ISO 10273:2017
(Main)Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection of pathogenic Yersinia enterocolitica
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection of pathogenic Yersinia enterocolitica
ISO 10273:2017 specifies a horizontal method for the detection of Y. enterocolitica associated with human disease. It is applicable to - products intended for human consumption and the feeding of animals, and - environmental samples in the area of food production and food handling.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche de Yersinia enterocolitica pathogènes
ISO 10273:2017 spécifie une méthode horizontale pour la recherche des Y. enterocolitica associées aux maladies chez l'homme. Ce document est applicable - aux produits destinés à l'alimentation humaine et animale, et - aux échantillons d'environnement pour la production et la distribution des aliments.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10273
Third edition
2017-03
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the detection
of pathogenic Yersinia enterocolitica
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour
la recherche de Yersinia enterocolitica pathogènes
Reference number
©
ISO 2017
© ISO 2017, Published in Switzerland
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Ch. de Blandonnet 8 • CP 401
CH-1214 Vernier, Geneva, Switzerland
Tel. +41 22 749 01 11
Fax +41 22 749 09 47
copyright@iso.org
www.iso.org
ii © ISO 2017 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .v
Introduction .vii
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Abbreviated terms . 2
5 Principle . 2
5.1 General . 2
5.2 Direct plating from liquid enrichment medium . 2
5.3 Enrichment in liquid enrichment medium and selective liquid enrichment medium . 2
5.4 Plating out after enrichment and identification . 2
5.5 Confirmation . 3
6 Culture media and reagents . 3
7 Equipment and consumables . 3
8 Sampling . 3
9 Preparation of test sample . 4
Procedure (as shown in Annex A) . 4
10.1 Test portion and initial suspension . 4
10.2 Direct plating on selective agar . 4
10.3 Enrichment . 5
10.4 Plating out and incubation of plates . 5
10.4.1 Plating from PSB and ITC by KOH treatment on CIN agar. 5
10.4.2 Plating from PSB and ITC by KOH treatment on chromogenic agar (optional) . 5
10.5 Identification of characteristic colonies . 5
10.6 Confirmation . 6
10.6.1 General. 6
10.6.2 Selection of colonies for confirmation . 6
10.6.3 Determination of pathogenic Yersinia species . 6
10.6.4 Confirmation of pathogenic Y. enterocolitica . 8
10.6.5 Interpretation of confirmation tests for Y. enterocolitica.10
10.6.6 Interpretation of confirmation tests for pathogenic Y. enterocolitica .10
10.7 Biotyping of Y. enterocolitica (optional) .10
10.7.1 General.10
10.7.2 Fermentation of xylose .11
10.7.3 Tween-esterase test .11
10.7.4 Fermentation of salicin (optional) and trehalose .11
10.7.5 Indole formation .11
10.7.6 Interpretation of biotyping tests .11
11 Expression of results .12
12 Performance characteristics of the method .12
12.1 Interlaboratory study .12
12.2 Sensitivity .12
12.3 Specificity .12
12.4 LOD .12
13 Test report .12
14 Quality assurance .13
Annex A (normative) Diagrams of the procedures .14
Annex B (normative) Composition and preparation of culture media and reagents .17
Annex C (informative) Method validation studies and performance characteristics .32
Annex D (informative) Procedure for cold enrichment .34
Bibliography .39
iv © ISO 2017 – All rights reserved
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: w w w . i s o .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in collaboration with ISO Technical
Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the
agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 10273:2003), which has been technically
revised with the following main changes.
— In confirmation of pathogenic Y. enterocolitica, tests related to pathogenicity have been added or
specified and relocated in the frontline. Accordingly, the word “presumptive” has been removed
from the title wording (pathogenic Y. enterocolitica) since standard contains mandatory tests
related to pathogenicity and allows separation of pathogenic and non-pathogenic Y. enterocolitica.
1)
TM
— Direct plating on cefsulodin, Irgasan and novobiocin (CIN) agar has been added.
— Incubation time for peptone, sorbitol and bile salts (PSB) enrichment broth and CIN agar has been
changed.
TM
— Inoculation and incubation time for Irgasan , ticarcillin and potassium chlorate (ITC) enrichment
broth has been changed and specified.
— Salmonella/shigella agar with sodium desoxycholate and calcium chloride (SSDC) has been replaced
by CIN agar and optional chromogenic medium.
— Inoculation of CIN agar without prior potassium hydroxide (KOH) treatment of enrichment broth
has been changed to optional procedure (in parallel to mandatory KOH treatment).
— The preparation (shelf life) of KOH and ammonium iron(II) sulfate solutions has been specified.
TM
1) Irgasan is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
— Suspect colonies from primary culture are streaked (purified) on CIN agar and (optionally)
on chromogenic agar to facilitate better selection of characteristic colonies that need further
confirmation. The use of stereomicroscope in identification of characteristic colonies is emphasized.
— All biochemical confirmation tests, except for pyrazinamidase test, can be replaced by real-time
polymerase chain reaction (PCR) detection of ail-gene in accordance with ISO/TS 18867.
— Five confirmation tests (indole, trehalose, xylose, citrate, tween-esterase) have become optional.
Test for salicin has been added as an optional (biotyping) test. Test for calcium requirements at 37°C
has been replaced by congo red magnesium-oxalate (CR-MOX) test. Three tests (oxidase, Kligler’s
agar and ornithine decarboxylase) have been deleted.
— The procedure for cold-enrichment of Y. enterocolitica has been added as Annex D;
— Performance characteristics have been added to Annex C.
— Performance testing for the quality assurance of the culture media has been added to Annex B and
Annex D.
vi © ISO 2017 – All rights reserved
Introduction
This document specifies a horizontal method for the detection of Yersinia enterocolitica associated with
human disease. Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not
be appropriate in every detail for certain products, and for some other products it may be necessary to
use different methods. Nevertheless, it is hoped that in all cases every attempt will be made to apply
this horizontal method as far as possible and that deviations from this will only be made if absolutely
necessary for technical reasons.
The main changes, listed in the foreword, introduced in this document compared to ISO 10273:2003,
are considered as major (see ISO 17468).
When this document is next reviewed, account will be taken of all information then available regarding
the extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from this
in the case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate and, for certain group of products,
International Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this
horizontal method. It is hoped that when such standards are reviewed, they will be changed to comply
with this document so that eventually the only remaining departures from this horizontal method will
be those necessary for well-established technical reasons.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 10273:2017(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
the detection of pathogenic Yersinia enterocolitica
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests
for detecting pathogenic Yersinia enterocolitica are only undertaken in properly equipped
laboratories, under the control of a skilled microbiologist, and that great care is taken in the
disposal of all incubated materials. Persons using this document should be familiar with normal
laboratory practice. This document does not purport to address all of the safety aspects, if any,
associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and
health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
1 Scope
This document specifies a horizontal method for the detection of Y. enterocolitica associated with
human disease. It is applicable to
— products intended for human consumption and the feeding of animals, and
— environmental samples in the area of food production and food handling.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 11133:2014, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www.e lectropedia. org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www. iso. org/o bp
3.1
pathogenic Yersinia enterocolitica
psychrotrophic bacteria forming characteristic colonies on solid selective media and possessing the
biochemical and molecular properties meeting the pathogenicity criteria described when confirmation
tests are carried out in accordance with this document
3.2
detection of pathogenic Yersinia enterocolitica
determination of the presence or absence of pathogenic Yersinia enterocolitica (3.1) in a given mass
or volume of product or a specified surface, when the tests are carried out in accordance with this
document
4 Abbreviated terms
For the purposes of this document, the following abbreviations apply.
CEB cold enrichment broth
TM
CIN Cefsulodin, Irgasan and Novobiocin
CR-MOX congo red magnesium-oxalate
TM
ITC Irgasan , Ticarcillin and potassium chlorate
KOH potassium hydroxide
MRB modified rappaport broth
PCR: polymerase chain reaction
PSB peptone, sorbitol and bile salts
TSB tryptic soy broth
WDCM World Data Centre for Microorganisms
5 Principle
5.1 General
Detection of pathogenic Y. enterocolitica involves four successive stages (see Annex A for a diagram
of procedure and confirmation). In addition to the general procedure, for example during outbreak
investigations, optional cold enrichment procedure as described in Annex D may be used.
