ISO 14501:2021

Milk and milk powder — Determination of aflatoxin M1 content — Clean-up by immunoaffinity chromatography and determination by high-performance liquid chromatography

This document specifies a method for the determination of aflatoxin M1 content in milk and milk powder. The lowest level of validation is 0,08 µg/kg for whole milk powder, i.e. 0,008 µg/l for reconstituted liquid milk. The limit of detection (LOD) is 0,05 μg/kg for milk powder and 0,005 μg/kg for liquid milk. The limit of quantification (LOQ) is 0,1 μg/kg for milk powder and 0,01 μg/kg for liquid milk. The method is also applicable to low-fat milk, skimmed milk, low-fat milk powder and skimmed milk powder.

Lait et lait en poudre — Détermination de la teneur en aflatoxine M1 — Purification par chromatographie d'immunoaffinité et détermination par chromatographie en phase liquide à haute performance

Le présent document spécifie une méthode pour le dosage de l’aflatoxine M1 dans le lait et le lait en poudre. Le niveau de validation le plus bas est de 0,08 µg/kg de poudre de lait entier, ce qui correspond à 0,008 µg/l de lait liquide reconstitué. La limite de détection (LOD) est de 0,05 μg/kg pour le lait en poudre et de 0,005 μg/kg pour le lait liquide. La limite de quantification (LOQ) est de 0,1 μg/kg pour le lait en poudre et de 0,01 μg/kg pour le lait liquide. La méthode est également applicable au lait à faible teneur en matière grasse, au lait écrémé et au lait en poudre à faible teneur en matière grasse ou écrémé.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 10-May-2021
• ICS: 67.100.10 - Milk and processed milk products
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Current Stage: 6060 - International Standard published
• Start Date: 11-May-2021
• Due Date: 26-May-2020
• Completion Date: 11-May-2021

Relations

• Revises: ISO 14501:2007 - Milk and milk powder — Determination of aflatoxin M1 content — Clean-up by immunoaffinity chromatography and determination by high-performance liquid chromatography
• Effective Date: 24-Feb-2018

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14501
IDF 171
Third edition
2021-05
Milk and milk powder —
Determination of aflatoxin M content
1
— Clean-up by immunoaffinity
chromatography and determination
by high-performance liquid
chromatography
Lait et lait en poudre — Détermination de la teneur en aflatoxine
M — Purification par chromatographie d'immunoaffinité et
1
détermination par chromatographie en phase liquide à haute
performance
Reference numbers
ISO 14501:2021(E)
IDF 171:2021(E)
©
ISO and IDF 2021

