ISO 10273:2017
(Main)Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection of pathogenic Yersinia enterocolitica
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection of pathogenic Yersinia enterocolitica
ISO 10273:2017 specifies a horizontal method for the detection of Y. enterocolitica associated with human disease. It is applicable to - products intended for human consumption and the feeding of animals, and - environmental samples in the area of food production and food handling.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche de Yersinia enterocolitica pathogènes
ISO 10273:2017 spécifie une méthode horizontale pour la recherche des Y. enterocolitica associées aux maladies chez l'homme. Ce document est applicable - aux produits destinés à l'alimentation humaine et animale, et - aux échantillons d'environnement pour la production et la distribution des aliments.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10273
Third edition
2017-03
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the detection
of pathogenic Yersinia enterocolitica
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour
la recherche de Yersinia enterocolitica pathogènes
Reference number
ISO 10273:2017(E)
©
ISO 2017
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ISO 10273:2017(E)
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ISO 10273:2017(E)
Contents Page
Foreword .v
Introduction .vii
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Abbreviated terms . 2
5 Principle . 2
5.1 General . 2
5.2 Direct plating from liquid enrichment medium . 2
5.3 Enrichment in liquid enrichment medium and selective liquid enrichment medium . 2
5.4 Plating out after enrichment and identification . 2
5.5 Confirmation . 3
6 Culture media and reagents . 3
7 Equipment and consumables . 3
8 Sampling . 3
9 Preparation of test sample . 4
10
Procedure (as shown in Annex A) . 4
10.1 Test portion and initial suspension . 4
10.2 Direct plating on selective agar . 4
10.3 Enrichment . 5
10.4 Plating out and incubation of plates . 5
10.4.1 Plating from PSB and ITC by KOH treatment on CIN agar. 5
10.4.2 Plating from PSB and ITC by KOH treatment on chromogenic agar (optional) . 5
10.5 Identification of characteristic colonies . 5
10.6 Confirmation . 6
10.6.1 General. 6
10.6.2 Selection of colonies for confirmation . 6
10.6.3 Determination of pathogenic Yersinia species . 6
10.6.4 Confirmation of pathogenic Y. enterocolitica . 8
10.6.5 Interpretation of confirmation tests for Y. enterocolitica.10
10.6.6 Interpretation of confirmation tests for pathogenic Y. enterocolitica .10
10.7 Biotyping of Y. enterocolitica (optional) .10
10.7.1 General.10
10.7.2 Fermentation of xylose .11
10.7.3 Tween-esterase test .11
10.7.4 Fermentation of salicin (optional) and trehalose .11
10.7.5 Indole formation .11
10.7.6 Interpretation of biotyping tests .11
11 Expression of results .12
12 Performance characteristics of the method .12
12.1 Interlaboratory study .12
12.2 Sensitivity .12
12.3 Specificity .12
12.4 LOD .12
50
13 Test report .12
14 Quality assurance .13
Annex A (normative) Diagrams of the procedures .14
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ISO 10273:2017(E)
Annex B (normative) Composition and preparation of culture media and reagents .17
Annex C (informative) Method validation studies and performance characteristics .32
Annex D (informative) Procedure for cold enrichment .34
Bibliography .39
iv © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 10273:2017(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: w w w . i s o .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in collaboration with ISO Technical
Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the
agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 10273:2003), which has been technically
revised with the following main changes.
— In confirmation of pathogenic Y. enterocolitica, tests related to pathogenicity have been added or
specified and relocated in the frontline. Accordingly, the word “presumptive” has been removed
from the title wording (pathogenic Y. enterocolitica) since standard contains mandatory tests
related to pathogenicity and allows separation of pathogenic and non-pathogenic Y. enterocolitica.
1)
TM
— Direct plating on cefsulodin, Irgasan and novobiocin (CIN) agar has been added.
— Incubation time for peptone, sorbitol and bile salts (PSB) enrichment broth and CIN agar has been
changed.
TM
— Inoculation and incubation time for Irgasan , ticarcillin and potassium chlorate (ITC) enrichment
broth has been changed and specified.
— Salmonella/shigella agar with sodium desoxycholate and calcium chloride (SSDC) has been replaced
by CIN agar and optional chromogenic medium.
— Inoculation of CIN agar without prior potassium hydroxide (KOH) treatment of enrichment broth
has been changed to optional procedure (in parallel to mandatory KOH treatment).