5.2 Direct plating from liquid enrichment medium
The sample is homogenized into a liquid enrichment medium (PSB broth), after which a specified amount
[15]
is inoculated onto two to four CIN agar plates. Inoculated plates are incubated at 30 °C for 24 h.
NOTE Additional plates like chromogenic agar medium for detection of pathogenic Y. enterocolitica can also
[9,13,18]
be used.
5.3 Enrichment in liquid enrichment medium and selective liquid enrichment medium
A specified amount of inoculated PSB enrichment medium (5.2) is transferred into a selective liquid
[17]
enrichment medium ITC broth. The ITC broth and initial PSB suspension are incubated at 25 °C
for 44 h.
5.4 Plating out after enrichment and identification
Using the enrichments obtained in 5.3, surface plating on the CIN agar is performed by transferring first
a specified amount of enrichment (5.3, see Clause 10 for the procedure) into 0,5 % KOH solution and,
after mixing for specified amount of time (KOH treatment or alkaline treatment), inoculating onto a CIN
plate. Inoculated plates are incubated at 30 °C for 24 h. Colonies typical of pathogenic Y. enterocolitica are
2 © ISO 2017 – All rights reserved
identified (see 10.5) and the colony morphology is verified as presumptive pathogenic Y. enterocolitica
by successive culturing onto selective plates (see 10.5).
NOTE Additional plates like chromogenic agar medium for detection of pathogenic Y. enterocolitica can also
[9,13,18]
be used.
5.5 Confirmation
On colonies identified as presumptive pathogenic Y. enterocolitica (5.2 and 5.4), confirmation of
pathogenic Y. enterocolitica is carried out by appropriate biochemical or/and molecular confirmation
tests (see 10.6 and Figure A.2).
6 Culture media and reagents
For current laboratory practice, see ISO 7218.
For performance testing of culture media see ISO 11133 and Annex B.
Composition of culture media and reagents and their preparation are described in Annex B.
Alternatively, dehydrated complete media, diluents or ready-to-use media may be used; follow the
manufacturer’s instructions.
7 Equipment and consumables
Disposable equipment is an acceptable alternative to reusable glassware if it has suitable specifications.
Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
7.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet sterilization (autoclave).
As specified in ISO 7218.
7.2 Incubators, in accordance with ISO 7218, capable of operating at 4 °C ± 2 °C, 25 °C ± 1 °C,
30 °C ± 1 °C and 37 °C ± 1 °C.
7.3 Sterile blender bags, test tubes, bottles and/or flasks, of appropriate capacity.
7.4 Petri dishes, with a diameter of approximately 90 mm and (optional) large size (diameter
approximately 140 mm).
7.5 Pipettes. Graduated pipettes or automatic pipettes, with a wide opening, and of nominal capacities
1 ml and 10 ml, graduated respectively in 0,1 ml and 0,5 ml divisions and Pasteur pipettes.
7.6 Loops and spreaders. Sterile loops, approximately 6 mm in diameter (10 µl volume), and
inoculation needle or wire. L-shaped or T-shaped single-use spreaders. Cotton buds (see optional
protocol in Annex D).
7.7 Stereomicroscope, equipped with dark field illumination or obliquely (45° angle) transmitted light.
7.8 Peristaltic blender.
8 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document. See the specific International Standard
dealing with the product concerned. If there is no specific International Standard dealing with the
sampling of the product concerned, it is recommended that the parties concerned come to an agreement
on this subject.
Recommended sampling techniques are given in the following documents:
— ISO/TS 17728 for food and animal feed;
— ISO 13307 for primary production stage;
— ISO 17604 for carcasses;
— ISO 18593 for environmental samples.
It is important that the laboratory receives a sample that is representative and the sample should not
have been damaged or changed during transport or storage.
9 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with the specific International Standard appropriate to the
product concerned. If there is no specific International Standard available, it is recommended that the
parties concerned come to an agreement on this subject.
10 Procedure (as shown in Annex A)
10.1 Test portion and initial suspension
10.1.1 See the relevant document of ISO 6887 (all parts) or any specific International Standard
appropriate to the product concerned.
10.1.2 For preparation of the initial suspension, in the general case, use as diluent the pre-enrichment
medium specified in B.2 (PSB broth). Pre-warm the PSB broth to room temperature before use.
In general, an amount of test portion (mass or volume) is added to a quantity of PSB (mass or volume) to
yield a tenfold dilution. For this, a 25 g test portion is mixed with 225 ml of PSB.
Homogenize the suspension, preferably by using a peristaltic blender (7.8) for 1 min.
This document has been validated for test portions of 25 g or ml. A smaller test portion may be
used, without the need for additional validation/verification, providing that the same ratio between
enrichment broth and test portion is maintained. A larger test portion than that initially validated may
be used, if a validation/verification study has shown that there are no negative effects on the detection
of pathogenic Y. enterocolitica.
NOTE Validation can be conducted in accordance with the appropriate documents of ISO 16140 (all parts).
Verification for pooling samples can be conducted in accordance with the protocol described in ISO 6887-1:2017,
Annex D (verification protocol for pooling samples for qualitative tests).
10.1.3 Prepare the selective enrichment ITC suspension by transferring 10 ml of PSB suspension
(10.1.2) into 90 ml of ITC broth (B.3) and mix.
10.2 Direct plating on selective agar
Using the initial PSB suspension obtained (10.1.2), divide a total volume of 1 ml onto two to four CIN
agar plates (B.6) and spread it over the plates with a spreader (7.6).
4 © ISO 2017 – All rights reserved
Invert the CIN plates and place them in the incubator set at 30 °C (7.2) for 24 h ± 2 h.
NOTE 1 Drying of CIN agar plates (e.g. in laminar airflow cabinet) before inoculation for half an hour can be
required for complete absorption of the inoculum in the agar.
NOTE 2 The number of CIN agar plates to use depends on the expected level of background microflora of the
samples.
10.3 Enrichment
Incubate the initial suspension in PSB (10.1.2) and selective enrichment broth ITC (10.1.3) at 25 °C (7.2)
for 44 h ± 4 h (without agitation).
10.4 Plating out and incubation of plates
10.4.1 Plating from PSB and ITC by KOH treatment on CIN agar
Using a sterile pipette (7.5), transfer 0,5 ml of the PSB enrichment (10.3) into 4,5 ml of KOH solution
[7]
(B.5) (prepared the day before use) and mix. After 20 s ± 5 s of the addition of the PSB enrichment
to the KOH solution, streak by means of a loop (7.6), the surface of a CIN agar plate (B.6) to obtain well-
separated colonies. Repeat the procedure for ITC enrichment (10.3).
NOTE 1 It is crucial for method performance to prepare KOH on the day before use, see Annexes B and C.
Invert the CIN plates and place them in the incubator set at 30 °C (7.2) for 24 h ± 2 h.
NOTE 2 Additionally, it can be advantageous to inoculate [by means of a loop (7.6)] CIN agar plates with
untreated (no KOH treatment) PSB and ITC.
NOTE 3 During KOH treatment the enrichment is diluted tenfold. Furthermore, this treatment can reduce the
number of pathogenic Y. enterocolitica in the solution. Consequently, it can be advantageous, in some cases, to
inoculate an additional CIN plate with 0,1 ml of inoculum.
10.4.2 Plating from PSB and ITC by KOH treatment on chromogenic agar (optional)
Repeat the procedure in 10.4.1 and inoculate, after KOH treatment, by means of a loop (7.6), the surface
[9,13,18]
of a chromogenic agar plate to obtain well-separated colonies.
Incubate the chromogenic plates according to the instructions of the manufacturer.
10.5 Identification of characteristic colonies
After incubation for 24 h ± 2 h, examine the CIN plates in order to detect the presence of characteristic
colonies of Y. enterocolitica. This should be done with the help of a stereomicroscope (7.7) equipped
with dark field illumination or obliquely transmitted light (45° angle).
