 12 Réducteur
4 Colonne de garde 13 Résidu
5 Colonne analytique 14 Enregistreur/intégrateur
6 Solution saturée d’iode 15 Cellule de formation de dérivés (KOBRA)
7 Pompe à réactif 16 Voltmètre
8 Raccord en T 17 Alimentation électrique, 10 V CC
9 Bain-marie (60 °C) 18 Résistance, 100 kΩ
Figure 1 — Représentation schématique d’un système chromatographique pour CLHP
avec formation de dérivés d’iode
NOTE Pour l’explication des détails du schéma ci-dessus, voir la légende de la Figure 1.
Figure 2 — Représentation schématique d’un système chromatographique pour CLHP
avec formation de dérivés de brome
© ISO
5.15  Appareillage pour CLHP avec formation de dérivés de brome.
5)
5.15.1  Cellule électrochimique de formation de dérivés: appareillage pour brome de Kok (KOBRA ).
5.15.2  Alimentation électrique, de 0 V à 20 V CC.
5.15.3  Voltmètre, dont la plage de mesure est comprise entre 0 V et 10 V CC, et présentant une impédance
supérieure à 50 kΩ.
, 100 k
5.15.4  Résistance Ω
, adaptée à l’injection pour CLHP, de capacité 250 μl.
5.16 Seringue
6 Échantillonnage
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une méthode
d’échantillonnage recommandée est donnée dans l’ISO 6497 [7].
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié lors
du transport et de l'entreposage.
7 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai conformément à l’ISO 6498.
Broyer l’échantillon pour laboratoire (en général 500 g) afin qu’il passe en totalité au travers d’un tamis de 1 mm
d’ouverture de maille. Bien homogénéiser.
8 Mode opératoire
8.1 Généralités
Ajouter, à chaque série, un échantillon pour essai à blanc dopé, présentant une teneur en aflatoxine B de
10 μg/kg, et un matériau de référence certifié ou un échantillon témoin (4.4). L’ajout d’un échantillon d’essai à blanc
à chaque série est vivement recommandé pour vérifier la contamination par la verrerie.
Les résultats doivent être conformes aux critères donnés à l’article 10.
8.2 Détermination du spectre d’absorption de la solution étalon d’aflatoxine B
Dans des cuves, déterminer le spectre d’absorption de la solution étalon d’aflatoxine B (4.24) à des longueurs
d’onde comprises entre 330 nm et 370 nm, à l’aide du spectromètre (5.5), et en utilisant le chloroforme comme
blanc. Mesurer l'absorbance (A) au maximum d'absorption situé vers la longueur d’onde de 363 nm.
8.3 Extraction
Peser, à 0,1 g près, 50,0 g de l’échantillon pour essai préparé (voir article 7) dans une fiole conique (5.6). Ajouter
successivement 25 g de Celite (4.5), 250 ml de chloroforme (4.11) et 25 ml d’eau (4.1). Boucher la fiole, agiter en
la tournant et décompresser. Reboucher et agiter pendant 30 min sur l’agitateur mécanique (5.7).

5)
KOBRA est l’appellation commerciale d’un produit disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs de la présent
...