ISO 13903:2005
(Main)Animal feeding stuffs — Determination of amino acids content
Animal feeding stuffs — Determination of amino acids content
ISO 13903:2005 describes the determination of free (synthetic and natural) and total (peptide-bound and free) amino acids in feeding stuffs, using an amino acid analyser or HPLC equipment. It is applicable to the following amino acids: sum of cystine and cysteine; methionine; lysine; threonine; alanine; arginine; aspartic acid; glutamic acid; glycine; histidine; isoleucine; leucine; phenylalanine; proline; serine; tyrosine; valine. The method does not distinguish between the salts of amino acids, nor does it differentiate between D and L forms of amino acids. It is not valid for the determination of tryptophan or hydroxy analogues of amino acids. Limits of quantification depend on the chromatographic equipment, but levels as low as: 0,3 g/kg total lysine; 0,25 g/kg total methionine; 0,35 g/kg total cystine plus cysteine; 0,2 g/kg total threonine; 0,035g/kg free lysine; 0,035g/kg free methionine; and 0,03g/kg free threonine can typically be analysed.
Aliments des animaux — Dosage de la teneur en acides aminés
L'ISO 13903:2005 décrit le dosage des acides aminés libres (de synthèse et naturels) et totaux (dans des peptides et libres) dans les aliments des animaux, au moyen d'un analyseur d'acides aminés ou d'un équipement de chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Elle s'applique aux acides aminés suivants: la somme de la cystine et de la cystéine, la méthionine, la lysine, la thréonine, l'alanine, l'arginine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, la glycine, l'histidine, l'isoleucine, la leucine, la phénylalanine, la proline, la sérine, la tyrosine et la valine. Cette méthode ne distingue pas les sels d'acides aminés, pas plus qu'elle ne fait la différence entre les formes D et L des acides aminés. Elle n'est pas valable pour le dosage du tryptophane ou des hydroxy-analogues d'acides aminés. Les limites de quantification dépendent de l'équipement chromatographique, mais on peut généralement analyser des niveaux aussi bas que 0,3 g/kg pour la lysine totale, 0,25 g/kg pour la méthionine totale, 0,35 g/kg pour la cystine plus la cystéine totales, 0,2 g/kg pour la thréonine totale, 0,035 g/kg pour la lysine libre, 0,035 g/kg pour la méthionine libre et 0,03 g/kg pour la thréonine libre.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 13903
First edition
2005-05-15
Animal feeding stuffs — Determination
of amino acids content
Aliments des animaux — Détermination de la teneur en acides aminés
Reference number
ISO 13903:2005(E)
©
ISO 2005
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ISO 13903:2005(E)
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Published in Switzerland
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ISO 13903:2005(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope. 1
2 Principle . 1
2.1 Free amino acids. 1
2.2 Total amino acids. 2
3 Reagents and materials. 2
4 Apparatus. 4
5 Procedure. 4
5.1 Preparation of test sample. 4
5.2 Determination of free amino acids in feeding stuffs and premixtures. 4
5.3 Determination of total amino acids . 5
5.4 Chromatography . 6
6 Calculation of results. 7
7 Precision . 8
7.1 Interlaboratory tests . 8
7.2 Repeatability. 8
7.3 Reproducibility . 8
8 Use of reference materials . 8
9 Observations on the method . 8
Annex A (informative) Results of interlaboratory tests . 10
Annex B (informative) Examples of chromatograms. 15
Bibliography . 17
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ISO 13903:2005(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 13903 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 10, Animal
feeding stuffs.
[1]
ISO 13903 is based on Commission Directive 98/64/EC of September 1998 .
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 13903:2005(E)
Animal feeding stuffs — Determination of amino acids content
1 Scope
This International Standard describes the determination of free (synthetic and natural) and total
(peptide-bound and free) amino acids in feeding stuffs, using an amino acid analyser or HPLC equipment. It is
applicable to the following amino acids:
sum of cystine and cysteine;
methionine;
lysine;
threonine;
alanine;
arginine;
aspartic acid;
glutamic acid;
glycine;
histidine;
isoleucine;
leucine;
phenylalanine;
proline;
serine;
tyrosine;
valine.