— The preparation (shelf life) of KOH and ammonium iron(II) sulfate solutions has been specified.
TM
1) Irgasan is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
© ISO 2017 – All rights reserved v
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ISO 10273:2017(E)
— Suspect colonies from primary culture are streaked (purified) on CIN agar and (optionally)
on chromogenic agar to facilitate better selection of characteristic colonies that need further
confirmation. The use of stereomicroscope in identification of characteristic colonies is emphasized.
— All biochemical confirmation tests, except for pyrazinamidase test, can be replaced by real-time
polymerase chain reaction (PCR) detection of ail-gene in accordance with ISO/TS 18867.
— Five confirmation tests (indole, trehalose, xylose, citrate, tween-esterase) have become optional.
Test for salicin has been added as an optional (biotyping) test. Test for calcium requirements at 37°C
has been replaced by congo red magnesium-oxalate (CR-MOX) test. Three tests (oxidase, Kligler’s
agar and ornithine decarboxylase) have been deleted.
— The procedure for cold-enrichment of Y. enterocolitica has been added as Annex D;
— Performance characteristics have been added to Annex C.
— Performance testing for the quality assurance of the culture media has been added to Annex B and
Annex D.
vi © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 10273:2017(E)
Introduction
This document specifies a horizontal method for the detection of Yersinia enterocolitica associated with
human disease. Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not
be appropriate in every detail for certain products, and for some other products it may be necessary to
use different methods. Nevertheless, it is hoped that in all cases every attempt will be made to apply
this horizontal method as far as possible and that deviations from this will only be made if absolutely
necessary for technical reasons.
The main changes, listed in the foreword, introduced in this document compared to ISO 10273:2003,
are considered as major (see ISO 17468).
When this document is next reviewed, account will be taken of all information then available regarding
the extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from this
in the case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate and, for certain group of products,
International Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this
horizontal method. It is hoped that when such standards are reviewed, they will be changed to comply
with this document so that eventually the only remaining departures from this horizontal method will
be those necessary for well-established technical reasons.
© ISO 2017 – All rights reserved vii
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 10273:2017(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
the detection of pathogenic Yersinia enterocolitica
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests
for detecting pathogenic Yersinia enterocolitica are only undertaken in properly equipped
laboratories, under the control of a skilled microbiologist, and that great care is taken in the
disposal of all incubated materials. Persons using this document should be familiar with normal
laboratory practice. This document does not purport to address all of the safety aspects, if any,
associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and
health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
1 Scope
This document specifies a horizontal method for the detection of Y. enterocolitica associated with
human disease. It is applicable to
— products intended for human consumption and the feeding of animals, and
— environmental samples in the area of food production and food handling.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 11133:2014, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www.e lectropedia. org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www. iso. org/o bp
3.1
pathogenic Yersinia enterocolitica
psychrotrophic bacteria forming characteristic colonies on solid selective media and possessing the
biochemical and molecular properties meeting the pathogenicity criteria described when confirmation
tests are carried out in accordance with this document
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ISO 10273:2017(E)
3.2
detection of pathogenic Yersinia enterocolitica
determination of the presence or absence of pathogenic Yersinia enterocolitica (3.1) in a given mass
or volume of product or a specified surface, when the tests are carried out in accordance with this
document
4 Abbreviated terms
For the purposes of this document, the following abbreviations apply.
CEB cold enrichment broth
TM
CIN Cefsulodin, Irgasan and Novobiocin
CR-MOX congo red magnesium-oxalate
TM
ITC Irgasan , Ticarcillin and potassium chlorate
KOH potassium hydroxide
MRB modified rappaport broth
PCR: polymerase chain reaction
PSB peptone, sorbitol and bile salts
TSB tryptic soy broth
WDCM World Data Centre for Microorganisms
5 Principle
5.1 General
Detection of pathogenic Y. enterocolitica involves four successive stages (see Annex A for a diagram
of procedure and confirmation). In addition to the general procedure, for example during outbreak
investigations, optional cold enrichment procedure as described in Annex D may be used.
5.2 Direct plating from liquid enrichment medium
The sample is homogenized into a liquid enrichment medium (PSB broth), after which a specified amount
[15]
is inoculated onto two to four CIN agar plates. Inoculated plates are incubated at 30 °C for 24 h.
