ISO 8192:2007
(Main)Water quality — Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation
Water quality — Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation
ISO 8192:2007 specifies a method for assessing the inhibitory effect of a test material on the oxygen consumption of activated sludge microorganisms. This method is intended to represent the conditions in biological waste-water treatment plants. It gives information on inhibitory or stimulatory effects after a short exposure (usually 30 min up to 180 min or even more ) of the test material on activated sludge microorganisms. This method is applicable for testing waters, waste waters, pure chemicals and mixtures of chemicals. Concerning the chemicals, the method refers to those which are soluble under the test conditions. Special care is necessary with materials of low water solubility or high volatility, and with materials abiotically consuming or producing oxygen.
Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de la consommation d'oxygène par des boues activées pour l'oxydation du carbone et de l'ammonium
L'ISO 8192:2007 spécifie une méthode d'évaluation de l'effet inhibiteur d'un échantillon d'essai sur la consommation d'oxygène des micro-organismes des boues activées. La présente méthode est conçue pour représenter les conditions dans les stations de traitement des eaux résiduaires biologiques. Elle fournit des informations sur les effets inhibiteurs ou stimulateurs après un temps d'exposition court (habituellement de 30 min à 180 min ou même plus) des micro-organismes des boues activées à l'échantillon d'essai. Cette méthode est applicable aux essais des eaux, des eaux résiduaires, des substances chimiques pures et des mélanges de substances chimiques. S'agissant des substances chimiques, la méthode porte sur les substances chimiques solubles dans les conditions de l'essai. Des précautions particulières sont nécessaires avec les produits à faible solubilité aqueuse, à haute volatilité et avec ceux qui consomment ou produisent de l'oxygène de manière abiotique.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 8192
Second edition
2007-02-01
Water quality — Test for inhibition of
oxygen consumption by activated sludge
for carbonaceous and ammonium
oxidation
Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de la consommation d'oxygène par
des boues activées pour l'oxydation du carbone et de l'ammonium
Reference number
ISO 8192:2007(E)
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ISO 8192:2007(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle. 2
5 Reagents, media and inoculum. 3
6 Apparatus . 4
7 Test environment. 5
8 Procedure . 5
9 Calculation and expression of results. 8
10 Validity of the results. 11
11 Test report . 13
Annex A (informative) Examples of measuring units . 14
Annex B (informative) Apparatus for culturing nitrifying activated sludge . 16
Annex C (informative) Overview of the test procedure . 18
Annex D (informative) Mixtures for the preliminary test . 19
Annex E (informative) Example of an inhibition curve . 20
Bibliography . 21
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ISO 8192:2007(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 8192 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological
methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 8192:1986), which has been technically revised.
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ISO 8192:2007(E)
Introduction
Information generated by this method for assessing the potential toxicity of substances, mixtures and waste
waters to activated sludge may be helpful in estimating the effect of a test material on mixed bacterial
communities in the aquatic environment, especially in aerobic biological treatment systems. The susceptibility
of oxygen uptake by different sub-populations of the bacterial communities to inhibition by chemicals and
waste waters is not necessarily uniform and selective effects may profoundly influence the outcome of the test.
There are two principal groups of microorganisms contributing to the total oxygen consumption by activated
sludge: heterotrophic organisms mainly responsible for the breakdown of carbon-based substrates
(carbonaceous oxidation) and autotrophic nitrifying organisms causing the oxidation of ammonium to nitrate
(nitrification).
This International Standard may be used to assess the toxicity of substances on total oxygen uptake (i.e.
carbonaceous oxidation and nitrification combined) or, by deliberately adding a specific inhibitor of nitrification,
also to assess toxicity of substances to the carbonaceous and nitrification components separately.
For the determination of the nitrification inhibition with this method, a sufficiently nitrifying activated sludge is
[4]
required. Indications of nitrification may be investigated further by application of ISO 9509 .
The user of this method should be aware that particular problems could require the specification of additional
marginal conditions.
The inhibitory effect of a test material may be exerted on both components or it may be exerted predominantly
on only one of them. Nitrification is the process more commonly prone to selective inhibition.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 8192:2007(E)
Water quality — Test for inhibition of oxygen consumption by
activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if any,
associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health
practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this International Standard
be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for assessing the inhibitory effect of a test material on the
oxygen consumption of activated sludge microorganisms.
This method is intended to represent the conditions in biological waste-water treatment plants. It gives
information on inhibitory or stimulatory effects after a short exposure (usually 30 min up to 180 min or even
more) of the test material on activated sludge microorganisms.
This method is applicable for testing waters, waste waters, pure chemicals and mixtures of chemicals.
Concerning the chemicals, the method refers to those which are soluble under the test conditions. Special
care is necessary with materials of low water solubility, high volatility and with materials abiotically consuming
or producing oxygen.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
activated sludge
accumulated biological mass (floc) produced in the treatment of waste water by the growth of bacteria and
other microorganisms in the presence of oxygen
[3]
(ISO 6107-1:2004 , definition 2)
3.2
concentration of suspended solids of an activated sludge
amount of solids obtained by filtration or centrifugation of a known volume of activated sludge and drying at
about 105 °C to constant mass
[6]
(ISO 9888:1999 , definition 3.4)
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ISO 8192:2007(E)
3.3
oxygen consumption rate
uptake of oxygen by activated sludge microorganisms per unit volume of sludge, in unit time
NOTE This quantity is expressed in milligrams per litre per hour [mg/(l⋅h)].
3.4
specific oxygen consumption rate
uptake of oxygen by activated sludge microorganisms per unit mass of dry sludge (suspended solids), in unit
time
NOTE This quantity is expressed in milligrams per gram per hour [mg/(g⋅h)].