The method does not distinguish between the salts of amino acids, nor does it differentiate between D and L
forms of amino acids. It is not valid for the determination of tryptophan or hydroxy analogues of amino acids.
Limits of quantification depend on the chromatographic equipment, but levels as low as: 0,3 g/kg total lysine;
0,25 g/kg total methionine; 0,35 g/kg total cystine plus cysteine; 0,2 g/kg total threonine; 0,035 g/kg free
lysine; 0,035 g/kg free methionine; and 0,03 g/kg free threonine can typically be analysed.
NOTE A lower limit of quantification or detection might be achievable but this is to be validated by the users.
2 Principle
2.1 Free amino acids
The free amino acids are extracted with dilute hydrochloric acid. Co-extracted nitrogenous macromolecules
are precipitated with sulfosalicylic acid and removed by filtration. The filtered solution is adjusted to pH 2,20.
The amino acids are separated by ion exchange chromatography and determined by reaction with ninhydrin
with photometric detection at 570 nm.
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ISO 13903:2005(E)
2.2 Total amino acids
The procedure chosen depends on the amino acids under investigation. Cyst(e)ine and methionine shall be
oxidized to cysteic acid and methionine sulphone, respectively, prior to hydrolysis. Tyrosine shall be
determined in hydrolysates of unoxidized samples. All the other amino acids listed in Clause 1 may be
determined in either the oxidized or unoxidized sample.
Oxidation is performed at 0 °C with a performic acid/phenol mixture. Excess oxidation reagent is decomposed
with sodium disulfite. The oxidized or unoxidized sample is hydrolysed with hydrochloric acid (c = 6 mol/l) for
23 h. The hydrolysate is adjusted to pH 2,20. The amino acids are separated by ion exchange
chromatography and determined by reaction with ninhydrin, using photometric detection at 570 nm (440 nm
for proline).
3 Reagents and materials
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
3.1 Water, double distilled water or water of equivalent quality shall be used (conductivity < 10 µS).
3.2 Hydrogen peroxide, w = 30 %.
3.3 Formic acid, w = 98 % to 100 %.
3.4 Hydrochloric acid, density approximately 1,19 g/ml.
3.5 2,2'-Thiodiethanol (thiodiglycol)
3.6 Light petroleum, boiling rate 40 °C to 60 °C
3.7 Norleucine, or any other compound suitable for use as internal standard.
3.8 Nitrogen gas (< 10 parts per million oxygen).
3.9 Amino acids.
3.9.1 Standard substances listed under Clause 1.
Use pure compounds containing no water of crystallization. Dry under vacuum over P O or H SO for
2 5 2 4
1 week prior to use.
3.9.2 Cysteic acid.
3.9.3 Methionine sulfone.
3.10 Sodium hydroxide solution I, c = 7,5 mol/l.
Dissolve 300 g of NaOH (3.6) in water and make up to 1 l.
3.11 Sodium hydroxide solution II, c = 1 mol/l.
Dissolve 40 g of NaOH in water (3.1) and make up to 1 l.
3.12 Formic acid-phenol solution.
Mix 889 g of formic acid (3.3) with 111 g of water (3.1) and add 4,73 g of phenol.
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3.13 Hydrolysis mixture, c = 6 mol/l HCl containing 1 g of phenol per litre.
Add 1 g of phenol to 492 ml of HCl (3.4) and make up to 1 l with water (3.1).
3.14 Extraction mixture, c = 0,1 mol/l HCl containing 2 % thiodiglycol.
Take 8,2 ml of HCl (3.4), dilute with approximately 900 ml of water (3.1). Add 20 ml of thiodiglycol (3.5) and
make up to 1 l with water. Do not mix 3.4 and 3.5 directly.
3.15 5-Sulfosalicylic acid, β = 6 %.
Dissolve 60 g of 5-sulfosalicylic acid dihydrate in water (3.1) and make up to 1 l with water.
3.16 Oxidation mixture (performic acid-phenol).
Mix 0,5 ml of hydrogen peroxide (3.2) with 4,5 ml of formic acid-phenol solution (3.12) in a small beaker.
Incubate at between 20 °C and 30 °C for 1 h in order to form performic acid, then cool in an ice-water bath
(15 min) before adding to the sample.