On CIN agar, pathogenic Y. enterocolitica appears as small (approximately 1 mm or under), circular,
smooth colonies with entire edge. The colonies have a small, deep red sharp bordered centre (“bull’s
eye”). The surrounding rim is translucent or transparent and, when examined with obliquely
transmitted light, non-iridescent and finely granular.
NOTE 1 Dark field illumination or obliquely transmitted light helps to distinguish characteristic colonies of
[12]
Yersinia enterocolitica from very similar colonies of other Yersinia species and some non-Yersinia species.
NOTE 2 In case of dense growth of background flora on the CIN plates, the colony size of pathogenic
Y. enterocolitica can be smaller and the typical red centre can be unclear or absent.
10.6 Confirmation
10.6.1 General
The use of control strains of Yersinia species is required especially in helping to distinguish between
pathogenic Y. enterocolitica from other Yersinia species on CIN agar. Appropriate positive and negative
control strains for each of the confirmation tests shall be used. Examples of suitable control strains are
given in chapters dealing with these tests. A flow-diagram of the confirmation is given in Figure A.2.
10.6.2 Selection of colonies for confirmation
For confirmation, take from each plate of each selective medium (see 10.3) five colonies considered to
be typical for pathogenic Y. enterocolitica if available (see 10.5).
Streak the selected colonies onto the surface of CIN agar plates (B.6) in order to allow well separated
colonies to develop. Streak also control strains of Y. enterocolitica bioserotype 4/O:3, 2/O:9, and biotype
1A and other Yersinia species for comparison of the colony morphology.
Additionally, it is advantageous to streak typical colonies for confirmation and appropriate control
strains on chromogenic agar, in parallel to CIN agar plating. For identification of characteristic colonies
on chromogenic agar, follow the manufacturer’s instructions on evaluation of typical morphology of the
colonies.
EXAMPLE Suitable Y. enterocolitica control strains are WDCM 00216 (bioserotype 4/O:3), WDCM 00215
(bioserotype 2/O:9), and WDCM 00160 (bioserotype 1B/O:8).
Invert the inoculated plates and place them in the incubator set at 30 °C (7.2) for 24 h ± 2 h.
Examine the incubated plates for characteristic colonies (see 10.5) and purity of culture. This should be
done with the help of a stereomicroscope (7.7). Compare the morphology of suspect colonies to colonies
of control strains for better distinction between typical and atypical colonies. Discard plates with
atypical colonies. If mixed cultures with typical colonies are present, subculture typical colonies onto
CIN agar plates (B.6) and incubate as above.
Proceed with one pure culture representing initial typical colonies on the primary plate. Retain the
other typical pure cultures (up to five, if available) for confirmation in case the first culture does not
confirm. Streak the selected colonies onto the surface of non-selective agar (for example, nutrient
agar (B.7), blood agar, or tryptone soya agar) in a manner which will allow well-separated colonies to
develop.
Invert the inoculated plates and place them in the incubator set at 30 °C (7.2) for 18 h to 24 h or until
growth is satisfactory.
Use pure cultures for the biochemical confirmations and pathogenicity tests.
NOTE 1 It is not necessary to proceed to confirmation from all successive enrichment steps if pathogenic Y.
enterocolitica from earlier step has been confirmed.
NOTE 2 For epidemiological purposes or during outbreak investigations, confirmation of additional colonies,
e.g. five typical or suspect colonies from each selective enrichment/isolation medium combination, can be
beneficial.
10.6.3 Determination of pathogenic Yersinia species
10.6.3.1 Detection of urease
Streak bacteria onto the slant surface of the agar (B.10). Close the caps of the tubes loosely so that air
can enter and aerobic growth conditions prevail.
Incubate at 30 °C (7.2) for 24 h ± 2 h.
6 © ISO 2017 – All rights reserved
Pink-violet or red-pink colours indicate a positive urease reaction.
EXAMPLE Suitable positive control strain is WDCM 00216 (Y. enterocolitica, bioserotype 4/O:3) or WDCM
00160 (Y. enterocolitica, bioserotype 1B/O:8).
An orange-yellow colour indicates a negative urease reaction.
Retain for further confirmation all urease positive colonies with typical colony morphology.
NOTE 1 Pathogenic Y. enterocolitica strains inoculated on some types of commercially available urea agars
can need more time (up to 7 days) for positive reaction to develop.
NOTE 2 Pathogenic urease-negative strains of Y. enterocolitica do exist, but they are extremely rare (0,01 %).
10.6.3.2 Hydrolysis of esculin
Streak bacteria onto the slant surface (B.12) of the agar.
Incubate at 30 °C (7.2) for 24 h ± 2 h.
A black halo around the colonies indicates a positive reaction.
EXAMPLE Suitable negative control strain is WDCM 00216 (Y. enterocolitica, bioserotype 4/O:3) or
WDCM 000160 (Y. enterocolitica, bioserotype 1B/O:8) and positive control strain is any Y. enterocolitica strain
representing biotype 1A or Y. intermedia WDCM 00217.
NOTE This test for hydrolysis of esculin is equivalent to the test for fermentation of salicin in determining
pathogenicity.
10.6.3.3 Detection of virulence plasmid (pYV) by CR-MOX agar test
Congo red binding and formation of pin-point colonies at 37 °C are typical features of pathogenic
Y. enterocolitica. The virulence plasmid (pYV) determines traits related to the pathogenicity of Yersinia,
and many of them, including calcium dependent growth are switched on only at 37 °C.
The virulence plasmid (pYV) can be spontaneously lost in the laboratory during storage, lengthy
culture and repeated passages. Therefore, the test for virulence plasmid (CR-MOX test) shall be carried
out at an early stage of confirmation.
Using a loop (7.6), touch several colonies of the pure culture of the strain selected for further
confirmation (urease positive, typical colony morphology). Inoculate the surface of CR-MOX agar (B.11)
to obtain well-separated colonies.
Incubate at 37 °C (7.2) for 24 h to 48 h.
If needed, examine the plates for positive, pYV containing colonies after 24 h and continue incubation
for further 24 h if positive colonies are not present.
A plate giving a positive reaction contains sharp orange-red (congo red binding) pinpoint colonies
(calcium dependent growth at 37 °C) and possibly colourless larger colonies. A plate giving a negative
reaction contains only colourless colonies.
NOTE 1 In a pure culture, it is normal that some of the colonies contain cells with plasmid pYV while other
colonies in the same culture contain plasmid-free cells. When preparing inoculum for this test, collecting
material with a loop from several colonies helps to avoid choosing for plasmid-free bacterial cells.
NOTE 2 For better distinction between positive and negative reactions, it is advantageous to inoculate two
parallel CR-MOX plates from the same inoculant of the strain tested and incubate one plate at 37 °C (7.2) and the
other at 25 °C (7.2). The plate incubated at 25 °C (7.2) always gives a negative reaction (even if the strain contains
pYV). Therefore, the difference between possible positive result at 37 °C (7.2) and negative reaction at 25 °C (7.2)
is better visualized.
A suitable positive control is any pathogenic Y. enterocolitica strain that has been verified to possess the
virulence plasmid, before use.
EXAMPLE Suitable positive control strain is WDCM 00216 (Y. enterocolitica, bioserotype 4/O:3) and
negative control strain is WDCM 00160 (Y. enterocolitica, bioserotype 1B/O:8, plasmid-free) or WDCM 00217
(Y. intermedia).
Since the virulence plasmid (pYV) can be lost during subculturing in the laboratory, continue
confirmation also with strains giving a negative reaction in the test.
Additionally, preserve positive strains as frozen stock cultures at an early stage of confirmation
[preferably after positive reactions in urease (10.6.3.1) and CR-MOX tests (10.6.3.3)].
An example of preserving strains is given below (other suitable means of preserving cultures can also
be used):
— immediately subculture each pure culture into TSB (B.8);
— incubate at 30 °C (7.2) for 24 h ± 2 h;
— add an equal volume of 40 % sterile glycerol (B.9) to get a final glycerol concentration of 20 %;
— mix well and freeze, preferably at −70 °C.
