ISO 4831:1991
(Main)Microbiology — General guidance for the enumeration of coliforms — Most probable number technique
Microbiology — General guidance for the enumeration of coliforms — Most probable number technique
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 4831:1978). It is intended to provide general guidance for the examination of products not dealt with by existing International Standards. These guidelines may not be appropriate for some products in every detail, and for some other products it may be necessary to use different methods. The technique described here is less precise than that described in ISO 4832. Gives references, and the definition of the term coliforms. Specifies principle, culture media and dilution fluid, apparatus and glassware, sampling, preparation of the test sample, procedure, expression of results and test report.
Microbiologie — Directives générales pour le dénombrement des coliformes — Technique du nombre le plus probable
La présente Norme internationale donne des directives générales pour le dénombrement des coliformes dans les produits destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation animale, par calcul du nombre le plus probable (NPP) après incubation à 30 °C, 35 °C ou 37 °C en milieu liquide, cette température faisant l'objet d'un accord entre les parties concernées.NOTE 1 La température d'incubation de 30 °C est retenue lorsque la finalité du dénombrement est technologique; la température de 35 °C ou 37 °C est retenue lorsque la finalité du dénombrement relève plutôt du domaine de la santé publique. Des limites sont imposées aux possibilités d'application de la présente Norme internationale, du fait que cette méthode est sujette à de grandes variations. Il est recommandé d'appliquer cette méthode et d'interpréter les résultats à la lumière des renseignements donnés en 10.4.
General Information
Relations
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL
STANDARD
Second edition
1991-03-01
Microbiology - General guidance for the
enumeration of coliforms - Most probable
number technique
- Direc tives
Microbiologie g&Wales pour Ie dhombrement des
coliformes - Technique du nombre le plus
probable
Reference number
ISO 4831:1991(E)
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ISO 4831:1991(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national Standards bodies (ISO member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Esch member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the
work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission. (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an Inter-
national Standard requires approval by at least 75 % of the member
x
bodies casting a vote.
International Standard ISO 4831 was prepared by Technical Committee
lSO/TC 34, Agricultural food products.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO
4831:1978), of which it constitutes a technical revision.
Annexes A and B form an integral patt of this International Standard.
,
0 ISO 1991
All rights reserved. No part of this pubiication may be reproduced or utiiized in any form
or by any means, eiectronic or mechanicai, inciuding photocopying and microfiim, without
Permission in writing from the pubiisher.
international Organization for Standardization
Case Postaie 56 * CH-121 1 Geneve 20 l Switzeriand
Printed in Switzeriand
ii
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ISO 4831:1991(E)
Introduction
0.1 This International Standard is intended to provide general guid-
ante for the examination of products not dealt with by existing Inter-
national Standards and for reference for bodies preparing
microbiological methods of test for application to foods or to animal
feeding stuffs. Because of the Iarge variety of products within this field
of application, these guidelines may not be appropriate for some pro-
ducts in every detail, and for some other products it may be necessary
to use different methods. Nevertheless, it is hoped that in all cases every
attempt will be made to apply the guidelines provided as far as possible
and that deviations from them will only be made if absolutely necessary
for technical reasons.
-.
When this International Standard is next reviewed, account will be taken
of all information then available regarding the extent to which the
guidelines have been followed and the reasons for deviation from them
in the case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate, and for certain
groups of products International Standards and/or national Standards
may already exist that do not comply with these guidelines. In cases
where International Standards already exist for the product to be tested,
they should be followed, but it is hoped that when such Standards are
reviewed they will be changed to comply with this International Standard
so that eventually the only remaining departures from these guidelines
will be those necessary for weil-established technical reasons.
0.2 The technique described in this International Standard is less pre-
eise than that described in ISO 4832:1990, Microbiology - General guid-
ante for the enumeration of coliforms - Colony count technique, but
allows a microbiological examination to be carried out on a larger test
Portion, thus permitting a lower number of coliforms per gram or per
millilitre of product to be detected. Moreover, since the definition of
adopted in the two documents is different, the micro-
“coliforms”
organisms enumerated are not necessarily the Same.
For any particular product, the method to be Chosen will be specified in
the International Standard dealing with that product.
0.3 For the purposes of a practicable test method, the definition of
“coliforms” given in clause 3 and used as the basis for the procedure
is not necessarily identical with corresponding definitions given in other
published texts. A proportion of strains of the micro-organisms de-
scribed in other published texts as “coliforms” (including Escherichia
coli) fail to produce enough gas to be detectable by use of a Durharn
tube (i.e. “anaerogenic strains”). Therefore, the method described in
this International Standard will not detect all strains of the micro-
organisms referred to in other publications as
“(presumptive)
coliforms” (e.g. certain strains of Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella).
. . .
Ill
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ISO 4831:1991(E)
(See Edwards, P.R. and Ewing, W.H. Identification ofhterobacteriaceae,
3rd edition, Burgess Publishing Company, Minneapolis, Minnesota,
USA, 1972.)
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 4831:199l(E)
General guidance for the enumeration of
Microbiology -
Most probable number technique
coliforms -
1 Scope 3 Definition
For the purposes of this International Standard, the
This International Standard gives general guidelines
following definition applies.
for the enumeration of coliforms present in products
intended for human consumption or feeding of ani-
coliforms: Bacteria which, at the specified tempera-
mals, by means of the calculation of the most prob-
ture (i.e. 30 OC, 35 OC or 37 OC, as agreed) Cause
able number (MPN) after incubation at 30 OC, 35 OC
or 37 OC in a liquid medium, this temperature form- fermentation of Iactose with the production of gas
under the test conditions specified in this Inter-
ing the subject of agreement between the Parties
national Standard.
concerned.