Avoid contact with skin and wear protective clothing.
+
3.17 Citrate buffer, c = 0,2 mol/l Na , pH 2,20.
Dissolve 19,61 g of sodium citrate dihydrate, 5 ml of thiodiglycol (3.5), 1 g of phenol and 16,50 ml of HCl (3.4)
in approximately 800 ml of water (3.1). Adjust the pH to 2,20. Make up to 1 l with water.
3.18 Elution buffers, prepared according to conditions for the analyser used (4.9).
3.19 Ninhydrin reagent, prepared according to conditions for the analyser used (4.9).
3.20 Standard solutions of amino acids.
These solutions shall be stored below 5 °C.
3.20.1 Stock standard solution of amino acids (3.9.1), c = 2,5 µmol/ml of each in hydrochloric acid.
These may be obtained commercially.
3.20.2 Stock standard solution of cysteic acid and methionine sulfone, c = 1,25 µmol/ml.
Dissolve 0,211 5 g of cysteic acid (3.9.2) and 0,226 5 g of methionine sulphone (3.9.3) in citrate buffer (3.17)
in a 1 l graduated flask and make up to mark with citrate buffer. Store below 5 °C for not more than 12 months.
This solution shall not be used if the stock standard solution (3.20.1) contains cysteic acid and methionine
sulfone.
3.20.3 Stock standard solution of the internal standard e.g. norleucine, c = 20 µmol/ml.
Dissolve 0,656 0 g of norleucine (3.7) in citrate buffer (3.17) in a graduated flask and make up to 250 ml with
citrate buffer. Store below 5 °C for no more than 6 months.
3.20.4 Calibration solution of standard amino acids, for use with hydrolysates, c = 0,1 µmol/ml of cysteic
acid and methionine sulfone and c = 0,2 µmol/ml of the other amino acids.
Dissolve 2,2 g of sodium chloride in 100 ml beaker with 30 ml of citrate buffer (3.17). Add 4,00 ml of stock
standard solution of amino acids (3.20.1), 4,00 ml of stock standard solution of cysteic acid and methionine
sulfone (3.20.2), and 0,50 ml of stock standard solution of internal standard (3.20.3) if used. Adjust the pH to
2,20 with sodium hydroxide (3.11). Transfer quantitatively to a 50 ml graduated flask and make up to the mark
with citrate buffer (3.17) and mix. Store below 5 °C for not more than 3 months. See also 9.1.
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3.20.5 Calibration solution of standard amino acids, for use with hydrolysates prepared according to
5.3.3.2 and for use with extracts (5.2).
Prepare the calibration solution according to 3.20.4 but omitting sodium chloride. Store below 5 °C for not
more than 3 months.
4 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
4.1 Round bottomed flask, of capacity 100 ml or 250 ml, fitted with a reflux condenser.
4.2 Borosilicate glass bottle, of capacity 100 ml, with screw cap with rubber/teflon liner (e.g. Duran,
Schott) for use in the oven.
4.3 Oven, with forced ventilation and a temperature regulator, with an accuracy better than ± 2 °C.
4.4 pH-meter, reading to three decimal places.
4.5 Membrane filter, 0,2 µm.
4.6 Centrifuge.
4.7 Rotary vacuum evaporator.
4.8 Mechanical shaker or magnetic stirrer.
4.9 Amino acid analyser or HPLC equipment with ion exchange column, device for ninhydrin,
post-column derivatization and photometric detector
The column is filled with sulfonated polystyrene resins capable of separating the amino acids from each other
and from other ninhydrin-positive materials. The flow in the buffer and ninhydrin lines is provided by pumps
having a flow stability of ± 0,5 % in the period covering both the standard calibration run and the analysis of
the sample.
With some amino acid analysers, hydrolysis procedures may be used in which the hydrolysate has a sodium
concentration of c = 0,8 mol/l and contains all the residual formic acid from the oxidation step. Others do not
give a satisfactory separation of certain amino acids if the hydrolysate contains excess formic acid and/or high
sodium ion concentrations. In this case, reduce the volume of acid by evaporation to approx. 5 ml after the
hydrolysis and prior to pH adjustment. The evaporation shall be performed under vacuum at 40 °C maximum.