3.5
inhibition of oxygen consumption
decrease of the oxygen consumption rate of an activated sludge plus (a) degradable substance(s) in the
presence of the test material, compared with that of a similar mixture without test material
NOTE 1 This quantity is expressed as a percentage.
NOTE 2 In the absence of a substrate, some chemicals (e.g. uncouplers of phosphorylation) can increase oxygen
uptake.
3.6
toxic range
range of concentration of a test material over which 0 % to 100 % inhibition occurs
3.7
EC
50
effective concentration of the test material giving a calculated or interpolated inhibition of oxygen consumption
of 50 % compared with a blank control
3.8
nitrification
oxidation of ammonium compounds by bacteria
NOTE Usually the intermediate product is nitrite and the end product is nitrate
[3]
[ISO 6107-1:2004 , definition 49].
4 Principle
In the presence of easily biodegradable substances, activated sludge consumes oxygen at a higher rate than
in their absence, depending on, among other factors, the concentration of microorganisms. Addition of a toxic
concentration of a test material results in a decrease in the oxygen consumption rate. The rates are measured
using an oxygen electrode. The percentage inhibition of the oxygen consumption is estimated by comparison
of the rate with that of a control mixture containing no test material.
The sensitivity of the activated sludge may be checked with a suitable reference substance. The inhibition of
the oxygen uptake by all sludge microorganisms, heterotrophic microorganisms and the oxidation of
ammonium salts by nitrifying microorganisms may be separately expressed from measurements of the rate of
uptake in the absence and presence of N-allylthiourea (ATU), a specific inhibitor of the oxidation of ammonium
to nitrite by first-stage nitrifiers. The difference between the two oxygen values is due to nitrification and the
residual value in the presence of allylthiourea is due to the heterotrophs. Any oxygen consumption due to
abiotic processes may be detected by determining the rate in mixtures of the test material, synthetic medium
and water, but omitting activated sludge.
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ISO 8192:2007(E)
Under certain (rare) circumstances, a test substance with strong reducing properties may cause measurable
abiotic oxygen consumption. In such cases, abiotic controls are necessary to discriminate between oxygen
uptake by the test substance and microbial respiration. Abiotic controls may be prepared either by omitting the
inoculum from test mixtures, or by poisoning the inoculum with a solution of mercury(II) chloride.
5 Reagents, media and inoculum
Use only reagents of recognized analytical grade.
5.1 Water, complying with grade 1 as defined in ISO 3696, dissolved respectively distilled or de-ionized
water containing less than 1 mg/l dissolved organic carbon (DOC).
5.2 Specific nitrification inhibitor, N-allylthiourea (ATU).
Dissolve 2,50 g of N-allylthiourea (ATU) in 1 000 ml of water (5.1). The addition of 2,32 ml of this stock
−4
solution to a sample of 500 ml results in a final concentration of 11,6 mg/l (10 mol/l).
5.3 Mercury(II) chloride solution
If required (see Clause 4), prepare a solution of 0,10 g of mercury(II)chloride (HgCl ) in 10 ml of water (5.1).
2
WARNING — Stringent safety precautions and extraordinary waste disposal measures apply to the
use of mercury salts in the laboratory. Routine deployment of abiotic controls poisoned with mercuric
chloride is not recommended.
5.4 Antifoam agent, free from silicone.
5.5 Reference substance, stock solution.
Prepare a solution containing 1,00 g of 3,5-dichlorophenol (3,5-DCP) in 1 000 ml of water (5.1). Use warm
water and/or ultrasonication to accelerate the dissolution and make the solution up to volume when it has
cooled to room temperature.
Alternatively N-methylaniline can be used as a reference substance, especially for inhibition of nitrification
processes. When using this substance, prepare a solution containing 1,00 g of N-methylaniline (NMA) in
1 000 ml of water (5.1).
5.6 Test medium, synthetic sewage 1 (100-fold OECD medium).
Peptone 16 g
Meat extract 11 g
Urea [CO(NH )] 3 g
2 2
Sodium chloride (NaCl) 0,7 g
0,4 g
Calcium chloride dihydrate (CaCl ⋅ 2H O)
2 2
0,2 g
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO ⋅ 7 H O)
4 2
Anhydrous potassium monohydrogenphosphate (K HPO) 2,8 g
2 4
Water (5.1) 1 l
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ISO 8192:2007(E)
The pH of this synthetic medium shall be 7,5 ± 0,5.
If the prepared synthetic medium is not used immediately, store it in the dark at 0 °C to 4 °C, for no longer
than 1 week.
Alternatively, sterilize the synthetic medium prior to storage, or add the peptone and meat extract shortly
before carrying out the test. Prior to use, ensure that the medium is mixed thoroughly and adjust the pH as
necessary.
5.7 Test material, stock solution.
The test material may be a pure chemical, a mixture of chemicals, a chemical product or a waste water.
Prepare a stock solution of the test material in water (5.1) at a suitable concentration, for example 1 g/l or
10 g/l. Waste waters may be used without dilution.
For insoluble materials, a suspension or dispersion may be prepared, or the test material may be added
directly to the test vessels. Take care to ensure as much homogeneity as possible. For handling insoluble
[7]
materials, see, for example, ISO 10634 .
5.8 Inoculum
For general use, activated sludge should be taken from the exit of the aeration tank (where substrate
concentrations are lowest) of a waste-water plant, treating predominantly domestic sewage, and working
efficiently. Depending on the purpose of the test, any type of activated sludge, including sludge grown in the
laboratory and sludge grown on industrial waste waters, may also be used at a suitable suspended-solids
concentration of, for example, 2 g/l to 4 g/l. However, activated sludges from different treatment plants are
likely to exhibit different characteristics and sensitivities.