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IDF 171:2021(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
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IDF 171:2021(E)
Contents Page
Forewords .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents . 2
6 Apparatus . 4
7 Sampling . 5
8 Procedure. 5
8.1 General . 5
8.2 Preparation of test samples . 5
8.2.1 Milk . 5
8.2.2 Milk powder . 5
8.3 Immunoaffinity column preparation . 6
8.4 Test sample purification . 6
8.5 High performance liquid chromatography (HPLC) . 6
8.5.1 Pump setting. 6
8.5.2 Chromatographic performance . 6
8.5.3 Calibration curve of aflatoxin M . 7
1
8.5.4 Analysis of the purified extracts and injection scheme . 7
9 Calculation and expression of results . 7
9.1 Skimmed milk . 7
9.1.1 Calculation . 7
9.1.2 Expression of results . 7
9.2 Skimmed milk powder . 8
9.2.1 Calculation . 8
9.2.2 Expression of results . 8
10 Precision . 8
10.1 Interlaboratory test. 8
10.2 Repeatability . 8
10.3 Reproducibility . 8
11 Test report . 9
Annex A (informative) Results of an interlaboratory trial .10
Bibliography .11
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IDF 171:2021(E)
Forewords
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national
standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally
carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented on that committee.
International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part
in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with the European
Committee for Standardization (CEN) Technical Committee CEN/TC 302, Milk and milk products -
Methods of sampling and analysis, in accordance with the Agreement on technical cooperation between
ISO and CEN (Vienna Agreement). It is being published jointly by ISO and IDF.
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 14501 | IDF 171:2007), which has been
technically revised. The main changes compared with the previous edition are as follows:
— the lack of detailed explanation in some clauses was leading to variability in the way the method
was executed from one laboratory to another. Practical information from skilled end users familiar
with routine analysis using this protocol was taken into account in this revision to clarify those
ambiguous clauses.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
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IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the
interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National
Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national
interest groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and
governments/food control authorities.
ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis
and sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International
Standards using the logos and reference numbers of both organizations.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
This document was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Additives and
Contaminants and ISO Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk
products. It is being published jointly by ISO and IDF.
The work was carried out by the IDF-ISO Action Team on A12 of the Standing Committee on Analytical
Methods for Additives and Contaminants under the aegis of its project leader Mr Paul Jamieson.
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ISO 14501:2021(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 171:2021(E)
Milk and milk powder — Determination of aflatoxin M
1
content — Clean-up by immunoaffinity chromatography
and determination by high-performance liquid
chromatography
CAUTION 1 — The method described in this document requires the use of solutions of
aflatoxin M . Aflatoxins are carcinogenic to humans. Attention is drawn to the statement made
1
[1][2]
by the International Agency for Research on Cancer (WHO) .
CAUTION 2 — Adequately protect the laboratory in which the analyses are performed from
daylight and keep aflatoxin M standard solutions protected from light, e.g. by using aluminium
1
foil.
CAUTION 3 — The use of non-acid-washed glassware (e.g. tubes, vials, flasks, beakers, syringes)
for aqueous aflatoxin solutions can cause loss of aflatoxin M . Moreover, brand new laboratory
1
glassware, before coming into contact with aqueous solutions of aflatoxin M , should be soaked
1
in dilute acid (e.g. sulfuric acid, c = 2 mol/l) for several hours, then rinsed well with distilled
water to remove all traces of acid (check to ensure pH is in the range 6 to 8).
CAUTION 4 — Use decontamination procedures for laboratory wastes such as solid compounds,
solutions in organic solvents, aqueous solutions and spills, and for glassware coming into contact
with carcinogenic materials. Suitable decontamination procedures have been developed and