10.6.3.4 Detection of pyrazinamidase
Inoculate a large area of the slant surface (B.13) of the medium with generous loopful (7.6) of bacteria.
Incubate at 30 °C (7.2) for 48 h ± 4 h.
Add 1 ml of freshly prepared (on the day of use) 1 % ammonium iron(II) sulfate solution (B.14).
If the reaction is positive, a pinkish-brown colour develops within 15 min indicating presence of
pyrazinoic acid formed by pyrazinamidase enzyme.
EXAMPLE Suitable negative control strain is WDCM 00216 (Y. enterocolitica, bioserotype 4/O:3) or
WDCM 000160 (Y. enterocolitica, bioserotype 1B/O:8) and positive control strain is any Y. enterocolitica strain
representing biotype 1A or Y. intermedia WDCM 00217.
NOTE The possibility of obtaining false positive reactions increases if old 1 % ammonium iron(II) sulfate
solution is used.
10.6.3.5 Interpretation of pathogenicity tests
The strain is considered to be a pathogenic Yersinia if it is urease positive, and esculin and
pyrazinamidase negative. Additionally, the presence of virulence plasmid pYV (10.6.3.3) is a strong
[10,14]
indication of pathogenicity. For confirmation of pathogenic Y. enterocolitica, proceed to 10.6.4.
10.6.4 Confirmation of pathogenic Y. enterocolitica
10.6.4.1 General
After determination of pathogenic Yersinia species proceed to confirmation of Y. enterocolitica. This is
necessary only if tests in 10.6.3 have indicated the presence of pathogenic Yersinia species.
8 © ISO 2017 – All rights reserved
10.6.4.2 Lysine decarboxylase and arginine dihydrolase
Using a loop (7.6), inoculate each liquid medium just below the surface (B.15). If the tubes are not full
of medium and airtight, cover the surface with molten (heated then just cooled so that it remains still
2) ®
liquid) Vaseline oil or sterile liquid paraffin.
Incubate at 30 °C (7.2) for 24 h ± 2 h.
A violet colour after incubation indicates a positive reaction.
A yellow colour indicates a negative reaction.
10.6.4.3 Phenylalanine (Tryptophane) deaminase
Inoculate a large area of the slant surface (B.16) of the medium.
Incubate at 30 °C (7.2) for 24 h ± 2 h.
Add 2 to 3 drops of 10 % ferric chloride solution (B.17) onto grown bacteria on agar slant surface.
Development of a green colour indicates a positive reaction.
10.6.4.4 Fermentation of sucrose, sorbitol, rhamnose and melibiose
Inoculate each medium (B.18) just below the surface of the liquid.
Incubate at 30 °C (7.2) for 24 h ± 2 h.
A yellow colour after incubation indicates a positive reaction.
A red colour indicates a negative reaction.
10.6.4.5 Utilization of citrate (Simmon’s citrate) (optional)
By means of a loop (7.6), take a well isolated colony of a strain to be tested and mix it well with a drop
of saline solution (B.4).
NOTE 1 The washing step with saline removes the excess nutrients from the inoculum and thus helps to avoid
false-positive results and interpretation problems. Over incubation can also cause false positive reactions.
NOTE 2 This test can give false positive reactions in some commercially available biochemical identification kits.
Streak the surface of the agar (B.19) with the bacterial suspension and incubate at 30 °C (7.2) for
24 h ± 2 h.
The reaction is positive if there is visible growth on the medium and it turns blue. Faint blue reaction is
also considered positive.
EXAMPLE Suitable control strains are Y. intermedia WDCM 00217 (positive control) and Y. enterocolitica
WDCM 00216 (bioserotype 4/O:3, negative control) or WDCM 000160 (Y. enterocolitica, bioserotype 1B/O:8,
negative control).
NOTE 3 This test is useful in discriminating between Y. enterocolitica (negative reaction) and many related
species like Y. intermedia, Y. frederiksenii, Y. rohdei and Y. aldovae (positive and variable reactions).
10.6.4.6 Alternative confirmation tests
In confirmation of pathogenic Y. enterocolitica, it is possible to replace the biochemical tests of 10.6.3
and 10.6.4 by real-time PCR test targeting ail-gene in accordance with ISO/TS 18867 (see Figure A.2 and ®
2) Vaseline is an example(s) of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
Reference [6]). However, in case of positive reaction in real-time PCR test, it is mandatory to proceed to
detection of pyrazinamidase (10.6.3.4) to obtain a test result according to this document.
If shown to be reliable, miniaturized galleries for the biochemical identification of Y. enterocolitica may
be used (see ISO 7218). The galleries shall include, as a minimum, the biochemical tests as specified in
this document.
NOTE 1 Alternative procedures can be used to confirm the isolate as Y. enterocolitica, providing the suitability
of the alternative procedure is verified (see ISO 7218).
NOTE 2 Some alternative identification procedures can incorrectly identify the most recent members of
Yersinia species as Y. enterocolitica.
10.6.5 Interpretation of confirmation tests for Y. enterocolitica
Y. enterocolitica gives results in accordance with Table 1.
Table 1 — Interpretation of confirmation tests for Yersinia enterocolitica
Test Reaction
Urea (10.6.3.1) +
Lysine decarboxylase (10.6.4.2) −
Arginine dihydrolase (10.6.4.2) −
Phenylalanine/Tryptophane deaminase −
(10.6.4.3)
a
Sucrose (10.6.4.4) +
a
Sorbitol (10.6.4.4) +
Rhamnose (10.6.4.4) −
Melibiose (10.6.4.4) −
Citrate (10.6.4.5) −
a
Negative strains belonging to pathogenic biotypes may occur.
10.6.6 Interpretation of confirmation tests for pathogenic Y. enterocolitica
Pathogenic Y. enterocolitica is detected if at least one colony is urease positive, and esculin and
pyrazinamidase negative (10.6.3.5) and presents the characteristics of Y. enterocolitica in Table 1
(10.6.5).
For interpretation of real-time PCR result (optional alternative confirmation) see Annex A, Figure A.2
and ISO/TS 18867.
10.7 Biotyping of Y. enterocolitica (optional)
10.7.1 General
In addition to tests for esculin (10.6.3.2) and pyrazinamidase (10.6.3.4), complete biotyping scheme
includes tests for xylose, tween-esterase/lipase, salicin (optional), trehalose and indole.
Use appropriate control strains for each test in biotyping.
EXAMPLE Suitable positive control strain for all tests is any Y. enterocolitica strain representing biotype 1A.
Y. enterocolitica WDCM 000160 (bioserotype 1B
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 10273
Troisième édition
2017-03
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche de Yersinia
enterocolitica pathogènes
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
detection of pathogenic Yersinia enterocolitica
Numéro de référence
©
ISO 2017
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2017, Publié en Suisse
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Ch. de Blandonnet 8 • CP 401