5 Procedure
5.1 Preparation of test sample
Grind the sample until it passes through a 0,5 mm sieve. Samples high in moisture shall either be air-dried at
a temperature not exceeding 50 °C or freeze-dried prior to grinding. Samples with a high fat content shall be
extracted with light petroleum (3.6) prior to grinding.
5.2 Determination of free amino acids in feeding stuffs and premixtures
Weigh, to the nearest 0,2 mg, an appropriate amount (1 g to 5 g) of the prepared test sample (5.1) into a
conical flask and add 100,0 ml of extraction mixture (3.14). Shake the mixture for 60 min using a mechanical
shaker or a magnetic stirrer (4.8). Allow the sediment to settle and pipette 10,0 ml of the supernatant solution
into a 100 ml beaker.
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Add 5,0 ml of sulfosalicylic acid solution (3.15), with stirring, and continue to stir with the aid of magnetic stirrer
for 5 min. Filter or centrifuge the supernatant in order to remove any precipitate. Place 10,0 ml of the resulting
solution into a 100 ml beaker and adjust the pH to 2,20 using sodium hydroxide solution (3.11). Transfer to a
volumetric flask of appropriate volume using citrate buffer (3.17), and make up to the mark with the buffer
solution.
If an internal standard is being used, add 1,00 ml of internal standard (3.20.3) for each 100 ml of final solution
and make up to the mark with the buffer solution (3.17).
Proceed to the chromatography step according to 5.4.
If the extracts are not being examined the same day, they shall be stored below 5 °C.
5.3 Determination of total amino acids
5.3.1 Oxidation
Weigh, to the nearest 0,2 mg, from 0,1 g to 1 g of the prepared test sample (5.1) into
a 100 ml round-bottomed flask (4.1) for open hydrolysis (5.3.2.3), or
a 250 ml round-bottomed flask (4.1) if a low sodium concentration is required (5.3.3.2), or
a 100 ml bottle, fitted with a screw cap (4.2), for closed hydrolysis (5.3.2.4).
The weighed test portion shall have a nitrogen content of about 10 mg and a moisture content not exceeding
100 mg.
Place the flask/bottle in an ice-water bath and cool to 0 °C. Add 5 ml of oxidation mixture (3.16) and mix using
a glass spatula with a bent tip. Seal the flask/bottle containing the spatula with an airtight film, place the
ice-water bath containing the sealed container in a refrigerator at 0 °C and leave for 16 h. After 16 h, remove
from the refrigerator and decompose the excess oxidation reagent by the addition of 0,84 g of sodium disulfite.
Proceed to 5.3.2.1.
5.3.2 Hydrolysis
5.3.2.1 Hydrolysis of oxidized samples
To the oxidized sample prepared according to 5.3.1, add 25 ml of hydrolysis mixture (3.13), taking care to
wash down any sample residue adhering to the sides of the vessel and the spatula. Depending on the
hydrolysis procedure being used, proceed according to 5.3.2.3 or 5.3.2.4.
5.3.2.2 Hydrolysis of unoxidized samples
Weigh, to the nearest 0,2 mg, into a 100 ml or 250 ml round-bottom flask (4.1) or into a 100 ml bottle fitted
with a screw cap (4.2) from 0,1 g to 1 g of the prepared sample (5.1). The weighed sample portion shall have
a nitrogen content of about 10 mg. Carefully add 25 ml of hydrolysis mixture (3.13) and mix with the sample.
Proceed according to either 5.3.2.3 or 5.3.2.4.
