Infant formula and adult nutritionals -- Determination of vitamin D by liquid chromatography-mass spectrometry

This document specifies a method for the quantitative determination of vitamin D2 and/or vitamin D3 in infant formula, and adult nutritionals in solid (i.e. powders) or liquid (i.e. ready-to-feed liquids and liquid concentrates) forms using liquid chromatography-mass spectrometry. The application range runs from 0,15 µg/100 g (limit of quantification) to 59 µg/100 g for vitamin D2 and from 0,25 µg/100 g to 65 µg/100 g for vitamin D3.

Formules infantiles et produits nutritionnels pour adultes -- Détermination de la teneur en vitamine D par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse

Le présent document spécifie une méthode destinée ŕ la détermination quantitative de la vitamine D2 et/ou de la vitamine D3 dans les formules infantiles et les produits nutritionnels pour adultes sous forme solide (ŕ savoir les poudres) ou sous forme liquide (ŕ savoir les liquides pręts ŕ l'emploi et les liquides concentrés) par chromatographie liquide couplée ŕ la spectrométrie de masse. La plage d'application s'étend de 0,15 µg/100 g (limite de quantification) ŕ 59 µg/100 g pour la vitamine D2, et de 0,25 µg/100 g ŕ 65 µg/100 g pour la vitamine D3.

General Information

Status
Published
Publication Date
01-Jul-2018
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
19-Jun-2018
Completion Date
02-Jul-2018
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ISO 20636:2018 - Infant formula and adult nutritionals -- Determination of vitamin D by liquid chromatography-mass spectrometry
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ISO 20636:2018 - Formules infantiles et produits nutritionnels pour adultes -- Détermination de la teneur en vitamine D par chromatographie liquide couplée a la spectrométrie de masse
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20636
First edition
2018-07
Infant formula and adult
nutritionals — Determination of
vitamin D by liquid chromatography-
mass spectrometry
Formules infantiles et produits nutritionnels pour adultes —
Détermination de la teneur en vitamine D par chromatographie
liquide couplée à la spectrométrie de masse
Reference number
ISO 20636:2018(E)
ISO 2018
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ISO 20636:2018(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2018

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Published in Switzerland
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ISO 20636:2018(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 1

5 Reagents and materials ................................................................................................................................................................................. 2

5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 2

5.2 Reagent preparation........................................................................................................................................................................... 2

5.3 Standard preparation ........................................................................................................................................................................ 3

5.4 Calibration standard solutions .................................................................................................................................................. 4

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 4

7 Sample preparation ........................................................................................................................................................................................... 5

7.1 Powder sample preparation ........................................................................................................................................................ 5

7.2 Slurry sample preparation ............................................................................................................................................................ 5

7.3 Liquid sample preparation ........................................................................................................................................................... 5

8 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 6

8.1 Extraction and derivatisation ..................................................................................................................................................... 6

8.2 Chromatography .................................................................................................................................................................................... 6

8.3 Mass spectrometry .............................................................................................................................................................................. 7

9 Calculations................................................................................................................................................................................................................ 8

10 Results ..........................................................................................................................................................................................................................12

11 Precision ....................................................................................................................................................................................................................12

11.1 General ........................................................................................................................................................................................................12

11.2 Repeatability ..........................................................................................................................................................................................12

11.3 Reproducibility ....................................................................................................................................................................................13

Annex A (informative) Examples of spectra and chromatograms.......................................................................................15

Annex B (informative) Precision data ..............................................................................................................................................................18

Annex C (informative) Alternative instrument settings ................................................................................................................20

Annex D (informative) Comparison between ISO 20636 and EN 12821 ......................................................................21

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................23

© ISO 2018 – All rights reserved iii
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ISO 20636:2018(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso

.org/iso/foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, in collaboration

with AOAC INTERNATIONAL. It is being published by ISO and separately by AOAC INTERNATIONAL.

The method described in this document is equivalent to the AOAC Official Method 2016.05, Analysis

of Vitamin D and Vitamin D in Fortified Milk Powders, Infant Formulas, and Adult/Pediatric Nutritional

2 3
Formulas.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
iv © ISO 2018 – All rights reserved
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 20636:2018(E)
Infant formula and adult nutritionals — Determination of
vitamin D by liquid chromatography-mass spectrometry

WARNING — The use of this method can involve hazardous materials, operations and equipment.

This method does not purport to address all the safety problems associated with its use. It is the

responsibility of the user of this method to establish appropriate safety and health practices.

1 Scope

This document specifies a method for the quantitative determination of vitamin D and/or vitamin D

2 3

in infant formula, and adult nutritionals in solid (i.e. powders) or liquid (i.e. ready-to-feed liquids and

liquid concentrates) forms using liquid chromatography-mass spectrometry. The application range

runs from 0,15 µg/100 g (limit of quantification) to 59 µg/100 g for vitamin D and from 0,25 µg/100 g

to 65 µg/100 g for vitamin D .
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
adult nutritional

nutritionally complete, specially formulated food, consumed in liquid form, which may constitute the

sole source of nourishment, made from any combination of milk, soy, rice, whey, hydrolysed protein,

starch and amino acids, with and without intact protein
3.2
infant formula

breast-milk substitute specially manufactured to satisfy, by itself, the nutritional requirements of

infants during the first months of life up to the introduction of appropriate complementary feeding

[SOURCE: CODEX STAN 72-1981]
4 Principle

Samples are saponified at high temperature then lipid soluble components are extracted into isooctane.

A portion of the isooctane layer is transferred, washed, and an aliquot of 4-phenyl-1,2,4-triazoline-3,5-

dione (PTAD) is added to derivatise vitamin D to form a high molecular mass, easily ionisable adduct.