CH-1214 Vernier, Geneva, Switzerland
Tel. +41 22 749 01 11
Fax +41 22 749 09 47
copyright@iso.org
www.iso.org
ii © ISO 2017 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vii
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Abréviations . 2
5 Principe . 2
5.1 Généralités . 2
5.2 Ensemencement direct à partir du milieu liquide d’enrichissement . . 2
5.3 Enrichissement dans le milieu liquide d’enrichissement et le milieu liquide
sélectif d’enrichissement . 2
5.4 Isolement après enrichissement et identification . 3
5.5 Confirmation . 3
6 Milieux de culture et réactifs . 3
7 Matériel et consommables . 3
8 Échantillonnage . 4
9 Préparation de l’échantillon pour essai . 4
10 Mode opératoire (voir Annexe A). 4
10.1 Prise d’essai et suspension mère. 4
10.2 Ensemencement direct sur gélose sélective . 5
10.3 Enrichissement . 5
10.4 Isolement et incubation des boîtes . 5
10.4.1 Isolement à partir du PSB et de l’ITC par traitement au KOH sur gélose CIN . 5
10.4.2 Isolement à partir du PSB et de l’ITC par traitement au KOH sur gélose
chromogène (facultatif) . . 5
10.5 Identification des colonies caractéristiques . 5
10.6 Confirmation . 6
10.6.1 Généralités . 6
10.6.2 Sélection des colonies en vue de la confirmation . 6
10.6.3 Détermination des espèces de Yersinia pathogènes . 7
10.6.4 Confirmation des Y. enterocolitica pathogènes . 9
10.6.5 Interprétation des essais de confirmation de Y. enterocolitica .10
10.6.6 Interprétation des essais de confirmation de Y. enterocolitica pathogènes .11
10.7 Biotypage de Y. enterocolitica (facultatif) .11
10.7.1 Généralités .11
10.7.2 Fermentation du xylose .11
10.7.3 Essai tween-estérase .11
10.7.4 Fermentation de la salicine (facultatif) et du tréhalose .12
10.7.5 Formation d’indole .12
10.7.6 Interprétation des essais de biotypage .12
11 Expression des résultats.13
12 Caractéristiques de performance de la méthode .13
12.1 Étude interlaboratoires .13
12.2 Sensibilité .13
12.3 Spécificité .13
12.4 LOD .
50 13
13 Rapport d’essai .13
14 Assurance de la qualité .14
Annexe A (normative) Schémas des modes opératoires .15
Annexe B (normative) Composition et préparation des milieux de culture et des réactifs .17
Annexe C (informative) Études de validation de méthode et caractéristiques de performance .32
Annexe D (informative) Mode opératoire pour l’enrichissement par le froid .35
Bibliographie .40
iv © ISO 2017 – Tous droits réservés
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré(e) par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits
alimentaires — Méthodes horizontales,, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec
le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à
l’accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 10273:2003), qui a fait l’objet d’une
révision technique. Les principales modifications apportées à cette troisième édition sont:
— pour la confirmation des Y. enterocolitica pathogènes, des essais liés à la pathogénicité ont été
ajoutés ou spécifiés et mis en exergue. En conséquence, l’adjectif «présumé» a été supprimé du titre
(Y. enterocolitica pathogènes) car la norme contient des essais obligatoires liés à la pathogénicité et
permet la séparation des Y. enterocolitica pathogènes et non pathogènes;
1)
— l’ensemencement direct sur gélose à la cefsulodine, à l’Irgasan™ et à la novobiocine (CIN) a été ajouté;
— le temps d’incubation a été modifié pour le bouillon d’enrichissement à la peptone, au sorbitol et aux
sels biliaires (PSB) et la gélose CIN;
TM
— l’ensemencement et le temps d’incubation pour le bouillon d’enrichissement à l’Irgasan , à la
ticarcilline et au chlorate de potassium (ITC) ont été modifiés et spécifiés;
— la gélose Salmonella/Shigella avec désoxycholate de sodium et chlorure de calcium (SSDC) a été
remplacée par la gélose CIN et un milieu chromogène facultatif;
1) L’Irgasan™ est un exemple de produit adapté disponible dans le commerce. Cette information est donnée par
souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de
l’ISO à l’égard de ce produit.
— l’ensemencement de la gélose CIN sans traitement préalable à l’hydroxyde de potassium (KOH)
du bouillon d’enrichissement a été changé en un mode opératoire facultatif (parallèlement au
traitement au KOH obligatoire);
— la préparation (durée de conservation) des solutions de KOH et de sulfate de fer(II) ammoniacal a
été spécifiée;
— les colonies suspectes issues de la culture primaire sont ensemencées en stries (purifiées) sur
gélose CIN et (facultatif) sur gélose chromogène afin de faciliter une meilleure sélection des
colonies caractéristiques ayant besoin d’une confirmation. L’emploi d’un stéréomicroscope dans
l’identification des colonies caractéristiques est mis en avant;
— tous les essais de confirmation biochimique, sauf l’essai de recherche de la pyrazinamidase, peuvent
être remplacés par une recherche par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en temps réel du
gène ail conformément à l’ISO/TS 18867;
— cinq essais de confirmation (indole, tréhalose, xylose, citrate, tween-estérase) sont devenus
facultatifs. L’essai de recherche de la fermentation de la salicine a été ajouté en tant qu’essai
facultatif (biotypage). L’essai de recherche de l’exigence en calcium à 37 °C a été remplacé par un
essai sur rouge Congo et oxalate de magnésium (CR-MOX). Trois essais (oxydase, gélose de Kligler et
décarboxylation de l’ornithine) ont été supprimés;
— le mode opératoire d’enrichissement par le froid de Y. enterocolitica a été ajouté à l’Annexe D;
— les caractéristiques de performance ont été ajoutées à l’Annexe C.
— les essais de performance pour l’assurance qualité des milieux de culture ont été ajoutés à l’Annexe B
et l’Annexe D.
vi © ISO 2017 – Tous droits réservés
Introduction
Le présent document spécifie une méthode horizontale pour la recherche des Yersinia enterocolitica
associées aux maladies chez l’homme. En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il est
possible que la présente méthode horizontale ne soit pas applicable dans tous ses détails à certains
d’entre eux et que, pour certains autres, il soit nécessaire d’employer d’autres méthodes. Néanmoins,
il convient que tous les efforts soient faits pour appliquer cette méthode horizontale chaque fois que
possible et il est à espérer qu’il n’y aura d’écarts par rapport à celle-ci qu’en cas d’absolue nécessité et
pour des raisons techniques.
Les principales modifications énumérées en préambule et introduites dans le présent document par
rapport à l’ISO 10273:2003, sont considérées comme des modifications majeures (voir l’ISO 17468).
Lors du prochain réexamen périodique du présent document, il sera tenu compte de toutes les évolutions
intervenues depuis sa publication et, notamment, dans quelle mesure cette méthode horizontale aura
été suivie ainsi que les raisons des dérogations dans le cas de produits particuliers.
L’harmonisation de toutes les méthodes d’essai ne peut être réalisée de façon immédiate; de ce fait, il
peut déjà exister des Normes internationales et/ou nationales pour certains groupes de produits, qui ne
concordent pas avec la présente méthode horizontale. Lorsque de telles normes viendront en révision, il
serait souhaitable de les aligner avec le présent document et de ne conserver que les seules divergences
justifiées indispensables pour des raisons techniques.
NORME INTERNATIONALE ISO 10273:2017(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche de Yersinia enterocolitica
pathogènes
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel que
les essais de recherche de Yersinia enterocolitica pathogènes ne soient réalisés que dans des
laboratoires équipés à cet effet et sous la surveillance d’un microbiologiste expérimenté, et qu’un
grand soin soit pris pour se débarrasser de tout le matériel incubé. Il convient que l’utilisateur
du présent document maîtrise les pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n’a
pas pour but de traiter tous les problèmes de sécurité qui peuvent être liés à son utilisation.
Il est de la responsabilité de l’utilisateur d’établir des pratiques appropriées de sécurité, de
protection de la santé et de garantir la conformité vis-à-vis des réglementations nationales en
vigueur.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode horizontale pour la recherche des Y. enterocolitica associées
aux maladies chez l’homme. Ce document est applicable
— aux produits destinés à l’alimentation humaine et animale, et
— aux échantillons d’environnement pour la production et la distribution des aliments.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133:2014, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau — Préparation,
production, stockage et essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www.e lectropedia. org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www. iso. org/o bp.
3.1
Yersinia enterocolitica pathogènes
bactéries psychrotrophes formant des colonies caractéristiques sur des milieux solides sélectifs,
possédant des propriétés biochimiques et moléculaires répondant aux critères de pathogénicité décrits
lorsque des essais de confirmation sont réalisés conformément au présent document
3.2
recherche de Yersinia enterocolitica pathogènes
détermination de la présence ou de l’absence des Yersinia enterocolitica pathogènes (3.1) dans une
masse ou un volume donné(e) de produit ou une surface spécifiée, lorsque les essais sont réalisés
conformément au présent document
4 Abréviations
Pour les besoins du présent document, les abréviations suivantes s’appliquent.