5.3.2.3 Open hydrolysis
Add three glass beads to the mixture in th
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 13903
Première édition
2005-05-15
Aliments des animaux — Dosage de la
teneur en acides aminés
Animal feeding stuffs — Determination of amino acids content
Numéro de référence
ISO 13903:2005(F)
©
ISO 2005
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ISO 13903:2005(F)
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Web www.iso.org
Version française parue en 2008
Publié en Suisse
ii © ISO 2005 – Tous droits réservés
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ISO 13903:2005(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
1 Domaine d'application. 1
2 Principe. 2
2.1 Acides aminés libres . 2
2.2 Acides aminés totaux. 2
3 Réactifs et matériaux. 2
4 Appareillage . 4
5 Mode opératoire . 5
5.1 Préparation de l'échantillon d’essai . 5
5.2 Dosage des acides aminés libres dans les aliments des animaux et prémélanges. 5
5.3 Dosage des acides aminés totaux . 5
5.4 Chromatographie. 7
6 Expression des résultats . 8
7 Fidélité . 9
7.1 Essais interlaboratoires . 9
7.2 Répétabilité. 9
7.3 Reproductibilité. 9
8 Utilisation de matériaux de référence. 9
9 Observations sur la méthode . 9
Annexe A (informative) Résultats des essais interlaboratoires . 10
Annexe B (informative) Exemples de chromatogrammes. 15
Bibliographie . 17
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ISO 13903:2005(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 13903 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 10,
Aliments des animaux.
[1]
L'ISO 13903 est fondée sur la directive 98/64/CE de septembre 1998 de la Commission .
iv © ISO 2005 – Tous droits réservés
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NORME INTERNATIONALE ISO 13903:2005(F)
Aliments des animaux — Dosage de la teneur en acides aminés
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale décrit le dosage des acides aminés libres (de synthèse et naturels) et
totaux (dans des peptides et libres) dans les aliments des animaux, au moyen d'un analyseur d'acides aminés
ou d'un équipement de chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Elle s'applique aux acides
aminés suivants:
⎯ la somme de la cystine et de la cystéine;
⎯ la méthionine;
⎯ la lysine;
⎯ la thréonine;
⎯ l'alanine;
⎯ l'arginine;
⎯ l'acide aspartique;
⎯ l'acide glutamique;
⎯ la glycine;
⎯ l'histidine;
⎯ l'isoleucine;
⎯ la leucine;
⎯ la phénylalanine;
⎯ la proline;
⎯ la sérine;
⎯ la tyrosine;
⎯ la valine.
Cette méthode ne distingue pas les sels d'acides aminés, pas plus qu'elle ne fait la différence entre les formes
D et L des acides aminés. Elle n'est pas valable pour le dosage du tryptophane ou des hydroxy-analogues
d'acides aminés.
Les limites de quantification dépendent de l'équipement chromatographique, mais on peut généralement
analyser des niveaux aussi bas que 0,3 g/kg pour la lysine totale, 0,25 g/kg pour la méthionine totale,
0,35 g/kg pour la cystine plus la cystéine totales, 0,2 g/kg pour la thréonine totale, 0,035 g/kg pour la lysine
libre, 0,035 g/kg pour la méthionine libre et 0,03 g/kg pour la thréonine libre.
NOTE Une limite de quantification ou détection plus basse peut être atteinte, mais cela est à valider par les
utilisateurs.
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ISO 13903:2005(F)
2 Principe
2.1 Acides aminés libres
Les acides aminés libres sont extraits avec de l'acide chlorhydrique dilué. Les macromolécules azotées sont
précipitées par de l'acide sulfosalicylique et éliminées par filtration. Le pH de la solution filtrée est ramené
à 2,20. Les acides aminés sont séparés par chromatographie par échange d'ions et déterminés par réaction
avec de la ninhydrine et détection photométrique à 570 nm.
2.2 Acides aminés totaux
Le mode opératoire choisi dépend des acides aminés recherchés. La cyst(é)ine et la méthionine doivent être
oxydées, avant hydrolyse, respectivement en acide cystéique et méthionine sulfone. La tyrosine doit être
déterminée dans des hydrolysats d'échantillons non oxydés. Tous les autres acides aminés répertoriés dans
l'Article 1 peuvent être déterminés dans un échantillon soit oxydé, soit non oxydé.
L'oxydation est effectuée à 0 °C avec un mélange acide performique/phénol. L'excès de réactif d'oxydation
est décomposé par du disulfite de sodium. L'échantillon oxydé ou non est hydrolysé pendant 23 h avec de
l'acide chlorhydrique (c = 6 mol/l). Le pH de l'hydrolysat est ramené à 2,20. Les acides aminés sont séparés
par chromatographie par échange d'ions et déterminés par réaction avec de la ninhydrine et détection
photométrique à 570 nm (440 nm pour la proline).