The vitamin D-adduct is then re extracted into a small volume of acetonitrile and analysed by reversed-

phase liquid chromatography. Detection is by mass spectrometry using multiple reaction monitoring

(MRM). Stable isotope labelled d6-vitamin D and d6-vitamin D internal standards are used for

2 3

quantitation to correct for losses in extraction and any variation in derivatisation and ionisation

[2]
efficiencies .
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ISO 20636:2018(E)
5 Reagents and materials

During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and

distilled or demineralized water or water of equivalent purity.
5.1 General
5.1.1 Standards, ≥99 % pure.
5.1.2 Vitamin D , ergocalciferol.
5.1.3 Vitamin D , cholecalciferol.
5.1.4 d6-Vitamin D , 26,26,26,27,27,27-d6 ergocalciferol.
5.1.5 d6-Vitamin D , 26,26,26,27,27,27-d6 cholecalciferol.
5.1.6 PTAD (4-phenyl-1,2,4-triazoline-3,5-dione).
5.1.7 Formic acid (HCO H), LC-MS grade.
5.1.8 Potassium hydroxide (KOH).
5.1.9 Pyrogallol (C H (OH) ).
6 3 3
5.1.10 Ethanol (C H OH).
2 5
5.1.11 Methanol (CH OH), LC-MS grade.
5.1.12 Isooctane ((CH ) CCH CH(CH ) ).
3 3 2 3 2
5.1.13 Acetone (CH COCH ).
3 3
5.1.14 Acetonitrile (CH CN), LC-MS grade.
5.2 Reagent preparation

5.2.1 PTAD solution, c(4-phenyl-1,2,4-triazoline-3,5-dione) = 10 mg/ml. Dissolve 50 mg PTAD (5.1.6)

in 5,0 ml acetone (5.1.13).

5.2.2 Potassium hydroxide solution, c(KOH) = 8,9 mol/l. Dissolve 100 g potassium hydroxide (5.1.8)

in 200 ml water.

5.2.3 Ethanolic pyrogallol solution, c(C H (OH) ) = 0,079 mol/l. Dissolve 5 g pyrogallol (5.1.9) in

6 3 3
500 ml ethanol (5.1.10).

5.2.4 Mobile phase A, c(HCO H) = 0,026 5 mol/l. To 500 ml of water, add 0,5 ml formic acid (5.1.7).

5.2.5 Mobile phase B, methanol, 500 ml (5.1.11).
2 © ISO 2018 – All rights reserved
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ISO 20636:2018(E)
5.3 Standard preparation

5.3.1 Vitamin D is sensitive to light. Perform all steps under low-level incandescent lighting. If exclusively

vitamin D is required for analysis, then standards pertaining to vitamin D need not be used and vice

3 2

versa. Calibration standards should be bracketed at the beginning and at the end of an analytical run.

5.3.2 Vitamin D stable isotope labelled stock standard solution, ρ ≈ 10 μg/ml. Dispense the

contents of a 1 mg vial of d6-vitamin D (5.1.4) into a 100 ml volumetric flask. Dissolve in 90 ml of ethanol

(5.1.10). To promote dissolution, sonicate if necessary. Mix thoroughly, make up to volume with ethanol

(5.1.10). Measure the absorbance of an aliquot at 265 nm. The spectrophotometer should be zeroed

against an ethanol (5.1.10) blank solution. Calculate and record concentration. Immediately dispense

aliquots (~1,3 ml) into cryogenic vials and freeze at < –15 °C for up to 6 months.

5.3.3 Vitamin D stable isotope labelled stock standard solution, ρ ≈ 10 μg/ml. Dispense the

contents of a 1 mg vial of d6-vitamin D (5.1.5) into a 100 ml volumetric flask. Dissolve in 90 ml of ethanol

(5.1.10). To promote dissolution, sonicate if necessary. Mix thoroughly, make up to volume with ethanol

(5.1.10). Measure the absorbance of an aliquot at 265 nm. The spectrophotometer should be zeroed

against an ethanol (5.1.10) blank solution. Calculate and record concentration. Immediately dispense

aliquots (~1,3 ml) into cryogenic vials and freeze at < –15 °C for up to 6 months.

5.3.4 Stable isotope labelled internal standard solution, ρ ≈ 1 μg/ml. Depending on the number

of samples that need to be analysed in a run, more or less stable isotope labelled internal standard

solution needs to be made up. For every 15 samples (or part thereof) in an analytical run, remove 1 vial

of Vitamin D stable isotope labelled stock standard solution (5.3.2) and/or 1 vial of Vitamin D stable

2 3

isotope labelled stock standard solution (5.3.3) from the freezer and allow to warm to room temperature.

Pipette 1,0 ml of vitamin D stable isotope labelled stock standard solution (5.3.2) and/or 1,0 ml of

vitamin D stable isotope labelled stock standard solution (5.3.3) into a 10 ml volumetric flask (use a

separate 10 ml volumetric flask for each set of 15 samples). Make each 10 ml volumetric flask to volume

with acetonitrile, pool together and mix thoroughly. Make fresh daily.

5.3.5 Vitamin D non-labelled stock standard solution, ρ ≈ 1 mg/ml. Weigh accurately,

approximately 50 mg of vitamin D (5.1.2) into a 50 ml volumetric flask. Dissolve in 40 ml of ethanol

(5.1.10). To promote dissolution, sonicate if necessary. Mix thoroughly, make up to volume with ethanol

(5.1.10). Store in freezer at < –15 °C for up to 1 month.

5.3.6 Vitamin D non-labelled stock standard solution, ρ ≈ 1 mg/ml. Weigh accurately,

approximately 50 mg of vitamin D (5.1.3) into a 50 ml volumetric flask. Dissolve in 40 ml of ethanol

(5.1.10). To promote dissolution, sonicate if necessary. Mix thoroughly, make up to volume with ethanol

(5.1.10). Store in freezer at < −15 °C for up to 1 month.

5.3.7 Vitamin D non-labelled purity standard solution, ρ ≈ 10 μg/ml. Pipette 1,0 ml of vitamin D

2 2

non-labelled stock standard solution (5.3.5) into a 100 ml volumetric flask. Make to volume with ethanol

(5.1.10). Measure the absorbance of an aliquot at 265 nm. The spectrophotometer should be zeroed against

an ethanol (5.1.10) blank solution. Record absorbance and calculate concentration. Make fresh daily.

5.3.8 Vitamin D non-labelled purity standard solution, ρ ≈ 10 μg/ml. Pipette 1,0 ml of vitamin D

3 3

non-labelled stock standard solution (5.3.6) into a 100 ml volumetric flask. Make to volume with ethanol

(5.1.10). Measure the absorbance of an aliquot at 265 nm. The spectrophotometer should be zeroed against

an ethanol (5.1.10) blank solution. Record absorbance and calculate concentration. Make fresh daily.