NOTE 1 The incubation temperature of 30 OC is used
4 Principle
when the aim of the enumeration is technological; the
temperature of 35 OC or 37 OC is used when the aim of the
enumeration is more in the field of public health.
4.1 Inoculation of three tubes of double-strength
liquid selective enrichment medium [see 5.3 a)] with
A limitation on the applicability of this International
a specified quantity of the test Sample if the initial
Standard is imposed by the method’s susceptibility
product is liquid, or with a specified quantity of an
to a large degree of variability. The method should
initial Suspension in the case of other products.
be applied and the results interpreted in the light of
the information given in 10.4.
4.2 Inoculation of three tubes of Single-strength
liquid selective enrichment medium [see 5.3 b)] with
a speclfied quantity of the test Sample if the initial
product ls liquid, or with a specified quantity of an
2 Normative references initial Suspension in the case of other products.
Then, under the Same conditions, inoculation of fur-
The following Standards contain provisions which,
ther tubes of medium 5.3 b) with decimal dilutions
through reference in this text, constitute provisions
of the test Sample or of the initial Suspension.
of this International Standard. At the time of publi-
cation, the editions indicated were valid. All stan-
dards are subject to revision, and Parties to
4.3 Incubation at 30 OC, 35 OC or 37 OC (as agreed)
agreements based on this International Standard
of the tubes containing double-strength medium
are encouraged to investigate the possibility of ap-
[5.3 a)] for 24 h and of the tubes containing single-
plying the most recent editions of the Standards in-
strength medium [5.3 b)] for 24 h or 48 h, and ex-
dicated below. Members of IEC and ISO maintain
amination of these tubes.
registers of currently valid International Standards.
4.4 Inoculation of a series of tubes of the confir-
ISO 6579:1990, Microbiology - General guidance on
mation medium (5.4) with the cultures from the
methods for the detection of Salmonella.
tubes of medium 5.3 a) and with those cultures from
the fit-st series of tubes of medium 5.3 b) in which
ISO 6887:1983, Microbiology - General guidance for
Opacity or gas formation has been noted.
the preparation of dilutions for microbiological ex-
amination.
4.5 Incubation at 30 OC, 35 OC or 37 OC (as agreed)
for 24 h or 48 h, and examination of the new series
ISO 7218:1985, Microbiology - General guidance for
of tubes (4.4).
microbiological examinations.
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ISO 4831: 1991 (E)
4.6 Calculation of the most probable number of 5.4 Lactose blle brilliant green broth
coliforms per millilitre or per gram of Sample (i.e.
(confirmation medium)
the MPN), from the number of tubes in the new se-
ries (4.5) showing gas formation, using a table for
Composition
determination of most probable numbers.
peptone
10 Cl
5 Culture media and dilution fluid lactose
10 Cl
dehydrated ox bile
20 9
5.1 General
brilliant greenl) 0,0133 g
For current laboratory practice, see ISO 7218.
water 1000 ml
5.2 Diktion fluid
Prepara tion
See ISO 6887 and the specific International Standard
Dissolve the components or the dehydrated
dealing with the product under examination.
complete medium in the water, by heating if
necessary.
5.3 Lauryl sulfate tryptose broth (selective
Adjust the pH, if necessary, so that after
enrichment medium)
sterilization it is 7,2 at 25 OC.
Composition
Dispense the medium, in quantities of 10 ml, in
16 mm x 160 mm test tubes (6.4) containing
a) b)
Durharn tubes (6.5).
double- single-
strength strength +
Sterilize in an autoclave set at 121 OC for 15 min.
medium medium
tryptose
40 g 20 Cl
The Durharn tubes shall not contain air bubbles
lactose
10 g 5g
after sterilization.
dipotassium hydrogen
Phosphate (K,H PO,)
515 g 2175 g
potassium dihydrogen
NOTE 2 Because the dehydrated complete medium
Phosphate (KH,PO,)
515 g 2175 g
may not always produce the expected result, its per-
sodium chloride
10 g 59
formante should be checked before use.
sodium lauryl sulfate
012 9 Oll g
water 1000 ml 1000 ml
6 Apparatus and glassware
Prepara tion
NOTE 3 Disposable apparatus is an acceptable alterna-
or the dehydrated
Dissolve the components
tive to reusable glassware if it has suitable specifications.
complete medium in the water, by heating if
necessary.
Usual microblologica ,I laboratory equipment and, in
partic ular, the followi
w
Adjust the pH, if necessary, so that after
sterilization it is 6,8 at 25 OC.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet
Dispense the media in quantities of 10 ml into
sterilization (autoclave).
tubes of dimensions 16 mm x 160 mm (6.4) con-
taining Durharn tubes (6.5) in the case of single-
See ISO 7218.
strength medium, and into test tubes of
dimensions 20 mm x 200 mm (6.4) [not contain-
ing Durharn tubes (6.5)] in the case of the 6.2 Incubator, capable of operating at 30 OC + 1 OC,
-
double-strength medium. 35 OC + 1 OC or 37 OC + 1 OC.
-
-
Sterilize in an autoclave set at 121 OC for 15 min.
6.3 Loop, made of platinum-iridium or nickel-
chromium, approximately 3 mm in diameter-, or
The Durharn tubes shall not contain air bubbles
disposable loops.
after sterilization.
1) Corresponding to the specifications given in ISO 6579:1981, annex C.
2
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ISO 4831:1991(E)
6.4 Test tubes, of dimensions approximately 16 mm 9.2 Inoculation2) and incubation
x 160 mm and 20 mm x 200 mm, or bottles of suit-
able capacity.