3 Réactifs et matériaux
Sauf indication contraire, n'utiliser que des réactifs de qualité analytique reconnue.
3.1 Eau, eau bi-distillée ou de qualité équivalente (conductivité < 10 µS).
3.2 Peroxyde d'hydrogène, w = 30 %.
3.3 Acide formique, w = 98 % à 100 %.
3.4 Acide chlorhydrique, densité d'environ 1,19 g/ml.
3.5 2,2'-Thiodiéthanol (thiodiglycol).
3.6 Éther de pétrole, intervalle d'ébullition entre 40 °C et 60 °C.
3.7 Norleucine, ou tout autre composé adapté à l'emploi comme étalon interne.
3.8 Azote gazeux (< 10 parties par million d'oxygène).
3.9 Acides aminés.
3.9.1 Substances étalons répertoriées dans l'Article 1.
N'utiliser que des composés purs ne contenant pas d'eau de cristallisation. Sécher sous vide sur P O ou
2 5
H SO pendant 1 semaine avant utilisation.
2 4
3.9.2 Acide cystéique.
3.9.3 Méthionine sulfone.
3.10 Solution d'hydroxyde de sodium I, c = 7,5 mol/l.
Dissoudre 300 g de NaOH dans de l'eau (3.1) et compléter à 1 l.
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3.11 Solution d'hydroxyde de sodium II, c = 1 mol/l.
Dissoudre 40 g de NaOH dans de l'eau (3.1) et compléter à 1 l.
3.12 Solution de phénol-acide formique.
Mélanger 889 g d'acide formique (3.3) avec 111 g d'eau (3.1), puis ajouter 4,73 g de phénol.
3.13 Solution d’hydrolyse, c = 6 mol/l d'HCl contenant 1 g de phénol par litre.
Ajouter 1 g de phénol à 492 ml d'HCl (3.4) et compléter à 1 l avec de l'eau (3.1).
3.14 Mélange d'extraction, c = 0,1 mol/l d'HCl contenant 2 % de thiodiglycol.
Diluer 8,2 ml d'HCl (3.4) dans environ 900 ml d'eau (3.1). Ajouter 20 ml de thiodiglycol (3.5) et compléter à 1 l
avec de l'eau. Ne pas mélanger directement 3.4 et 3.5.
3.15 5-Acide sulfosalicylique, β = 6 %.
Dissoudre 60 g d'acide 5-sulfosalicylique dihydraté dans de l'eau (3.1) et compléter à 1 l avec de l'eau.
3.16 Mélange d'oxydation (acide performique-phénol).
Mélanger 0,5 ml de peroxyde d'hydrogène (3.2) avec 4,5 ml de solution de phénol-acide formique (3.12) dans
un petit bécher. Incuber entre 20 °C et 30 °C pendant 1 h pour former de l'acide performique, puis refroidir
dans un bain d'eau glacée (15 min) avant de l'ajouter à l'échantillon.
Éviter tout contact avec la peau et porter des vêtements de protection.
+
3.17 Tampon citrate, c = 0,2 mol/l de Na , pH 2,20.
Dissoudre 19,61 g de citrate de sodium dihydraté, 5 ml de thiodiglycol (3.5), 1 g de phénol et 16,50 ml d'HCl
(3.4) dans environ 800 ml d'eau (3.1). Ramener le pH à 2,20. Compléter à 1 l avec de l'eau.
3.18 Tampons d'élution, préparés conformément aux exigences prévues pour l'analyseur utilisé (4.9).
3.19 Réactif à la ninhydrine, préparé conformément aux exigences prévues pour l'analyseur utilisé (4.9).
3.20 Solutions étalons d'acides aminés
Ces solutions doivent être conservées à une température inférieure à 5 °C.
3.20.1 Solution étalon mère d'acides aminés (3.9.1), c = 2,5 µmol/ml de chaque acide aminé dans de
l'acide chlorhydrique.
Celles-ci sont disponibles dans le commerce.