5.3.9 Non-labelled working standard solution, ρ ≈ 1 μg/ml. Pipette 1,0 ml of vitamin D non-

labelled purity standard solution (5.3.7) and/or 1,0 ml of vitamin D non-labelled purity standard

solution (5.3.8) into a 10 ml volumetric flask. Make to volume with acetonitrile (5.1.14) and mix

thoroughly. Make fresh daily.
© ISO 2018 – All rights reserved 3
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ISO 20636:2018(E)
5.4 Calibration standard solutions

5.4.1 See Table 1 for nominal vitamin D concentrations of the calibration standard solutions. Make

fresh daily.

5.4.2 Calibration standard 1. Pipette 10 μl non-labelled working standard solution (5.3.9) and 250 μl

stable isotope labelled internal standard solution (5.3.4) into a 25 ml volumetric flask. Add 5 ml of

acetonitrile (5.1.14) and 75 µl of PTAD solution (5.2.1), shake to mix and leave in the dark for 5 min. Add

6,25 ml of water then make to volume with acetonitrile (5.1.14), mix, and transfer to HPLC vial ready for

analysis.

5.4.3 Calibration standard 2. Pipette 50 μl non-labelled working standard solution (5.3.9) and 250 μl

ntable isotope labelled internal standard solution (5.3.4) into a 25 ml volumetric flask. Add 5 ml of

acetonitrile (5.1.14) and 75 µl of PTAD solution (5.2.1), shake to mix and leave in the dark for 5 min. Add

6,25 ml of water then make to volume with acetonitrile (5.1.14), mix, and transfer to HPLC vial ready for

analysis.

5.4.4 Calibration standard 3. Pipette 250 μl non-labelled working standard solution (5.3.9) and

250 μl stable isotope labelled internal standard solution (5.3.4) into a 25 ml volumetric flask. Add 5 ml of

acetonitrile (5.1.14) and 75 µl of PTAD solution (5.2.1), shake to mix and leave in the dark for 5 min. Add

6,25 ml of water then make to volume with acetonitrile (5.1.14), mix, and transfer to HPLC vial ready for

analysis.

5.4.5 Calibration standard 4. Pipette 500 μl non-labelled working standard solution (5.3.9) and

250 μl stable isotope labelled internal standard solution (5.3.4) into a 25 ml volumetric flask. Add 5 ml of

acetonitrile (5.1.14) and 75 µl of PTAD solution (5.2.1), shake to mix and leave in the dark for 5 min. Add

6,25 ml of water then make to volume with acetonitrile (5.1.14), mix, and transfer to HPLC vial ready for

analysis.

5.4.6 Calibration standard 5. Pipette 1 250 μl non-labelled working standard solution (5.3.9) and

250 μl stable isotope labelled internal standard solution (5.3.4) into a 25 ml volumetric flask. Add 5 ml of

acetonitrile (5.1.14) and 75 µl of PTAD solution (5.2.1), shake to mix and leave in the dark for 5 min. Add

6,25 ml of water then make to volume with acetonitrile (5.1.14), mix, and transfer to HPLC vial ready for

analysis.
Table 1 — Nominal concentration of calibration standards
Concentration of vitamin D Concentration of d6-vitamin D
Calibration solution
ng/ml ng/ml
1 0,4 10
2 2,0 10
3 10 10
4 20 10
5 50 10
6 Apparatus
Usual laboratory glassware an equipment and, in particular, the following.

6.1 Ultra high performance liquid chromatography (UHPLC) system, consisting of dual pump

system, a sample injector unit, a degasser unit, and a column oven.

6.2 Triple quadrupole mass spectrometer, with sufficient sensitivity to detect and quantify vitamin

D in PTAD adduct at 0,4 ng/ml.
4 © ISO 2018 – All rights reserved
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ISO 20636:2018(E)

6.3 Solid core silica column, e.g. Phenomenex Kinetex C 2,6 μm, 2,1 mm × 50 mm, or equivalent.

6.4 Spectrophotometer, capable of digital readout to three decimal places.
6.5 Centrifuge tubes, polypropylene, 15 ml.
6.6 Boiling tubes, glass, 60 ml.
6.7 Water bath, 20 °C to 70 °C.
6.8 Disposable syringes, capacity 1 ml.
6.9 Syringe filters, PTFE, 0,2 µm, 13 mm.
6.10 Centrifuges, suitable for 60 ml boiling tubes, and 15 ml centrifuge tubes.
6.11 Pasteur pipettes, glass, ~140 mm.
6.12 Horizontal shaker.
6.13 Micro centrifuge tubes, 2 ml.
6.14 Filter membranes, 0,45 µm polyamide.
6.15 Cryogenic vials, 2 ml.
6.16 High performance liquid chromatography (HPLC) vials, septa, and caps.
7 Sample preparation
7.1 Powder sample preparation

Accurately weigh 1,8 g to 2,2 g of powder sample into a boiling tube. Record mass.

7.2 Slurry sample preparation

Accurately weigh 19,0 g to 21,0 g of powder to a disposable slurry container. Record mass.

Accurately weigh ~80 ml water to container. Record mass.

Shake thoroughly until mixed. Place in the dark at room temperature for 15 min and shake to mix

every 5 min.

Accurately weigh 9,5 g to 10,5 g of slurry or reconstituted powder sample into a boiling tube. Record mass.

7.3 Liquid sample preparation
Accurately weigh 10,0 ml of liquid milk into a boiling tube. Record mass.

1) This is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of

users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.

© ISO 2018 – All rights reserved 5
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ISO 20636:2018(E)
8 Procedure
8.1 Extraction and derivatisation

To powder, slurry, or liquid sample in a boiling tube, add 10 ml of ethanolic pyrogallol solution (5.2.3),

and 0,5 ml of stable isotope labelled internal standard solution (5.3.4), cap and vortex mix.

Add 2 ml of potassium hydroxide solution (5.2.2) to boiling tube, cap and vortex mix.

Place boiling tube in water bath at 70 °C for 1 h, vortex mix every 15 min.
Place boiling tube in water bath at room temperature until cool.

Add 10 ml of isooctane (5.1.12) to the boiling tube; cap boiling tube tightly and place on horizontal

shaker for 10 min.

