ISO 5667-16:1998
(Main)Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques des échantillons
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 5667-16
First edition
1998-10-01
Water quality — Sampling —
Part 16:
Guidance on biotesting of samples
Qualité de l’eau — Échantillonnage
Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques des échantillons
A
Reference number
ISO 5667-16:1998(E)
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ISO 5667-16:1998(E)
Contents Page
1 Scope . 1
2 Normative references. 1
3 Sampling. 1
4 Transport. 2
5 Preservation and storage. 3
6 Apparatus and equipment . 3
7 Pretreatment and preparation of samples . 4
8 Treatment of samples during the test . 10
9 General guidance regarding test design. 11
10 Special guidance regarding test performance . 13
11 Special biological assays . 16
12 Evaluation. 20
13 Presentation of results. 23
14 Test report. 24
15 Basic principles of quality assurance for biotesting . 25
Annex A Lowest Ineffective Dilution (LID) . 28
Annex B Bibliography . 29
© ISO 1998
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
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Printed in Switzerland
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ISO ISO 5667-16:1998(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (ISO member bodies). The work of
preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented
on that committee. International organizations, governmental and non-
governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 5667-16 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 6, Sampling.
ISO 5667 consists of the following parts, under the general title Water
quality — Sampling:
Part 1: Guidance on the design of sampling programmes
Part 2: Guidance on sampling techniques
Part 3: Guidance on the preservation and handling of samples
Part 4: Guidance on sampling from lakes, natural and man-made
Part 5: Guidance on sampling of drinking water and water used for
food and beverage processing
Part 6: Guidance on sampling of rivers and streams
Part 7: Guidance on sampling of water and steam in boiler plants
Part 8: Guidance on the sampling of wet deposition
Part 9: Guidance on sampling from marine waters
Part 10: Guidance on sampling of waste waters
Part 11: Guidance on sampling of groundwaters
Part 12: Guidance on sampling of bottom sediments
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Part 13: Guidance on sampling of water, wastewater and related
sludges
Part 14: Guidance on quality assurance of environmental water
sampling and handling
Part 15: Guidance on preservation and handling of sludge and
sediment samples
Part 16: Guidance on biotesting of samples.
Annexes A and B of this part of ISO 5667 are for information only.
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ISO ISO 5667-16:1998(E)
Introduction
Biological tests are suitable for determining the effect of chemical and
physical parameters on test organisms under specific experimental
conditions. In principle, the methods of chemical analysis are not suitable
for determining the biological effects. These effects can be enhancing or
inhibiting, and can be determined by the reaction of the organisms, e.g.
death, growth, proliferation, morphological, physiological and histological
changes. Inhibiting effects are triggered by toxic water constituents or by
other noxious influences.
Effects can refer to various levels, e.g. proceeding from (sub)cellular
structures or enzyme systems, concerning the whole organism, and
eventually the supra-organism or community level.
In the context of this part of ISO 5667, toxicity is the ability of a substance
to exert a deleterious effect on organisms or biocenoses due to its
chemical properties and its concentration.
The deleterious potential of a toxic substance can be counteracted by the
protective potential of the biological system, for instance by metabolic
detoxification and excretion. The apparent toxicity measurable in the
biological test is the result of the interaction between the substance and the
biological system.
Apart from the direct toxic effect of one or more water constituents,
damaging biological effects can be exerted by the combined action of all
noxious substances, e.g. by substances which are not toxic per se but
affect the chemical or physical properties of the medium and,
consequently, the living conditions for the organisms. This applies for
instance to oxygen-depleting substances, coloured substances or turbid
matter which reduce light exposure. It also includes non-substance-related
effects such as impairment or damage due to extreme temperature.
Biological tests also include those tests which examine the effect of
organisms on substances, e.g. microbial degradation studies.
The results of the biological tests refer primarily to the organisms used in
the test and the conditions stipulated in the test procedure. A harmful effect
stated by means of standardized tests can justify concern that aquatic
organisms and biocenoses might be endangered. The results, however, do
not permit direct or extrapolative conclusions as to the occurrence of
similar effects in the aquatic environment. This applies in particular to sub-
organism systems, as important properties and physiological functions of
intact organisms (e.g. protective integuments, repair mechanisms) are
removed or deactivated.
In principle there is no organism and no biocenosis which can be used to
test all the effects on the ecosystem possible under the various
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constellations of abiotic and biotic conditions. Only a few ("model") species
representing relevant ecological functions can be tested in practice.
Besides these fundamental and practical limitations in the selection of test
organisms, the sample to be tested can also pose experimental problems
on biotesting. Waters, in particular waste waters, are complex mixtures and
often contain sparingly soluble, volatile, unstable, coloured substances
and/or suspended, sometimes colloidal, particles. The complexity and
heterogeneity of materials give rise to a variety of experimental problems
when performing biotests.
Special problems are related to the instability of the test material due to
reactions and processes such as:
physical (e.g. phase separation, sedimentation, volatilization);
chemical (e.g. hydrolysis, photodegradation, precipitation); and/or
biological (e.g. biodegradation, biotransformation, biological uptake in
organisms).
Other problems, especially if spectrometric measurements are applied,
relate to turbidity and colour.
This part of ISO 5667 is one of a group of International Standards dealing
with the sampling of waters. It should be read in conjunction with the other
parts and in particular with ISO 5667-1, ISO 5667-2 and ISO 5667-3.
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Water quality — Sampling —
Part 16:
Guidance on biotesting of samples
1 Scope
This part of ISO 5667 gives practical guidance on sampling, pretreatment, performance and evaluation of waters in
the context of biotesting. Information is given on how to cope with the problems for biotesting arising from the nature
of the water sample and the suitability of the test design.
It is intended to convey practical experience concerning precautions to be taken by describing methods successfully
proven to solve or to circumvent some of the experimental problems of biotesting of waters.