NOTE Additional plates like chromogenic agar medium for detection of pathogenic Y. enterocolitica can also
[9,13,18]
be used.
5.3 Enrichment in liquid enrichment medium and selective liquid enrichment medium
A specified amount of inoculated PSB enrichment medium (5.2) is transferred into a selective liquid
[17]
enrichment medium ITC broth. The ITC broth and initial PSB suspension are incubated at 25 °C
for 44 h.
5.4 Plating out after enrichment and identification
Using the enrichments obtained in 5.3, surface plating on the CIN agar is performed by transferring first
a specified amount of enrichment (5.3, see Clause 10 for the procedure) into 0,5 % KOH solution and,
after mixing for specified amount of time (KOH treatment or alkaline treatment), inoculating onto a CIN
plate. Inoculated plates are incubated at 30 °C for 24 h. Colonies typical of pathogenic Y. enterocolitica are
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ISO 10273:2017(E)
identified (see 10.5) and the colony morphology is verified as presumptive pathogenic Y. enterocolitica
by successive culturing onto selective plates (see 10.5).
NOTE Additional plates like chromogenic agar medium for detection of pathogenic Y. enterocolitica can also
[9,13,18]
be used.
5.5 Confirmation
On colonies identified as presumptive pathogenic Y. enterocolitica (5.2 and 5.4), confirmation of
pathogenic Y. enterocolitica is carried out by appropriate biochemical or/and molecular confirmation
tests (see 10.6 and Figure A.2).
6 Culture media and reagents
For current laboratory practice, see ISO 7218.
For performance testing of culture media see ISO 11133 and Annex B.
Composition of culture media and reagents and their preparation are described in Annex B.
Alternatively, dehydrated complete media, diluents or ready-to-use media may be used; follow the
manufacturer’s instructions.
7 Equipment and consumables
Disposable equipment is an acceptable alternative to reusable glassware if it has suitable specifications.
Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
7.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet sterilization (autoclave).
As specified in ISO 7218.
7.2 Incubators, in accordance with ISO 7218, capable of operating at 4 °C ± 2 °C, 25 °C ± 1 °C,
30 °C ± 1 °C and 37 °C ± 1 °C.
7.3 Sterile blender bags, test tubes, bottles and/or flasks, of appropriate capacity.
7.4 Petri dishes, with a diameter of approximately 90 mm and (optional) large size (diameter
approximately 140 mm).
7.5 Pipettes. Graduated pipettes or automatic pipettes, with a wide opening, and of nominal capacities
1 ml and 10 ml, graduated respectively in 0,1 ml and 0,5 ml divisions and Pasteur pipettes.
7.6 Loops and spreaders. Sterile loops, approximately 6 mm in diameter (10 µl volume), and
inoculation needle or wire. L-shaped or T-shaped single-use spreaders. Cotton buds (see optional
protocol in Annex D).
7.7 Stereomicroscope, equipped with dark field illumination or obliquely (45° angle) transmitted light.
7.8 Peristaltic blender.
8 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document. See the specific International Standard
dealing with the product concerned. If there is no specific International Standard dealing with the
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ISO 10273:2017(E)
sampling of the product concerned, it is recommended that the parties concerned come to an agreement
on this subject.
Recommended sampling techniques are given in the following documents:
— ISO/TS 17728 for food and animal feed;
— ISO 13307 for primary production stage;
— ISO 17604 for carcasses;
— ISO 18593 for environmental samples.
It is important that the laboratory receives a sample that is representative and the sample should not
have been damaged or changed during transport or storage.
9 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with the specific International Standard appropriate to the
product concerned. If there is no specific International Standard available, it is recommended that the
parties concerned come to an agreement on this subject.
10 Procedure (as shown in Annex A)
10.1 Test portion and initial suspension
10.1.1 See the relevant document of ISO 6887 (all parts) or any specific International Standard
appropriate to the product concerned.
10.1.2 For preparation of the initial suspension, in the general case, use as diluent the pre-enrichment
medium specified in B.2 (PSB broth). Pre-warm the PSB broth to room temperature before use.
In general, an amount of test portion (mass or volume) is added to a quantity of PSB (mass or volume) to
yield a tenfold dilution. For this, a 25 g test portion is mixed with 225 ml of PSB.
Homogenize the suspension, preferably by using a peristaltic blender (7.8) for 1 min.