Add 20 ml of water to boiling tube and invert tube 10 times; place in centrifuge at >250g for 15 min.

Transfer a 5 ml aliquot of the upper isooctane layer into a 15 ml centrifuge tube using a Pasteur pipette,

taking care not to transfer any of the lower layer (discard boiling tube with lower layer).

Add 5 ml of water to centrifuge tube, cap and vortex mix and place in centrifuge at 2 000g for 5 min.

Transfer 4 ml to 5 ml of upper isooctane layer to a new 15 ml disposable centrifuge tube using a

disposable pipette, taking care not to transfer any of the lower layer (discard centrifuge tube with

lower layer).

Add 75 µl of PTAD solution (5.2.1) to centrifuge tube, cap and immediately vortex mix.

Allow to stand in the dark for 5 min to allow for derivatization reaction to complete.

Add 1 ml acetonitrile to centrifuge tube, cap and vortex mix, place in centrifuge at 2 000g for 5 min.

Using a variable volume pipette, transfer 500 μl of the lower layer into a micro centrifuge tube (6.13)

taking care not to transfer any of the upper layer.
Add 167 µl of water to the micro centrifuge tube (6.13), cap and vortex mix.

Using a syringe filter, transfer an aliquot from the micro centrifuge tube (6.13) to an amber HPLC vial,

cap ready for analysis.
8.2 Chromatography

Form high pressure gradients by mixing the two mobile phases, A and B, using the procedure given in

Table 2. Information on expected retention times and product ion spectra are given in Annex A.

Table 2 — Gradient procedure for chromatographic separation
Time Flow rate Mobile phase A Mobile phase B
min ml/min % %
0 START 0,6 25 75
3,3 PUMP 0,6 0 100
3,7 PUMP 1,0 0 100
4,8 PUMP 1,0 0 100
4,9 PUMP 0,6 25 75
5,5 STOP 0,6 25 75
6 © ISO 2018 – All rights reserved
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ISO 20636:2018(E)
8.3 Mass spectrometry

Set up the mass spectrometer with the instrument setting shown in Table 3. These values are indicative

and need to be optimized for each instrument used. Examples of alternative instrument settings are

given in Annex C.
Table 3 — Mass spectrometer instrument settings
Instrument parameter Value
ionization mode ESI
curtain gas 207 kPa (30 psi)
nebulizer gas 277 kPa (40 psi)
heater gas 277 kPa (40 psi)
collision gas N
source temperature 300 °C
ion spray voltage 5 500 V

Settings are applicable to Sciex 6500 mass spectrometer. Sciex 6500 mass spectrometer is an example of a suitable product

available commercially. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an

endorsement by ISO of this product.
Compound specific parameters to be used are shown in Table 4 and Table 5.
Table 4 — Compound parameters (vitamin D instrument method only)
Precursor Dwell
Vitamin D ion Product ion DP EP CE CXP
ion time
m/z m/z V V V V ms
analyte quantifier 572,2 298,0 23 22 120
analyte qualifier 572,2 280,0 39 16 80
81 10
internal standard quantifier 578,2 298,0 23 22 120
internal standard qualifier 578,2 280,0 39 16 80
Key
DP: declustering potential
EP: entrance potential
CE: collision energy
CXP: collision cell exit potential

Analyte = vitamin D -PTAD adduct, Internal standard ion = d6-vitamin D -PTAD adduct.

2 2
© ISO 2018 – All rights reserved 7
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ISO 20636:2018(E)
Table 5 — Compound parameters (vitamin D instrument method only)
Precursor Dwell
Vitamin D ion Product ion DP EP CE CXP
ion time
m/z m/z V V V V ms
analyte quantifier 560,2 298,0 21 18 120
analyte qualifier 560,2 280,0 37 18 80
151 10
internal standard quantifier 566,2 298,0 21 18 120
internal standard qualifier 566,2 280,0 37 18 80
Key
DP: declustering potential
EP: entrance potential
CE: collision energy
CXP: collision cell exit potential

Analyte = vitamin D -PTAD adduct, Internal standard ion = d6-vitamin D -PTAD adduct.

3 3
9 Calculations

9.1 Calculate the concentration of d6-vitamin D in vitamin D stable isotope labelled stock standard

2 2
solution (5.3.2) using Formula (1):
SILD SS
2abs(mλ ax)
SILD SS = ×10000 (1)
2D2conc
1cm
where
SILD SS is the concentration of d6-vitamin D in stock standard (µg/ml);
2 D2conc 2
SILD SS is the UV absorbance of stock standard at 265 nm (1/cm);
2 abs(λmax)
is the extinction coefficient for vitamin D in ethanol [461] (dl/g.cm);
1cm
10 000 is the concentration conversion factor (g/dl to µg/ml).

9.2 Calculate the concentration of d6-vitamin D in vitamin D stable isotope labelled stock standard

3 3
solution (5.3.3) using Formula (2):
SILD SS
3abs(mλ ax)
SILD SS = ×10000 (2)
3D3conc
1cm
where
SILD SS is the concentration of d6-vitamin D in stock standard (µg/ml);
3 D3conc 3
SILD SS is the UV absorbance of stock standard at 265 nm (1/cm);
3 abs(λmax)
is the extinction coefficient for vitamin D in ethanol [485] (dl/g.cm);
1cm
10 000 is the concentration conversion factor (g/dl to µg/ml).
8 © ISO 2018 – All rights reserved
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 20636:2018(E)

9.3 Calculate the concentration of d6-vitamin D in stable isotope labelled internal standard solution

(5.3.4) using Formula (3):
1,0
SILIS=SILD SS ××1000 (3)
D2conc 2D2conc
where
SILIS is the concentration of d6-vitamin D in internal standard (ng/ml);
D2conc 2
SILD SS is the concentration of d6-vitamin D in stock standard (µg/ml);
2 D2conc 2
1 000 is the concentration conversion factor (µg/ml to ng/ml).

9.4 Calculate the concentration of d6-vitamin D in stable isotope labelled internal standard solution

(5.3.4) using Formula (4):
1,0
SILIS=SILD SS ××1000 (4)
D3conc 3D3conc
where
SILIS is the concentration of d6-vitamin D in internal standard (ng/ml);
D3conc 3
SILD SS is the concentration of d6-vitamin D in stock standard (µg/ml);
3 D3conc 3
1 000 is the concentration conversion factor (µg/ml to ng/ml).