Reference has been made as far as possible to existing International Standards and guidelines. Information taken
from published papers or oral communication is utilized as well.
Primarily dealt with are substance-related problems concerning sampling, pretreatment and preparation of water
samples for biotesting and treatment of samples during the test, especially when performing tests with waters and
waste waters containing unstable or removable ingredients. Basic principles of quality assurance, evaluation of data
and presentation of results are outlined.
Special emphasis is laid on ecotoxicological testing with organisms ('single-species biotests'). Some features
addressed in this general guidance apply as well to biodegradation and/or bioaccumulation studies as far as
sampling and sample preparations is concerned. Preparation of poorly soluble substances and testing beyond the
water-solubility limit is also addressed.
This part of ISO 5667 is not applicable to bacteriological examination of water. Appropriate methods are described
in other International Standards.
2 Normative references
The following standards contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of this part of
ISO 5667. At the time of publication, the editions indicated were valid. All standards are subject to revision, and
parties to agreements based on this part of ISO 5667 are encouraged to investigate the possibility applying the
most recent editions of the standards indicated below. Members of IEC and ISO maintain registers of currently valid
International Standards.
ISO 5667-3 :1994, Water quality — Sampling — Part 3: Guidance on the preservation and handling of samples.
ISO 5667-10 :1992, Water quality — Sampling — Part 10: Guidance on sampling of waste waters.
3 Sampling
3.1 General
The choice of representative sampling points, frequency of sampling, type of samples taken, etc. is dependent on
the objective of the study. In general, the sampling approach for chemical analysis is compatible with the purpose of
biotesting.
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Some tests, however, require the water and waste water to be handled and kept in a particular way.
Depending on the type of investigation (e.g. toxicity or biodegradation tests) and the way the samples are to be
processed, it is necessary to divide a sample into different portions which are preserved and/or stored under
different conditions and processed in different ways.
If several samples have been taken (e.g. from different locations or at several times) they may be combined to
achieve greater representativity. These samples should be thoroughly mixed and, if necessary, divided into
subsamples. To obtain subsamples of equal quality, it should be ensured that the bulk sample maintains
homogeneity during the subsampling process, e.g. by continuous shaking or stirring. This holds particularly in the
case of two-phase mixtures, e.g. waters containing suspended particles, algal suspensions. It is recommended to
use cooling sampling apparatus when several samples taken at several times are combined.
3.2 Samplers/vessels/containers
The volume, shape and material of the vessels are dependent on the nature of the sample (e.g.
degradability/stability), the number of replicates, the volume required for these tests and the necessity of preserving
and storing the samples prior to further processing.
The time required for freezing and thawing should be minimized by reducing the sample volume, i.e. the size of the
vessel. In general it is appropriate to use one-litre vessels for freezing. For tests requiring larger volumes, the
sample should be divided into vessels holding not more than 10 l.
The total sample volume taken should be sufficient to cover any supplementary or repeated testing. Remaining
subsamples stored frozen separately should be saved until the final evaluation has been made.
The material of vessels should be chemically inert, easily cleaned and resistant to heating and freezing. Glassware,
polyethene or polytetrafluoroethene (PTFE) vessels are recommended.
3.3 Filling status of containers
It should be decided whether the containers should be filled completely to the brim or only partially, having an air
space, by taking into account the type of sample, the preservation mode and the biotest envisaged.
Problems related to partial filling can be
enhanced agitation during transport, leading to breakdown of aggregated particles;
interaction with gas phase, leading to stripping;
oxidation of substances, leading e.g. to precipitation of compounds of heavy metals.
Problems related to complete filling can be
oxygen depletion, with possible decomposition, leading to formation of toxic metabolites (e.g. nitrite, sulfide);
impairment of homogenization by shaking or stirring the total volume.
Sample containers, when freezing is envisaged for preservation, should not be filled completely in order to allow
expansion of volume.
4 Transport
The samples collected should be protected from breakage, temperature increase and external contamination.
Misidentification of samples transported in melting ice should be avoided by using waterproof markers and/or labels.
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5 Preservation and storage
As stated in ISO 5667-3, it is impossible to give absolute rules for preservation, e.g. the duration of possible storage
and efficiency of various modes, because it depends primarily on the nature of the sample, especially its biological
activity.
Potable waters and ground waters are generally less susceptible to biological and chemical reactions than surface
waters, treated or raw waste waters. If the chemical composition can be approximately anticipated, reference
should be made to ISO 5667-3 for the purposes of biotesting. Some additional precautions, however, should be
considered as follows.
Samples for biotesting should be processed preferably without delay after collection to avoid changes in the original
composition as a result of physical and chemical reactions and/or biological processes. The maximum duration of
storage should not exceed 12 h at ambient temperature (maximum 25 °C). The samples should be kept in the dark
to prevent algal growth.
If testing almost immediately after sampling (or sample preparation) is not possible, e.g. when preparing composite
samples, cooling or freezing is recommended.
The most common and recommended way of preserving waste water samples is to cool to between 0 °C and 5 °C.
When cooled to this range and stored in the dark, most samples are normally stable for up to 24 h (see
ISO 5667-10). Cooling should commence as soon as possible after sampling, either in the field, for instance in cool
boxes with melting ice, or in a refrigerator in the transport vehicle.
Deep freezing below 218 °C in accordance with ISO 5667-10 allows in general an increase in conservation. A few
weeks up to 2 months, depending on the stability of samples, are generally the maximum storage periods.
Experience has shown that the quality of waste water can be affected during both freezing and thawing.
The use of biocidal preservatives should be excluded for the purpose of biotesting. The addition of highly
concentrated acids or bases to stabilize the samples, e.g. HCl or NaOH, is not recommended either.