CEB Bouillon d’enrichissement par le froid
CIN Cefsulodine, Irgasan™ et Novobiocine
CR-MOX Rouge Congo et oxalate de magnésium
ITC Irgasan™, Ticarcilline et Chlorate de potassium
KOH Hydroxyde de potassium
MRB Milieu Rappaport modifié
PCR Réaction de polymérisation en chaîne
PSB Peptone, sorbitol et sels biliaires
TSB Bouillon tryptique soja
WDCM World Data Centre for Microorganisms
5 Principe
5.1 Généralités
La recherche de Y. enterocolitica pathogènes nécessite quatre étapes successives (voir l’Annexe A pour
le schéma du mode opératoire et la confirmation). Outre le mode opératoire général, par exemple pour
les investigations réalisées lors d’une épidémie, un mode opératoire facultatif d’enrichissement par le
froid (voir l’Annexe D) peut être employé.
5.2 Ensemencement direct à partir du milieu liquide d’enrichissement
L’échantillon est homogénéisé dans un milieu liquide d’enrichissement (bouillon PSB), puis une quantité
[15]
spécifiée est ensemencée sur deux à quatre boîtes de gélose CIN. Les boîtes ensemencées sont
incubées à 30 °C pendant 24 h.
NOTE Des boîtes supplémentaires, telles qu’une gélose chromogène pour la recherche de Y. enterocolitica
[9][13][18]
pathogènes, peuvent également être utilisées .
5.3 Enrichissement dans le milieu liquide d’enrichissement et le milieu liquide sélectif
d’enrichissement
Une quantité spécifiée de milieu d’enrichissement PSB ensemencé (5.2) est transférée dans un milieu
[17]
liquide sélectif d’enrichissement constitué d’un bouillon ITC. Le bouillon ITC et la suspension mère
de PSB sont incubés à 25 °C pendant 44 h.
2 © ISO 2017 – Tous droits réservés
5.4 Isolement après enrichissement et identification
À partir des enrichissements obtenus en 5.3, un isolement sur gélose CIN est effectué en transférant
tout d’abord une quantité spécifiée de milieu d’enrichissement (5.3, voir l’Article 10 pour le mode
opératoire) dans une solution de KOH à 0,5 % et, après mélange pendant une durée spécifiée (traitement
au KOH ou traitement alcalin), en ensemençant une boîte de CIN. Les boîtes ensemencées sont incubées
à 30 °C pendant 24 h. Les colonies typiques de Y. enterocolitica pathogènes sont identifiées (voir 10.5) et
la morphologie de la colonie est vérifiée en tant que Y. enterocolitica présumée pathogène par mises en
culture successives sur des boîtes sélectives (voir 10.5).
NOTE Des boîtes supplémentaires, telles qu’une gélose chromogène pour la recherche de Y. enterocolitica
[9][13][18]
pathogènes, peuvent également être utilisées .
5.5 Confirmation
Sur les colonies identifiées comme Y. enterocolitica pathogènes présumées (5.2 et 5.4), la confirmation
de Y. enterocolitica pathogènes est réalisée par des essais appropriés de confirmation biochimique et/ou
moléculaire (voir 10.6 et Figure A.2).
6 Milieux de culture et réactifs
Voir l’ISO 7218 pour les pratiques courantes de laboratoire.
Voir l’ISO 11133 et l’Annexe B pour les essais de performance des milieux de culture.
La composition des milieux de culture et des réactifs et leur préparation sont décrites dans l’Annexe B.
Il est également possible d’utiliser des milieux complets déshydratés, des diluants ou des milieux prêts
à l’emploi. Dans ce cas, suivre les instructions du fabricant.
7 Matériel et consommables
Le matériel jetable est une alternative acceptable à la verrerie réutilisable, à condition que ses
spécifications soient adaptées à l’usage prévu. Utiliser le matériel courant de laboratoire de
microbiologie (voir l’ISO 7218) et en particulier ce qui suit.
7.1 Appareil pour la stérilisation par chaleur sèche (four) ou par chaleur humide (autoclave).
Voir l’ISO 7218.
7.2 Étuves, conformément à l’ISO 7218, capables de fonctionner à 4 °C ± 2 °C, 25 °C ± 1 °C, 30 °C ± 1 °C
et 37 °C ± 1 °C.
7.3 Poches d’homogénéisateur, tubes à essai, flacons et/ou fioles stériles, de capacité appropriée.
7.4 Boîtes de Petri, de 90 mm de diamètre environ et de grandes dimensions (facultatif)
(environ 140 mm de diamètre).
7.5 Pipettes. Pipettes graduées ou pipettes automatiques, avec une grande ouverture et de capacités
nominales de 1 ml et 10 ml, respectivement par divisions de 0,1 ml et 0,5 ml et pipettes Pasteur.
7.6 Anses et étaleurs. Anses stériles, d’environ 6 mm de diamètre (10 µl de volume), et aiguille
ou fil d’ensemencement. Étaleurs à usage unique en L ou en T. Cotons-tiges (protocole facultatif dans
l’Annexe D).
7.7 Stéréomicroscope, équipé d’un éclairage à fond noir ou de transillumination oblique (angle
de 45°).
7.8 Homogénéisateur péristaltique.
8 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Se reporter à la
Norme internationale spécifique traitant du produit concerné. S’il n’existe aucune Norme internationale
spécifique pour l’échantillonnage du produit concerné, il convient que les parties concernées s’accordent
sur ce sujet.
Des techniques d’échantillonnage recommandées sont décrites dans les documents suivants:
— l’ISO/TS 17728 pour les aliments et les aliments pour animaux;
— l’ISO 13307 pour le stade de production primaire;
— l’ISO 17604 pour les carcasses;
— l’ISO 18593 pour les échantillons d’environnement.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon qui soit représentatif et il convient que cet
échantillon n’ait été ni endommagé ni modifié lors du transport ou du stockage.
9 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai conformément à la Norme internationale spécifique au produit
concerné. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique, il convient que les parties concernées
s’accordent sur ce sujet.
10 Mode opératoire (voir Annexe A)
10.1 Prise d’essai et suspension mère
10.1.1 Voir le document pertinent de l’ISO 6887 (toutes les parties) ou toute autre Norme internationale
spécifique au produit à examiner.
10.1.2 En règle générale, pour la préparation de la suspension mère, utiliser comme diluant le milieu
de pré-enrichissement spécifié au B.2 (bouillon PSB). Avant de l’utiliser, préchauffer le bouillon PSB à
température ambiante.
En général, une quantité donnée de prise d’essai (masse ou volume) est ajoutée à une quantité donnée
de PSB (masse ou volume) afin d’obtenir une dilution 1/10. Pour cet essai, une prise d’essai de 25 g est
mélangée avec 225 ml de PSB.
Homogénéiser la suspension, de préférence à l’aide d’un homogénéisateur péristaltique (7.8)
pendant 1 min.
Le présent document est validé pour des prises d’essai allant jusqu’à 25 g ou ml. Une prise d’essai
plus petite peut être utilisée sans qu’il soit nécessaire de procéder à une validation/vérification
supplémentaire, à condition de maintenir le même rapport entre le bouillon d’enrichissement et la
prise d’essai. Une prise d’essai plus grande que celle initialement validée peut être utilisée à condition
qu’une étude de validation/vérification ait montré l’absence d’effets négatifs sur la recherche
des Y. enterocolitica pathogènes.
NOTE La validation peut être effectuée conformément aux documents appropriés de l’ISO 16140 (toutes
les parties). La vérification des échantillons groupés peut être réalisée conformément au protocole décrit dans
l’ISO 6887-1:2017, Annexe D (protocole de vérification des échantillons groupés pour les essais qualitatifs).
4 © ISO 2017 – Tous droits réservés
10.1.3 Préparer la suspension d’enrichissement sélectif ITC en transférant 10 ml de suspension PSB
(10.1.2) dans 90 ml de bouillon ITC (B.3) et mélanger.
10.2 Ensemencement direct sur gélose sélective
En utilisant la suspension mère de PSB obtenue (10.1.2), diviser un volume total de 1 ml sur deux à
quatre boîtes de gélose CIN (B.6) et l’étaler sur les boîtes avec un étaleur (7.6).
Inverser les boîtes de CIN et les placer dans l’étuve (7.2) réglée à 30°C pendant 24 h ± 2 h.