[1][2]
validated by the International Agency for Research on Cancer (WHO) .
1 Scope
This document specifies a method for the determination of aflatoxin M content in milk and milk powder.
1
The lowest level of validation is 0,08 µg/kg for whole milk powder, i.e. 0,008 µg/l for reconstituted
liquid milk. The limit of detection (LOD) is 0,05 μg/kg for milk powder and 0,005 μg/kg for liquid milk.
The limit of quantification (LOQ) is 0,1 μg/kg for milk powder and 0,01 μg/kg for liquid milk.
The method is also applicable to low-fat milk, skimmed milk, low-fat milk powder and skimmed milk
powder.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
3.1
aflatoxin M content
1
concentration or mass fraction of substances determined by the procedure specified in this document
Note 1 to entry: Concentration is expressed in μg/l and mass fraction is expressed in in μg/kg.
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IDF 171:2021(E)
4 Principle
Aflatoxin M is extracted by passing the test portion through an immunoaffinity column that contains
1
specific antibodies bound onto a solid support material.
As the sample passes through the column, the antibodies are selectively bound with any aflatoxin M
1
(antigen) present and form an antibody-antigen complex. All other components of the sample matrix
are washed off the column with water. Then aflatoxin M is eluted from the column and the eluate is
1
collected. The amount of aflatoxin M present in this eluate is determined by means of high-performance
1
liquid chromatography (HPLC) coupled with fluorimetric detection.
5 Reagents
During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and
distilled or demineralized water or water of equivalent purity.
5.1 Immunoaffinity column.
The immunoaffinity column shall contain antibodies against aflatoxin M . The column shall have a
1
maximum capacity of not less than 100 ng of aflatoxin M (which corresponds to 2 µg/l when a volume
1
of 50 ml of a test portion is applied). It shall give a recovery of not less than 80 % for aflatoxin M when
1
a standard solution containing 4 ng of toxin is applied (which corresponds to 80 ng/l when a volume
of 50 ml of sample is applied). Any immunoaffinity column meeting the performance specifications
1)
mentioned above can be used.
The performance of the columns shall be checked regularly and at least once for every batch of columns.
The procedure is as follows.
a) Capacity check:
1) dilute 2,0 ml of aflatoxin M standard stock solution (5.4.2) to 50 ml with water;
1
2) mix well and apply the whole volume to the immunoaffinity column, carefully following the
recommendations given by the manufacturer for the use of columns;
3) wash the column and elute the toxin;
4) determine the amount of aflatoxin M eluted from the column by HPLC after preparing a
1
suitable dilution of the final eluate;
5) calculate the capacity for the aflatoxin;
6) compare the result with the requirements given above.
b) Recovery check:
1) use a pipette (6.4) to dilute 0,8 ml of aflatoxin M standard working solution of 0,005 µg/ml
1
(5.4.3) to 50 ml with water;
2) mix well and apply the whole volume to the immunoaffinity column, carefully following the
recommendations given by the manufacturer for the use of columns;
3) wash the column and elute the toxin;
4) determine the amount of aflatoxin M eluted from the column by HPLC after preparing a
1
suitable dilution of the final eluate;
® ®
1) Examples of immuno affinity columns: Afla Test P Vicam , Aflaprep M R-Biopharm. Similar products are
® ® ®
also available from Romer Labs , Bioo Scientific and Neogen . These products are examples of suitable products
available commercially. This information is given for the convenience of users of this document and does not
constitute an endorsement by ISO and/or IDF of these products.
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5) calculate the recovery for the aflatoxin;
6) compare the result with the requirements given above. The concentration shall not be less
than 0,064 μg/l. Recovery checks can also be conducted with commercially available reference
materials.
5.2 Acetonitrile, pure, HPLC grade.
5.2.1 Acetonitrile solution, volume fraction of 25 % in water.
Add 250 ml of acetonitrile (5.2) to 750 ml of water and mix.
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 14501
FIL 171
Troisième édition
2021-05
Lait et lait en poudre — Détermination
de la teneur en aflatoxine M —
1
Purification par chromatographie
d'immunoaffinité et détermination
par chromatographie en phase liquide
à haute performance
Milk and milk powder — Determination of aflatoxin M content —
1
Clean-up by immunoaffinity chromatography and determination by
high-performance liquid chromatography
Numéros de référence
ISO 14501:2021(F)
FIL 171:2021(F)
©
ISO et FIL 2021