It should be stressed that, if there is any doubt, the chemical analyst and the biotester should consult each other
before deciding on the method of handling and preserving the samples. If preservation techniques for the chemical
analysis and for biotesting are not compatible, separate subsamples should be provided for the different purposes.
6 Apparatus and equipment
6.1 Selection of apparatus
Type, shape and material of the technical equipment are dependent on the test and nature of the sample. All
materials which come into contact with the test sample should be such that interferences caused by sorption or
diffusion of the test material, by elution of foreign matter (e.g. plasticizers) or by growth of organisms, are kept to a
minimum. Inert materials are suitable, e.g. glass, PTFE. Tubing connections should be as short as possible and
replaced from time to time. Contamination of the test material, e.g. by grinding grease from stoppers or fittings,
should be avoided. Pipes made from copper, copper alloy or non-inert plastics are not suitable.
6.2 Silanization
In order to minimize adsorption of test material on containers, pipes, tubings, glassware or plasticsware can be
silanized (siliconized) by soaking or rinsing in a 5 % mass fraction solution of dichlorodimethylsilane in chloroform or
heptane. As the organic solvent evaporates, the silane is deposited on the surface, which should be rinsed many
times with water or heated at 180 °C for 2 h before use. Silanization should only be used if highly adsorbable
substances or water ingredients are to be tested and suitable inert material (e.g. PTFE) is not available.
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6.3 Cleaning of apparatus and equipment
Prior to use, the apparatus and equipment should be cleaned with suitable cleaning agents, e.g. hydrochloric acid,
sodium hydroxide, detergents, ethanol, sulfuric acid/ hydrogen peroxide and, where appropriate, sterilized, thermally
or chemically (e.g. with hypochlorite solution). Chromosulfuric acid should not be used.
Repeated rinsing of the apparatus with distilled water (or water with the same degree of purity), ensures that no
traces of cleaning or disinfection agent are left.
To efficiently remove traces of previous use, acid washing is recommended prior to final washing with distilled
water.
7 Pretreatment and preparation of samples
7.1 General
The flow diagram (figure 1) contains information on commonly (but sometimes differently) used terms in biotest
standards and guidelines.
Figure 1 — Preparation of samples for biotesting
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The sample, i.e. a chemical substance, is a preparation, solid or in solution, a mixture of various substances, water
or wastewater. The test sample is made from the sample by means of various preparatory steps specific to the
sample and the test, e.g. by dissolving, homogenizing, sedimenting, filtering, neutralizing or aerating. Dilution water
is added to prepare a series of defined dilutions. Following addition of the test-specific nutrient medium, the test
medium (including test sample) is obtained.
The final test batch is obtained by adding the test organisms – in the case of microorganisms called inoculum. The
control batch, or in several parallels, the controls are prepared from a mixture of dilution water and nutrient solution
with test organisms without the test sample.
When the effect or behaviour of a substance is known from previous tests ('reference substance') and when this
substance is examined within the framework of a test series as test sample, this is called the reference batch.
7.2 Thawing
Samples stored frozen should be thawed immediately before use. Running water or a warm water bath at a
temperature not exceeding 25 °C, together with gentle shaking, are recommended to avoid local overheating.
Complete thawing of the samples before use is essential, as the freezing process can have the effect of
concentrating some components in the inner part of the sample which freezes last. Microwave treatment involves
the risk of overheating.
7.3 Homogenization
An even distribution of all soluble and particulate components should be ensured. Gentle agitation, vigorous
shaking, ultrasonic treatment or high-speed mechanical dispersion may be applied, depending on the nature of the
samples. During this treatment step, attention should be given to the potential loss of volatile ingredients.
As a general rule, care should be taken that the original status of the sample be restored or at least be altered as
little as possible.
7.4 Separation of soluble and particulate matter
In general, biotests are carried out with the original sample. In some cases, however, large amounts of particulate
matter, sludge and sediment interfere with the behavioural requirements of test organisms (clogging of fish gills,
impairment of filter feeding of daphnids, light limitation of algae).
If these deleterious effects are not intended to be reflected by the test results, such interferences can be avoided or
overcome by various means.
Waters rich in particles can give rise to interferences, e.g. when quantifying by use of a particle counter.
Microscopic counting is strongly impaired as well. Continuous dosing is rendered unreliable by clogging and
blockage of tubing.
Filtration, centrifugation and other separation methods, however, involve the risk that active components, which are
bound to the particles, are removed prior to the test. Moreover, problems related to filtration, e.g. adsorption on and
leaching of filter materials, need to be taken into account. Sedimentation and centrifugation circumvent these
problems. When carrying out tests in the presence of particles causing severe problems, it is recommended that the
sample be allowed to settle for 30 min to 2 h or a coarse filtration (>50 μm) is carried out, thus removing only gross
particles. The separated particle mass may be examined separately.
Some test methods offer the possibility of determining a correction factor for parameters such as turbidity.
Waters rich in bacteria interfere in tests related to bacterial activity, e.g. respiration inhibition. The interference due
to the activity of bacteria in the sample can be accounted for, at least partially, by running suitable controls. When
testing certain algae, eggs and fry or cell cultures, interference can be caused by bacterial infections. Available
sterilization methods, such as thermal or UV-treatment or membrane filtration (0,2 μm), all involve a high risk of side
effects. Glass-fibre filtration is preferable when filtering is necessary. Centrifugation, e.g. 10 min at 4500 g + 1500 g,
is, in general, preferable to filtration.
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7.5 Preconcentration
Preconcentration of samples increases the concentration not only of harmful substances but of other water
constituents as well, which probably can be deleterious in higher concentrations.