6 Apparatus
General laboratory equipment, and the following (see Annex A).
6.1 Test vessels: 250 ml to 300 ml biochemical oxygen demand (BOD) bottles or Erlenmeyer flasks with
stoppers are recommended (see Figure A.1). Alternatively, larger test vessels may also be used (see
Figure A.2).
When using a BOD bottle for oxygen measurements, a suitable sleeve adapter may be required for sealing
the oxygen electrode against the necks of the test vessels (see Figure A.1). To avoid loss of displaced liquid
on insertion of the oxygen electrode, it is advisable first to insert a funnel or glass tube through the sleeve, or
to use vessels with flared-out rims.
6.2 Device for measuring oxygen concentration: comprising a suitable oxygen electrode, a cell to
contain the sample and a recorder (see Figure A.2).
6.3 Magnetic stirrers, covered with an inert material.
6.4 Aeration device
If necessary, pass compressed air through an appropriate filter to remove dust and oil, and through wash
bottles containing water to humidify the air. Aerate the test vessels with Pasteur pipettes, or other aeration
devices which do not adsorb chemicals.
6.5 pH-meter
2
6.6 Centrifuge, general bench-top centrifuge for sludge, capable of 10 000 m/s .
6.7 Apparatus for culturing nitrifying activated sludge (see Annex B).
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ISO 8192:2007(E)
7 Test environment
Perform the test at a temperature within the range of (22 ± 2) °C and in an atmosphere free from dust and
toxic vapours.
8 Procedure
8.1 General
An overview of the test procedure is shown in Annex C.
The procedures to be applied to nitrifying sludge differ from those applied to non-nitrifying sludge. Therefore, it
is advisable first to check the activated sludge for its nitrification activity (see Annex C).
The use of nitrifying sludge is only necessary when the influence of a test material on nitrification is to be
determined. Nitrifying sludge is not required if only heterotrophic respiration is determined.
In order to check the nitrification activity of the sludge, apply the nitrification test (8.8) and calculate the rate of
nitrification, if any, according to 9.2.
This preliminary test serves as a range-finder for the following definitive test.
See 8.9 for an outline of this preliminary test.
8.2 Elimination of foam
Difficulties can arise if foaming occurs during the incubation, to the extent that the foam, and the sludge solids
carried on it, are expelled from the aeration vessels. Occasionally, foaming may simply result from the
presence of the synthetic sewage, but foaming should be anticipated if the test material is, or contains, a
surfactant. Loss of sludge solids from the test mixtures will result in artificially lowered respiration rates that
could mistakenly be interpreted as a result of inhibition. In addition, aeration of surfactant solutions
concentrates the surfactant in the foam layer; loss of foam from the test system will lower the exposure
concentrations.
If foaming occurs, add a surfactant-free silicone-emulsion antifoam agent (5.4). If the problem is associated
with the presence of the synthetic sewage, modify the sewage concentrate (5.6) by including an antifoam
agent (5.4) at a rate of 50 µl/l. If foaming is caused by the test material, determine the quantity (generally a
few drops from a Pasteur pipette) needed for abatement at the maximum test concentration, then treat all
individual aeration vessels identically (including those, for example, blank controls and reference vessels,
where foam is absent).
8.3 Preparation of inoculum
Where necessary, remove coarse particles by settling for a short period, for example 15 min, and decanting
the upper layer of finer solids for use. Alternatively, the sludge may be homogenized by using a blender for a
few seconds. Where necessary, remove coarse particles with a suitable sieve.
The sludge may be washed as follows: first centrifuge (6.6) the sludge for about 10 min at approximately
2
10 000 m/s and discard the supernatant liquid. Re-suspend the sludge in chlorine-free tap water, remove this
by re-centrifuging and then repeat, if necessary, the washing and centrifuging process. Determine the dry
mass of a known volume of the sludge. Finally re-suspend the sludge in chlorine-free tap water to obtain the
required activated sludge concentration, of about 3 g/l of suspended solids.
Having adjusted the concentration of suspended solids, continuously aerate the activated sludge and, where
possible, use it within 24 h of collection. If this is not possible, the activated sludge may be fed for up to one
additional day with synthetic medium (see 5.6) at a rate not exceeding 50 ml per litre per day, provided no
significant change in its activity results and that nitrification, if initially present, is not lost. Alternatively,
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ISO 8192:2007(E)
changes in activity may be minimized by refrigerating the activated sludge at 4 °C for up to 4 d without
feeding [13]. In all cases, the origin, the concentration, any pre-treatment and maintenance of the activated
sludge shall be stated in the test report. Knowledge about possible changes occurring to sludges during
storage is insufficient. Therefore, any sludge storage and/or treatment should be the same for all samples in a
study under investigation.
WARNING — Laboratory-grown sludges can be less active, with a narrower spectrum of substrates
than sludges from waste-water treatment plants.
8.4 Test mixtures
Incubate test mixtures under conditions of forced aeration. Start the incubation (aeration) for each preparation
with the initial contact between the activated sludge inoculum and the other mixture constituents, and finalize
after a specified exposure time when the rate of decline in dissolved oxygen concentration is measured.
The capacity of the equipment used to measure oxygen consumption rates determines the manner in which
the incubations begin. For example, if it comprises a single probe, the measurements are made individually. In
this case, prepare the various mixtures required for the test, but withhold the inoculum, adding it to each
vessel of the series and starting each incubation in turn, at timed intervals of, for example, 10 min to 15 min.
Alternatively, the measuring system may comprise multiple probes that facilitate multiple, simultaneous
measurements, in which case inoculum may be added at the same time to appropriate groups of vessels.