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FIL 171:2021(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO et FIL 2021
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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FIL 171:2021(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 4
7 Échantillonnage . 5
8 Mode opératoire. 5
8.1 Généralités . 5
8.2 Préparation des échantillons pour essai . 5
8.2.1 Lait . 5
8.2.2 Lait en poudre . 6
8.3 Préparation de la colonne d’immunoaffinité . 6
8.4 Purification de l’échantillon pour essai . 6
8.5 Chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) . 7
8.5.1 Réglage de la pompe . 7
8.5.2 Performances chromatographiques . 7
8.5.3 Courbe d’étalonnage de l’aflatoxine M . 7
1
8.5.4 Analyse des extraits purifiés et programme d’injection . 7
9 Calcul et expression des résultats . 8
9.1 Lait écrémé . 8
9.1.1 Calcul . 8
9.1.2 Expression des résultats . 8
9.2 Poudre de lait écrémé . 8
9.2.1 Calcul . 8
9.2.2 Expression des résultats . 8
10 Fidélité . 8
10.1 Essai interlaboratoires . 8
10.2 Répétabilité . 9
10.3 Reproductibilité . 9
11 Rapport d’essai . 9
Annexe A (informative) Résultats d’un essai interlaboratoires .10
Bibliographie .11
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FIL 171:2021(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale du lait (FIL), en collaboration avec
le comité technique CEN/TC 302, Lait et produits laitiers - Méthodes d’échantillonnage et d’analyse, du
Comité européen de normalisation (CEN), conformément à l’Accord de coopération technique entre
l’ISO et le CEN (Accord de Vienne). Il est publié conjointement par l’ISO et la FIL.
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 14501 | FIL 171:2007), qui a fait
l’objet d’une révision technique. Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont
les suivantes:
— le manque d’explications détaillées dans certains articles conduisait à une variabilité de la manière
d’exécuter la méthode d’un laboratoire à l’autre. Des informations pratiques fournies par des
utilisateurs finals qualifiés connaissant bien l’analyse de routine et utilisant ce protocole ont été
prises en compte lors de la révision afin de clarifier ces articles ambigus.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
iv © ISO et FIL 2021 – Tous droits réservés