3.20.2 Solution étalon mère d'acide cystéique et de méthionine sulfone, c = 1,25 µmol/ml.
Dissoudre 0,211 5 g d'acide cystéique (3.9.2) et 0,226 5 g de méthionine sulfone (3.9.3) dans le tampon
citrate (3.17) dans une fiole jaugée de 1 l et compléter jusqu'à la marque avec le tampon citrate. Conserver à
une température inférieure à 5 °C pour une durée maximale de 12 mois. Cette solution ne doit pas être
utilisée si la solution mère (3.20.1) contient de l'acide cystéique et de la méthionine sulfone.
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3.20.3 Solution étalon mère de l'étalon interne par exemple la norleucine, c = 20 µmol/ml.
Dissoudre 0,656 0 g de norleucine (3.7) dans le tampon au citrate (3.17) dans une fiole jaugée et compléter
jusqu'à 250 ml avec le tampon au citrate. Conserver à une température inférieure à 5 °C pour une durée
maximale de 6 mois.
3.20.4 Solution d'étalonnage des acides aminés étalons, à utiliser avec les hydrolysats, c = 0,1 µmol/ml
d'acide cystéique et de méthionine sulfone et c = 0,2 µmol/ml des autres acides aminés.
Dissoudre 2,2 g de chlorure de sodium dans un bécher de 100 ml avec 30 ml de tampon au citrate (3.17).
Ajouter 4,00 ml de solution étalon mère des acides aminés (3.20.1), 4,00 ml de solution étalon mère d'acide
cystéique et de méthionine sulfone (3.20.2), et 0,50 ml de solution étalon mère d'étalon interne (3.20.3) s'il est
utilisé. Ramener le pH à 2,20 avec de l'hydroxyde de sodium (3.11). Transférer quantitativement dans une
fiole jaugée de 50 ml et compléter jusqu'à la marque avec du tampon citrate (3.17) et mélanger. Conserver à
une température inférieure à 5 °C pour une durée maximale de trois mois. Voir aussi 9.1.
3.20.5 Solution d'étalonnage des acides aminés étalons, à utiliser pour l'analyse des hydrolysats
préparés selon 5.3.3.2 et des extraits (5.2).
Préparer la solution d'étalonnage conformément à 3.20.4 mais sans le chlorure de sodium. Conserver à une
température inférieure à 5 °C pour une durée maximale de trois mois.
4 Appareillage
Matériel de laboratoire courant et, en particulier, ce qui suit.
4.1 Ballon à fond rond, d'une capacité de 100 ml ou 250 ml, pourvu d'un condenseur à reflux.
4.2 Flacon en verre borosilicaté, d'une capacité de 100 ml, avec bouchon à vis à revêtement de
caoutchouc/teflon (par exemple Duran, Schott) pour être utilisé dans l'étuve.
4.3 Étuve, avec ventilation forcée et régulateur de température, d’une exactitude de moins de ± 2 °C.
4.4 pH-mètre, à graduation à trois décimales.
4.5 Membrane filtrante, 0,2 µm.
4.6 Centrifugeuse.
4.7 Évaporateur rotatif à vide.
4.8 Agitateur mécanique ou magnétique.
4.9 Analyseur d'acides aminés ou équipement de CLHP avec colonne d'échange d'ions, dispositif pour
ninhydrine, dérivatisation post-colonne et détecteur photométrique.
La colonne est remplie de résines de polystyrène sulfoné capables de séparer les acides aminés les uns des
autres ainsi que des autres produits réagissant à la ninhydrine. Le flux du tampon et de la ninhydrine est
assuré par des pompes ayant une stabilité de flux de ± 0,5 % sur la période couvrant à la fois l'analyse de la
solution d'étalonnage et l'analyse des échantillons.
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Avec certains analyseurs d'acides aminés, on peut utiliser des modes opératoires d'hydrolyse dans lesquels
l'hydrolysat possède une concentration en sodium de c = 0,8 mol/l et contient tout l'acide formique résiduel de
l'étape d'oxydation. D'autres appareils ne donnent pas une séparation satisfaisante de certains acides aminés
si l'hydrolysat contient de trop fortes concentrations en acide formique et/ou ions sodium. Dans ce cas, le
volume d'acide est réduit par évaporation à environ 5 ml après l'hydrolyse et avant l'ajustement du pH.