The activated sludge concentration in the test mixtures is nominally 1 500 mg/l of suspended solids. Measure
the oxygen consumption after 30 min of incubation. If more information after an extended contact time is found
necessary, carry out additional measurements after 180 min of incubation. Depending on the purpose of the
test, the incubation time may be extended still further, e.g. up to 27 h. For a 27 h test, add the synthetic
medium (5.6) after 24 h of incubation (without synthetic medium) and aerate additionally for 3 h. This shall be
stated in the test report.
NOTE Usually, an incubation time of 30 min is sufficient. Longer incubation may, for example, be required for
substances that are poorly soluble in water. Any extension of the incubation time will result in an increase of work.
Prepare in the test vessels (6.1) mixtures, F , containing dilution water (5.1), synthetic medium (5.6) and test
T
material (5.7), to obtain different known concentrations as required. See Table D.1 of Annex D for examples of
volumes of constituents. Adjust the pH to 7,5 ± 0,5, dilute with water and add the inoculum (5.8) to obtain
equal final volumes. If the inhibitory effect of the pH is to be tested, do not adjust the pH.
8.5 Reference mixtures
Normally, for most cases, prepare mixtures, F , with a suitable reference substance (5.5) in the same way as
R
in 8.4 (see 8.10.2).
8.6 Blank control
Carry out at least one blank control, F , which contains an equal volume of activated sludge and synthetic
B
medium as the test mixture(s), but no test material. Dilute with water to the same volume as the test mixtures.
8.7 Abiotic test
If required (for example, if a test material is known or suspected to have strong reducing properties), prepare
mixtures, F , to measure the abiotic oxygen consumption. They contain the same amount of test material,
A
synthetic medium and water as the test mixtures, but no activated sludge. If required, add an inhibitor such as
mercury chloride to prevent biological oxygen consumption, for example, 1,0 ml/l of a HgCl solution (5.3).
2
6 © ISO 2007 – All rights reserved
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ISO 8192:2007(E)
8.8 Nitrification test
Prepare mixtures (F ) as in the blank control (8.6) and additional control mixtures (F ) but which also contain
B N
11,6 mg/l of ATU (5.2). Aerate and incubate for 30 min (8.4) and then measure the rates of oxygen uptake
(8.12) and calculate the rate of oxygen uptake due to nitrification (as indicated in 9.2).
8.9 Preliminary test
A preliminary test is useful to estimate the range of concentrations needed in a definitive test for determining
the inhibition of oxygen consumption. Alternatively, the absence of inhibition of oxygen consumption in a
preliminary test may demonstrate that a definitive test is unnecessary.
Carry out the test (8.10.2, 8.10.3) using at least three concentrations of test material (5.7), for example
1,0 mg/l, 10 mg/l; and 100 mg/l, a blank control (8.6) and, if necessary, an abiotic control (8.7) with the highest
concentration of test material (see the example in Annex D, Table D.1).
Ideally, the lowest concentration of test material used should have no effect on the oxygen consumption.
Calculate the rates of oxygen uptake (9.1) and the rate of nitrification (9.2), if relevant; and calculate the
percentages of inhibition (9.3).
NOTE Depending on the purpose of the test, it is also possible to determine the toxicity of a limit concentration, e.g.
100 mg/l, that covers all realistic scenarios for the test material in question. If no significant toxic effect occurs at this
concentration, further testing at higher or lower concentrations is not necessary.
8.10 Definitive test
8.10.1 General
The inhibition of three different oxygen uptakes may be determined, namely, total, heterotrophic, and that due
to nitrification. For total uptake, prepare the reaction mixtures as in 8.10.2, while for the other two, prepare
mixtures as in 8.10.2 and also those in 8.10.3.
8.10.2 Inhibition of total oxygen uptake
Carry out the test using a range of concentrations deduced from the preliminary test. Use at least five
concentrations in a logarithmic series and include a blank control. The abiotic control does not need to be
repeated if there was no oxygen uptake in the preliminary test. However, if significant uptake occurs, include
abiotic controls for each concentration of test material.
The sensitivity of the sludge may be checked using a reference substance [e.g. 3,5-dichlorophenol or
N-methylaniline (5.5)]. Where possible, check the sensitivity for each test series.
NOTE The sensitivity of activated sludge is known to fluctuate [13], among other factors, according to the
maintenance of the sludge in the laboratory during the interval between collection/preparation and use. It is therefore not
permissible to rely on reference inhibitor responses obtained on other occasions, with activated sludge from the same
source or the same batch.
8.10.3 Discrimination between inhibition of heterotrophic respiration and nitrification-linked oxygen
uptake
The use of the specific nitrification inhibitor, ATU, enables the inhibitory effects of test substances on solely
heterotrophic oxidation to be assessed directly, and, by subtracting the oxygen uptake rate in the presence of
ATU from the total oxygen uptake rate (no ATU present), the effects on the rate of nitrification may be
calculated (see Annex C).
