Milk and milk products -- Determination of alkaline phosphatase activity

ISO 11816-1|IDF 155-1:2006 specifies a fluorimetric method for the determination of alkaline phosphatase (ALP, EC 3.1.3.1) activity in pasteurised whole milk, semi-skimmed milk, skimmed milk and flavoured milks. The method is applicable for milk from cows, sheep and goats, and milk-based drinks. The method is also suitable for the determination of high alkaline phosphatase activity in raw milk and heat-treated milk with activities of more than 2 000 mU/l after dilution of the sample as specified.

Lait et produits laitiers -- Détermination de l'activité de la phosphatase alcaline

L'ISO 11816-1|FIL 155-1:2006 décrit une méthode fluorimétrique pour la détermination de l'activité de la phosphatase alcaline (ALP, EC 3.1.3.1) dans les laits pasteurisés entiers, demi-écrémés, écrémés et aromatisés. La présente méthode est applicable aux laits de vache, de brebis et de chèvre, et aux boissons à base de lait. La méthode convient également pour la détermination d'activités élevées de la phosphatase alcaline dans le lait cru et le lait traité thermiquement, ayant des activités de plus de 2 000 milliunités par litre (mU/l) après dilution de l'échantillon, comme spécifié.

General Information

Status
Replaced
Publication Date
06-Apr-2006
Withdrawal Date
06-Apr-2006
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
28-Mar-2006
Completion Date
07-Apr-2006
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ISO 11816-1:2006 - Milk and milk products -- Determination of alkaline phosphatase activity
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ISO 11816-1:2006 - Lait et produits laitiers -- Détermination de l'activité de la phosphatase alcaline
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11816-1
IDF
155-1
Second edition
2006-04-15
Milk and milk products — Determination
of alkaline phosphatase activity —
Part 1:
Fluorimetric method for milk
and milk-based drinks
Lait et produits laitiers — Détermination de l'activité de la phosphatase
alcaline
Partie 1: Méthode fluorimétrique pour le lait et les boissons à base de
lait
Reference numbers
ISO 11816-1:2006(E)
IDF 155-1:2006(E)
ISO and IDF 2006
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 11816-1:2006(E)
IDF 155-1:2006(E)
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and IDF national committees. In the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the ISO Central Secretariat at the

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All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,

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address below.
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Published in Switzerland
ii © ISO and IDF 2006 – All rights reserved
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ISO 11816-1:2006(E)
IDF 155-1:2006(E)
Contents Page

Foreword............................................................................................................................................................ iv

1 Scope ..................................................................................................................................................... 1

2 Terms and definitions........................................................................................................................... 1

3 Principle................................................................................................................................................. 1

4 Reagents................................................................................................................................................ 2

5 Apparatus .............................................................................................................................................. 3

6 Sampling................................................................................................................................................ 3

7 Preparations .......................................................................................................................................... 3

7.1 Alkaline phosphatase-free milk........................................................................................................... 3

7.2 Preparation of test sample................................................................................................................... 4

8 Procedure .............................................................................................................................................. 4

8.1 Verification of instrument performance ............................................................................................. 4

8.2 Calibration ............................................................................................................................................. 4

8.3 Determination........................................................................................................................................ 5

8.4 Control tests.......................................................................................................................................... 5

9 Calculation and expression of results................................................................................................ 7

9.1 Calibration ratio .................................................................................................................................... 7

9.2 Calculation............................................................................................................................................. 7

9.3 Expression of test results.................................................................................................................... 7

10 Precision................................................................................................................................................ 8

10.1 Interlaboratory test ............................................................................................................................... 8

10.2 Repeatability.......................................................................................................................................... 8

10.3 Reproducibility...................................................................................................................................... 8

11 Test report ............................................................................................................................................. 8

Annex A (informative) Interlaboratory trial ...................................................................................................... 9

Bibliography ..................................................................................................................................................... 11

© ISO and IDF 2006 – All rights reserved iii
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ISO 11816-1:2006(E)
IDF 155-1:2006(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through

ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has

been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental

and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the

International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards

adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an

International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

ISO 11816-1⎪IDF 155-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee

SC 5, Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO

and IDF.