Furthermore it is essential to take into consideration that in any case the preconcentration is selective depending on
the procedure applied. This alters the original composition pattern of water ingredients, e.g.
liquid/liquid extraction with organic solvents and solid phase extraction by adsorption on solids (e.g. XAD-
resins) are particularly efficient for hydrophobic water constituents. Ionic strength and osmotic pressure can be
lowered. Toxic ions, polar chemicals and coefficient (e.g. masking) water ingredients, such as humic acids, can
be excluded;
evaporation and freeze-drying can lead to a loss of volatile substances and enhance the ionic strength and
osmotic pressure;
ultrafiltration can lead to a loss especially of small molecules penetrating the membrane.
The increase in concentration above the solubility threshold can lead to precipitation or flocculation of previously
dissolved substances.
Bioaccumulation cannot be simulated by preconcentration of samples, since bioconcentration factors (BCF) cannot
be related or extrapolated.
Certain ingredients of the water sample being concentrated can undergo chemical reactions at a higher rate than in
the original sample.
Appropriate blank values can be obtained only if unpolluted reference samples, e.g. upstream of the contamination
source, are available. The increase in salinity may be allowed for by preparing blanks with equal osmolarity and
similar ionic composition (e.g. Na:K ratio).
It is not possible to extrapolate from acute tests with preconcentrated samples to chronic effects of the original
sample.
Therefore it is preferable to choose a more sensitive test system or to prolong the exposure time rather than to
preconcentrate a sample. If there is no sensitive method available to test the original sample and a pre-
concentration procedure is applied, the result is the more contestable the higher the concentration factor.
For the above-mentioned reasons, tests for acute and chronic toxicity with pre-concentrated samples are generally
meaningless and not recommended. In all cases test results obtained with pre-concentrated water samples should
be interpreted with extreme caution. Preliminary investigations of this kind cannot be standardized and should be
validated by further extensive investigations.
7.6 pH adjustment
The selection of the pH value to which the sample is to be adjusted is governed by the objective of the test:
adjustment to the pH of the receiving water will produce results more representative of the effect of toxicants
once in the environment;
adjustment to a defined pH between 6 and 9 (which is usually tolerable for aquatic biota) will permit the
expression of ionizable toxicants that would otherwise be masked by pH conditions outside this range.
Usually samples with extreme pH values exceeding the tolerance limits of the test organisms are neutralized.
Neutralization should be omitted if the effect of the pH is to be reflected in the test result or if physical modification
or chemical reactions (e.g. precipitation) are observed due to pH adjustment. The concentration of the acid or base
required for neutralization should be such that the volume change is as small as possible. Passing the neutral point
should be avoided.
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The neutralizing agent should not undergo a reaction with the ingredients in the sample, which might, for example,
lead to precipitation or complexation. Also it should not influence the test organism by enhancement or inhibition.
Usually hydrochloric acid or sodium hydroxide solutions are recommended.
7.7 Preparation of stock solutions and test batches
7.7.1 Water-soluble substances
When preparing the stock solution, the weighed portion of the substance should not exceed the maximum amount
that will dissolve (< saturation concentration). By means of stirring and/or heating, the solution kinetics can be
enhanced. This should not lead, however, to substance loss or thermal decomposition of the test sample.
7.7.2 Emulsions and suspensions stable in water
In the case of emulsions (e.g. cutting oil emulsions) and suspensions (e.g. latex milk) that are stable in water, and
also with substances forming these stable entities with water, graduated dilutions should be prepared.
If a homogeneous distribution is not obtained in the stock liquor, the mixture should be stirred or shaken for up to
one day.
7.7.3 Poorly soluble substances
7.7.3.1 General
Substances with a solubility in water of less than approximately 100 mg/l should be considered as sparingly soluble.
When examining poorly soluble substances, ensure that no undissolved matter remains as sediment, as floating
particles or in dispersed form. Hence, in order to secure reproducible results, those methods are to be used that
ensure the best homogeneous distribution of the test compound in the test batch.
In the case of toxicity tests, it is advisable first to ascertain whether the substance has effects in the range of its
water solubility. It should be borne in mind that in the case of some pure substances there is sometimes overlapping
between molecular-dispersed and micellar- and colloid-dispersed up to coarsely dispersed systems (example:
isomer-pure surfactants). In the case of isomer mixtures, e.g. surfactants, there is no substance-specific solubility
limit. Simple optical methods (e.g. light-scattering measurements) do not permit any reliable determination of the
degree of dispersion.
It is impossible to recommend one single method for generating an optimum solution or distribution
of the substances in the medium, since the method selected should correspond to the physical properties of the
substance. For that reason it has to be left to the experience of the investigator and/or production information
of the manufacturer to select an appropriate method.
The following guidance is derived from practical experience and contains advice on ways and means which enable
the investigator, after
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 5667-16
Première édition
1998-10-01
Qualité de l’eau — Échantillonnage —
Partie 16:
Lignes directrices pour les essais biologiques
des échantillons
Water quality — Sampling —
Part 16: Guidance on biotesting of samples
A
Numéro de référence
ISO 5667-16:1998(F)
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ISO 5667-16:1998(F)
Sommaire
1 Domaine d'application.1
2 Références normatives .1
3 Échantillonnage .2
4 Transport .3
5 Conservation et stockage .3
6 Matériels et équipements.4
7 Prétraitement et préparation des échantillons .4
8 Traitement des échantillons lors de l'essai.12
9 Ligne directrice relative à la conception de l'essai .13
10 Ligne directrice spécifique relative à la réalisation des essais .15
11 Essais biologiques spécifiques .18
12 Évaluation.22
13 Présentation des résultats.26
14 Rapport d'essai .27
15 Principes de base de l'assurance qualité relative aux essais biologiques.28
Annexe A (informative) Plus faible dilution sans effet (LID) .31
(informative)
Annexe B Bibliographie .32
© ISO 1998
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
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Imprimé en Suisse
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ISO 5667-16:1998(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptées par les comités techniques sont soumis aux comités membres
pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 5667-16 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-
comité SC 6, Échantillonnage (méthodes générales).