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ISO 14501:2021(F)
FIL 171:2021(F)
La FIL (Fédération internationale du lait) est une organisation privée à but non lucratif qui représente
les intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres de la FIL sont
organisés en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de représentants de
groupes d’intérêt nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des producteurs laitiers, des
acteurs de l’industrie de transformation des produits laitiers, des fournisseurs de produits laitiers, des
universitaires et des représentants des gouvernements/autorités chargées du contrôle des aliments.
L’ISO et la FIL collaborent étroitement à toutes les activités de normalisation concernant les méthodes
d’analyse et d’échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL publient
conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et les numéros de référence des deux
organisations.
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Le présent document a été élaboré par le Comité permanent chargé des Méthodes d’analyse des additifs
et contaminants (SCAMC) de la Fédération internationale du lait (FIL) et le comité technique ISO/TC 34,
Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Il est publié conjointement par l’ISO et la
FIL.
L’ensemble des travaux a été confié à l’équipe d’action mixte ISO-FIL (A12) du Comité permanent
chargé des Méthodes d’analyse des additifs et contaminants, sous la conduite de son chef de projet,
monsieur Paul Jamieson.
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ISO 14501:2021(F)
NORME INTERNATIONALE
FIL 171:2021(F)
Lait et lait en poudre — Détermination de la teneur
en aflatoxine M — Purification par chromatographie
1
d'immunoaffinité et détermination par chromatographie
en phase liquide à haute performance
AVERTISSEMENT 1 — La méthode décrite dans le présent document nécessite l’utilisation de
solutions d’aflatoxine M . Les aflatoxines sont cancérigènes pour l’homme. L’attention est attirée
1
[1][2]
sur les recommandations du Centre international de Recherche sur le Cancer de l’OMS .
AVERTISSEMENT 2 — Protéger correctement de la lumière du jour le laboratoire dans lequel
sont effectuées les analyses et conserver les solutions étalons d’aflatoxine M à l’abri de la
1
lumière, par exemple à l’aide d’une feuille d’aluminium.
AVERTISSEMENT 3 — L’utilisation d’une verrerie pour les solutions aqueuses d’aflatoxine
(par exemple tubes, flacons, ballons et fioles, béchers, seringues) lavée avec des produits non
acides peut provoquer une perte d’aflatoxine M . De plus, il convient de laisser tremper pendant
1
plusieurs heures dans de l’acide dilué (par exemple de l’acide sulfurique à c = 2 mol/l) la verrerie
neuve de laboratoire entrant en contact avec les solutions aqueuses d’aflatoxine M , puis de la
1
rincer à l’eau distillée afin de retirer toute trace d’acide (vérifier que le pH se situe entre 6 et 8).
AVERTISSEMENT 4 — Utiliser des méthodes de décontamination pour les déchets de laboratoire,
tels que les composés solides, les solutions dans des solvants organiques, les solutions aqueuses
et de déversement, ainsi que pour la verrerie en contact avec des matériaux cancérigènes.
Des méthodes de décontamination adaptées ont été mises au point et validées par le Centre
[1][2]
international de Recherche sur le Cancer de l’OMS .
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode pour le dosage de l’aflatoxine M dans le lait et le lait en
1
poudre. Le niveau de validation le plus bas est de 0,08 µg/kg de poudre de lait entier, ce qui correspond
à 0,008 µg/l de lait liquide reconstitué. La limite de détection (LOD) est de 0,05 μg/kg pour le lait en
poudre et de 0,005 μg/kg pour le lait liquide. La limite de quantification (LOQ) est de 0,1 μg/kg pour le
lait en poudre et de 0,01 μg/kg pour le lait liquide.
La méthode est également applicable au lait à faible teneur en matière grasse, au lait écrémé et au lait en
poudre à faible teneur en matière grasse ou écrémé.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
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ISO 14501:2021(F)
FIL 171:2021(F)
3.1
teneur en aflatoxine M
1
concentration ou fraction massique de substances, déterminée selon le mode opératoire spécifié dans
le présent document
Note 1 à l'article: La concentration est exprimée en μg/l et la fraction massique en μg/kg.
4 Principe
L’aflatoxine M est extraite par passage de la prise d’essai à travers une colonne d’immunoaffinité qui
1
contient des anticorps spécifiques fixés sur un support solide.
Au fur et à mesure que l’échantillon traverse la colonne, les anticorps se lient de manière sélective à
toute aflatoxine M (antigène) présente et constituent un complexe anticorps-antigène. Tous les
1
autres composants de la matrice échantillon sont éliminés de la colonne avec de l’eau. L’aflatoxine M
1
est ensuite éluée de la colonne et l’éluat recueilli. La quantité d’aflatoxine M présente dans l’éluat est
1
déterminée par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) associée à une détection
fluorimétrique.
5 Réactifs
Au cours de l’analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique
reconnue et de l’eau distillée ou déminéralisée ou de l’eau de pureté équivalente.
5.1 Colonne d’immunoaffinité.
La colonne d’immunoaffinité doit contenir des anticorps antiaflatoxine M . Sa capacité ne doit pas
1
être inférieure à 100 ng d’aflatoxine M (ce qui correspond à 2 µg/l pour une prise d’essai de 50 ml).
1
Son taux de récupération ne doit pas être inférieur à 80 % d’aflatoxine M en cas d’utilisation d’une
1
solution étalon contenant 4 ng de toxine (ce qui correspond à 80 ng/l pour un échantillon de 50 ml).
Toute colonne d’immunoaffinité répondant aux spécifications de performance susmentionnées peut
1)
être utilisée .
Les performances des colonnes doivent être contrôlées régulièrement et au moins une fois pour chaque
lot de colonnes. La procédure est la suivante.
a) Contrôle de la capacité:
1) diluer 2,0 ml de solution mère d’aflatoxine M (5.4.2) à 50 ml avec de l’eau;
1
2) bien mélanger et verser la totalité du volume dans la colonne d’immunoaffinité en suivant
soigneusement les recommandations données par le fabricant pour l’utilisation des colonnes;
3) laver la colonne et éluer la toxine;
4) déterminer la quantité d’aflatoxine M éluée de la colonne par CLHP après avoir préparé la
1
dilution appropriée de l’éluat final;
5) calculer la capacité d’aflatoxine;
® ®
1) Exemples de colonnes d’immunoaffinité: Afla Test P Vicam , Aflaprep M R-Biopharm. Des produits similaires
® ® ®
sont également disponibles auprès de Romer Labs , Bioo Scientific et Neogen . Ces produits sont des exemples
de produits appropriés disponibles dans le commerce. Ces informations sont données par souci de commodité à
l’intention des utilisateurs du présent document et ne sauraient constituer un engagement de l’ISO et/ou de la FIL à
l’égard de ces produits.
2 © ISO et FIL 2021 – Tous droits réservés