9.5 Calculate the concentration of vitamin D in vitamin D non-labelled purity standard solution

2 2
(5.3.7) using Formula (5):
NLDPS
2abs(mλ ax)
NLDPS = ×10000 (5)
2D2conc
1cm
where
NLD PS is the concentration of vitam
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 20636
Première édition
2018-07
Formules infantiles et produits
nutritionnels pour adultes —
Détermination de la teneur en vitamine
D par chromatographie liquide couplée
à la spectrométrie de masse
Infant formula and adult nutritionals — Determination of vitamin D
by liquid chromatography-mass spectrometry
Numéro de référence
ISO 20636:2018(F)
ISO 2018
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 20636:2018(F)
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,

y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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Publié en Suisse
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ISO 20636:2018(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Réactifs et matériaux ....................................................................................................................................................................................... 2

5.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 2

5.2 Préparation du réactif ....................................................................................................................................................................... 2

5.3 Préparation de l’étalon ..................................................................................................................................................................... 3

5.4 Solutions d’étalonnage ..................................................................................................................................................................... 4

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 5

7 Préparation des échantillons .................................................................................................................................................................. 6

7.1 Préparation des échantillons de poudre ........................................................................................................................... 6

7.2 Préparation des échantillons de suspension ................................................................................................................ 6

7.3 Préparation des échantillons de liquide ........................................................................................................................... 6

8 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 6

8.1 Extraction et dérivatisation ......................................................................................................................................................... 6

8.2 Chromatographie .................................................................................................................................................................................. 7

8.3 Spectrométrie de masse .................................................................................................................................................................. 7

9 Calculs .............................................................................................................................................................................................................................. 9

10 Résultats .....................................................................................................................................................................................................................13

11 Fidélité .........................................................................................................................................................................................................................13

11.1 Généralités ...............................................................................................................................................................................................13

11.2 Répétabilité .............................................................................................................................................................................................13

11.3 Reproductibilité ..................................................................................................................................................................................14

Annex A (informative) Exemples de spectres et chromatogrammes ...............................................................................16

Annex B (informative) Données de fidélité .................................................................................................................................................19

Annex C (informative) Autres paramètres d’instrument .............................................................................................................21

Annex D (informative) Comparaison entre l’ISO 20636 et l’EN 12821 ..........................................................................22

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................24

© ISO 2018 – Tous droits réservés iii
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ISO 20636:2018(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/directives).

L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le Comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,

en collaboration avec l’AOAC INTERNATIONAL. Il est publié par l’ISO et séparément par l’AOAC

INTERNATIONAL. La méthode décrite dans le présent document est équivalente à la Méthode officielle

de l’AOAC 2016.05, Analysis of Vitamin D and Vitamin D in Fortified Milk Powders, Infant Formulas, and

2 3
Adult/Pediatric Nutritional Formulas.

Il convient d’adresser les commentaires ou questions portant sur le présent document à l’organisme

national de normalisation de l’utilisateur. Un référencement complet de ces organismes est disponible à

l’adresse www .iso .org/members .html.
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NORME INTERNATIONALE ISO 20636:2018(F)
Formules infantiles et produits nutritionnels pour
adultes — Détermination de la teneur en vitamine D par
chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de
masse

AVERTISSEMENT — L’utilisation de la présente méthode peut impliquer des matériaux, des

opérations et des équipements dangereux. La présente méthode n’a pas pour but de traiter

les problèmes de sécurité qui peuvent être liés à son utilisation. Il est de la responsabilité de

l’utilisateur de la présente méthode de mettre en place des pratiques appropriées en matière de

santé et de sécurité.
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie une méthode destinée à la détermination quantitative de la vitamine D

et/ou de la vitamine D dans les formules infantiles et les produits nutritionnels pour adultes sous

forme solide (à savoir les poudres) ou sous forme liquide (à savoir les liquides prêts à l’emploi et les

liquides concentrés) par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse. La plage

d’application s’étend de 0,15 µg/100 g (limite de quantification) à 59 µg/100 g pour la vitamine D , et de

0,25 µg/100 g à 65 µg/100 g pour la vitamine D .
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
3.1
produit nutritionnel pour adultes

aliment complet sur le plan nutritionnel, spécialement formulé, consommé sous forme liquide, pouvant

constituer la seule source d’alimentation, composé de n’importe quelle combinaison de lait, soja, riz,

lactosérum, protéine hydrolysée, amidon et acides aminés, avec et sans protéine intacte

3.2
formule infantile

substitut du lait maternel spécialement fabriqué pour satisfaire, par lui-même, les besoins nutritionnels

des nourrissons pendant les premiers mois de la vie jusqu’à l’introduction d’une alimentation

complémentaire appropriée
[SOURCE: NORME CODEX 72-1981]
© ISO 2018 – Tous droits réservés 1
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ISO 20636:2018(F)
4 Principe

Des échantillons sont saponifiés à haute température, puis les composants lipidiques solubles sont

extraits dans de l’isooctane. Une partie de la couche d’isooctane est transférée et lavée, puis une

aliquote de 4-phényl-1,2,4-triazoline-3,5-dione (PTAD) est ajoutée pour dérivatiser la vitamine D

afin de former un adduit facilement ionisable de masse moléculaire élevée. L’adduit de vitamine D est

ensuite de nouveau extrait dans un petit volume d’acétonitrile et analysé par chromatographie liquide

en phase inverse. La détection est réalisée par spectrométrie de masse en mode MRM (multiple reaction

monitoring). Des étalons internes de vitamine D -d6 et de vitamine D -d6 marquées par un isotope

2 3

stable sont utilisés pour la quantification afin de corriger les pertes d’extraction et toute variation

[2]
d’efficacité dans la dérivatisation et l’ionisation .
5 Réactifs et matériaux

Au cours de l’analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique

reconnue et de l’eau distillée ou déminéralisée ou de l’eau de pureté équivalente.