L’ISO 5667 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l’eau — Échantillonnage:
— Partie 1: Guide général pour l’établissement des programmes d’échantillonnage
— Partie 2: Guide général sur les techniques d’échantillonnage
— Partie 3: Guide général pour la conservation et la manipulation des échantillons
— Partie 4: Guide pour l’échantillonnage des eaux des lacs naturels et des lacs artificiels
— Partie 5: Guide pour l’échantillonnage de l’eau potable et de l’eau utilisée dans l’industrie alimentaire et des
boissons
— Partie 6: Guide pour l’échantillonnage des rivières et des cours d’eau
— Partie 7: Guide général pour l’échantillonnage des eaux et des vapeurs dans les chaudières
— Partie 8: Guide général pour l’échantillonnage des dépôts humides
— Partie 9: Guide général pour l’échantillonnage des eaux marines
— Partie 10: Guide pour l’échantillonnage des eaux résiduaires
— Partie 11: Guide général pour l’échantillonnage des eaux souterraines
— Partie 12: Guide général pour l’échantillonnage des sédiments
— Partie 13: Guide pour l’échantillonnage de boues provenant d’installations de traitement de l’eau et des eaux
usées
— Partie 14: Lignes directrices pour le contrôle de la qualité dans l’échantillonnage et la manutention des eaux
environnementales
— Partie 15: Lignes directrices pour la préservation et le traitement des échantillons de boue et de sédiments
— Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques des échantillons
Les annexes A et B de la présente partie de l’ISO 5667 sont données uniquement à titre d’information.
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ISO 5667-16:1998(F)
Introduction
Les essais biologiques sont effectués pour déterminer l'effet des paramètres chimiques et physiques sur les
organismes d'essai dans des conditions expérimentales spécifiées. En principe, les méthodes d'analyse chimique
ne conviennent pas pour la détermination des effets biologiques. Ces effets peuvent être la stimulation ou l’inhibition
et peuvent être déterminés par la réaction des organismes, par exemple mort, croissance, prolifération,
modifications morphologiques, physiologiques et histologiques. Les effets d'inhibition sont déclenchés par des
constituants toxiques de l'eau ou par d'autres influences nocives.
Les effets peuvent se rapporter à différents niveaux (par exemple découlant de structures (sub-)cellulaires ou de
systèmes d'enzymes, concernant l’ensemble de l'organisme) et, le cas échéant, au niveau supra-organismique ou
communautaire.
Dans le cadre de la présente partie de l’ISO 5667, la toxicité est la capacité d'une substance à induire un effet nocif
sur les organismes ou biocénoses en raison de ses propriétés chimiques et de sa concentration.
Le potentiel nocif d'une substance toxique peut être contrecarré par le potentiel de protection du système
biologique, par exemple par détoxication métabolique et excrétion. La toxicité apparente mesurable par l'essai
biologique est le résultat de l'interaction entre la substance et le système biologique.
Mis à part les effets toxiques directs d'un ou de plusieurs constituants de l'eau, des effets biologiques préjudiciables
peuvent se développer par l'action combinée de toutes les substances nocives, par exemple par des substances
non toxiques en elles-mêmes mais qui affectent les propriétés chimiques ou physiques du milieu et, par
conséquent, les conditions de vie des organismes. Ceci s'applique par exemple aux substances consommant de
l’oxygène, aux substances colorées ou aux matières turbides qui réduisent l'exposition à la lumière. Ceci comprend
également les effets non liés aux substances tels que les influences défavorables ou les endommagements dus à
des températures extrêmes.
Les essais biologiques comprennent également les essais qui examinent l'effet des organismes sur les substances,
par exemple les études de dégradation microbienne.
Les résultats des essais biologiques font principalement référence aux organismes utilisés pour les essais et aux
conditions stipulées dans le mode opératoire d'essai. Un effet nocif établi au moyen d'essais normalisés peut
renseigner sur un danger potentiel pour les organismes et les biocénoses aquatiques. Cependant, les résultats ne
permettent pas de tirer des conclusions directes ou d'extrapolation en ce qui concerne la présence d'effets
similaires dans l'environnement aquatique. Ceci s'applique en particulier au niveau du sub-organisme, dans la
mesure où des propriétés et des fonctions physiologiques importantes des organismes entiers (par exemple
téguments protecteurs, mécanismes de réparation) sont supprimées ou désactivées.
En principe, aucun organisme et aucune biocénose ne peut être utilisé pour examiner tous les effets possibles sur
l'écosystème compte tenu du grand nombre de conditions abiotiques et biotiques possibles. Seules quelques
espèces («modèles») représentant les fonctions écologiques majeures peuvent en pratique être soumises à l'essai.
Outre ces limitations fondamentales et pratiques dans la sélection des organismes d'essai, l'échantillon devant être
soumis à l'essai peut poser des problèmes d'expérimentation en matière d'essai biologique. Les eaux, en particulier
les eaux résiduaires, sont des mélanges complexes et contiennent souvent des substances difficilement solubles,
volatiles, instables, colorées et/ou des particules en suspension, parfois colloïdales. La complexité et l'hétérogénéité
des matériaux entraînent toute une variété de problèmes expérimentaux lors de la réalisation des essais
biologiques.
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ISO 5667-16:1998(F)
Des problèmes spéciaux sont liés à l'instabilité du matériau d'essai en raison des réactions et des procédés, tels
que:
— ceux de nature physique (par exemple séparation de phases, sédimentation, volatilisation);
— ceux de nature chimique (par exemple hydrolyse, photodégradation, précipitation); et/ou
— ceux de nature biologique (par exemple, biodégradation, biotransformation, capacité d'absorption biologique au
sein des organismes).
D’autres problèmes, particulièrement en cas d'application de mesures spectrométriques, sont liés à la turbidité et à
la couleur.