Prepare two sets of reaction mixtures as in 8.10.2, but to one set add ATU to each mixture to allow a final
concentration of 11,6 mg/l (5.2), which should completely inhibit
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 8192
Deuxième édition
2007-02-01
Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de la
consommation d'oxygène par des boues
activées pour l'oxydation du carbone et
de l'ammonium
Water quality — Test for inhibition of oxygen consumption by activated
sludge for carbonaceous and ammonium oxidation
Numéro de référence
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ISO 8192:2007(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principe. 3
5 Réactifs, milieux et inoculum . 3
6 Appareils. 4
7 Environnement de l’essai . 5
8 Mode opératoire . 5
9 Calcul et expression des résultats. 9
10 Validité des résultats. 12
11 Rapport d’essai . 14
Annexe A (informative) Exemples d’unités de mesurage . 15
Annexe B (informative) Appareillage pour cultiver de la boue activée nitrifiante. 17
Annexe C (informative) Vue d’ensemble du mode opératoire d’essai. 19
Annexe D (informative) Mélanges pour l’essai préliminaire . 20
Annexe E (informative) Exemple de courbes d’inhibition. 21
Bibliographie . 22
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ISO 8192:2007(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 8192 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 5, Méthodes
biologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 8192:1986), qui a fait l'objet d'une
révision technique.
iv © ISO 2007 – Tous droits réservés
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ISO 8192:2007(F)
Introduction
Les informations obtenues par la présente méthode, qui permettent d’évaluer la toxicité potentielle de
substances, de mélanges et d'eaux résiduaires vis-à-vis des boues activées, peuvent être utiles pour estimer
l’effet d’un matériau d’essai sur des populations bactériennes mixtes dans l’environnement aquatique,
notamment dans les systèmes de traitement biologique aérobie. L’inhibition potentielle de la consommation
d’oxygène par des substances chimiques et des eaux résiduaires n’est pas nécessairement uniforme pour les
différentes sous-populations de communautés bactériennes et des effets sélectifs peuvent influer
profondément sur le résultat de l’essai.
Il existe deux groupes principaux de micro-organismes contribuant à la consommation d’oxygène totale par
les boues activées: les organismes hétérotrophes principalement responsables de la décomposition des
substrats à base de carbone (oxydation des composants carbonés) et les organismes autotrophes nitrifiants
provoquant l’oxydation de l’ammonium en nitrate (nitrification). L’effet inhibiteur d’un échantillon d’essai peut
s’exercer sur les deux groupes de micro-organismes ou il peut s’exercer de manière prédominante sur l’un
d’eux uniquement. La nitrification est le processus généralement le plus favorable à l’inhibition sélective.
La présente Norme internationale peut être utilisée pour évaluer la toxicité des substances sur la
consommation d’oxygène totale (c’est-à-dire l'oxydation des composants carbonés et la nitrification
combinées) ou, en ajoutant délibérément un inhibiteur spécifique de la nitrification, pour évaluer la toxicité des
substances sur l’oxydation des composants carbonés et la nitrification séparément.
Pour la détermination de l’inhibition de la nitrification selon la présente méthode, une boue activée
suffisamment nitrifiante est exigée. Des indications sur la nitrification peuvent être obtenues dans
[4]
l’ISO 9509 .
Il convient que l’utilisateur de cette méthode soit conscient que des problèmes particuliers peuvent nécessiter
la spécification de conditions marginales supplémentaires.
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NORME INTERNATIONALE ISO 8192:2007(F)
Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de la consommation
d'oxygène par des boues activées pour l'oxydation du carbone
et de l'ammonium
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale maîtrise les
pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n’a pas pour but de traiter tous
les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il est de la responsabilité de
l’utilisateur de mettre en place des pratiques d’hygiène et de sécurité adéquates et de s’assurer de la
conformité avec toutes les dispositions réglementaires nationales.
IMPORTANT — Il est indispensable que les essais menés selon la présente Norme internationale le
soient par du personnel qualifié.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode d’évaluation de l’effet inhibiteur d’un échantillon
d’essai sur la consommation d’oxygène des micro-organismes des boues activées.
La présente méthode est conçue pour représenter les conditions dans les stations de traitement des eaux
résiduaires biologiques. Elle fournit des informations sur les effets inhibiteurs ou stimulateurs après un temps
d’exposition court (habituellement de 30 min à 180 min ou même plus) des micro-organismes des boues
activées à l’échantillon d’essai.
Cette méthode est applicable aux essais des eaux, des eaux résiduaires, des substances chimiques pures et
des mélanges de substances chimiques. S’agissant des substances chimiques, la méthode porte sur les
substances chimiques solubles dans les conditions de l’essai. Des précautions particulières sont nécessaires
avec les produits à faible solubilité aqueuse, à haute volatilité et avec ceux qui consomment ou produisent de
l’oxygène de manière abiotique.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l’application du présent document. Pour les
références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
boue activée
amas biologique (floc) formé au cours du traitement d’une eau résiduaire par la croissance de bactéries et
d’autres micro-organismes en présence d’oxygène dissous
[3]
(ISO 6107-1:2004 , définition 2)
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ISO 8192:2007(F)
3.2
concentration de matières en suspension d’une boue activée
quantité de matière solide obtenue par filtration ou centrifugation d’un volume connu de boues activées et
séchage à 105 °C environ jusqu’à masse constante
[6]
(ISO 9888:1999 , définition 3.4)
3.3
taux de consommation d’oxygène
consommation d’oxygène par les micro-organismes de boues activées par unité de volume de boue et unité
de temps
.
NOTE Cette grandeur est exprimée en milligrammes par litre par heure [mg/(l h)].
3.4
taux spécifique de consommation d’oxygène
consommation d’oxygène par des micro-organismes de boue activée par unité de masse (matières en
suspension) et unité de temps
.
NOTE Cette grandeur est exprimée en milligrammes par gramme par heure [mg/(g h)].
3.5
inhibition de la consommation d’oxygène
diminution du taux de consommation d’oxygène d’une boue activée et d’une ou plusieurs substances
biodégradables en présence de l’échantillon d’essai, par rapport à celui d’un mélange similaire sans
échantillon d’essai
NOTE 1 Cette grandeur est exprimée en pourcentage.
NOTE 2 En l’absence de substrat, des substances chimiques (par exemple des agents découplants de
phosphorylation) peuvent augmenter la consommation d’oxygène.