9.2.1 Take three tubes of double-strength selective
enrichment medium [5.3a)]. Using a sterile pipette
(6.6), transfer to each of these tubes 10 ml of the test
6.5 Durharn tubes, of a size suitable for use in the
Sample, if liquid, or 10 mf of the initial Suspension,
test tubes of dimensions 16 mm x 160 mm (6.4).
in the case of other products.
6.6 Total delivery pipettes, having nominal capaci-
9.2.2 Then take three tubes of Single-strength se-
ties of 1 ml and 10 ml.
lective enrichment medium [5.3b)]. Using a fresh
sterile pipette (6.6) transfer to each of these tubes
6.7 pH meter, accurate to + 0,l pH unit at 25 OC. 1 ml of the test Sample, if liquid, or 1 ml of the initial
-
Suspension, in the case of other products.
7 Sampling
9.2.3 For each of the further dilutions (from IO-1 or
IO-2 according to the test Sample), continue as de-
Sampling shall have been carried out in accordance
scribed in 9.2.2. Use a fresh sterile pipette for each
with the specific International Standard appropriate
dilution. Carefully mix the inoculum and the medium.
to the product concerned. If there is no specific In-
ternational Standard, it is recommended that the
9.2.4 Leave the tubes of double-strength medium
Parties concerned come to an agreement on this
(9.2.1) In the incubator (6.2) set at 30 OC, 35 OC or
subject.
37 OC (as agreed) for 24 h + 2 h.
-
9.2.5 Leave the tubes of Single-strength medium
8 Preparation of the test Sample
(9.2.2 and 9.2.3) in the incubator (6.2) at 30 OC, 35 OC
or 37 OC (as agreed) for 24 h * 2 h or, if neither gas
Prepare the test Sample in accordance with the
formation nor Opacity preventing the Observation of
specific International Standard appropriate to the
gas formation is observed at this Stage, for
product concerned. If there is no specific Inter-
48 h + 2 h.
-
national Standard, it is recommended that the par-
ties concerned come to an agreement on this
subject.
9.3 Confirmation
9.3.1 From each of the incubated tubes from 9.2.4,
9 Procedure (see the diagram in
inoculate with a loop (6.3) a tube of confirmation
annex A)
medium (5.4). Incubate in the incubator set at 30 OC,
35 OC or 37 OC (as agreed) for 24 h & 2 h or, if gas
Where several samples taken from the Same batch formation is not observed at this Stage, for
are to be examined, carry out the following oper-
48 h & 2 h.
ations for each Sample.
9.3.2 Carry out the Same procedure for the incu-
bated tubes from 9.2.5 showing gas formation or
9.1 Test Portion, initial Suspension and
Opacity, when either of these features is first ob-
dilutions
served (i.e. after 24 h + 2 h or after 48 h & 2 h).
See ISO 6887 and the specific International Standard
9.4 Interpretation
appropriate to the product concerned
For each dilution, count the total number of tubes in
Prepare a sufficient number of dilutions to ensure
which gas formation is observed in 9.3 (positive
that all the tubes corresponding to the final dilu
...
Iso
NORME
INTERNATIONALE 4831
Deuxième bdition
1991-03-01
Microbiologie - Directives générales pour le
dénombrement des coliformes - Technique du
nombre le plus probable
Microbiology - General guidance for the enumeration of coliforms -
Most probable number technique
Numéro de référence
ISO 4831:1991(F)
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ISO 4831:1991(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres
de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre inté-
ressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique crée
à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I’ISO participent également aux tra-
vaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique
internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotech-
nique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techni-
ques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins
des comités membres votants.
La Norme internationale ISO 4831 a été élaborée par le comité techni-
que ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO
4831:1978), dont elle constitue une révision technique.
Les annexes A et B font partie intégrante de la présente Norme inter-
nationale.
0 ISO 1991
Droits de reproduction réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être repro-
duite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou
mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
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ISO 4831:1991(F)
Introduction
0.1 La présente Norme internationale se propose de fournir des di-
rectives générales pour l’examen de produits non concernés par les
Normes internationales existant actuellement, et pour l’étude par les
organismes élaborant des méthodes d’essais microbiologiques desti-
nées à être appliquées à des produits alimentaires ou à des aliments
pour animaux. En raison de la grande diversité des produits entrant
dans ce domaine d’application, il est possible que ces directives, dans
tous leurs details, ne conviennent pas exactement à certains produits
et que, pour certains autres produits, il puisse être nécessaire d’em-
ployer des méthodes différentes. Néanmoins, il est à espérer que, dans
tous les cas, tous les efforts seront faits pour appliquer, chaque fois qu’il
sera possible, les directives données, et qu’on n’aura recours à des
dérogations que si cela est absolument nécessaire pour des raisons
techniques.
Lorsque la présente Norme internationale sera réexaminee, il sera tenu
compte de tous les renseignements disponibles à ce moment-là, à sa-
voir dans quelle mesure les directives auront été suivies et les raisons
pour lesquellles il aura été nécessaire d’y déroger dans le cas de pro-
duits particuliers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut pas être immédiate et,
pour certains groupes de produits, des Normes internationales et/ou
des normes nationales existent peut-être. Dans le cas où des Normes
internationales existent déjà pour le produit à contrôler, elles devront
être appliquées, mais il serait souhaitable que, lorsqu’elles viendront
en révision, elles soient alignées sur la présente Norme internationale,
si bien que finalement les seules divergences restantes seront celles
qui sont nécessaires pour des raisons techniques bien établies.