La présente partie de l'ISO 5667 fait partie d'un groupe de Normes internationales relatives à l'échantillonnage des
eaux. Il convient de la lire conjointement avec les autres parties et, en particulier, avec l’ISO 5667-1, l’ISO 5667-2 et
l’ISO 5667-3.
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NORME INTERNATIONALE ISO ISO 5667-16:1998(F)
Qualité de l’eau — Échantillonnage —
Partie 16:
Lignes directrices pour les essais biologiques des échantillons
1 Domaine d'application
La présente partie de l’ISO 5667 fournit des lignes directrices sur l'échantillonnage, le prétraitement, la mise en
œuvre et l'évaluation des eaux dans le cadre des essais biologiques. Des informations sont données sur la manière
de traiter les problèmes résultant de la nature de l'échantillon d’eau et sur l’adaptation du protocole expérimental.
Elle est destinée à diffuser une expérience pratique concernant les précautions à prendre en décrivant des
méthodes qui se sont révélées satisfaisantes dans la résolution ou l’élimination de certains problèmes
expérimentaux au cours des essais biologiques.
Il a été fait référence aux Normes internationales et aux directives existantes dans toute la mesure du possible. Les
informations provenant de publications ou de communications orales sont également utilisées.
La présente partie de l’ISO 5667 traite en premier lieu des problèmes liés aux substances en ce qui concerne
l'échantillonnage, le prétraitement et la préparation d'échantillons d'eau pour les essais biologiques et le traitement
des échantillons au cours de l'essai — particulièrement lors de la réalisation d'essais avec des eaux et des eaux
résiduaires contenant des composés instables ou susceptibles d'être éliminés. Les principes fondamentaux
d'assurance qualité, d'évaluation des données et de présentation des résultats y sont soulignés.
L'accent est mis sur les essais écotoxicologiques réalisés avec des organismes («essais biologiques
monospécifiques»). Certaines caractéristiques traitées dans ces lignes directrices s'appliquent également à
l'échantillonnage et la préparation d'échantillons pour les études de biodégradation et/ou de bioaccumulation. La
préparation de substances faiblement solubles et les essais réalisés au-delà des limites de solubilité de l'eau y sont
également traités.
La présente partie de l’ISO 5667 n’est pas applicable à l’examen bactériologique des eaux. Des méthodes
appropriées sont décrites dans d’autres Normes internationales.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente partie de l’ISO 5667. Au moment de la publication, les éditions indiquées
étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
partie de l'ISO 5667 sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de l'ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
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ISO 5667-16:1998(F)
ISO 5667-3:1994, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 3: Guide général pour la conservation et la manipu-
lation des échantillons.
ISO 5667-10:1992, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 10: Guide pour l'échantillonnage des eaux rési-
duaires.
3 Échantillonnage
3.1 Généralités
Le choix de points d'échantillonnage représentatifs, de la fréquence d'échantillonnage, du type d'échantillons
prélevés, etc., dépend de l'objectif de l'étude. En général, l'approche d'échantillonnage de l'analyse chimique est
compatible avec l'objectif de l'essai biologique.
Certains essais nécessitent cependant de manipuler et de conserver l'eau et les eaux résiduaires d'une manière
particulière.
En fonction du type d'analyses (par exemple essais de toxicité ou de biodégradation) et de la manière dont les
échantillons doivent être traités, il est nécessaire de diviser un échantillon en différentes parties qui sont conservées
et/ou stockées dans différentes conditions et traitées de différentes manières.
Lorsque plusieurs échantillons ont été prélevés (par exemple à partir d'emplacements différents ou à des moments
différents), ils peuvent être combinés pour obtenir une meilleure représentativité. Il convient que ces échantillons
soient bien mélangés et, si nécessaire, divisés en sous-échantillons. Pour obtenir des sous-échantillons de qualité
égale, il convient de s'assurer que l'échantillon composite conserve son homogénéité lors du procédé de sous-
échantillonnage, par exemple en l'agitant ou en le secouant de manière continue. Ceci vaut particulièrement dans le
cas de mélanges en deux phases (par exemple eaux contenant des particules en suspension, suspensions
d'algues). Il est recommandé d’utiliser un dispositif d’échantillonnage réfrigéré lorsque plusieurs échantillons,
prélevés à des temps différents, sont combinés.
3.2 Échantillonneurs/récipients/conteneurs
Le volume, la forme et le matériau des récipients dépendent de la nature de l'échantillon (par exemple dégrada-
bilité/stabilité), du nombre de réplicats, du volume requis pour ces essais et de la nécessité de conserver et de
stocker les échantillons avant tout autre traitement.
Il convient de raccourcir le temps de congélation-décongélation en réduisant le volume de l'échantillon, c'est-à-dire
la dimension du récipient. En général, il est approprié d'utiliser des récipients de 1 litre pour la congélation. Pour des
essais nécessitant des volumes plus importants, il convient de répartir l'échantillon dans des récipients ne
contenant pas plus de 10 litres.
Il convient que le volume d'échantillon total soit suffisant pour réaliser tout essai supplémentaire ou tout réplicat. Il
convient que les sous-échantillons restants stockés réfrigérés séparément soient conservés jusqu'à ce que
l'évaluation finale ait été effectuée.
Il convient que le matériau des récipients soit chimiquement inerte, facilement nettoyable et résistant à la chaleur et
au froid. Des récipients en verre, en polyéthylène ou en polytétrafluoroéthylène (PTFE) sont recommandés.
3.3 Condition de remplissage des récipients
Il convient de décider si les récipients doivent être remplis jusqu'à ras bord ou uniquement partiellement, en laissant
de l'air, en tenant compte du type d'échantillon, du mode de conservation et de l'essai biologique envisagé.
Les problèmes liés à un remplissage partiel peuvent conduire à:
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— une agitation accrue lors du transport, entraînant la désagrégation des agrégats de particules;
— une interaction avec la phase gazeuse, entraînant une perte par volatilisation;
— une oxydation de substances, entraînant par exemple la précipitation de composés de métaux lourds.