This edition of ISO 11816-1⎪IDF 155-1 cancels and replaces ISO 11816-1:1997, which has been technically

revised.

ISO 11816⎪IDF 155 consists of the following parts, under the general title Milk and milk products —

Determination of alkaline phosphatase activity:
⎯ Part 1: Fluorimetric method for milk and milk-based drinks
⎯ Part 2: Fluorimetric method for cheese
iv © ISO and IDF 2006 – All rights reserved
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ISO 11816-1:2006(E)
IDF 155-1:2006(E)
Foreword

IDF (the International Dairy Federation) is a worldwide federation of the dairy sector with a National

Committee in every member country. Every National Committee has the right to be represented on the IDF

Standing Committees carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO in the development of

standard methods of analysis and sampling for milk and milk products.

Draft International Standards adopted by the Action Teams and Standing Committees are circulated to the

National Committees for voting. Publication as an International Standard requires approval by at least 50 % of

the IDF National Committees casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

ISO 11816-1⎪IDF 155-1 was prepared by the International Dairy Federation (IDF) and Technical Committee

ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is being published jointly by IDF

and ISO.

All work was carried out by the Joint ISO-IDF Action Team Characterization to heat treatment, of the Standing

Committee on Minor components and characterization of physical properties, under the aegis of its project

leader, Mr F. Harding (UK).

This edition of ISO 11816-1⎪IDF 155-1 cancels and replaces IDF 155A:1999, which has been technically

revised.

ISO 11816⎪IDF 155 consists of the following parts, under the general title Milk and milk products —

Determination of alkaline phosphatase activity:
⎯ Part 1: Fluorimetric method for milk and milk-based drinks
⎯ Part 2: Fluorimetric method for cheese
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ISO 11816-1:2006(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 155-1:2006(E)
Milk and milk products — Determination of alkaline
phosphatase activity —
Part 1:
Fluorimetric method for milk and milk-based drinks
1 Scope

This part of ISO 11816⎪IDF 155 specifies a fluorimetric method for the determination of alkaline phosphatase

(ALP, EC 3.1.3.1) activity in pasteurized whole milk, semi-skimmed milk, skimmed milk and flavoured milks.

The method is applicable for milk from cows, sheep and goats, and milk-based drinks.

The method is also suitable for the determination of high alkaline phosphatase activity in raw milk and heat-

treated milk with activities of more than 2 000 mU/l after dilution of the sample as specified.

2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
alkaline phosphatase activity
APL activity

activity of the alkaline phosphatase present in the product, determined by the procedure specified in this part

of ISO 11816⎪IDF 155

NOTE The alkaline phosphatase activity is expressed as milliunits of enzyme activity per litre (mU/l).

2.2
unit of alkaline phosphatase activity

amount of alkaline phosphatase enzyme that catalyses the transformation of 1 µmol of substrate per minute

3 Principle

The alkaline phosphatase activity of the sample is measured by a continuous fluorimetric direct kinetic assay.

A non-fluorescent aromatic monophosphoric ester substrate, 2′-[2-benzothiazolyl]-6′-hydroxybenzothiazole

phosphate, in the presence of any alkaline phosphatase derived from the sample, undergoes hydrolysis of its

phosphate radical, producing a highly fluorescent product. Fluorimetric measurement of alkaline phosphatase

(ALP) activity is measured at 38 °C over a 3-min period when using the substrate. This includes pre-

incubation of substrate and sample, followed by multiple kinetic readings of the reaction rate.

NOTE Although this is a 3-min test, the first minute is an equilibration period to ensure that the sample is at 38 °C.

Measurements of activity are actually made from the beginning of the second minute to the end of the third minute

(i.e. over a 2-min period).
© ISO and IDF 2006 – All rights reserved 1
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ISO 11816-1:2006(E)
IDF 155-1:2006(E)
4 Reagents

Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled or demineralized

water or water of equivalent purity.
® 1) ®

4.1 Fluorophos substrate , in bottles, each containing 144 mg of Fluorophos substrate powder.

This is a non-fluorescent aromatic monophosphoric ester substrate, 2′-[2-benzothiazolyl]-6′-hydroxybenzothiazole

® ®

phosphate (Fluorophos ). The Fluorophos substrate remains stable for 2 years when stored in unopened

bottles at between 2 °C and 8 °C.