5.1 Généralités
5.1.1 Étalons, de pureté ≥ 99 %.
5.1.2 Vitamine D , ergocalciférol.
5.1.3 Vitamine D , cholécalciférol.
5.1.4 Vitamine D -d6, ergocalciférol 26,26,26,27,27,27-d6.
5.1.5 Vitamine D -d6, cholécalciférol 26,26,26,27,27,27-d6.
5.1.6 PTAD (4-phényl-1,2,4-triazoline-3,5-dione).
5.1.7 Acide formique (HCO H), de qualité CL-SM.
5.1.8 Hydroxyde de potassium (KOH).
5.1.9 Pyrogallol (C H (OH) ).
6 3 3
5.1.10 Éthanol (C H OH).
2 5
5.1.11 Méthanol (CH OH), de qualité CL-SM.
5.1.12 Isooctane ((CH ) CCH CH(CH ) ).
3 3 2 3 2
5.1.13 Acétone (CH COCH ).
3 3
5.1.14 Acétonitrile (CH CN), de qualité CL-SM.
5.2 Préparation du réactif

5.2.1 Solution de PTAD, c(4-phényl-1,2,4-triazoline-3,5-dione) = 10 mg/ml. Dissoudre 50 mg de PTAD

(5.1.6) dans 5,0 ml d’acétone (5.1.13).
2 © ISO 2018 – Tous droits réservés
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ISO 20636:2018(F)

5.2.2 Solution d’hydroxyde de potassium, c(KOH) = 8,9 mol/l. Dissoudre 100 g d’hydroxyde de

potassium (5.1.8) dans 200 ml d’eau.

5.2.3 Solution éthanolique de pyrogallol, c(C H (OH) ) = 0,079 mol/l. Dissoudre 5 g de pyrogallol

6 3 3
(5.1.9) dans 500 ml d’éthanol (5.1.10).

5.2.4 Phase mobile A, c(HCO H) = 0,026 5 mol/l. Ajouter 0,5 ml d’acide formique (5.1.7) à 500 ml d’eau.

5.2.5 Phase mobile B, méthanol, 500 ml (5.1.11).
5.3 Préparation de l’étalon

5.3.1 La vitamine D est sensible à la lumière. Réaliser toutes les étapes sous éclairage incandescent

de faible intensité. Si seule la vitamine D est exigée pour l’analyse, il n’est alors pas nécessaire d’utiliser

les étalons correspondant à la vitamine D , et inversement. Il convient de regrouper les solutions

d’étalonnage au début et à la fin d’un cycle d’analyse.

5.3.2 Solution étalon mère de vitamine D marquée par un isotope stable, ρ ≈ 10 μg/ml. Répartir

le contenu d’un flacon de 1 mg de vitamine D -d6 (5.1.4) dans une fiole jaugée de 100 ml. Dissoudre dans

90 ml d’éthanol (5.1.10). Pour favoriser la dissolution, passer au bain à ultrasons, le cas échéant. Mélanger

soigneusement, compléter au volume avec de l’éthanol (5.1.10). Mesurer l’absorbance d’une aliquote à

265 nm. Il convient de régler le zéro du spectrophotomètre à l’aide d’un blanc d’éthanol (5.1.10). Calculer

et consigner la teneur. Répartir immédiatement les aliquotes (~1,3 ml) dans des flacons cryogéniques et

les congeler à < –15 °C pendant une durée maximale de 6 mois.

5.3.3 Solution étalon mère de vitamine D marquée par un isotope stable, ρ ≈ 10 μg/ml. Répartir

le contenu d’un flacon de 1 mg de vitamine D -d6 (5.1.5) dans une fiole jaugée de 100 ml. Dissoudre dans

90 ml d’éthanol (5.1.10). Pour favoriser la dissolution, passer au bain à ultrasons, le cas échéant. Mélanger

soigneusement, compléter au volume avec de l’éthanol (5.1.10). Mesurer l’absorbance d’une aliquote à

265 nm. Il convient de régler le zéro du spectrophotomètre à l’aide d’un blanc d’éthanol (5.1.10). Calculer

et consigner la teneur. Répartir immédiatement les aliquotes (~1,3 ml) dans des flacons cryogéniques et

les congeler à < –15 °C pendant une durée maximale de 6 mois.

5.3.4 Solution étalon interne marquée par un isotope stable, ρ ≈ 1 μg/ml. En fonction du

nombre d’échantillons à analyser au cours d’un cycle, il est nécessaire de préparer un volume plus ou

moins important de solution étalon interne marquée par un isotope stable. Pour chaque ensemble de

15 échantillons (complet ou partiel) dans un cycle d’analyse, retirer 1 flacon de solution étalon mère de

vitamine D marquée par un isotope stable (5.3.2) et/ou 1 flacon de solution étalon mère de vitamine D

2 3

marquée par un isotope stable (5.3.3) du congélateur et les laisser réchauffer à température ambiante.

Prélever à la pipette 1,0 ml de solution étalon mère de vitamine D marquée par un isotope stable (5.3.2)

et/ou 1,0 ml de solution étalon mère de vitamine D marquée par un isotope stable (5.3.3) et les déposer

respectivement dans une fiole jaugée de 10 ml (utiliser une fiole jaugée de 10 ml séparée pour chaque

ensemble de 15 échantillons). Compléter chaque fiole jaugée de 10 ml au volume avec de l’acétonitrile,

regrouper les fioles et mélanger soigneusement. Renouveler la préparation chaque jour.

5.3.5 Solution étalon mère de vitamine D non marquée, ρ ≈ 1 mg/ml. Peser avec précision environ

50 mg de vitamine D (5.1.2) dans une fiole jaugée de 50 ml. Dissoudre dans 40 ml d’éthanol (5.1.10).

Pour favoriser la dissolution, passer au bain à ultrasons, le cas échéant. Mélanger soigneusement,

compléter au volume avec de l’éthanol (5.1.10). Conserver au congélateur à < –15 °C pendant une durée

maximale d’un mois.

5.3.6 Solution étalon mère de vitamine D non marquée, ρ ≈ 1 mg/ml. Peser avec précision environ

50 mg de vitamine D (5.1.3) dans une fiole jaugée de 50 ml. Dissoudre dans 40 ml d’éthanol (5.1.10).

Pour favoriser la dissolution, passer au bain à ultrasons, le cas échéant. Mélanger soigneusement,

© ISO 2018 – Tous droits réservés 3
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ISO 20636:2018(F)

compléter au volume avec de l’éthanol (5.1.10). Conserver au congélateur à < –15 °C pendant une durée

maximale d’un mois.