Les problèmes liés au remplissage complet peuvent conduire à:
— un appauvrissement en oxygène, avec une décomposition possible, entraînant la formation de métabolites
toxiques (par exemple nitrite, sulfure);
— une altération de l'homogénéisation par agitation du volume total.
Lorsque la congélation est envisagée comme moyen de conservation, les récipients d'échantillons ne doivent pas
être remplis complètement pour permettre l'expansion du volume.
4 Transport
Il convient de protéger les échantillons prélevés contre le risque de casse, d'augmentation de température et de
contamination extérieure. Il convient d'éviter toute mauvaise identification des échantillons transportés dans de la
glace fondante en utilisant des marqueurs et/ou des étiquettes indélébiles à l’eau.
5 Conservation et stockage
Comme spécifié dans l'ISO 5667-3, il est impossible de donner des règles de conservation absolues, par exemple
la durée du stockage possible et l'efficacité des différents modes, dans la mesure où cela dépend principalement de
la nature de l'échantillon, particulièrement de son activité biologique.
Les eaux potables et les eaux souterraines sont généralement moins sujettes aux réactions biologiques et
chimiques que les eaux de surface et les eaux résiduaires traitées ou brutes. Lorsque la composition chimique peut
être évaluée de manière approximative, il convient de faire référence à l'ISO 5667-3 pour les besoins de l'essai
biologique. Il convient cependant de prendre certaines précautions supplémentaires de la manière suivante.
Il convient de traiter les échantillons pour essai biologique de préférence sans le moindre retard après leur
prélèvement, pour éviter toutes modifications dans la composition initiale suite aux réactions physiques et
chimiques et/ou aux processus biologiques. Il convient que la durée maximale de stockage ne dépasse pas 12 h à
température ambiante (25 °C au maximum). Il est recommandé de conserver les échantillons à l’obscurité afin
d’éviter une croissance algale.
Lorsqu'il n'est pas possible de procéder à un essai presque immédiatement après l'échantillonnage (ou la
préparation des échantillons), par exemple lors de la préparation d'échantillons composites, la réfrigération ou la
congélation sont recommandées.
Le moyen de conservation des échantillons d'eaux résiduaires recommandé et le plus courant est de les réfrigérer à
une température comprise entre 0 °C et 5 °C. La durée de stabilité d'échantillons stockés à cette température et à
l'obscurité est normalement de 24 h (voir l’ISO 5667-10). Il convient que la réfrigération commence dès que
possible après l'échantillonnage, soit sur le site, par exemple dans des boîtes froides avec de la glace fondante, ou
dans un réfrigérateur dans le véhicule de transport.
Une congélation au-dessous de -18 °C conformément à l'ISO 5667-10 permet généralement une conservation
prolongée. Les périodes maximales de stockage vont généralement de quelques semaines à 2 mois, en fonction de
la stabilité des échantillons.
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L'expérience a montré que la qualité des eaux résiduaires peut être affectée lors de la congélation et de la
décongélation.
Il convient de ne pas utiliser d'agents de préservation biocides pour les besoins de l'essai biologique. Il n'est pas
non plus recommandé d'ajouter des acides ou des bases de forte concentration pour stabiliser les échantillons, par
exemple HCl ou NaOH.
Il convient de souligner que, si un doute persiste, le chimiste analyste et le biologiste doivent se consulter avant de
décider de la méthode de manipulation et de conservation des échantillons. Lorsque les techniques de conservation
pour l'analyse chimique et l'essai biologique ne sont pas compatibles, il convient de fournir des sous-échantillons
séparés pour les différents besoins.
6 Matériels et équipements
6.1 Choix du matériel
Le type, la forme et le matériau de l'équipement technique dépendent de l'essai et de la nature de l'échantillon. Il
convient que les matériaux qui entrent en contact avec l'échantillon pour essai soient tels que les interférences
dues à la sorption ou à la diffusion du matériau d'essai, ou à l'élution de matières étrangères (par exemple
plastifiants) et/ou à la croissance des organismes, soient réduites au minimum. Les matériaux inertes conviennent,
par exemple le verre ou le polytétrafluoroéthylène. Il convient que les tuyauteries utilisées soient aussi courtes que
possible et remplacées de temps à autre. Il convient d'éviter toute contamination du matériau d'essai, par exemple
par les graisses des dispositifs de fermeture ou des accessoires. Les tubes en cuivre, alliage cuivre ou en matières
plastiques non inertes ne sont pas appropriés.
6.2 Silanisation
Afin de réduire l'adsorption du matériau d'essai sur les récipients, les conduits ou les tubes, les verres ou les
plastiques peuvent être silanisés (siliconés) en les immergeant ou en les rinçant dans une solution à 5 % en masse
de dichlorodiméthylsilane dans du chloroforme ou de l'heptane. Au moment où le solvant organique s'évapore, le
silane est déposé à la surface, qu'il convient de rincer de nombreuses fois avec de l'eau ou de chauffer à 180 °C
pendant 2 h avant utilisation. Il convient de n'utiliser la silanisation que lorsque des substances ou des constituants
de l'eau à fort potentiel d'adsorption doivent être soumis à l'essai, et lorsque un matériau inerte approprié (par
exemple le polytétrafluoroéthylène) n'est pas disponible.
6.3 Nettoyage du matériel et des équipements
Avant utilisation, il convient de nettoyer le matériel et les équipements avec des produits nettoyants appropriés, par
exemple acide chlorhydrique, hydroxyde de sodium, détergents, éthanol, acide sulfurique/peroxyde d'hydrogène et,
le cas échéant, stérilisés, thermiquement ou chimiquement (par exemple avec une solution d'hypochlorite). Il est
recommandé de ne pas utiliser d'acide sulfochromique.