3.6
niveau toxique
plage de concentrations d’un échantillon d’essai dans laquelle se produit une inhibition de 0 % à 100 %
3.7
CE
50
concentration efficace d’un échantillon d’essai produisant une inhibition calculée ou interpolée de 50 % de la
consommation d’oxygène par rapport à un essai à blanc
3.8
nitrification
oxydation des composés d’ammonium par des bactéries
NOTE Généralement les produits intermédiaires d’une telle oxydation sont des nitrites et les produits ultimes des
nitrates.
[3]
(ISO 6107-1:2004 , définition 49)
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ISO 8192:2007(F)
4 Principe
En présence de substances facilement biodégradables, la boue activée consomme de l’oxygène à un taux
plus élevé qu’en leur absence, taux qui dépend, entre autres facteurs, de la concentration en micro-
organismes. L’ajout d’un échantillon d’essai à une concentration toxique provoque une diminution du taux de
consommation d’oxygène. Les taux sont mesurés à l’aide d’une électrode à oxygène. Le pourcentage
d’inhibition de la consommation d’oxygène est estimé par comparaison du taux correspondant à l’échantillon
d’essai avec celui d’un mélange témoin ne contenant pas d’échantillon d’essai.
La sensibilité de la boue activée peut être vérifiée avec une substance de référence adaptée. L’inhibition de la
consommation d’oxygène par tous les micro-organismes des boues et par les micro-organismes
hétérotrophes, et celle de l’oxydation des sels d’ammonium par les micro-organismes nitrifiants peuvent être
exprimées séparément à partir de mesurages du taux de consommation en l’absence et en présence de N-
allylthiourée (ATU), inhibiteur spécifique de l’oxydation de l’ammonium en nitrite par les micro-organismes
intervenant dans la première étape de nitrification. La différence entre les deux valeurs d’oxygène est due à la
nitrification et la valeur résiduelle en présence d’allylthiourée est due aux micro-organismes hétérotrophes.
Toute consommation d’oxygène due à des processus abiotiques peut être détectée en déterminant le taux
dans des mélanges contenant de l’échantillon d’essai, du milieu synthétique et de l’eau, mais en omettant la
boue activée.
Dans certains cas (rares), une substance d’essai ayant de fortes propriétés réductrices peut provoquer une
consommation d’oxygène abiotique mesurable. Dans ce cas, des témoins abiotiques sont nécessaires pour
faire la différence entre la consommation d’oxygène par la substance d’essai et la respiration microbienne.
Les témoins abiotiques peuvent être préparés en omettant l’inoculum des mélanges d’essai, ou en
empoisonnant l’inoculum avec une solution de chlorure de mercure(II).
5 Réactifs, milieux et inoculum
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
5.1 Eau, conforme au niveau de qualité 1 tel que défini dans l’ISO 3696, c’est-à-dire de l’eau distillée ou
déionisée contenant moins de 1 mg/l de carbone organique dissous (COD).
5.2 Inhibiteur de nitrification spécifique, N-allylthiourée (ATU).
Dissoudre 2,50 g d'ATU dans 1 000 ml d’eau (5.1). L’ajout de 2,32 ml de cette solution mère à un échantillon
−4
de 500 ml donne une concentration finale de 11,6 mg/l (10 mol/l).
5.3 Solution de chlorure de mercure(II) (chlorure mercurique).
Si nécessaire (voir Article 4), préparer une solution de 0,10 g de chlorure de mercure(II) (HgCl ) dans 10 ml
2
d’eau (5.1).
AVERTISSEMENT — Des précautions de sécurité rigoureuses et des mesures d’élimination des
déchets spécifiques s’appliquent à l’utilisation de sels de mercure en laboratoire. L’emploi régulier de
témoins abiotiques empoisonnés au chlorure mercurique n’est pas recommandé.
5.4 Agent antimousse, exempt de silicone.
5.5 Substance de référence, solution mère de 3,5-dichlorophénol (3,5-DCP) ou de N-méthyl-aniline (NMA).
Préparer une solution contenant 1,00 g de 3,5-DCP dans 1 000 ml d’eau (5.1). Utiliser de l’eau chaude et/ou
l’ultrasonication pour accélérer la dissolution et compléter au volume après refroidissement à température
ambiante.
Il est également possible d’utiliser de la NMA comme substance de référence, en particulier pour l’inhibition
des processus de nitrification. Lors de l’utilisation de cette substance, préparer une solution contenant 1,00 g
de NMA dans 1 000 ml d’eau (5.1).
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5.6 Milieu d’essai, eau d’égout synthétique 1 (milieu OCDE concentré 100 fois).
Peptone 16 g
Extrait de viande 11 g
Urée [CO(NH )] 3 g
2 2
Chlorure de sodium (NaCl) 0,7 g
Chlorure de calcium dihydraté (CaCl ,2HO) 0,4 g
2 2
Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO ,7 HO) 0,2 g
4 2
Hydrogénophosphate de potassium (K HPO) 2,8 g
2 4
Eau (5.1) 1 l
Le pH de ce milieu synthétique doit être de 7,5 ± 0,5.
Si le milieu synthétique préparé n’est pas utilisé immédiatement, le conserver à l’abri de la lumière entre 0 °C
et 4 °C, pendant une semaine au maximum.
Dans le cas contraire, stériliser le milieu synthétique préalablement au stockage ou ajouter la peptone et
l’extrait de viande peu de temps avant de réaliser l’essai. Avant utilisation, s’assurer que le milieu est mélangé
minutieusement et ajuster le pH, si nécessaire.
5.7 Échantillon d’essai, solution mère.
L’échantillon d’essai peut être une substance chimique pure, un mélange de substances chimiques, ou un
produit chimique ou une eau résiduaire.