L'évaporation doit être effectuée sous vide à 40 °C maximum.
5 Mode opératoire
5.1 Préparation de l'échantillon d’essai
Broyer l'échantillon pour le réduire à une granulométrie de 0,5 mm. Avant broyage, les échantillons à fort taux
d'humidité doivent être soit séchés à l'air à une température maximale de 50 °C, soit séchés par lyophilisation.
Les échantillons à forte teneur en matières grasses doivent subir une extraction par de l'éther de pétrole (3.6)
avant broyage.
5.2 Dosage des acides aminés libres dans les aliments des animaux et prémélanges
Peser, à 0,2 mg près, une quantité adaptée (de 1 g à 5 g) de l'échantillon d’essai préparé (voir 5.1) dans un
erlenmeyer et ajouter 100,0 ml de mélange d'extraction (3.14). Agiter le mélange pendant 60 min à l'aide d'un
agitateur mécanique ou magnétique (4.8). Laisser décanter 10,0 ml du surnageant dans un bécher de 100 ml.
Ajouter 5,0 ml de solution d'acide sulfosalicylique (3.15), tout en agitant, et poursuivre l'agitation avec
l'agitateur magnétique pendant 5 min. Filtrer ou centrifuger le surnageant afin d'éliminer tout précipité éventuel.
Placer 10,0 ml de la solution obtenue dans un bécher de 100 ml et ajuster le pH à 2,20 avec la solution
d'hydroxyde de sodium (3.11). Transférer dans une fiole jaugée d'un volume approprié au moyen du tampon
citrate (3.17), et compléter avec la solution tampon jusqu'à la marque.
Si un étalon interne est utilisé, ajouter 1,00 ml d'étalon interne (3.20.3) par fractions de 100 ml de solution
finale et compléter à la marque avec la solution tampon (3.17).
Procéder à la chromatographie conformément à 5.4.
Si les extraits ne sont pas chromatographiés le jour même, les stocker à une température inférieure à 5 °C.
5.3 Dosage des acides aminés totaux
5.3.1 Oxydation
Peser, à 0,2 mg près, de 0,1 g à 1 g de l'échantillon d’essai préparé (voir 5.1) dans
⎯ un ballon à fond rond de 100 ml (4.1) pour hydrolyse ouverte (5.3.2.3), ou
⎯ un ballon à fond rond de 250 ml (4.1) si une faible concentration en sodium est nécessaire (5.3.3.2), ou
⎯ un flacon de 100 ml, muni d'un bouchon à vis (4.2), pour hydrolyse fermée (5.3.2.4).
La prise d'essai pesée doit avoir une teneur en azote d'environ 10 mg et une teneur en humidité de 100 mg
au plus.
Placer le flacon/ballon dans un bain d'eau glacée et à 0 °C. Ajouter 5 ml de mélange à oxyder (3.16) et
mélanger avec une spatule en verre à bout courbé. Fermer hermétiquement le flacon/ballon contenant la
spatule avec un film imperméable à l'air, placer le bain d'eau glacée avec le récipient fermé dans un
réfrigérateur à 0 °C et l'y laisser séjourner pendant 16 h. Après 16 h, retirer le produit du réfrigérateur et
décomposer l'excès de réactif d'oxydation en ajoutant 0,84 g de disulfite de sodium.
Passer à 5.3.2.1.
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5.3.2 Hydrolyse
5.3.2.1 Hydrolyse des échantillons oxydés
Ajouter 25 ml de mélange d'hydrolyse (3.13) à l'échantillon oxydé préparé conformément à 5.3.1, en prenant
soin de rincer tout résidu d'échantillon adhérant aux bords du récipient et de la spatule. Selon le mode
opératoire d'hydrolyse employé, poursuivre conformément à 5.3.2.3 ou à 5.3.2.4.
5.3.2.2 Hydrolyse des échantillons non oxydés
Peser, à 0,2 mg près, de 0,1 g à 1 g de l'échantillon préparé dans un ballon à fond rond de 100 ml ou 250 ml
(4.1) ou dans un flacon de 100 ml pourvu d'un bouchon à vis (4.2).
...
Questions, Comments and Discussion
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