Un rinçage répété du matériel avec de l'eau distillée (ou de l'eau ayant le même degré de pureté) garantit qu'il ne
reste aucune trace de produit de nettoyage ou de désinfection.
Pour enlever de manière efficace les traces d'une utilisation précédente, un lavage à l'acide est recommandé avant
le lavage final avec de l'eau distillée.
7 Prétraitement et préparation des échantillons
7.1 Généralités
Le diagramme des opérations successives (figure 1) contient des informations sur les termes couramment utilisés
(mais parfois différemment) dans les normes et lignes directrices relatives aux essais biologiques.
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Figure 1 — Préparation des échantillons pour les essais biologiques
L’échantillon, c’est-à-dire une substance chimique, est une préparation, solide ou en solution, ou un mélange de
diverses substances ou une eau ou une eau résiduaire. L’échantillon d’essai est réalisé à partir de l’échantillon au
moyen d’étapes de préparation diverses spécifiques de l’échantillon et de l’essai, par exemple par dissolution,
homogénéisation, sédimentation, filtration, neutralisation ou aération. L’eau de dilution est ajoutée pour préparer
une série de dilutions définies. Le milieu d’essai (incluant l’échantillon d’essai) est obtenu après ajout du milieu
nutritif spécifique de l’essai.
Le lot d’essai final est obtenu par ajout des organismes d’essai — appelé inoculum dans le cas de micro-
organismes. Le lot témoin ou les lots témoins menés en parallèle sont préparés à partir d’un mélange d’eau de
dilution et de solution nutritive avec les organismes d’essai et sans l’échantillon d’essai.
Lorsque l’effet ou le comportement d’une substance est connu suite à des essais antérieurs («substance de
référence») et lorsque cette substance est soumise à l’essai comme échantillon d’essai dans le cadre d’une série
d’essais, cela est désigné comme lot de référence.
7.2 Décongélation
Il convient de décongeler les échantillons stockés réfrigérés, immédiatement avant utilisation. Une eau courante ou
un bain-marie d'une température ne dépassant pas 25 °C associé à une légère agitation sont recommandés pour
éviter une surchauffe locale.
La décongélation complète des échantillons avant utilisation est essentielle dans la mesure où le procédé de
congélation peut avoir un effet de concentration de certains composants dans la partie centrale de l'échantillon qui
se congèle en dernier. Un traitement par micro-ondes entraîne un risque de surchauffe.
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7.3 Homogénéisation
Il convient d'assurer une répartition uniforme de tous les composants solubles et particulaires. En fonction de la
nature des échantillons, il est admis d'appliquer une légère agitation, une agitation vigoureuse, un traitement aux
ultrasons ou une dispersion mécanique à grande vitesse. Durant cette étape de traitement, il convient d'accorder
une attention particulière à la perte potentielle de composés volatils.
En règle générale, il convient de veiller à ce que l'état initial de l'échantillon soit restauré ou au moins modifié le
moins possible.
7.4 Séparation des matières solubles et particulaires
En général, les essais biologiques sont effectués avec l'échantillon brut. Dans certains cas, cependant,
d'importantes quantités de matières particulaires, de boues ou de sédiments peuvent interférer sur le comportement
des organismes d'essai (obturation des branchies des poissons, altération de la capacité de nourriture par filtrage
des daphnies, limitation de l’éclairement des algues).
Lorsque les résultats d'essai ne sont pas destinés à traduire ces effets nocifs, ces interférences peuvent être
évitées ou maîtrisées par différents moyens.
Les eaux riches en particules peuvent entraîner des interférences, par exemple lors du dénombrement à l'aide d'un
compteur de particules. Le dénombrement microscopique est également fortement entravé. L’apport continu
d’échantillon dans les essais dynamiques peut être perturbé par colmatage ou obstruction des tubes.
La filtration, la centrifugation et d'autres méthodes de séparation impliquent cependant le risque que les
composants actifs, liés aux particules, soient éliminés avant l'essai. En outre, les problèmes liés à la filtration, par
exemple l'adsorption et le lessivage des matériaux filtrants, doivent être pris en compte. La sédimentation et la
centrifugation évitent ces problèmes. Lorsque l'on réalise des essais en présence de particules pouvant poser
problèmes, il est recommandé de laisser reposer l'échantillon pendant une période comprise entre 30 min et 2 h ou
d'effectuer une filtration grossière (> 50 μm), ne supprimant ainsi que les grosses particules. La masse des
particules séparées peut être examinée séparément.
Certaines méthodes d'essai offrent la possibilité de déterminer un facteur de correction pour les paramètres tels
que la turbidité.
Les eaux riches en bactéries interfèrent sur les essais relatifs à l'activité bactérienne, par exemple inhibition de la
respiration. L'interférence due à l'activité des bactéries dans l'échantillon peut être prise en compte, au moins
partiellement, en procédant à des contrôles appropriés. Lors de l'essai avec certaines algues, certains œufs et
certains alevins ou des cultures cellulaires, une interférence peut être causée par des infections bactériennes.
Toutes les méthodes de stérilisation disponibles, telles que traitement thermique, par ultraviolets, ou filtration sur
membrane (0,2 μm) impliquent un risque élevé d'effets secondaires. Il est préférable d'utiliser un filtre en fibre de
verre lorsque la filtration est nécessaire. La centrifugation, par exemple 10 min à (4 500 ± 1 500) g, est générale-
ment préférable à la filtration.
7.5 Préconcentration
La préconcentration des échantillons accroît la concentration non seulement des substances polluantes mais
également des autres constituants de l'eau, qui risquent d'être nocifs à des concentrations plus élevées.
En outre, il est essentiel de tenir compte que la préconcentration est sélective dans tous les cas, en fonction de la
méthode appliquée, ce qui modifie la compositi
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.