4.2 Substrate buffer solution, diethanolamine (DEA) buffer solution, c(DEA) = 2,4 mol/l, with pH 10,0, in

bottles of 240 ml each.

The substrate buffer solution remains stable for 2 years when stored in unopened bottles at between 2 °C and

8 °C.
4.3 Working substrate

Allow the Fluorophos substrate (4.1) and the substrate buffer solution (4.2) to come to room temperature.

Add the content of one bottle of substrate buffer solution (240 ml) (4.2) to that of one bottle Fluorophos

substrate (144 mg) (4.1) and mix well by inversion for 3 min. Use amber glass to protect against light.

Allow the obtained solution stand at room temperature for at least 30 min prior to use.

Use the analog-to-digital test given in 8.4.1.1 to test the suitability of the ready to use working substrate.

The working substrate remains stable for 60 days when protected from light and stored at between 2 °C and

8 °C, or for 8 h when stored at 38 °C. Do not use the working substrate if a reading above 1 200 is obtained

(see 8.4.1.1.5).

NOTE The obtained volume of the working substrate (240 ml) is sufficient for approximately 115 tests.

4.4 Working calibrator solutions, Fluoroyellow (FY) [2′-(2-benzothiazolyl)-6′-hydroxybenzothiazole] in

DEA buffer (4.2).

The working calibrator solutions remain stable for 18 months when stored at between 2 °C and 8 °C.

4.4.1 Calibrator solution A, containing 0 µmol/l of Fluoroyellow .
–3 ®
4.4.2 Calibrator solution B, containing 17,24 × 10 µmol/l of Fluoroyellow .
–3 ®
4.4.3 Calibrator solution C, containing 34,48 × 10 µmol/l of Fluoroyellow .
–3 ®

4.5 Daily instrument control solution, containing 34,48 × 10 µmol/l of Fluoroyellow .

1) The reagents specified in 4.1 to 4.5 and the apparatus specified in 5.1 to 5.4 (except 5.3.3) are available as

Fluorophos Test System from Advanced Instruments, Inc., Two Technology Way, Norwood, Massachusetts 02062, USA.

The manufacturer may change packaging configurations supplied with the Fluorophos Test System. The user should refer

to the manufacturer’s instructions for preparing reagents if different from those specified herein. Fluorophos and

Fluoroyellow are registered trademarks of Advanced Instruments, Inc. and are examples of suitable products available

commercially.

This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by either

ISO or IDF of these products.
2 © ISO and IDF 2006 – All rights reserved
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ISO 11816-1:2006(E)
IDF 155-1:2006(E)
5 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.

5.1 Filter fluorimeter, with thermostatically controlled cuvette holder, capable of operating at 38 °C ± 1 °C

and right-angle optics, allowing excitation at a wavelength of 440 nm and emission at between 520 nm and

® 1)

560 nm [e.g. Fluorophos instrument ]. Measurements should be optimized according to the manufacturers

instructions.

5.2 Cuvettes, disposable, non-fluorescent glass, of diameter 12 mm and of length 75 mm.

5.3 Pipettes.
5.3.1 Fixed-volume dispenser, capable of dispensing 2,0 ml.
5.3.2 Positive-displacement or air-displacement pipette, of capacity 0,075 ml.
5.3.3 Pipette, of capacity 2 ml.

5.4 Incubator block, capable of maintaining a temperature of 38 °C ± 1 °C, suitable for holding cuvettes.

5.5 Parafilm , or other suitable laboratory-grade film.
5.6 Vortex mixer.

5.7 Water bath, capable of maintaining a temperature of 63 °C ± 1 °C and 95 °C ± 1 °C.

5.8 One-mark volumetric flasks, of capacity 100 ml.
6 Sampling

A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or

changed during transport or storage.