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ISO 14501:2021(F)
FIL 171:2021(F)
6) comparer le résultat aux exigences données ci-dessus.
b) Contrôle du taux de récupération:
1) à l’aide d’une pipette (6.4), diluer 0,8 ml de la solution étalon de travail d’aflatoxine M à
1
0,005 µg/ml (5.4.3) à 50 ml avec de l’eau;
2) bien mélanger et verser la totalité du volume dans la colonne d’immunoaffinité en suivant
soigneusement les recommandations données par le fabricant pour l’utilisation des colonnes;
3) laver la colonne et éluer la toxine;
4) déterminer la quantité d’aflatoxine M éluée de la colonne par CLHP après avoir préparé la
1
dilution appropriée de l’éluat final;
5) calculer le taux de récupération d’aflatoxine;
6) comparer le résultat aux exigences données ci-dessus. La concentration ne doit pas être
inférieure à 0,064 μg/l. Les contrôles du taux de récupération peuvent également être réalisés
avec des matériaux de référence disponibles dans le commerce.
5.2 Acétonitrile, pur, qualité pour CLHP.
5.2.1 Solution d’acétonitrile, fraction volumique de 25 % dans l’eau.
Ajouter 250 ml d’acétonitrile (5.2) à 750 ml d’eau e
...

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14501
IDF 171
Third edition
Milk and milk powder —
Determination of aflatoxin M1 content
— Clean-up by immunoaffinity
chromatography and determination
by high-performance liquid
chromatography
Lait et lait en poudre — Détermination de la teneur en aflatoxine
M — Purification par chromatographie d'immunoaffinité et
1
détermination par chromatographie en phase liquide à haute
performance
PROOF/ÉPREUVE
Reference numbers
ISO 14501:2021(E)
IDF 171:2021(E)
©
ISO and IDF 2021

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ISO 14501:2021(E)
IDF 171:2021(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO and IDF 2021
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
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below or ISO’s member body in the country of the requester.
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CP 401 • Ch. de Blandonnet 8 Silver Building • Bd Auguste Reyers 70/B
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Website: www.iso.org Website: www.fil-idf.org
Published in Switzerland
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ISO 14501:2021(E)
IDF 171:2021(E)
Contents Page
Forewords .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents . 2
6 Apparatus . 4
7 Sampling . 5
8 Procedure. 5
8.1 General . 5
8.2 Preparation of test samples . 5
8.2.1 Milk . 5
8.2.2 Milk powder . 5
8.3 Immunoaffinity column preparation . 6
8.4 Test sample purification . 6
8.5 High performance liquid chromatography (HPLC) . 6
8.5.1 Pump setting. 6
8.5.2 Chromatographic performance . 6
8.5.3 Calibration curve of aflatoxin M .
1 7
8.5.4 Analysis of the purified extracts and injection scheme . 7
9 Calculation and expression of results . 7
9.1 Skimmed milk . 7
9.1.1 Calculation . 7
9.1.2 Expression of results . 7
9.2 Skimmed milk powder . 8
9.2.1 Calculation . 8
9.2.2 Expression of results . 8
10 Precision . 8
10.1 Interlaboratory test. 8
10.2 Repeatability . 8
10.3 Reproducibility . 8
11 Test report . 8
Annex A (informative) Results of an interlaboratory trial .10
Bibliography .11
© ISO and IDF 2021 – All rights reserved PROOF/ÉPREUVE iii

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ISO 14501:2021(E)
IDF 171:2021(E)
Forewords
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national
standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally
carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented on that committee.
International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part
in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with the European
Committee for Standardization (CEN) Technical Committee CEN/TC 302, Milk and milk products —
Methods of sampling and analysis, in accordance with the Agreement on technical cooperation between
ISO and CEN (Vienna Agreement). It is being published jointly by ISO and IDF.
This third edition cancels and replaces the first edition (ISO/DIS 14501 | IDF 171:2007), which has been
technically revised. The main changes compared with the previous edition are as follows:
— the lack of detailed explanation in some clauses was leading to variability in the way the method
was executed from one laboratory to another. Practical information from skilled end users familiar
with routine analysis using this protocol was taken into account in this revision to clarify those
ambiguous clauses.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
iv PROOF/ÉPREUVE © ISO and IDF 2021 – All rights reserved

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ISO 14501:2021(E)
IDF 171:2021(E)
IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the
interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National
Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national
interest groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and
governments/food control authorities.
ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis
and sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International
Standards using the logos and reference numbers of both organizations.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
This document was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Composition and
ISO Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is
being published jointly by ISO and IDF.
The work was carried out by the IDF-ISO Action Team on A12 of the Standing Committee on Analytical
Methods for Composition under the aegis of its project leader Mr Paul Jamieson.
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ISO 14501:2021(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 171:2021(E)
Milk and milk powder — Determination of aflatoxin M1
content — Clean-up by immunoaffinity chromatography
and determination by high-performance liquid
chromatography
CAUTION 1 — The method described in this document requires the use of solutions of
aflatoxin M . Aflatoxins are carcinogenic to humans. Attention is drawn to the statement made
1
[1][2]
by the International Agency for Research on Cancer (WHO) .
CAUTION 2 — Adequately protect the laboratory in which the analyses are performed
from daylight and keep aflatoxin M standard solutions protected from light, e.g. by using
1
aluminium foil.
CAUTION 3 — The use of non-acid-washed glassware (e.g. tubes, vials, flasks, beakers, syringes)
for aqueous aflatoxin solutions can cause loss of aflatoxin M . Moreover, brand new laboratory
1
glassware, before coming into contact with aqueous solutions of aflatoxin M , should be soaked
1
in dilute acid (e.g. sulfuric acid, c = 2 mol/l) for several hours, then rinsed well with distilled
water to remove all traces of acid (check to ensure pH is in the range 6 to 8).
CAUTION 4 — Use decontamination procedures for laboratory wastes such as solid compounds,
solutions in organic solvents, aqueous solutions and spills, and for glassware coming into contact
with carcinogenic materials. Suitable decontamination procedures have been developed and
[1][2]
validated by the International Agency for Research on Cancer (WHO) .
1 Scope
This document specifies a method for the determination of aflatoxin M content in milk and milk powder.
1
The lowest level of validation is 0,08 µg/kg for whole milk powder, i.e. 0,008 µg/l for reconstituted
liquid milk. The limit of detection (LOD) is 0,05 μg/kg for milk powder and 0,005 μg/kg for liquid milk.
The limit of quantification (LOQ) is 0,1 μg/kg for milk powder and 0,01 μg/kg for liquid milk.
The method is also applicable to low-fat milk, skimmed milk, low-fat milk powder and skimmed
milk powder.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
3.1
aflatoxin M content
1
concentration or mass fraction of substances determined by the procedure specified in this document
Note 1 to entry: Concentration is expressed in μg/l and mass fraction is expressed in in μg/kg.
© ISO and IDF 2021 – All rights reserved PROOF/ÉPREUVE 1