0.2 La technique décrite dans la présente Norme internationale est
moins précise que celle decrite dans I’ISO 4832:1990, Microbiologie -
Directives générales pour le dénombrement des coliformes - Méthode
par comptage des colonies, mais elle permet d’effectuer un examen
microbiologique sur une prise d’essai plus importante et, par conse-
quent, de détecter un plus petit nombre de coliformes par gramme ou
par millilitre de produit, D’autre part, la définition des tcoliformew
adoptée dans les deux documents étant différente, on ne dénombre pas
nécessairement les mêmes micro-organismes.
Pour chaque produit particulier, le choix de la technique sera précisé
dans la Norme internationale concernant ce produit.
0.3 Pour les besoins d’une méthode d’essai efficace, la définition des
wzoIiformes>), donnée dans l’article 3 et servant de base à la technique,
n’est pas nécessairement identique aux définitions correspondantes
données dans d’autres textes publiés. Une certaine proportion de sou-
ches des micro-organismes désignés sous le nom de (coliformes~~ (y
. . .
III
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ISO 4831:1991(F)
compris les Escherichia coli) dans d’autres textes publiés, ne produisent
pas suffisament de gaz pour pouvoir être décelées au moyen des clo-
ches de Durham, (ce sont des souches anaérogénes). C’est pourquoi la
technique décrite dans la présente Norme internationale ne détectera
pas la totalité des souches des micro-organismes désignés, dans d’au-
tres publications, sous le nom de (coliformes (présumés)~~ (par exem-
ple, certaines souches de Citrobacter, Enferobacter, Klebsiella). (Voir
Edwards, P.R. et Ewing, W.H. Identification of Enterobacteriaceae, 3ème
édition, Burgess Publishing Company, Minneapolis, Minnesota, USA,
1972).
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NORME INTERNATIONALE ISO 4831:1991(F)
Microbiologie - Directives générales pour le dénombrement
Technique du nombre le plus probable
des coliformes -
ISO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales
1 Domaine d’application
pour /a préparation des dilutions en vue de l’examen
microbiologique.
La présente Norme internationale donne des direc-
tives générales pour le dénombrement des coli-
ISO 7218: 1985, Microbiologie - Directives générales
formes dans les produits destinés à la
pour /es examens microbiologiques.
consommation humaine ou à l’alimentation animale,
par calcul du nombre le plus probable (NPP) après
incubation à 30 OC, 35 OC ou 37 OC en milieu liquide,
3 Déflnition
cette température faisant l’objet d’un accord entre
les parties concernées.
Pour les besoins de la présente Norme internatio-
nale, la définition suivante s’applique.
NOTE 1 La température d’incubation de 30 OC est rete-
nue lorsque la finalité du dénombrement est technolo-
coliformes: Bactéries qui, à la température spécifiée
gique; la température de 35 OC ou 37 OC est retenue
(c’est-à-dire 30 OC, 35 OC ou 37 OC, selon accord),
lorsque la finalité du dénombrement relève plutôt du do-
provoquent la fermentation du lactose avec produc-
maine de la santé publique.
tion de gaz, lorsque l’essai est effectué selon la
méthode spécifiée dans la présente Norme interna-
Des limites sont imposées aux possiblités d’appli-
tionale.
cation de la présente Norme internationale, du fait
que cette méthode est sujette à de grandes va-
riations. II est recommandé d’appliquer cette mé-
4 Prlnclpe
thode et d’interpréter les résultats à la lumière des
renseignements donnés en 10.4.
4.1 Ensemencement de trois tubes de milieu d’en-
richissement sélectif liquide double concentration
[voir 5.3 a)] avec une quantité déterminée de
l’échantillon pour essai si le produit à examiner est
liquide, ou avec une quantité déterminée de sus-
pension met-e dans le cas d’autres produits.
2 Références normatives
4.2 Ensemencement de trois tubes de milieu d’en-
richissement sélectif simple concentration [voir 5.3
Les normes suivantes contiennent des dispositions
b)] avec une quantité déterminée de l’échantillon
qui, par suite de la référence qui en est faite,
pour essai si le produit à examiner est liquide, ou
constituent des dispositions valables pour la pré-
sente Norme internationale. Au moment de la pu- avec une quantité déterminée de suspension mère
blication, les éditions indiquées étaient en vigueur. dans le cas d’autres produits.
Toute norme est sujette à révision et les parties
Puis, dans les même conditions, ensemencement
prenantes des accords fondés sur la présente
du milieu 5.3 b) avec les dilutions décimales obte-
Norme internationale sont invitées à rechercher la
nues à partir de l’échantillon pour essai ou de la
possibilité d’appliquer les éditions les plus récentes
suspension mère.
des normes indiquées ci-aprés. Les membres de la
CE1 et de I’ISO possèdent le registre des Normes
internationales en vigueur à un moment donné. 4.3 Incubation à 30 OC, 35 OC ou 37 OC (selon ac-
cord) pendant 24 h pour les tubes de milieu double
ISO 6579: 1990, Microbiologie - Directives générales concentration [5.3 a)] et pendant 24 h ou 48 h pour
concernant les tubes de milieu simple concentration [5.3 b)] et
les méthodes de recherche des
Salmonella. examen de ces tubes.
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 4831:1991(F)
4.4 Repiquage, à partir des cultures des tubes de
Répartir les milieux, par quantités de 10 ml dans
milieu 5.3 a) et des cultures provenant de la pre-
des tubes de 16 mm x 160 mm (6.4) contenant
mière série des tubes de milieu 5.3 b) opaques ou
des cloches de Durham (6.5) dans le cas du mi-
troubles ou ayant donné lieu à un dégagement ga-
lieu simple concentration, et dans des tubes de
zeux, dans une série de tubes du milieu de confir-
20 mm x 200 mm (6.4) (sans cloches) dans le cas
mation (5.4).
du milieu double concentration.