Préparer une solution mère de l’échantillon d’essai dilué dans de l’eau (5.1) à une concentration appropriée,
par exemple 1 g/l ou 10 g/l. Les eaux résiduaires peuvent être utilisées sans dilution.
Pour les produits insolubles, une suspension ou une dispersion peut être préparée, ou l’échantillon d’essai
peut être ajouté directement dans les récipients d’essai. Veiller à garantir la meilleure homogénéité possible.
[7]
Voir, par exemple, l’ISO 10634 , pour la manipulation des produits insolubles.
5.8 Inoculum
Pour l’utilisation générale, il convient de prélever la boue activée à la sortie du bassin d’aération (là où les
concentrations de substrat sont les plus faibles) d’une station d’eaux résiduaires traitant principalement des
eaux d’égout d’origine domestique et fonctionnant de manière efficace. Selon l’objet de l’essai, tout type de
boue activée, y compris la boue cultivée en laboratoire et celle cultivée à partir d’eaux résiduaires industrielles,
peut également être utilisé à une concentration de matières en suspension appropriée de 2 g/l à 4 g/l, par
exemple. Toutefois, les boues activées provenant de différentes stations de traitement sont susceptibles
d’avoir des caractéristiques et des sensibilités différentes.
6 Appareils
Matériel courant de laboratoire et ce qui suit (voir Annexe A).
6.1 Récipients d’essai: des bouteilles DBO (demande biochimique en oxygène) de 250 ml à 300 ml ou
des erlenmeyers munis de bouchons sont recommandés (voir Figure A.1). Il est également possible d’utiliser
des récipients d’essai plus grands (voir Figure A.2).
Lorsqu’une bouteille DBO est utilisée pour les mesurages d’oxygène, un bouchon approprié préalablement
percé permettant de fixer hermétiquement l’électrode à oxygène contre le col des récipients d’essai peut être
nécessaire (voir Figure A.1). Afin d’éviter les pertes de liquide déplacé au moment de l’insertion de l’électrode
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à oxygène, il est conseillé d’introduire tout d’abord un entonnoir ou un tube de verre à travers le bouchon, ou
d’utiliser des récipients à bord évasé.
6.2 Dispositif de mesurage de la concentration en oxygène, comprenant une électrode à oxygène
adaptée, une cuve pour contenir l’échantillon et un enregistreur (voir Figure A.2).
6.3 Agitateurs magnétiques, recouverts d’un matériau inerte.
6.4 Dispositif d’aération
Si nécessaire, faire passer de l’air comprimé à travers un filtre approprié pour éliminer la poussière et l’huile,
et à travers des flacons laveurs contenant de l’eau pour humidifier l’air. Aérer les récipients d’essai avec une
pipette Pasteur ou un autre dispositif d’aération qui n’absorbe pas les substances chimiques.
6.5 pH-mètre
2
6.6 Centrifugeuse de laboratoire, adaptée à la boue, ayant une accélération de 10 000 m/s .
6.7 Appareillage pour cultiver de la boue nitrifiante en laboratoire (voir Annexe B).
7 Environnement de l’essai
Conduire l’essai à une température se trouvant dans la plage de (22 ± 2) °C et dans une atmosphère exempte
de poussières et de vapeurs toxiques.
8 Mode opératoire
8.1 Généralités
Un schéma du mode opératoire est donné en Annexe C.
Les modes opératoires utilisés pour les boues nitrifiantes diffèrent de ceux utilisés pour les boues non
nitrifiantes. En conséquence, il est conseillé de commencer par vérifier l’activité de nitrification de la boue
activée (voir Annexe C).
L’utilisation de boue nitrifiante est uniquement nécessaire pour pouvoir déterminer l’influence d’un échantillon
d’essai sur la nitrification. La boue nitrifiante n’est pas exigée si seule la respiration hétérotrophe est
déterminée.
Afin de vérifier l’activité de nitrification de la boue, procéder à l’essai de nitrification (8.8) et calculer le taux de
nitrification, le cas échéant, conformément à 9.2.
Cet essai préliminaire sert à rechercher la plage de concentrations pour l’essai définitif qui suit.
Voir 8.9 pour avoir un aperçu de cet essai préliminaire.
8.2 Élimination de la mousse
Des difficultés peuvent survenir si de la mousse se forme durant l’incubation dans la mesure où cette dernière,
et les matières solides de boues qu’elle porte, sont expulsées hors des récipients d’aération. La formation
occasionnelle de mousse peut simplement provenir de la présence d’eau d’égout synthétique, mais il convient
de l’anticiper si l’échantillon d’essai est, ou contient, un agent de surface. La perte de matières solides de
boue des mélanges d’essai conduira à des taux de respiration artificiellement diminués qui pourraient être
interprétés par erreur comme un résultat d’inhibition. En outre, l’aération des solutions d’agent de surface
concentre l’agent de surface dans la couche de mousse; la perte de mousse du système d’essai réduira les
concentrations d’exposition.
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En cas de formation de mousse, ajouter un agent antimousse exempt de silicone (5.4). Si le problème est
associé à la présence d’eau d’égout synthétique, modifier le concentré d’eau d’égout (5.6) en incluant un
agent antimousse (5.4) à un taux de 50 µl/l. Si la formation de mousse est provoquée par l’échantillon d’essai,
déterminer la quantité (généralement quelques gouttes d’une pipette Pasteur) nécessaire à l’élimination de la
mousse à la concentration d’essai maximale, puis traiter tous les récipients d’aération individuels de manière
identique (y compris ceux dans lesquels il n’y a pas de mousse, par exemple les témoins et les récipients de
référence).