Sampling is not part of the method specified in this part of ISO 11816⎪IDF 155. A recommended sampling

method is given in ISO 707⎪IDF 50.
7 Preparations
7.1 Alkaline phosphatase-free milk

Prepare phosphatase-free milk of the type to be tested by carefully dispensing the desired portion of milk into

a test tube or suitable container, ensuring that no milk touches the rim or sides of the container.

Place the tube or container with the milk portion in the water bath (5.7) set at 95 °C. Preheat the milk portion

to 95 °C, before starting its 5-min heating period at that temperature. Check the temperature by using a

thermometer or thermistor probe placed in the centre of the tube or container. When the milk portion reaches

95 °C, immediately start the 5-min heating period. Cool the whole rapidly after the heating period.

Test the thus-treated milk portion to ensure that its ALP activity is less then 10 mU/l.

2) Parafilm is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the conven

...

NORME ISO
INTERNATIONALE 11816-1
FIL
155-1
Deuxième édition
2006-04-15
Version corrigée
2006-09-01
Lait et produits laitiers — Détermination
de l'activité de la phosphatase alcaline —
Partie 1:
Méthode fluorimétrique pour le lait et les
boissons à base de lait
Milk and milk products — Determination of alkaline phosphatase
activity —
Part 1: Fluorimetric method for milk and milk-based drinks
Numéros de référence
ISO 11816-1:2006(F)
FIL 155-1:2006(F)
ISO et FIL 2006
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 11816-1:2006(F)
FIL 155-1:2006(F)
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Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier

peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence

autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées

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l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO et les comités nationaux de la FIL. Dans le cas peu probable où

surviendrait un problème d'utilisation, veuillez en informer le Secrétariat central de l'ISO à l'adresse donnée ci-dessous.

© ISO et FIL 2006

Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous

quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit

soit de l'ISO soit de la FIL à l'adresse respective ci-après.
ISO copyright office Fédération Internationale de Laiterie

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Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88
Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
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Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Publié en Suisse
ii © ISO et FIL 2006 – Tous droits réservés
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ISO 11816-1:2006(F)
FIL 155-1:2006(F)
Sommaire Page

Avant-propos..................................................................................................................................................... iv

1 Domaine d'application.......................................................................................................................... 1

2 Termes et définitions............................................................................................................................ 1

3 Principe.................................................................................................................................................. 1

4 Réactifs .................................................................................................................................................. 2

5 Appareillage .......................................................................................................................................... 3

6 Échantillonnage .................................................................................................................................... 3

7 Préparations .......................................................................................................................................... 3

7.1 Lait exempt de phosphatase alcaline ................................................................................................. 3

7.2 Préparation de l'échantillon pour essai.............................................................................................. 4

8 Mode opératoire .................................................................................................................................... 4

8.1 Vérification des performances de l'appareillage............................................................................... 4

8.2 Étalonnage............................................................................................................................................. 4

8.3 Détermination........................................................................................................................................ 5

8.4 Essais de contrôle ................................................................................................................................ 5

9 Calcul et expression des résultats...................................................................................................... 7

9.1 Ratio d'étalonnage................................................................................................................................ 7

9.2 Calcul ..................................................................................................................................................... 7

9.3 Expression des résultats des essais.................................................................................................. 8

10 Fidélité ................................................................................................................................................... 8

10.1 Essai interlaboratoires ......................................................................................................................... 8

10.2 Répétabilité............................................................................................................................................ 8

10.3 Reproductibilité..................................................................................................................................... 8

11 Rapport d'essai ..................................................................................................................................... 9

Annexe A (informative) Essai interlaboratoires ............................................................................................ 10

Bibliographie .................................................................................................................................................... 12

© ISO et FIL 2006 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 11816-1:2006(F)
FIL 155-1:2006(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux

de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général

confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire

partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non

gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec

la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,

Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes

internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur

publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres

votants.

L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne

pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L'ISO 11816-1⎪FIL 155-1 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires,

sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL). Elle est publiée

conjointement par l'ISO et la FIL.