Stériliser à l’autoclave à 121 OC pendant 15 min.
4.5 Incubation à 30 OC, 35 OC ou 37 OC (selon ac-
cord) pendant 24 h ou 48 h et examen de cette nou-
Les cloches de Durham ne doivent pas contenir
velle série de tubes (4.4).
de bulles d’air aprés stérilisation.
4.6 A partir du nombre de tubes de cette nouvelle
série (4.5) présentant une production de gaz, déter-
5.4 Bouillon lactosé bilié au vert brillant
mination du nombre le plus probable de coliformes
(milieu de confirmation)
par millilitre ou par gramme d’échantillon (c’est-à-
dire le NPP), au moyen de la table NPP.
Composition
10 g
5 Milieux de culture et diluant peptone
g
10
lactose
5.1 Généralités
bile de boeuf déshydratée
20 ci
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir
0,013 3 g
vert brillantl)
I’ISO 7218.
1000 ml
eau
5.2 Diluant
Préparation
Voir I’ISO 6887 et la Norme internationale spécifique
Dissoudre les composants ou le milieu complet
traitant du produit à examiner.
déshydraté dans l’eau en chauffant si néces-
saire.
5.3 Bouillon à la tryptose et au lauryle sulfate
(milieu d’enrichissement sélectif)
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après
stérilisation, il soit de 7,2 à 25 OC.
Composition
Répartir les milieux, par quantités de 10 ml, dans
4 W
des tubes à essais de 16 mm x 160 mm (6.4)
Milieu Milieu
contenant des cloches de Durham (6.5).
double simple
concen- concen-
Stériliser à l’autoclave à 121 OC pendant 15 min.
tration tration
tryptose
40 g 20 g
Les cloches de Durham ne doivent pas contenir
lactose
10 9 5g
de bulles d’air après stérilisation.
hydrogénomonophosphate
de potassium (K2HP04 ) 595 9 23 g
dihydrogénophosphate de
NOTE 2 Etant donné que le milieu complet déshy-
potassium (KH2P04 )
55 g 2975 g
draté ne donne pas toujours les résultats attendus, il
chlorure de sodium
10 9 59
est nécessaire de contrôler ses propriétés avant utili-
lauryl sulfate de sodium sation.
02 g O!f g
1000 ml 1000 ml
eau
Préparation
6 Appareillage et verrerie
Dissoudre les composants ou le milieu complet
NOTE 3 Le matériel à usage unique est acceptable au
déshydraté dans l’eau, en chauffant si néces-
même titre que la verrerie r&tilisable, si ses spkifica-
tions sont similaires.
saire.
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après Matériel courant de laboratoire de microbiologie, et
notamment:
stérilisation, il soit de 6,8 à 25 OC.
1) Répondant aux spécifications données dans I’ISO 6579:1981, annexe C.
2
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 4831:1991(F)
9.2 Ensemencement2) et Incubation
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche
.
(four) ou en chaleur humide (autoclave).
9.2.1 Prendre trois tubes de milieu d’enrichis-
Voir I’ISO 7218.
sement selectif double concentration [5.3a)]. A
l’aide d’une pipette stérile (6.6), transférer, dans
6.2 Étuve, réglable à 30 OC + 1 OC, 35 OC + 1 OC ou
-
chacun de ces tubes, 10 ml de l’échantillon pour
37 “C + 1 “C.
-
essai s’il est liquide, ou 10 ml de la suspension
mère dans le cas d’autres produits.
6.3 Anse bouclée, en platine iridié ou en nickel-
chrome, d’environ 3 mm de diamètre, ou anses
9.2.2 Prendre ensuite trois tubes de milieu d’enri-
bouclées jetables
chissement sélectif simple concentration [5.3b)]. A
l’aide d’une nouvelle pipette stérile (6.6) transférer,
6.4 Tubes à essais, de 16 mm x 160 mm et 20 mm
dans chacun de ces tubes, 1 ml de l’échantillon pour
x 200 mm, ou fioles de capacité appropriée.
essai s’il est liquide, ou 1 ml de la suspension mère
dans le cas d’autres produits.
6.5 Cloches de Durham, de dimensions appro-
priées en vue de leur utilisation dans les tubes de
9.2.3 Pour chacune des dilutions suivantes (à partir
16 mm x 160 mm (6.4).
de 10-I ou 10-2, selon l’échantillon pour essai),
opérer comme en 9.2.2. Utiliser une nouvelle pipette
6.6 Pipettes à écoulement total, de 1 ml et 10 ml de
stérile pour chaque dilution. Bien mélanger
capacité nominale.
I’inoculum et le milieu.
6.7 pH-mètre, précis à + 0,l unité de pH à 25 OC.
-
9.2.4 Incuber les tubes de milieu double concen-
tration (9.2.1) à l’étuve (6.2) à 30 OC, 35 OC ou 37 OC
(selon accord) pendant 24 h + 2 h.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage doit avoir été effectue conformé-
9.2.5 Incuber les tubes de milieu simple concen-
ment à la Norme internationale spécifique du pro-
tration (9.2.2 et 9.2.3) à l’étuve (6.2) à 30 OC, 35 OC
duit concerné. S’il n’existe pas de Norme
ou 37 OC (selon accord) pendant 24 h + 2 h, ou si, à
internationale spécifique, il est recommande que les
ce stade, on n’observe pas de formation de gaz ni
parties concernées se mettent d’accord à ce sujet.