This document has been validated for test portions of 25 g or ml. A smaller test portion may be
used, without the need for additional validation/verification, providing that the same ratio between
enrichment broth and test portion is maintained. A larger test portion than that initially validated may
be used, if a validation/verification study has shown that there are no negative effects on the detection
of pathogenic Y. enterocolitica.
NOTE Validation can be conducted in accordance with the appropriate documents of ISO 16140 (all parts).
Verification for pooling samples can be conducted in accordance with the protocol described in ISO 6887-1:2017,
Annex D (verification protocol for pooling samples for qualitative tests).
10.1.3 Prepare the selective enrichment ITC suspension by transferring 10 ml of PSB suspension
(10.1.2) into 90 ml of ITC broth (B.3) and mix.
10.2 Direct plating on selective agar
Using the initial PSB suspension obtained (10.1.2), divide a total volume of 1 ml onto two to four CIN
agar plates (B.6) and spread it over the plates with a spreader (7.6).
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ISO 10273:2017(E)
Invert the CIN plates and place them in the incubator set at 30 °C (7.2) for 24 h ± 2 h.
NOTE 1 Drying of CIN agar plates (e.g. in laminar airflow cabinet) before inoculation for half an hour can be
required for complete absorption of the inoculum in the agar.
NOTE 2 The number of CIN agar plates to use depends on the expected level of background microflora of the
samples.
10.3 Enrichment
Incubate the initial suspension in PSB (10.1.2) and selective enrichment broth ITC (10.1.3) at 25 °C (7.2)
for 44 h ± 4 h (without agitation).
10.4 Plating out and incubation of plates
10.4.1 Plating from PSB and ITC by KOH treatment on CIN agar
Using a sterile pipette (7.5), transfer 0,5 ml of the PSB enrichment (10.3) into 4,5 ml of KOH solution
[7]
(B.5) (prepared the day before use) and mix. After 20 s ± 5 s of the addition of the PSB enrichment
to the KOH solution, streak by means of a loop (7.6), the surface of a CIN agar plate (B.6) to obtain well-
separated colonies. Repeat the procedure for ITC enrichment (10.3).
NOTE 1 It is crucial for method performance to prepare KOH on the day before use, see Annexes B and C.
Invert the CIN plates and place them in the incubator set at 30 °C (7.2) for 24 h ± 2 h.
NOTE 2 Additionally, it can be advantageous to inoculate [by means of a loop (7.6)] CIN agar plates with
untreated (no KOH treatment) PSB and ITC.
NOTE 3 During KOH treatment the enrichment is diluted tenfold. Furthermore, this treatment can reduce the
number of pathogenic Y. enterocolitica in the solution. Consequently, it can be advantageous, in some cases, to
inoculate an additional CIN plate with 0,1 ml of inoculum.
10.4.2 Plating from PSB and ITC by KOH treatment on chromogenic agar (optional)
Repeat the procedure in 10.4.1 and inoculate, after KOH treatment, by means of a loop (7.6), the surface
[9,13,18]
of a chromogenic agar plate to obtain well-separated colonies.
Incubate the chromogenic plates according to the instructions of the manufacturer.
10.5 Identification of characteristic colonies
After incubation for 24 h ± 2 h, examine the CIN plates in order to detect the presence of characteristic
colonies of Y. enterocolitica. This should be done with the help of a stereomicroscope (7.7) equipped
with dark field illumination or obliquely transmitted light (45° angle).
On CIN agar, pathogenic Y. enterocolitica appears as small (approximately 1 mm or under), circular,
smooth colonies with entire edge. The colonies have a small, deep red sharp bordered centre (“bull’s
eye”). The surrounding rim is translucent or transparent and, when examined with obliquely
transmitted light, non-iridescent and finely granular.