Cette édition de l'ISO 11816-1⎪FIL 155-1 annule et remplace l'ISO 11816-1:1997, dont elle constitue une

révision technique.

L'ISO 11816⎪FIL 155 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Lait et produits

laitiers — Détermination de l'activité de la phosphatase alcaline:
⎯ Partie 1: Méthode fluorimétrique pour le lait et les boissons à base de lait
⎯ Partie 2: Méthode fluorimétrique pour le fromage

La présente version corrigée de l'ISO 11816-1⎪FIL 155-1 comprend les modifications suivantes:

Page 8, Tableau 1 — Limites de répétabilité, valeurs r
Tableau 2 — Limites de reproductibilité, valeurs R

Les valeurs données dans ces deux tableaux étaient inexactes et ont été modifiées. Elles sont maintenant

identiques aux valeurs correctes de la version anglaise du présent document.
iv © ISO et FIL 2006 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 11816-1:2006(F)
FIL 155-1:2006(F)
Avant-propos

La FIL (Fédération internationale de laiterie) est une fédération mondiale du secteur laitier avec un Comité

National dans chacun de ses pays membres. Chaque Comité National a le droit de faire partie des Comités

permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux techniques. La FIL collabore avec l'ISO pour

l'élaboration de méthodes normalisées d'analyse et d'échantillonnage pour le lait et les produits laitiers.

Les projets de Normes internationales adoptés par les Équipes d'Action et les Comités permanents sont

soumis aux Comités Nationaux pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert

l'approbation de 50 % au moins des Comités Nationaux de la FIL votants.

L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne

pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L'ISO 11816-1⎪FIL 155-1 a été élaborée par la Fédération internationale de laiterie (FIL) et le comité

technique ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Elle est

publiée conjointement par la FIL et l'ISO.

L'ensemble des travaux a été confié à l'Équipe d'Action mixte ISO-FIL, Caractérisation du traitement

thermique du Comité permanent Composants mineurs et caractérisation des propriétés physiques, sous la

conduite de son chef de projet, Monsieur F. Harding (Royaume-Uni).

Cette édition de l'ISO 11816-1⎪FIL 155-1 annule et remplace la FIL 155A:1999, dont elle constitue une

révision technique.

L'ISO 11816⎪FIL 155 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Lait et produits

laitiers — Détermination de l'activité de la phosphatase alcaline:
⎯ Partie 1: Méthode fluorimétrique pour le lait et les boissons à base de lait
⎯ Partie 2: Méthode fluorimétrique pour le fromage

La présente version corrigée de l'ISO 11816-1⎪FIL 155-1 comprend les modifications suivantes:

Page 8, Tableau 1 — Limites de répétabilité, valeurs r
Tableau 2 — Limites de reproductibilité, valeurs R

Les valeurs données dans ces deux tableaux étaient inexactes et ont été modifiées. Elles sont maintenant

identiques aux valeurs correctes de la version anglaise du présent document.
© ISO et FIL 2006 – Tous droits réservés v
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ISO 11816-1:2006(F)
NORME INTERNATIONALE
FIL 155-1:2006(F)
Lait et produits laitiers — Détermination de l'activité
de la phosphatase alcaline —
Partie 1:
Méthode fluorimétrique pour le lait et les boissons
à base de lait
1 Domaine d'application

La présente partie de l'ISO 11816⎪FIL 155 décrit une méthode fluorimétrique pour la détermination de

l'activité de la phosphatase alcaline (ALP, EC 3.1.3.1) dans les laits pasteurisés entiers, demi-écrémés,

écrémés et aromatisés. La présente méthode est applicable aux laits de vache, de brebis et de chèvre, et aux

boissons à base de lait.

La méthode convient également pour la détermination d'activités élevées de la phosphatase alcaline dans le

lait cru et le lait traité thermiquement, ayant des activités de plus de 2 000 milliunités par litre (mU/l) après

dilution de l'échantillon, comme spécifié.
2 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.