NOTE 1 Le séchage des boîtes de gélose CIN (par exemple dans une armoire à flux laminaire) avant
ensemencement pendant une demi-heure peut être exigé pour une absorption complète de l’inoculum dans
la gélose.
NOTE 2 Le nombre de boîtes de gélose CIN à utiliser dépend du niveau attendu de microflore annexe des
échantillons.
10.3 Enrichissement
Incuber la suspension mère dans le PSB (10.1.2) et le bouillon d’enrichissement sélectif ITC (10.1.3)
à 25 °C (7.2) pendant 44 h ± 4 h (sans agitation).
10.4 Isolement et incubation des boîtes
10.4.1 Isolement à partir du PSB et de l’ITC par traitement au KOH sur gélose CIN
À l’aide d’une pipette stérile (7.5), transférer 0,5 ml du milieu d’enrichissement PSB (10.3) dans 4,5 ml
[7]
de solution de KOH (B.5) (préparée la veille de son utilisation), puis mélanger. Au bout de 20 s ± 5 s
après l’addition du milieu d’enrichissement PSB à la solution de KOH, ensemencer en stries, à l’aide d’une
anse (7.6), la surface d’une boîte de gélose CIN (B.6) afin d’obtenir des colonies bien séparées. Répéter le
mode opératoire pour le milieu d’enrichissement ITC (10.3).
NOTE 1 Pour garantir les performances de la méthode, il est essentiel de préparer le KOH la veille de son
utilisation. Se reporter aux Annexes B et C.
Inverser les boîtes de CIN et les placer dans l’étuve (7.2) réglée à 30°C pendant 24 h ± 2 h.
NOTE 2 En outre, il peut être intéressant d’ensemencer [à l’aide d’une anse (7.6)] les boîtes de gélose CIN avec
des milieux PSB et ITC non traités (sans traitement au KOH).
NOTE 3 Pendant le traitement au KOH, le milieu d’enrichissement est dilué selon le rapport 1/10. De plus, ce
traitement peut réduire le nombre d’Y. enterocolitica pathogènes dans la solution. Dans certains cas, il peut donc
être intéressant d’ensemencer une boîte de CIN supplémentaire avec 0,1 ml d’inoculum.
10.4.2 Isolement à partir du PSB et de l’ITC par traitement au KOH sur gélose chromogène
(facultatif)
Répéter le mode opératoire décrit en 10.4.1 et ensemencer, après traitement au KOH, à l’aide d’une
[9][13][18]
anse (7.6), la surface d’une boîte de gélose chromogène afin d’obtenir des colonies bien
séparées.
Incuber les boîtes chromogènes conformément aux instructions du fabricant.
10.5 Identification des colonies caractéristiques
Après 24 h ± 2 h d’incubation, examiner les boîtes de CIN afin de rechercher la présence de colonies
caractéristiques de Y. enterocolitica. Il convient d’effectuer cet examen à l’aide d’un stéréomicroscope (7.7)
équipé d’un éclairage à fond noir ou de transillumination oblique (angle de 45°).
Sur la gélose CIN, les Y. enterocolitica pathogènes se présentent sous la forme de petites colonies (environ
1 mm ou moins) circulaires, lisses, au bord entier. Les colonies ont un petit centre à bord net rouge foncé
(«œil de bœuf»). Le pourtour est translucide ou transparent et, observé avec transillumination oblique,
non iridescent et finement granulaire.
NOTE 1 L’éclairage à fond noir ou la transillumination oblique aide à distinguer les colonies caractéristiques
[12]
de Yersinia enterocolitica de colonies très similaires d’autres espèces de Yersinia et de certaines espèces non
Yersinia.
NOTE 2 En cas de croissance dense de la flore annexe sur les boîtes de CIN, la taille des colonies
de Y. enterocolitica pathogènes peut être plus petite et le centre rouge typique peut être peu clair ou absent.
10.6 Confirmation
10.6.1 Généralités
L’emploi de souches de contrôle d’espèces de Yersinia est exigé en particulier pour aider à faire la
distinction entre Y. enterocolitica pathogènes et les autres espèces de Yersinia sur gélose CIN. Des
souches appropriées de contrôle positif et négatif doivent être utilisées pour chacun des essais de
confirmation. Des exemples de souches de contrôle adaptées sont fournis dans les chapitres relatifs à
ces essais. Une représentation schématique de la confirmation est donnée à la Figure A.2.
10.6.2 Sélection des colonies en vue de la confirmation
Pour les essais de confirmation, sélectionner dans chaque boîte de chaque milieu sélectif (voir 10.3)
cinq colonies considérées comme typiques des Y. enterocolitica pathogènes si elles sont disponibles
(voir 10.5).
Ensemencer en stries les colonies sélectionnées sur la surface des boîtes de gélose CIN (B.6) de manière
à permettre le développement de colonies bien séparées. Ensemencer en stries également les souches de
contrôle de Y. enterocolitica de biosérotype 4/O:3, 2/O:9 et de biotype 1A et d’autres espèces de Yersinia
afin de comparer la morphologie des colonies.
En outre, il est intéressant d’ensemencer en stries des colonies typiques pour confirmation et des
souches de contrôle appropriées sur gélose chromogène, parallèlement à la préparation des boîtes de
gélose CIN. Pour identifier les colonies caractéristiques sur gélose chromogène, suivre les instructions
du fabricant concernant l’évaluation de la morphologie typique des colonies.
EXEMPLE Des souches de contrôle adaptées de Y. enterocolitica sont WDCM 00216 (biosérotype 4/O:3),
WDCM 00215 (biosérotype 2/O:9) et WDCM 00160 (biosérotype 1B/O:8).
Inverser les boîtes ensemencées et les placer dans l’étuve (7.2) réglée à 30 °C pendant 24 h ± 2 h.
Examiner les boîtes incubées afin de rechercher les colonies caractéristiques (voir 10.5) et d’évaluer la
pureté de la culture. Il convient de réaliser cet examen à l’aide d’un stéréomicroscope (7.7). Comparer
la morphologie des colonies suspectées à celles des colonies de souches de contrôle afin de mieux
distinguer les colonies typiques des colonies atypiques. Jeter les boîtes ayant des colonies atypiques.
Si des cultures mixtes avec colonies typiques sont présentes, repiquer des colonies typiques sur des
boîtes de gélose CIN (B.6) et incuber comme ci-dessus.
Continuer avec une culture pure représentant les colonies typiques mères de la boîte primaire.
Conserver les autres cultures pures typiques (jusqu’à cinq, si elles sont disponibles) pour confirmation
si la première culture n’apporte aucune confirmation. Ensemencer en stries les colonies sélectionnées
sur la surface d’une gélose non sélective (par exemple une gélose nutritive (B.7), une gélose au sang ou
une gélose tryptone-soja) de manière à permettre le développement de colonies bien séparées.
Inverser les boîtes ensemencées et les placer dans l’étuve réglée à 30 °C (7.2) pendant 18 h à 24 h ou
jusqu’à ce que la croissance soit satisfaisante.
6 © ISO 2017 – Tous droits réservés
Pour les essais de confirmation biochimique et de pathogénicité, utiliser uniquement des cultures pures.
NOTE 1 Il n’est pas nécessaire de procéder à la confirmation de toutes les étapes successives d’enrichissement
si les Y. enterocolitica pathogènes de l’étape précédente ont été confirmées.
NOTE 2 Pour des raisons épidémiologiques ou pour les investigations réalisées lors d’une épidémie, la
confirmation de colonies supplémentaires, par exemple cinq colonies typiques ou suspectes issues de chaque
combinaison milieu d’enrichissement sélectif/milieu d’isolement, peut être bénéfique.
10.6.3 Détermination des espèces de Yersinia pathogènes
10.6.3.1 Recherche de l’uréase
Ensemencer en stries les bactéries sur la pente de la gélose (B.10). Ne pas visser hermétiquement les
capuchons des tubes de manière à laisser l’air entrer et à assurer des conditions d’aérobie.
Incuber à 30 °C (7.2) pendant 24 h ± 2 h.