NOTE 1 Dark field illumination or obliq
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 10273
Troisième édition
2017-03
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche de Yersinia
enterocolitica pathogènes
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
detection of pathogenic Yersinia enterocolitica
Numéro de référence
ISO 10273:2017(F)
©
ISO 2017
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ISO 10273:2017(F)
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l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ii © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 10273:2017(F)
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vii
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Abréviations . 2
5 Principe . 2
5.1 Généralités . 2
5.2 Ensemencement direct à partir du milieu liquide d’enrichissement . . 2
5.3 Enrichissement dans le milieu liquide d’enrichissement et le milieu liquide
sélectif d’enrichissement . 2
5.4 Isolement après enrichissement et identification . 3
5.5 Confirmation . 3
6 Milieux de culture et réactifs . 3
7 Matériel et consommables . 3
8 Échantillonnage . 4
9 Préparation de l’échantillon pour essai . 4
10 Mode opératoire (voir Annexe A). 4
10.1 Prise d’essai et suspension mère. 4
10.2 Ensemencement direct sur gélose sélective . 5
10.3 Enrichissement . 5
10.4 Isolement et incubation des boîtes . 5
10.4.1 Isolement à partir du PSB et de l’ITC par traitement au KOH sur gélose CIN . 5
10.4.2 Isolement à partir du PSB et de l’ITC par traitement au KOH sur gélose
chromogène (facultatif) . . 5
10.5 Identification des colonies caractéristiques . 5
10.6 Confirmation . 6
10.6.1 Généralités . 6
10.6.2 Sélection des colonies en vue de la confirmation . 6
10.6.3 Détermination des espèces de Yersinia pathogènes . 7
10.6.4 Confirmation des Y. enterocolitica pathogènes . 9
10.6.5 Interprétation des essais de confirmation de Y. enterocolitica .10
10.6.6 Interprétation des essais de confirmation de Y. enterocolitica pathogènes .11
10.7 Biotypage de Y. enterocolitica (facultatif) .11
10.7.1 Généralités .11
10.7.2 Fermentation du xylose .11
10.7.3 Essai tween-estérase .11
10.7.4 Fermentation de la salicine (facultatif) et du tréhalose .12
10.7.5 Formation d’indole .12
10.7.6 Interprétation des essais de biotypage .12
11 Expression des résultats.13
12 Caractéristiques de performance de la méthode .13
12.1 Étude interlaboratoires .13
12.2 Sensibilité .13
12.3 Spécificité .13
12.4 LOD .
50 13
13 Rapport d’essai .13
14 Assurance de la qualité .14
© ISO 2017 – Tous droits réservés iii
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ISO 10273:2017(F)
Annexe A (normative) Schémas des modes opératoires .15
Annexe B (normative) Composition et préparation des milieux de culture et des réactifs .17
Annexe C (informative) Études de validation de méthode et caractéristiques de performance .32
Annexe D (informative) Mode opératoire pour l’enrichissement par le froid .35
Bibliographie .40
iv © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 10273:2017(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré(e) par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits
alimentaires — Méthodes horizontales,, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec
le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à
l’accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 10273:2003), qui a fait l’objet d’une
révision technique. Les principales modifications apportées à cette troisième édition sont:
— pour la confirmation des Y. enterocolitica pathogènes, des essais liés à la pathogénicité ont été
ajoutés ou spécifiés et mis en exergue. En conséquence, l’adjectif «présumé» a été supprimé du titre
(Y. enterocolitica pathogènes) car la norme contient des essais obligatoires liés à la pathogénicité et
permet la séparation des Y. enterocolitica pathogènes et non pathogènes;
1)
— l’ensemencement direct sur gélose à la cefsulodine, à l’Irgasan™ et à la novobiocine (CIN) a été ajouté;
— le temps d’incubation a été modifié pour le bouillon d’enrichissement à la peptone, au sorbitol et aux
sels biliaires (PSB) et la gélose CIN;
TM
— l’ensemencement et le temps d’incubation pour le bouillon d’enrichissement à l’Irgasan , à la
ticarcilline et au chlorate de potassium (ITC) ont été modifiés et spécifiés;
— la gélose Salmonella/Shigella avec désoxycholate de sodium et chlorure de calcium (SSDC) a été
remplacée par la gélose CIN et un milieu chromogène facultatif;
1) L’Irgasan™ est un exemple de produit adapté disponible dans le commerce. Cette information est donnée par
souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de
l’ISO à l’égard de ce produit.