2.1
activité de la phosphatase alcaline
activité ALP

activité de la phosphatase alcaline présente dans un produit, déterminée suivant le mode opératoire spécifié

dans la présente partie de l'ISO 11816⎪FIL 155

NOTE L'activité de la phosphatase alcaline est exprimée en milliunités d'activité enzymatique par litre (mU/l).

2.2
unité d'activité de la phosphatase alcaline

quantité d'enzyme phosphatase alcaline qui catalyse la transformation de 1 µmol de substrat par minute

3 Principe

L'activité de la phosphatase alcaline de l'échantillon se mesure en effectuant un essai cinétique direct

fluorimétrique continu. Un substrat d'ester monophosphorique aromatique non fluorescent,

2′-[2-benzothiazolyl]-6′-hydroxybenzothiazole phosphate, en présence de phosphatase alcaline issue de

l'échantillon, subit une hydrolyse de son radical phosphate et produit un composé hautement fluorescent. Le

mesurage fluorimétrique de l'activité de la phosphatase alcaline (ALP) est effectué à 38 °C sur une période de

3 min. Ce mesurage comprend la préincubation du substrat et de l'échantillon, suivie de plusieurs lectures

cinétiques de la vitesse de réaction.

NOTE Bien que l'essai dure 3 min, la première minute est une période d'équilibration afin de s'assurer que

l'échantillon est à 38 °C. Les mesurages d'activité sont en effet réalisés du début de la deuxième minute à la fin de la

troisième minute (c'est-à-dire sur une période de 2 min).
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ISO 11816-1:2006(F)
FIL 155-1:2006(F)
4 Réactifs

Sauf indication contraire, utiliser exclusivement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l'eau distillée,

de l'eau déminéralisée ou de l'eau de pureté équivalente.
® 1) ®

4.1 Substrat Fluorophos , en flacons, contenant chacun 144 mg de poudre de substrat Fluorophos .

Substrat d'ester monophosphorique aromatique non fluorescent, par exemple 2′-[2-benzothiazolyl]-6′-

® ®

hydroxybenzothiazole phosphate (Fluorophos ). Le substrat Fluorophos , si le flacon n'a pas été ouvert,

reste stable pendant 2 ans lorsqu'il est conservé entre 2 °C et 8 °C.
4.2 Solution tampon de substrat

Solution tampon de diéthanolamine (DEA), c(DEA) = 2,4 mol/l, pH 10,0, en flacons de 240 ml.

La solution tampon de substrat reste stable pendant 2 ans lorsqu'elle est conservée entre 2 °C et 8 °C, si le

flacon n'a pas été ouvert.
4.3 Substrat de travail

Amener le substrat Fluorophos (4.1) et la solution tampon de substrat (4.2) à température ambiante. Ajouter

le contenu d'un flacon de solution tampon de substrat (240 ml) (4.2) à un flacon de substrat Fluorophos

(144 mg) (4.1), puis mélanger avec soin en retournant le récipient pendant 3 min. Utiliser un verre ambré pour

protéger de la lumière.

Laisser la solution ainsi obtenue reposer à température ambiante pendant au moins 30 min avant utilisation.

Utiliser l'essai analogique/numérique (A/D) donné en 8.4.1.1 pour vérifier que le substrat de travail prêt pour

utilisation convient.

Le substrat de travail reste stable pendant 60 jours lorsqu'il est conservé à l'abri de la lumière entre 2 °C et

8 °C, ou pendant 8 h lorsqu'il est conservé à 38 °C. Ne pas utiliser le substrat actif en cas d'obtention d'une

lecture supérieure à 1 200 (voir 8.4.1.1.5).

NOTE Le volume de substrat de travail obtenu (240 ml) suffit pour mener environ 115 essais.

4.4 Solutions étalons de travail, Fluoroyellow (FY) [2′-(2-benzothiazolyl)-6′-hydroxybenzothiazole] dans

une solution tampon DEA (4.2).

Les solutions étalons restent stables pendant 18 mois lorsqu'elles sont conservées entre 2 °C et 8 °C.