de trouble empêchant d’apprécier un dégagement
gazeux, pendant 48 h + 2 h.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
9.3 Confirmation
Préparer l’échantillon pour essai conformément à la
Norme internationale spécifique du produit
9.3.1 A partir de chaque tube incubé selon 9.2.4,
concerné. S’il n’existe pas de Norme internationale
ensemencer avec une anse bouclée (6.3) un tube du
spécifique, il est recommande que les parties
milieu de confirmation (5.4). Incuber a 30 OC, 35 OC
concernées se mettent d’accord à ce sujet.
ou 37 OC (selon accord) pendant 24 h & 2 h, ou si, à
ce stade, on n’observe pas de dégagement de gaz,
9 Mode opératoire (voir le schéma en
pendant 48 h & 2 h.
annexe A )
9,3,2 Opérer de même pour les tubes incubés se-
Dans le cas de plusieurs échantillons examinés
lon 9.2.5 présentant un dégagement gazeux ou un
provenant d’un même lot, effectuer les opérations
trouble, des que l’un de ces phénoménes est ob-
décrites ci-après pour chaque échantillon.
servé (c’est-à-dire après 24 h + 2 h ou après
48 h + 2 h).
9.1 Prise d’essai, suspension mère et
dilutions
9.4 Interprétation
Voir I’ISO 6887 et la Norme internationale spécifique
Pour chaque dilution, compter le nombre total de
du produit concerné.
tubes où l’on note en 9.3 un dégagement gazeux
(tubes positifs), après 24 h k 2 h et, éventuellement,
Effectuer un nombre de dilutions suffisant, afin que
tous les tubes de la dernier-e dilution soient négatifs. après 48
...
Iso
NORME
INTERNATIONALE 4831
Deuxième bdition
1991-03-01
Microbiologie - Directives générales pour le
dénombrement des coliformes - Technique du
nombre le plus probable
Microbiology - General guidance for the enumeration of coliforms -
Most probable number technique
Numéro de référence
ISO 4831:1991(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 4831:1991(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres
de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre inté-
ressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique crée
à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I’ISO participent également aux tra-
vaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique
internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotech-
nique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techni-
ques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins
des comités membres votants.
La Norme internationale ISO 4831 a été élaborée par le comité techni-
que ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO
4831:1978), dont elle constitue une révision technique.
Les annexes A et B font partie intégrante de la présente Norme inter-
nationale.
0 ISO 1991
Droits de reproduction réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être repro-
duite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou
mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 4831:1991(F)
Introduction
0.1 La présente Norme internationale se propose de fournir des di-
rectives générales pour l’examen de produits non concernés par les
Normes internationales existant actuellement, et pour l’étude par les
organismes élaborant des méthodes d’essais microbiologiques desti-
nées à être appliquées à des produits alimentaires ou à des aliments
pour animaux. En raison de la grande diversité des produits entrant
dans ce domaine d’application, il est possible que ces directives, dans
tous leurs details, ne conviennent pas exactement à certains produits
et que, pour certains autres produits, il puisse être nécessaire d’em-
ployer des méthodes différentes. Néanmoins, il est à espérer que, dans
tous les cas, tous les efforts seront faits pour appliquer, chaque fois qu’il
sera possible, les directives données, et qu’on n’aura recours à des
dérogations que si cela est absolument nécessaire pour des raisons
techniques.
Lorsque la présente Norme internationale sera réexaminee, il sera tenu
compte de tous les renseignements disponibles à ce moment-là, à sa-
voir dans quelle mesure les directives auront été suivies et les raisons
pour lesquellles il aura été nécessaire d’y déroger dans le cas de pro-
duits particuliers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut pas être immédiate et,
pour certains groupes de produits, des Normes internationales et/ou
des normes nationales existent peut-être. Dans le cas où des Normes
internationales existent déjà pour le produit à contrôler, elles devront
être appliquées, mais il serait souhaitable que, lorsqu’elles viendront
en révision, elles soient alignées sur la présente Norme internationale,
si bien que finalement les seules divergences restantes seront celles
qui sont nécessaires pour des raisons techniques bien établies.
0.2 La technique décrite dans la présente Norme internationale est
moins précise que celle decrite dans I’ISO 4832:1990, Microbiologie -
Directives générales pour le dénombrement des coliformes - Méthode
par comptage des colonies, mais elle permet d’effectuer un examen
microbiologique sur une prise d’essai plus importante et, par conse-
quent, de détecter un plus petit nombre de coliformes par gramme ou
par millilitre de produit, D’autre part, la définition des tcoliformew
adoptée dans les deux documents étant différente, on ne dénombre pas
nécessairement les mêmes micro-organismes.
Pour chaque produit particulier, le choix de la technique sera précisé
dans la Norme internationale concernant ce produit.
0.3 Pour les besoins d’une méthode d’essai efficace, la définition des
wzoIiformes>), donnée dans l’article 3 et servant de base à la technique,
n’est pas nécessairement identique aux définitions correspondantes
données dans d’autres textes publiés. Une certaine proportion de sou-
ches des micro-organismes désignés sous le nom de (coliformes~~ (y
. . .
III
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 4831:1991(F)
compris les Escherichia coli) dans d’autres textes publiés, ne produisent
pas suffisament de gaz pour pouvoir être décelées au moyen des clo-
ches de Durham, (ce sont des souches anaérogénes). C’est pourquoi la
technique décrite dans la présente Norme internationale ne détectera
pas la totalité des souches des micro-organismes désignés, dans d’au-
tres publications, sous le nom de (coliformes (présumés)~~ (par exem-
ple, certaines souches de Citrobacter, Enferobacter, Klebsiella). (Voir
Edwards, P.R. et Ewing, W.H. Identification of Enterobacteriaceae, 3ème
édition, Burgess Publishing Company, Minneapolis, Minnesota, USA,
1972).