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ISO 10273:2017(F)
— l’ensemencement de la gélose CIN sans traitement préalable à l’hydroxyde de potassium (KOH)
du bouillon d’enrichissement a été changé en un mode opératoire facultatif (parallèlement au
traitement au KOH obligatoire);
— la préparation (durée de conservation) des solutions de KOH et de sulfate de fer(II) ammoniacal a
été spécifiée;
— les colonies suspectes issues de la culture primaire sont ensemencées en stries (purifiées) sur
gélose CIN et (facultatif) sur gélose chromogène afin de faciliter une meilleure sélection des
colonies caractéristiques ayant besoin d’une confirmation. L’emploi d’un stéréomicroscope dans
l’identification des colonies caractéristiques est mis en avant;
— tous les essais de confirmation biochimique, sauf l’essai de recherche de la pyrazinamidase, peuvent
être remplacés par une recherche par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en temps réel du
gène ail conformément à l’ISO/TS 18867;
— cinq essais de confirmation (indole, tréhalose, xylose, citrate, tween-estérase) sont devenus
facultatifs. L’essai de recherche de la fermentation de la salicine a été ajouté en tant qu’essai
facultatif (biotypage). L’essai de recherche de l’exigence en calcium à 37 °C a été remplacé par un
essai sur rouge Congo et oxalate de magnésium (CR-MOX). Trois essais (oxydase, gélose de Kligler et
décarboxylation de l’ornithine) ont été supprimés;
— le mode opératoire d’enrichissement par le froid de Y. enterocolitica a été ajouté à l’Annexe D;
— les caractéristiques de performance ont été ajoutées à l’Annexe C.
— les essais de performance pour l’assurance qualité des milieux de culture ont été ajoutés à l’Annexe B
et l’Annexe D.
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ISO 10273:2017(F)
Introduction
Le présent document spécifie une méthode horizontale pour la recherche des Yersinia enterocolitica
associées aux maladies chez l’homme. En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il est
possible que la présente méthode horizontale ne soit pas applicable dans tous ses détails à certains
d’entre eux et que, pour certains autres, il soit nécessaire d’employer d’autres méthodes. Néanmoins,
il convient que tous les efforts soient faits pour appliquer cette méthode horizontale chaque fois que
possible et il est à espérer qu’il n’y aura d’écarts par rapport à celle-ci qu’en cas d’absolue nécessité et
pour des raisons techniques.
Les principales modifications énumérées en préambule et introduites dans le présent document par
rapport à l’ISO 10273:2003, sont considérées comme des modifications majeures (voir l’ISO 17468).
Lors du prochain réexamen périodique du présent document, il sera tenu compte de toutes les évolutions
intervenues depuis sa publication et, notamment, dans quelle mesure cette méthode horizontale aura
été suivie ainsi que les raisons des dérogations dans le cas de produits particuliers.
L’harmonisation de toutes les méthodes d’essai ne peut être réalisée de façon immédiate; de ce fait, il
peut déjà exister des Normes internationales et/ou nationales pour certains groupes de produits, qui ne
concordent pas avec la présente méthode horizontale. Lorsque de telles normes viendront en révision, il
serait souhaitable de les aligner avec le présent document et de ne conserver que les seules divergences
justifiées indispensables pour des raisons techniques.
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NORME INTERNATIONALE ISO 10273:2017(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche de Yersinia enterocolitica
pathogènes
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel que
les essais de recherche de Yersinia enterocolitica pathogènes ne soient réalisés que dans des
laboratoires équipés à cet effet et sous la surveillance d’un microbiologiste expérimenté, et qu’un
grand soin soit pris pour se débarrasser de tout le matériel incubé. Il convient que l’utilisateur
du présent document maîtrise les pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n’a
pas pour but de traiter tous les problèmes de sécurité qui peuvent être liés à son utilisation.
Il est de la responsabilité de l’utilisateur d’établir des pratiques appropriées de sécurité, de
protection de la santé et de garantir la conformité vis-à-vis des réglementations nationales en
vigueur.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode horizontale pour la recherche des Y. enterocolitica associées
aux maladies chez l’homme. Ce document est applicable
— aux produits destinés à l’alimentation humaine et animale, et
— aux échantillons d’environnement pour la production et la distribution des aliments.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133:2014, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau — Préparation,
production, stockage et essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www.e lectropedia. org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www. iso. org/o bp.
3.1
Yersinia enterocolitica pathogènes
bactéries psychrotrophes formant des colonies caractéristiques sur des milieux solides sélectifs,
possédant des propriétés biochimiques et moléculaires répondant aux critères de pathogénicité décrits
lorsque des essais de confirmation sont réalisés conformément au présent document
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ISO 10273:2017(F)
3.2
recherche de Yersinia enterocolitica pathogènes
détermination de la présence ou de l’absence des Yersinia enterocolitica pathogènes (3.1) dans une
masse ou un volume donné(e) de produit ou une surface spécifiée, lorsque les essais sont réalisés
conformément au présent document
4 Abréviations
Pour les besoins du présent document, les abréviations suivantes s’appliquent.