8.3 Préparation de l'inoculum
Lorsque cela est nécessaire, éliminer les particules grossières par sédimentation pendant une courte durée,
par exemple 15 min, et récupérer par décantation la couche supérieure contenant les matières les plus fines
pour utilisation. Il est aussi possible d’homogénéiser la boue en utilisant un mélangeur pendant quelques
secondes. Lorsque cela est nécessaire, éliminer les particules grossières à l’aide d’un tamis adapté.
La boue peut être lavée de la manière suivante: tout d’abord, centrifuger (6.6) la boue pendant environ 10 min
2
à approximativement 10 000 m/s et éliminer le surnageant. Remettre la boue en suspension dans de l’eau du
robinet exempte de chlore, procéder à une nouvelle centrifugation puis répéter, si nécessaire, les processus
de lavage et de centrifugation. Déterminer la masse de matière sèche d’un volume connu de boue. Remettre
enfin la boue en suspension dans de l’eau du robinet exempte de chlore afin d’obtenir la concentration de
boue activée nécessaire, d’environ 3 g/l de matières en suspension.
Une fois la concentration de matières en suspension ajustée, aérer de manière continue la boue activée, et
dans la mesure du possible, l’utiliser dans les 24 h suivant le prélèvement. Si ce n’est pas possible, la boue
activée peut être nourrie pendant un jour supplémentaire au maximum avec un milieu synthétique (voir 5.6) à
un taux ne dépassant pas 50 ml par litre par jour, à condition de ne provoquer aucune modification
significative de son activité et que la nitrification – si initialement présente – ne soit pas perdue. Les
modifications peuvent également être minimisées en réfrigérant la boue activée à 4 °C pendant 4 j au
[13]
maximum sans alimentation . Dans tous les cas, l’origine, la concentration, tout prétraitement et tout
entretien de la boue activée doivent être indiqués dans le rapport d’essai. La connaissance de possibles
modifications des boues susceptibles d’intervenir durant le stockage est insuffisante. Par conséquent, il
convient que toutes les opérations de stockage de boue et/ou de traitement soient identiques pour tous les
échantillons utilisés dans une étude en cours.
AVERTISSEMENT — Les boues cultivées en laboratoire peuvent être moins actives avec un spectre
plus limité de substrats que les boues provenant de stations de traitement des eaux résiduaires.
8.4 Mélanges d’essai
Incuber les mélanges d’essai dans des conditions d’aération forcée. Commencer l’incubation (aération) pour
chaque préparation dès le contact entre l’inoculum de boue activée et les autres constituants du mélange, et
terminer après un temps d’exposition spécifié lorsque le taux de diminution de la concentration d’oxygène
dissous est mesuré.
La capacité de l’appareillage utilisé pour mesurer les taux de consommation d’oxygène détermine la manière
dont les incubations commencent. Par exemple, si le système comprend une seule électrode, les mesurages
s’effectuent un par un. Dans ce cas, préparer les différents mélanges nécessaires à l’essai, mais mettre de
côté l’inoculum, qui sera ajouté à chaque dispositif de la série de manière décalée, en commençant les
incubations à intervalles programmés, par exemple 10 min à 15 min.
Si, en revanche, le système de mesurage comprend plusieurs électrodes, ce qui facilite les mesurages
multiples et simultanés, l’inoculum peut alors être ajouté en même temps dans les groupes appropriés de
récipients.
La concentration de boue activée dans les mélanges d’essai est nominalement de 1 500 mg/l de matières en
suspension. Mesurer la consommation d’oxygène après 30 min d’incubation. Si davantage d’informations sont
nécessaires après un temps de contact prolongé, effectuer des mesurages supplémentaires après 180 min
d’incubation. Selon l’objectif de l’essai, le temps d’incubation peut être prolongé davantage, par exemple
jusqu’à 27 h. Dans le cas d’un essai de 27 h, ajouter le milieu synthétique (5.6) après 24 h d’incubation (sans
le milieu synthétique), puis aérer pendant 3 h supplémentaires. Cela doit être indiqué dans le rapport d’essai.
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ISO 8192:2007(F)
NOTE Généralement, un temps d’incubation de 30 min est suffisant. Une incubation plus longue peut par exemple
être exigée pour les substances faiblement solubles dans l’eau. Toute prolongation du temps d’incubation demandera
davantage de travail.
Préparer dans des récipients d’essai (6.1) des mélanges, F , contenant de l’eau de dilution (5.1), un milieu
T
synthétique (5.6) et un échantillon d’essai (5.7) afin d’obtenir différentes concentrations connues telles
qu’exigées. Voir le Tableau D.1 de l'Annexe D pour obtenir des exemples de volumes des constituants.
Ajuster le pH à 7,5 ± 0,5, diluer avec de l’eau et ajouter l’inoculum (5.8) pour obtenir des volumes finals égaux.
Si l’effet inhibiteur du pH est à contrôler, ne pas ajuster le pH.
8.5 Mélanges de référence
Généralement, dans la plupart des cas, préparer des mélanges F , avec une substance de référence
R
adéquate (5.5) comme indiqué en 8.4 (voir 8.10.2).
8.6 Essai à blanc
Conduire au moins un essai à blanc, F , sur un témoin contenant le même volume de boue activée et de
B
milieu synthétique que le ou les mélanges d’essai mais pas l’échantillon d’essai. Diluer avec de l’eau au
même volume que pour les mélanges d’essai.
8.7 Essai abiotique
Si exigé (par exemple, si un échantillon d’essai a ou est censé avoir des propriétés réductrices importantes),
préparer des mélanges, F , afin de mesurer la consommation abiotique d’oxygène. Ces mélanges
A
contiennent la même quantité d’échantillon d’essai, de milieu synt
...
Questions, Comments and Discussion
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