4.4.1 Solution étalon A, contenant 0 µmol/l de Fluoroyellow .
–3 ®
4.4.2 Solution étalon B, contenant 17,24 × 10 µmol/l de Fluoroyellow .
–3 ®
4.4.3 Solution étalon C, contenant 34,48 × 10 µmol/l de Fluoroyellow .
–3 ®

4.5 Solution quotidienne de contrôle des instruments, contenant 34,48 × 10 µmol/l de Fluoroyellow .

1) Les réactifs spécifiés de 4.1 à 4.5 et les appareils spécifiés de 5.1 à 5.4 (sauf 5.3.3) sont disponibles sous l'appellation

«Fluorophos Test System» et commercialisés par la firme Advanced Instruments, Inc., Two Technology Way, Norwood,

Massachusetts 02062, États-Unis. La configuration des emballages fournis avec le Fluorophos Test System peut être

modifiée par le fabricant. II convient que l'utilisateur se réfère aux instructions du fabricant pour la préparation des réactifs

s'ils se révèlent différents de ceux spécifiés dans la présente norme. Fluorophos et Fluoroyellow sont des marques

déposées de la firme Advanced Instruments, Inc. et sont des exemples de produits appropriés disponibles sur le marché.

Cette information est donnée par souci de commodité à l'intention des utilisateurs du présent document et ne saurait

constituer un engagement de l'ISO ou de la FIL à l'égard de ce(s) produit(s).
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5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, notamment, l'appareillage suivant:

5.1 Fluorimètre à filtre, avec un support de cuvettes à contrôle thermostatique, capable de fonctionner à

38 °C ± 1 °C et avec une optique à angle droit, permettant une excitation à une longueur d'onde de 440 nm et

une émission située entre 520 nm et 560 nm [Fluorophos , par exemple]. Il convient d'optimiser les

mesurages conformément aux instructions du fabricant.

5.2 Cuvettes, jetables, en verre non fluorescent, de 12 mm de diamètre et de 75 mm de longueur.

5.3 Pipettes.
5.3.1 Pipette à écoulement, à volume fixe, permettant de délivrer 2,0 ml.

5.3.2 Pipette à déplacement positif ou pipette à piston, de 0,075 ml de capacité.

5.3.3 Pipette, de 2 ml de capacité.

5.4 Bloc d'incubation, pouvant être maintenu à une température de 38 °C ± 1 °C et pouvant supporter les

cuvettes.
5.5 Parafilm ou autre film approprié de qualité pour laboratoire.
5.6 Agitateur/mélangeur Vortex.

5.7 Bain d'eau, pouvant être maintenu à une température de 63 °C ± 1 °C et 95 °C ± 1 °C.

5.8 Fioles jaugées à un trait, de 100 ml de capacité.
6 Échantillonnage

Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif de la portion échantillonnée,

non endommagé ou modifié lors du transport et de l'entreposage.

L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente partie de l'ISO 11816⎪FIL 155.

Une méthode d'échantillonnage recommandée est fournie dans l'ISO 707⎪FIL 50.
7 Préparations
7.1 Lait exempt de phosphatase alcaline

Préparer du lait sans phosphatase du même type que l'échantillon à analyser, en versant avec soin la prise

de lait voulue dans un tube à essai ou un conteneur adapté, en veillant à ce que le lait ne touche pas le bord

et les côtés du conteneur.

Placer le tube ou le conteneur renfermant la prise de lait dans le bain d'eau (5.7) chauffé à 95 °C. Préchauffer

la prise de lait à 95 °C avant de démarrer la période de chauffage de 5 min à cette température. Contrôler la

température à l'aide d'un thermomètre ou d'une sonde à thermistance, placée au centre du tube ou du

conteneur. Dès que la température de la prise de lait a atteint 95 °C, démarrer la période de chauffage de

5 min. À l'issue de cette période de chauffage, refroidir rapidement le tout.

Soumettre à essai la prise de lait ainsi traitée en vue de s'assurer que son activité ALP est inférieure à

10 mU/l.

2) Le parafilm est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée par souci de

commodité à l'intention des utilisateurs de la présente norme et ne saurait constituer un engagement de l'ISO ou de la FIL

à l'égard de ce produit.
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