5.3.7 Solution étalon de pureté de vitamine D non marquée, ρ ≈ 10 μg/ml. Prélever à la pipette

1,0 ml de solution étalon mère de vitamine D non marquée (5.3.5) et la déposer dans une fiole jaugée de

100 ml. Compléter au volume avec de l’éthanol (5.1.10). Mesurer l’absorbance d’une aliquote à 265 nm.

Il convient de régler le zéro du spectrophotomètre à l’aide d’un blanc d’éthanol (5.1.10). Consigner

l’absorbance et calculer la teneur. Renouveler la préparation chaque jour.

5.3.8 Solution étalon de pureté de vitamine D non marquée, ρ ≈ 10 μg/ml. Prélever à la pipette

1,0 ml de solution étalon mère de vitamine D non marquée (5.3.6) et la déposer dans une fiole jaugée de

100 ml. Compléter au volume avec de l’éthanol (5.1.10). Mesurer l’absorbance d’une aliquote à 265 nm.

Il convient de régler le zéro du spectrophotomètre à l’aide d’un blanc d’éthanol (5.1.10). Consigner

l’absorbance et calculer la teneur. Renouveler la préparation chaque jour.

5.3.9 Solution étalon de travail non marquée, ρ ≈ 1 μg/ml. Prélever à la pipette 1,0 ml de solution étalon

de pureté de vitamine D non marquée (5.3.7) et/ou 1,0 ml de solution étalon de pureté de vitamine D non

2 3

marquée (5.3.8) et les déposer respectivement dans une fiole jaugée de 10 ml. Compléter au volume avec de

l’acétonitrile (5.1.14) et mélanger soigneusement. Renouveler la préparation chaque jour.

5.4 Solutions d’étalonnage

5.4.1 Voir Tableau 1 pour connaître les teneurs nominales en vitamine D des solutions d’étalonnage.

Renouveler la préparation chaque jour.

5.4.2 Solution d’étalonnage 1. Prélever à la pipette 10 µl de solution étalon de travail non marquée

(5.3.9) et 250 µl de solution étalon interne marquée par un isotope stable (5.3.4) et les déposer dans

une fiole jaugée de 25 ml. Ajouter 5 ml d’acétonitrile (5.1.14) et 75 µl de solution de PTAD (5.2.1), agiter

pour mélanger et laisser reposer dans l’obscurité pendant 5 min. Ajouter 6,25 ml d’eau, puis compléter

au volume avec de l’acétonitrile (5.1.14), mélanger et transférer dans le flacon pour CLHP prêt pour

l’analyse.

5.4.3 Solution d’étalonnage 2. Prélever à la pipette 50 µl de solution étalon de travail non marquée

(5.3.9) et 250 µl de solution étalon interne marquée par un isotope stable (5.3.4) et les déposer dans

une fiole jaugée de 25 ml. Ajouter 5 ml d’acétonitrile (5.1.14) et 75 µl de solution de PTAD (5.2.1), agiter

pour mélanger et laisser reposer dans l’obscurité pendant 5 min. Ajouter 6,25 ml d’eau, puis compléter

au volume avec de l’acétonitrile (5.1.14), mélanger et transférer dans le flacon pour CLHP prêt pour

l’analyse.

5.4.4 Solution d’étalonnage 3. Prélever à la pipette 250 µl de solution étalon de travail non marquée

(5.3.9) et 250 µl de solution étalon interne marquée par un isotope stable (5.3.4) et les déposer dans

une fiole jaugée de 25 ml. Ajouter 5 ml d’acétonitrile (5.1.14) et 75 µl de solution de PTAD (5.2.1), agiter

pour mélanger et laisser reposer dans l’obscurité pendant 5 min. Ajouter 6,25 ml d’eau, puis compléter

au volume avec de l’acétonitrile (5.1.14), mélanger et transférer dans le flacon pour CLHP prêt pour

l’analyse.

5.4.5 Solution d’étalonnage 4. Prélever à la pipette 500 µl de solution étalon de travail non marquée

(5.3.9) et 250 µl de solution étalon interne marquée par un isotope stable (5.3.4) et les déposer dans

une fiole jaugée de 25 ml. Ajouter 5 ml d’acétonitrile (5.1.14) et 75 µl de solution de PTAD (5.2.1), agiter

pour mélanger et laisser reposer dans l’obscurité pendant 5 min. Ajouter 6,25 ml d’eau, puis compléter

au volume avec de l’acétonitrile (5.1.14), mélanger et transférer dans le flacon pour CLHP prêt pour

l’analyse.

5.4.6 Solution d’étalonnage 5. Prélever à la pipette 1 250 µl de solution étalon de travail non marquée

(5.3.9) et 250 µl de solution étalon interne marquée par un isotope stable (5.3.4) et les déposer dans une

4 © ISO 2018 – Tous droits réservés
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ISO 20636:2018(F)

fiole jaugée de 25 ml. Ajouter 5 ml d’acétonitrile (5.1.15) et 75 µl de solution de PTAD (5.2.1), agiter

pour mélanger et laisser reposer dans l’obscurité pendant 5 min. Ajouter 6,25 ml d’eau, puis compléter

au volume avec de l’acétonitrile (5.1.15), mélanger et transférer dans le flacon pour CLHP prêt pour

l’analyse.
Tableau 1 — Teneur nominale des solutions d’étalonnage
Teneur en vitamine D Teneur en vitamine D-d6
Solution d’étalonnage
ng/ml ng/ml
1 0,4 10
2 2,0 10
3 10 10
4 20 10
5 50 10
6 Appareillage

Verrerie et équipement de laboratoire habituels et, en particulier, les éléments suivants.

6.1 Système de chromatographie liquide à ultra haute performance (CLUHP), composé d’un

système à double pompe, d’une unité d’injection d’échantillons, d’une unité de dégazage et d’un four

pour colonne.

6.2 Spectromètre de masse triple quadripôle, avec une sensibilité suffisante pour détecter et

quantifier la vitamine D dans l’adduit de PTAD à 0,4 ng/ml.