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NORME INTERNATIONALE ISO 4831:1991(F)
Microbiologie - Directives générales pour le dénombrement
Technique du nombre le plus probable
des coliformes -
ISO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales
1 Domaine d’application
pour /a préparation des dilutions en vue de l’examen
microbiologique.
La présente Norme internationale donne des direc-
tives générales pour le dénombrement des coli-
ISO 7218: 1985, Microbiologie - Directives générales
formes dans les produits destinés à la
pour /es examens microbiologiques.
consommation humaine ou à l’alimentation animale,
par calcul du nombre le plus probable (NPP) après
incubation à 30 OC, 35 OC ou 37 OC en milieu liquide,
3 Déflnition
cette température faisant l’objet d’un accord entre
les parties concernées.
Pour les besoins de la présente Norme internatio-
nale, la définition suivante s’applique.
NOTE 1 La température d’incubation de 30 OC est rete-
nue lorsque la finalité du dénombrement est technolo-
coliformes: Bactéries qui, à la température spécifiée
gique; la température de 35 OC ou 37 OC est retenue
(c’est-à-dire 30 OC, 35 OC ou 37 OC, selon accord),
lorsque la finalité du dénombrement relève plutôt du do-
provoquent la fermentation du lactose avec produc-
maine de la santé publique.
tion de gaz, lorsque l’essai est effectué selon la
méthode spécifiée dans la présente Norme interna-
Des limites sont imposées aux possiblités d’appli-
tionale.
cation de la présente Norme internationale, du fait
que cette méthode est sujette à de grandes va-
riations. II est recommandé d’appliquer cette mé-
4 Prlnclpe
thode et d’interpréter les résultats à la lumière des
renseignements donnés en 10.4.
4.1 Ensemencement de trois tubes de milieu d’en-
richissement sélectif liquide double concentration
[voir 5.3 a)] avec une quantité déterminée de
l’échantillon pour essai si le produit à examiner est
liquide, ou avec une quantité déterminée de sus-
pension met-e dans le cas d’autres produits.
2 Références normatives
4.2 Ensemencement de trois tubes de milieu d’en-
richissement sélectif simple concentration [voir 5.3
Les normes suivantes contiennent des dispositions
b)] avec une quantité déterminée de l’échantillon
qui, par suite de la référence qui en est faite,
pour essai si le produit à examiner est liquide, ou
constituent des dispositions valables pour la pré-
sente Norme internationale. Au moment de la pu- avec une quantité déterminée de suspension mère
blication, les éditions indiquées étaient en vigueur. dans le cas d’autres produits.
Toute norme est sujette à révision et les parties
Puis, dans les même conditions, ensemencement
prenantes des accords fondés sur la présente
du milieu 5.3 b) avec les dilutions décimales obte-
Norme internationale sont invitées à rechercher la
nues à partir de l’échantillon pour essai ou de la
possibilité d’appliquer les éditions les plus récentes
suspension mère.
des normes indiquées ci-aprés. Les membres de la
CE1 et de I’ISO possèdent le registre des Normes
internationales en vigueur à un moment donné. 4.3 Incubation à 30 OC, 35 OC ou 37 OC (selon ac-
cord) pendant 24 h pour les tubes de milieu double
ISO 6579: 1990, Microbiologie - Directives générales concentration [5.3 a)] et pendant 24 h ou 48 h pour
concernant les tubes de milieu simple concentration [5.3 b)] et
les méthodes de recherche des
Salmonella. examen de ces tubes.
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 4831:1991(F)
4.4 Repiquage, à partir des cultures des tubes de
Répartir les milieux, par quantités de 10 ml dans
milieu 5.3 a) et des cultures provenant de la pre-
des tubes de 16 mm x 160 mm (6.4) contenant
mière série des tubes de milieu 5.3 b) opaques ou
des cloches de Durham (6.5) dans le cas du mi-
troubles ou ayant donné lieu à un dégagement ga-
lieu simple concentration, et dans des tubes de
zeux, dans une série de tubes du milieu de confir-
20 mm x 200 mm (6.4) (sans cloches) dans le cas
mation (5.4).
du milieu double concentration.
Stériliser à l’autoclave à 121 OC pendant 15 min.
4.5 Incubation à 30 OC, 35 OC ou 37 OC (selon ac-
cord) pendant 24 h ou 48 h et examen de cette nou-
Les cloches de Durham ne doivent pas contenir
velle série de tubes (4.4).
de bulles d’air aprés stérilisation.
4.6 A partir du nombre de tubes de cette nouvelle
série (4.5) présentant une production de gaz, déter-
5.4 Bouillon lactosé bilié au vert brillant
mination du nombre le plus probable de coliformes
(milieu de confirmation)
par millilitre ou par gramme d’échantillon (c’est-à-
dire le NPP), au moyen de la table NPP.
Composition
10 g
5 Milieux de culture et diluant peptone
g
10
lactose
5.1 Généralités
bile de boeuf déshydratée
20 ci
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir
0,013 3 g
vert brillantl)
I’ISO 7218.
1000 ml
eau
5.2 Diluant
Préparation
Voir I’ISO 6887 et la Norme internationale spécifique
Dissoudre les composants ou le milieu complet
traitant du produit à examiner.
déshydraté dans l’eau en chauffant si néces-
saire.
5.3 Bouillon à la tryptose et au lauryle sulfate
(milieu d’enrichissement sélectif)
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après
stérilisation, il soit de 7,2 à 25 OC.