CEB Bouillon d’enrichissement par le froid
CIN Cefsulodine, Irgasan™ et Novobiocine
CR-MOX Rouge Congo et oxalate de magnésium
ITC Irgasan™, Ticarcilline et Chlorate de potassium
KOH Hydroxyde de potassium
MRB Milieu Rappaport modifié
PCR Réaction de polymérisation en chaîne
PSB Peptone, sorbitol et sels biliaires
TSB Bouillon tryptique soja
WDCM World Data Centre for Microorganisms
5 Principe
5.1 Généralités
La recherche de Y. enterocolitica pathogènes nécessite quatre étapes successives (voir l’Annexe A pour
le schéma du mode opératoire et la confirmation). Outre le mode opératoire général, par exemple pour
les investigations réalisées lors d’une épidémie, un mode opératoire facultatif d’enrichissement par le
froid (voir l’Annexe D) peut être employé.
5.2 Ensemencement direct à partir du milieu liquide d’enrichissement
L’échantillon est homogénéisé dans un milieu liquide d’enrichissement (bouillon PSB), puis une quantité
[15]
spécifiée est ensemencée sur deux à quatre boîtes de gélose CIN. Les boîtes ensemencées sont
incubées à 30 °C pendant 24 h.
NOTE Des boîtes supplémentaires, telles qu’une gélose chromogène pour la recherche de Y. enterocolitica
[9][13][18]
pathogènes, peuvent également être utilisées .
5.3 Enrichissement dans le milieu liquide d’enrichissement et le milieu liquide sélectif
d’enrichissement
Une quantité spécifiée de milieu d’enrichissement PSB ensemencé (5.2) est transférée dans un milieu
[17]
liquide sélectif d’enrichissement constitué d’un bouillon ITC. Le bouillon ITC et la suspension mère
de PSB sont incubés à 25 °C pendant 44 h.
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ISO 10273:2017(F)
5.4 Isolement après enrichissement et identification
À partir des enrichissements obtenus en 5.3, un isolement sur gélose CIN est effectué en transférant
tout d’abord une quantité spécifiée de milieu d’enrichissement (5.3, voir l’Article 10 pour le mode
opératoire) dans une solution de KOH à 0,5 % et, après mélange pendant une durée spécifiée (traitement
au KOH ou traitement alcalin), en ensemençant une boîte de CIN. Les boîtes ensemencées sont incubées
à 30 °C pendant 24 h. Les colonies typiques de Y. enterocolitica pathogènes sont identifiées (voir 10.5) et
la morphologie de la colonie est vérifiée en tant que Y. enterocolitica présumée pathogène par mises en
culture successives sur des boîtes sélectives (voir 10.5).
NOTE Des boîtes supplémentaires, telles qu’une gélose chromogène pour la recherche de Y. enterocolitica
[9][13][18]
pathogènes, peuvent également être utilisées .
5.5 Confirmation
Sur les colonies identifiées comme Y. enterocolitica pathogènes présumées (5.2 et 5.4), la confirmation
de Y. enterocolitica pathogènes est réalisée par des essais appropriés de confirmation biochimique et/ou
moléculaire (voir 10.6 et Figure A.2).
6 Milieux de culture et réactifs
Voir l’ISO 7218 pour les pratiques courantes de laboratoire.
Voir l’ISO 11133 et l’Annexe B pour les essais de performance des milieux de culture.
La composition des milieux de culture et des réactifs et leur préparation sont décrites dans l’Annexe B.
Il est également possible d’utiliser des milieux complets déshydratés, des diluants ou des milieux prêts
à l’emploi. Dans ce cas, suivre les instructions du fabricant.
7 Matériel et consommables
Le matériel jetable est une alternative acceptable à la verrerie réutilisable, à condition que ses
spécifications soient adaptées à l’usage prévu. Utiliser le matériel courant de laboratoire de
microbiologie (voir l’ISO 7218) et en particulier ce qui suit.
7.1 Appareil pour la stérilisation par chaleur sèche (four) ou par chaleur humide (autoclave).
Voir l’ISO 7218.
7.2 Étuves, conformément à l’ISO 7218, capables de fonctionner à 4 °C ± 2 °C, 25 °C ± 1 °C, 30 °C ± 1 °C
et 37 °C ± 1 °C.