6.3 Colonne de silice à noyau solide, par exemple, colonnes Phenomenex Kinetex C 2,6 μm,

2,1 mm × 50 mm ou équivalent.
6.4 Spectrophotomètre, capable d’une lecture numérique à trois décimales.
6.5 Tubes à centrifuger, polypropylène, 15 ml.
6.6 Tubes à essai pour ébullition, verre, 60 ml.
6.7 Bain-marie, 20 °C à 70 °C.
6.8 Seringues jetables, capacité 1 ml.
6.9 Filtres seringue, PFTE, 0,2 µm, 13 mm.

6.10 Centrifugeuses, adaptées pour des tubes à essai pour ébullition de 60 ml et des tubes à centrifuger

de 15 ml.
6.11 Pipettes Pasteur, verre, ~140 mm.
6.12 Agitateur horizontal
6.13 Tubes de microcentrifugeuse, 2 ml.

1) Il s’agit d’un exemple de produit adapté et disponible dans le commerce. Cette information est donnée par souci

de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à

l’égard de ce produit.
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ISO 20636:2018(F)
6.14 Membranes filtres, 0,45 µm polyamide.
6.15 Flacons cryogéniques, 2 ml.

6.16 Flacons, septums et bouchons pour chromatographie liquide à haute performance (CLHP)

7 Préparation des échantillons
7.1 Préparation des échantillons de poudre

Peser avec précision 1,8 g à 2,2 g d’échantillon de poudre dans un tube à essai pour ébullition. Consigner

la masse.
7.2 Préparation des échantillons de suspension

Peser avec précision 19,0 g à 21,0 g de poudre dans un récipient pour suspension à usage unique.

Consigner la masse.
Peser avec précision ~80 ml d’eau dans le récipient. Consigner la masse.

Agiter soigneusement pour mélanger. Placer le récipient dans l’obscurité à température ambiante

pendant 15 min et agiter pour mélanger toutes les 5 min.

Peser avec précision 9,5 g à 10,5 g de suspension ou de poudre reconstituée dans un tube à essai pour

ébullition. Consigner la masse.
7.3 Préparation des échantillons de liquide

Peser avec précision 10,0 ml de lait liquide dans un tube à essai pour ébullition. Consigner la masse.

8 Mode opératoire
8.1 Extraction et dérivatisation

Dans un tube à essai pour ébullition, ajouter 10 ml de solution éthanolique de pyrogallol (5.2.3) et

0,5 ml de solution étalon interne marquée par un isotope stable (5.3.4) à l’échantillon de poudre, de

suspension ou de liquide; boucher et mélanger avec un agitateur de type vortex.

Ajouter 2 ml de solution d’hydroxyde de potassium (5.2.2) au tube à essai pour ébullition; boucher et

mélanger avec un agitateur de type vortex.

Placer le tube à essai pour ébullition dans le bain-marie à 70 °C pendant 1 h, mélanger avec un agitateur

de type vortex toutes les 15 min.

Placer le tube à essai pour ébullition dans le bain-marie à température ambiante jusqu’à ce qu’il ait

refroidi.

Ajouter 10 ml d’isooctane (5.1.12) au tube à essai pour ébullition; boucher le tube à essai pour ébullition

et le placer dans l’agitateur horizontal pendant 10 min.

Ajouter 20 ml d’eau au tube à essai pour ébullition et retourner le tube 10 fois; le placer dans la

centrifugeuse à ≥ 250 g pendant 15 min.

Transférer une aliquote de 5 ml de la couche supérieure d’isooctane dans un tube à centrifuger de 15 ml

à l’aide d’une pipette Pasteur en veillant à ne transférer aucun élément de la couche inférieure (jeter le

tube à essai pour ébullition avec la couche inférieure).
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Ajouter 5 ml d’eau au tube à centrifuger, boucher et mélanger avec un agitateur de type vortex, puis

placer dans la centrifugeuse à 2 000 g pendant 5 min.

Transférer 4 ml à 5 ml de la couche supérieure d’isooctane dans un nouveau tube à centrifuger jetable

de 15 ml à l’aide d’une pipette jetable en veillant à ne transférer aucun élément de la couche inférieure

(jeter le tube à centrifuger avec la couche inférieure).

Ajouter 75 µl de solution de PTAD (5.2.1) au tube à centrifuger, boucher et mélanger immédiatement

avec un agitateur de type vortex.

Laisser reposer dans l’obscurité pendant 5 min pour permettre une réaction complète de dérivatisation.

Ajouter 1 ml d’acétonitrile au tube à centrifuger, boucher et mélanger avec un agitateur de type vortex,

puis placer dans la centrifugeuse à 2 000 g pendant 5 min.

À l’aide d’une pipette à volume variable, transférer 500 µl de la couche inférieure dans un tube de micro-

centrifugeuse (6.13) en veillant à ne transférer aucun élément de la couche supérieure.

Ajouter 167 µl d’eau au tube de micro-centrifugeuse (6.13), boucher et mélanger avec un agitateur de

type vortex.

À l’aide d’un filtre seringue, transférer une aliquote du tube de micro-centrifugeuse (6.13) dans un

flacon ambre pour CLHP avec bouchon, prêt pour l’analyse.
8.2 Chromatographie

Former des gradients de haute pression en mélangeant les deux phases mobiles, A et B, selon le mode

opératoire fourni dans le Tableau 2. Des informations sur les temps de rétention prévus et les spectres

des ions produits sont données dans l’Annexe A.
Tableau 2 — Mode opératoire du gradient pour la séparation chromatographique
Temps Débit Phase mobile A Phase mobile B
min ml/min % %
0 DÉMARRAGE 0,6 25 75
3,3 POMPE 0,6 0 100
3,7 POMPE 1,0 0 100
4,8 POMPE 1,0 0 100
4,9 POMPE 0,6 25 75
5,5 ARRÊT 0,6 25 75
8.3 Spectrométrie de masse

Configurer le spectromètre de masse avec le paramétrage d’instrument correspondant indiqué dans le

Tableau 3. Ces valeurs sont fournies à titre indicatif; il est donc nécessaire de les optimiser pour chaque

instrument utilisé. Des exemples d’autres paramètres d’instrument sont donnés dans l’Annexe C.

Tableau 3 — Paramètres du spectromètre de masse
Paramètre d’instrument Valeur
mode ionisation ESI
gaz rideau 207 kPa (30 psi)
gaz de nébulisation 277 kPa (40 psi)
Ces par
...

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