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ISO 14501:2021(E)
IDF 171:2021(E)
4 Principle
Aflatoxin M is extracted by passing the test portion through an immunoaffinity column that contains
1
specific antibodies bound onto a solid support material.
As the sample passes through the column, the antibodies are selectively bound with any aflatoxin M
1
(antigen) present and form an antibody-antigen complex. All other components of the sample matrix
are washed off the column with water. Then aflatoxin M is eluted from the column and the eluate is
1
collected. The amount of aflatoxin M present in this eluate is determined by means of high-performance
1
liquid chromatography (HPLC) coupled with fluorimetric detection.
5 Reagents
During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and
distilled or demineralized water or water of equivalent purity.
5.1 Immunoaffinity column.
The immunoaffinity column shall contain antibodies against aflatoxin M . The column shall have a
1
maximum capacity of not less than 100 ng of aflatoxin M (which corresponds to 2 µg/l when a volume
1
of 50 ml of a test portion is applied). It shall give a recovery of not less than 80 % for aflatoxin M when
1
a standard solution containing 4 ng of toxin is applied (which corresponds to 80 ng/l when a volume
of 50 ml of sample is applied). Any immunoaffinity column meeting the performance specifications
1)
mentioned above can be used.
The performance of the columns shall be checked regularly and at least once for every batch of columns.
The procedure is as follows.
a) Capacity check:
1) dilute 2,0 ml of aflatoxin M standard stock solution (5.4.2) to 50 ml with water;
1
2) mix well and apply the whole volume to the immunoaffinity column, carefully following the
recommendations given by the manufacturer for the use of columns;
3) wash the column and elute the toxin;
4) determine the amount of aflatoxin M eluted from the column by HPLC after preparing a
1
suitable dilution of the final eluate;
5) calculate the capacity for the aflatoxin;
6) compare the result with the requirements given above.
b) Recovery check:
1) use a pipette (6.4) to dilute 0,8 ml of aflatoxin M standard working solution of 0,005 µg/ml
1
(5.4.3) to 50 ml with water;
2) mix well and apply the whole volume to the immunoaffinity column, carefully following the
recommendations given by the manufacturer for the use of columns;
3) wash the column and elute the toxin;
4) determine the amount of aflatoxin M eluted from the column by HPLC after preparing a
1
suitable dilution of the final eluate;
® ®
1) Examples of immuno affinity columns: Afla Test P Vicam , Aflaprep M R-Biopharm. Similar products are
® ® ®
also available from Romer Labs , Bioo Scientific and Neogen . These products are examples of suitable products
available commercially. This information is given for the convenience of users of this document and does not
constitute an endorsement by ISO and/or IDF of these products.
2 PROOF/ÉPREUVE © ISO and IDF 2021 – All rights reserved

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ISO 14501:2021(E)
IDF 171:2021(E)
5) calculate the recovery for the aflatoxin;
6) compare the result with the requirements given above. The concentration shall not be less
than 0,064 μg/l. Recovery checks can also be conducted with commercially available reference
materials.
5.2 Acetonitrile, pure, HPLC grade.
5.2.1 Acetonitrile solution, volume fraction of 25 % in water.
Add 250 ml of acetonitrile (5.2) to 750 ml of water and mix. Other volumes in the same proportion
...