7.3 Poches d’homogénéisateur, tubes à essai, flacons et/ou fioles stériles, de capacité appropriée.
7.4 Boîtes de Petri, de 90 mm de diamètre environ et de grandes dimensions (facultatif)
(environ 140 mm de diamètre).
7.5 Pipettes. Pipettes graduées ou pipettes automatiques, avec une grande ouverture et de capacités
nominales de 1 ml et 10 ml, respectivement par divisions de 0,1 ml et 0,5 ml et pipettes Pasteur.
7.6 Anses et étaleurs. Anses stériles, d’environ 6 mm de diamètre (10 µl de volume), et aiguille
ou fil d’ensemencement. Étaleurs à usage unique en L ou en T. Cotons-tiges (protocole facultatif dans
l’Annexe D).
7.7 Stéréomicroscope, équipé d’un éclairage à fond noir ou de transillumination oblique (angle
de 45°).
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ISO 10273:2017(F)
7.8 Homogénéisateur péristaltique.
8 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Se reporter à la
Norme internationale spécifique traitant du produit concerné. S’il n’existe aucune Norme internationale
spécifique pour l’échantillonnage du produit concerné, il convient que les parties concernées s’accordent
sur ce sujet.
Des techniques d’échantillonnage recommandées sont décrites dans les documents suivants:
— l’ISO/TS 17728 pour les aliments et les aliments pour animaux;
— l’ISO 13307 pour le stade de production primaire;
— l’ISO 17604 pour les carcasses;
— l’ISO 18593 pour les échantillons d’environnement.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon qui soit représentatif et il convient que cet
échantillon n’ait été ni endommagé ni modifié lors du transport ou du stockage.
9 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai conformément à la Norme internationale spécifique au produit
concerné. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique, il convient que les parties concernées
s’accordent sur ce sujet.
10 Mode opératoire (voir Annexe A)
10.1 Prise d’essai et suspension mère
10.1.1 Voir le document pertinent de l’ISO 6887 (toutes les parties) ou toute autre Norme internationale
spécifique au produit à examiner.
10.1.2 En règle générale, pour la préparation de la suspension mère, utiliser comme diluant le milieu
de pré-enrichissement spécifié au B.2 (bouillon PSB). Avant de l’utiliser, préchauffer le bouillon PSB à
température ambiante.
En général, une quantité donnée de prise d’essai (masse ou volume) est ajoutée à une quantité donnée
de PSB (masse ou volume) afin d’obtenir une dilution 1/10. Pour cet essai, une prise d’essai de 25 g est
mélangée avec 225 ml de PSB.
Homogénéiser la suspension, de préférence à l’aide d’un homogénéisateur péristaltique (7.8)
pendant 1 min.
Le présent document est validé pour des prises d’essai allant jusqu’à 25 g ou ml. Une prise d’essai
plus petite peut être utilisée sans qu’il soit nécessaire de procéder à une validation/vérification
supplémentaire, à condition de maintenir le même rapport entre le bouillon d’enrichissement et la
prise d’essai. Une prise d’essai plus grande que celle initialement validée peut être utilisée à condition
qu’une étude de validation/vérification ait montré l’absence d’effets négatifs sur la recherche
des Y. enterocolitica pathogènes.
NOTE La validation peut être effectuée conformément aux documents appropriés de l’ISO 16140 (toutes
les parties). La vérification des échantillons groupés peut être réalisée conformément au protocole décrit dans
l’ISO 6887-1:2017, Annexe D (protocole de vérification des échantillons groupés pour les essais qualitatifs).
4 © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 10273:2017(F)
10.1.3 Préparer la suspension d’enrichissement sélectif ITC en transférant 10 ml de suspension PSB
(10.1.2) dans 90 ml de bouillon ITC (B.3) et mélanger.
10.2 Ensemencement direct sur gélose sélective
En utilisant la suspension mère de PSB obtenue (10.1.2), diviser un volume total de 1 ml sur deux à
quatre boîtes de gélose CIN (B.6) et l’étaler sur les boîtes avec un étaleur (7.6).
Inverser les boîtes de CIN et les placer dans l’étuve (7.2) réglée à 30°C pendant 24 h ± 2 h.
NOTE 1 Le séchage des boîtes de gélose CIN (par exemple dans une armoire à flux laminaire) avant
ensemencement pendant une dem
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.