Une couleur rose violacé ou rouge rosé indique une réaction positive pour l’uréase.
EXEMPLE Une souche de contrôle positif adaptée est WDCM 00216 (Y. enterocolitica, biosérotype 4/O:3)
ou WDCM 00160 (Y. enterocolitica, biosérotype 1B/O:8).
Une couleur jaune orangé indique une réaction négative pour l’uréase.
Conserver pour future confirmation toutes les colonies positives pour l’uréase ayant une morphologie
de colonie typique.
NOTE 1 Les souches de Y. enterocolitica pathogènes ensemencées sur certains types de gélose à l’urée
disponibles dans le commerce ont parfois besoin de plus de temps (jusqu’à 7 jours) pour le développement d’une
réaction positive.
NOTE 2 Les souches pathogènes négatives pour l’uréase de Y. enterocolitica existent, mais elles sont
extrêmement rares (0,01 %).
10.6.3.2 Hydrolyse de l’esculine
Ensemencer en stries des bactéries sur la pente de la gélose (B.12).
Incuber à 30 °C (7.2) pendant 24 h ± 2 h.
Une auréole noire autour des colonies indique une réaction positive.
EXEMPLE Une souche de contrôle négatif adaptée est WDCM 00216 (Y. enterocolitica, biosérotype 4/O:3)
ou WDCM 000160 (Y. enterocolitica, biosérotype 1B/O:8) et une souche de contrôle positif est toute souche de
Y. enterocolitica représentant le biotype 1A ou Y. intermedia WDCM 00217.
NOTE Cet essai de recherche de l’hydrolyse de l’esculine est équivalent à l’essai de recherche de la
fermentation de la salicine dans la détermination de la pathogénicité.
10.6.3.3 Recherche du plasmide de virulence (pYV) par un essai sur gélose CR-MOX
La fixation du rouge Congo et la formation de colonies en tête d’épingle à 37 °C sont des caractéristiques
typiques des Y. enterocolitica pathogènes. Le plasmide de virulence (pYV) détermine les caractères liés
à la pathogénicité de Yersinia, et beaucoup d’entre eux, y compris la croissance dépendant du calcium, ne
s’activent qu’à 37 °C.
Le plasmide de virulence (pYV) peut être perdu spontanément au laboratoire durant le stockage, la
culture de longue durée et les passages répétés. Par conséquent, l’essai de recherche du plasmide de
virulence (essai CR-MOX) doit être effectué à un stade précoce de la confirmation.
À l’aide d’une anse (7.6), toucher plusieurs colonies de la culture pure de la souche sélectionnée pour
la confirmation (positive pour l’uréase, morphologie de colonie typique). Ensemencer la surface de la
gélose CR-MOX (B.11) afin d’obtenir des colonies bien séparées.
Incuber à 37 °C (7.2) pendant 24 h à 48 h.
Si nécessaire, rechercher sur les boîtes les colonies positives contenant pYV après 24 h et poursuivre
l’incubation pendant 24 h supplémentaires si des colonies positives ne sont pas présentes.
Une boîte donnant une réaction positive contient des colonies en tête d’épingle rouge orangé (fixation
du rouge Congo) (croissance dépendant du calcium à 37 °C) et éventuellement des colonies plus grandes
incolores. Une boîte donnant une réaction négative ne contient que des colonies incolores.
NOTE 1 Dans une culture pure, il est normal que certaines des colonies contiennent des cellules avec le
plasmide pYV tandis que d’autres colonies de la même culture contiennent des cellules sans plasmide. Lors de
la préparation de l’inoculum pour cet essai, le fait de collecter le matériel avec une anse à partir de plusieurs
colonies aide à éviter de choisir les cellules bactériennes sans plasmide.
NOTE 2 Pour une meilleure distinction entre les réactions positives et négatives, il est intéressant
d’ensemencer deux boîtes CR-MOX en parallèle à partir du même inoculum de la souche analysée et d’incuber
une boîte à 37 °C (7.2) et l’autre à 25 °C (7.2). La boîte incubée à 25 °C (7.2) donne toujours une réaction négative
(même si la souche contient le plasmide pYV). Par conséquent, la différence entre un résultat positif possible
à 37 °C (7.2) et une réaction négative à 25 °C (7.2) est mieux visualisée.
Une souche de contrôle positif adaptée est toute souche de Y. enterocolitica pathogène pour laquelle la
présence du plasmide de virulence a été vérifiée, avant utilisation.
EXEMPLE Une souche de contrôle positif adaptée est WDCM 00216 (Y. enterocolitica, biosérotype 4/O:3)
et une souche de contrôle négatif est WDCM 00160 (Y. enterocolitica, biosérotype 1B/O:8, sans plasmide)
ou WDCM 00217 (Y. intermedia).
Le plasmide de virulence (pYV) pouvant être perdu au cours du repiquage dans le laboratoire, inclure
dans la confirmation des souches donnant une réaction négative lors de l’essai.
En outre, conserver des souches positives en tant que cultures mères congelées à un stade précoce de la
confirmation [de préférence après réactions positives dans les essais de recherche de l’uréase (10.6.3.1)
et sur CR-MOX (10.6.3.3)].
Un exemple de conservation de souches est fourni ci-dessous (d’autres moyens adaptés de conservation
des cultures peuvent également être utilisés):
— repiquer immédiatement chaque culture pure dans un bouillon TSB (B.8);
— incuber à 30 °C (7.2) pendant 24 h ± 2 h;
— ajouter un volume égal de glycérol à 40 % stérile (B.9) pour obtenir une concentration finale de
glycérol de 20 %;
— bien mélanger et congeler, de préférence à −70 °C.
10.6.3.4 Recherche de la pyrazinamidase
Ensemencer une grande superficie de la pente du milieu (B.13) avec une pleine anse (7.6) de bactéries.
Incuber à 30 °C (7.2) pendant 48 h ± 4 h.
Ajouter 1 ml de solution de sulfate de fer(II) ammoniacal à 1 % fraîchement préparée (le jour
d’utilisation) (B.14).
8 © ISO 2017 – Tous droits réservés
Si la réaction est positive, une couleur rose-marron se développe dans les 15 min, indiquant la présence
d’acide pyrazinoïque formé par l’enzyme pyrazinamidase.
EXEMPLE Une souche de contrôle négatif adaptée est WDCM 00216 (Y. enterocolitica, biosérotype 4/O:3)
ou WDCM 000160 (Y. enterocolitica, biosérotype 1B/O:8) et une souche de contrôle positif est toute souche
de Y. enterocolitica représentant le biotype 1A ou Y. intermedia WDCM 00217.
NOTE La possibilité d’obtenir de fausses réactions positives augmente si une solution de sulfate
de fer(II) ammoniacal à 1 % ancienne est utilisée.
10.6.3.5 Interprétation des essais de pathogénicité
La souche est considérée comme Yersinia pathogène si elle est positive pour l’uréase, et négative pour
l’esculine et la pyrazinamidase. En outre, la présence du plasmide de virulence pYV (10.6.3.3) est un
[10][14]
puissant indicateur de pathogénicité. Pour confirmer qu’il s’agit de Y. enterocolitica pathogènes,
procéder comme indiqué en 10.6.4.
10.6.4 Confirmation des Y. enterocolitica pathogènes
10.6.4.1 Généralités
Après la détermination des espèces de Yersinia pathogènes, procéder à la confirmation de Y. enterocolitica.
Cela n’est nécessaire que si l’essai de 10.6.3 a indiqué la présence d’espèces de Yersinia pathogènes.
10.6.4.2 Lysine décarboxylase et arginine dihydrolase
À l’aide d’une anse (7.6), ensemencer chaque milieu liquide juste au-dessous de la surface (B.15). Si les
tubes ne sont pas complètement remplis de milieu ni fermés hermétiquement, couvrir la surface avec
2)
de la Vaseline® fondue (chauffée puis refroidie juste assez pour rester liquide) ou avec de la paraffine
liquide stérile.
Incuber à 30 °C (7.2) pendant 24 h ± 2 h.
Une couleur violette après incubation indique une réaction positive.
Une couleur jaune indique une réa
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
Loading comments...