Composition
Répartir les milieux, par quantités de 10 ml, dans
4 W
des tubes à essais de 16 mm x 160 mm (6.4)
Milieu Milieu
contenant des cloches de Durham (6.5).
double simple
concen- concen-
Stériliser à l’autoclave à 121 OC pendant 15 min.
tration tration
tryptose
40 g 20 g
Les cloches de Durham ne doivent pas contenir
lactose
10 9 5g
de bulles d’air après stérilisation.
hydrogénomonophosphate
de potassium (K2HP04 ) 595 9 23 g
dihydrogénophosphate de
NOTE 2 Etant donné que le milieu complet déshy-
potassium (KH2P04 )
55 g 2975 g
draté ne donne pas toujours les résultats attendus, il
chlorure de sodium
10 9 59
est nécessaire de contrôler ses propriétés avant utili-
lauryl sulfate de sodium sation.
02 g O!f g
1000 ml 1000 ml
eau
Préparation
6 Appareillage et verrerie
Dissoudre les composants ou le milieu complet
NOTE 3 Le matériel à usage unique est acceptable au
déshydraté dans l’eau, en chauffant si néces-
même titre que la verrerie r&tilisable, si ses spkifica-
tions sont similaires.
saire.
Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu’après Matériel courant de laboratoire de microbiologie, et
notamment:
stérilisation, il soit de 6,8 à 25 OC.
1) Répondant aux spécifications données dans I’ISO 6579:1981, annexe C.
2
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 4831:1991(F)
9.2 Ensemencement2) et Incubation
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche
.
(four) ou en chaleur humide (autoclave).
9.2.1 Prendre trois tubes de milieu d’enrichis-
Voir I’ISO 7218.
sement selectif double concentration [5.3a)]. A
l’aide d’une pipette stérile (6.6), transférer, dans
6.2 Étuve, réglable à 30 OC + 1 OC, 35 OC + 1 OC ou
-
chacun de ces tubes, 10 ml de l’échantillon pour
37 “C + 1 “C.
-
essai s’il est liquide, ou 10 ml de la suspension
mère dans le cas d’autres produits.
6.3 Anse bouclée, en platine iridié ou en nickel-
chrome, d’environ 3 mm de diamètre, ou anses
9.2.2 Prendre ensuite trois tubes de milieu d’enri-
bouclées jetables
chissement sélectif simple concentration [5.3b)]. A
l’aide d’une nouvelle pipette stérile (6.6) transférer,
6.4 Tubes à essais, de 16 mm x 160 mm et 20 mm
dans chacun de ces tubes, 1 ml de l’échantillon pour
x 200 mm, ou fioles de capacité appropriée.
essai s’il est liquide, ou 1 ml de la suspension mère
dans le cas d’autres produits.
6.5 Cloches de Durham, de dimensions appro-
priées en vue de leur utilisation dans les tubes de
9.2.3 Pour chacune des dilutions suivantes (à partir
16 mm x 160 mm (6.4).
de 10-I ou 10-2, selon l’échantillon pour essai),
opérer comme en 9.2.2. Utiliser une nouvelle pipette
6.6 Pipettes à écoulement total, de 1 ml et 10 ml de
stérile pour chaque dilution. Bien mélanger
capacité nominale.
I’inoculum et le milieu.
6.7 pH-mètre, précis à + 0,l unité de pH à 25 OC.
-
9.2.4 Incuber les tubes de milieu double concen-
tration (9.2.1) à l’étuve (6.2) à 30 OC, 35 OC ou 37 OC
(selon accord) pendant 24 h + 2 h.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage doit avoir été effectue conformé-
9.2.5 Incuber les tubes de milieu simple concen-
ment à la Norme internationale spécifique du pro-
tration (9.2.2 et 9.2.3) à l’étuve (6.2) à 30 OC, 35 OC
duit concerné. S’il n’existe pas de Norme
ou 37 OC (selon accord) pendant 24 h + 2 h, ou si, à
internationale spécifique, il est recommande que les
ce stade, on n’observe pas de formation de gaz ni
parties concernées se mettent d’accord à ce sujet.
de trouble empêchant d’apprécier un dégagement
gazeux, pendant 48 h + 2 h.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
9.3 Confirmation
Préparer l’échantillon pour essai conformément à la
Norme internationale spécifique du produit
9.3.1 A partir de chaque tube incubé selon 9.2.4,
concerné. S’il n’existe pas de Norme internationale
ensemencer avec une anse bouclée (6.3) un tube du
spécifique, il est recommande que les parties
milieu de confirmation (5.4). Incuber a 30 OC, 35 OC
concernées se mettent d’accord à ce sujet.
ou 37 OC (selon accord) pendant 24 h & 2 h, ou si, à
ce stade, on n’observe pas de dégagement de gaz,
9 Mode opératoire (voir le schéma en
pendant 48 h & 2 h.
annexe A )
9,3,2 Opérer de même pour les tubes incubés se-
Dans le cas de plusieurs échantillons examinés
lon 9.2.5 présentant un dégagement gazeux ou un
provenant d’un même lot, effectuer les opérations
trouble, des que l’un de ces phénoménes est ob-
décrites ci-après pour chaque échantillon.
servé (c’est-à-dire après 24 h + 2 h ou après
48 h + 2 h).
9.1 Prise d’essai, suspension mère et
dilutions
9.4 Interprétation
Voir I’ISO 6887 et la Norme internationale spécifique
Pour chaque dilution, compter le nombre total de
du produit concerné.
tubes où l’on note en 9.3 un dégagement gazeux
(tubes positifs), après 24 h k 2 h et, éventuellement,
Effectuer un nombre de dilutions suffisant, afin que
tous les tubes de la dernier-e dilution soient négatifs. après 48
...
Questions, Comments and Discussion
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