ISO 10519:1992
(Main)Rapeseed — Determination of chlorophyll content — Spectrometric method
Rapeseed — Determination of chlorophyll content — Spectrometric method
Graines de colza — Détermination de la teneur en chlorophylle — Méthode spectrométrique
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
IS0
NORME
1051 9
INTERNATIONALE
Première édition
1992-08-1 5
Graines de colza - Détermination de la teneur
en chlorophylle - Méthode spectrométrique
Rapeseed - Determination of chlorophyll content - Spectrometric
method
Numéro de référence
IS0 10519:1992(F)
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IS0 10519:1992(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres
de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre inté-
ressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique créé
à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I’ISO participent également aux tra-
vaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique
internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotech-
nique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techni-
ques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins
des comités membres votants.
La Norme internationale IS0 10519 a été élaborée par le comité techni-
que ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 2, Grai-
nes et fruits oléagineux.
Les annexes A, B et C de la présente Norme internationale sont don-
nées uniquement à titre d’information.
0 IS0 1992
Droits de reproduction réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être repro-
duite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou
mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 CH-I21 1 Genève 20 Suisse
Imprimé en Suisse
ii
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Norme internationale, mesurée comme chlorophylle
1 Domaine d’application
A. La teneur en chlorophylle, mesurée en
chlorophylle A, est exprimée en milligrammes par
La présente Norme internationale prescrit une mé-
kilogram me.
thode spectrométrique de détermination de la te-
neur en chlorophylle des graines de colza. Elle ne
s’applique pas à la détermination de la chlorophylle
4 Principe
dans les huiles.
Extraction d’une prise d’essai dans un appareil
adapté, avec une solution d’éthanol et d’iso-octane,
2 References normatives
ou encore de propane-2-01, de méthanol et d’iso-
octane. Détermination spectrométrique de la teneur
Les normes suivantes contiennent des dispositions
en chlorophylle de l’extrait en solution.
qui, par suite de la référence qui en est faite,
constituent des dispositions valables pour la pré-
sente Norme internationale. Au moment de la pu-
5 Réactifs
blication, les éditions indiquées étaient en vigueur.
Toute norme est sujette à révision et les parties
Sauf indication contraire, utiliser uniquement des
prenantes des accords fondés sur la présente
réactifs de qualité analytique reconnue.
Norme internationale sont invitées à rechercher la
possibilité d’appliquer les éditions les plus récentes
5.1 Solvant d’extraction, préparé comme suit.
des normes indiquées ci-après. Les membres de la
CE1 et de I’ISO possèdent le registre des Normes
Dans un bécher de 500 mi, introduire
internationales en vigueur à un moment donné.
a) 100 ml d’éthanol anhydre, ou
IS0 648:1977, Verrerie de laboratoire - Pipetfes à un
trait.
b) 50 mi de propane-2-01 anhydre et 50 ml de mé-
thanol anhydre.
IS0 664:1990, Graines oléagineuses - Réduction de
l’échantillon pour laboratoire en échantillon pour
Ajouter au contenu du bécher, 300 ml d’iso-octane
essai.
(triméthyl-2,2,5-pentane) ou de n-heptane ou d’éther
de pétrole (composé essentiellement d’hydrocar-
IS0 665:1977, Graines oléagineuses - Détermination
bures en C,, ayant un intervalle d’ébullition compris
de la teneur en eau et matières volatiles.
entre 90 “C et 100 OC).
3 Définition 6 Appareillage
Pour les besoins de la présente Norme internatio- Appareillage courant de laboratoire, et notamment
nale, la définition suivante s’applique.
6.1 Balance analytique, précise a 1 mg près.
3.1 teneur en chlorophylle: Fraction en masse des
substances dans l’échantillon participant à I’ab-
sorption dans la bande voisine de 665 nm, détermi-
6.2 Moulin mécanique, du type moulin à couteaux,
née dans les conditions opératoires de la présente
moulin a café ou équivalent.
1
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IS0 105191992(F)
Dimensions en millimetres
Bouchon en neoprene w
en fluorosilicone (n’ 3)
BRLes pour roulement
f- en acler Inoxydable (cb 161
Tube en acier
J /
124
-
Figure 1 - Micro-broyeur mécanique
6.3 Micro-broyeur mécanique (voir figure I), com- L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode
posé de tubes en acier inoxydable, d’un volume de spécifiée dans la présente Norme internationale.
50 ml environ, pouvant être bouchés solidement, de Une méthode d’échantillonnage recommandée est
billes pour roulements en acier inoxydable (I71 donnée dans l’lS0 542.
16 mm) et d‘un système permettant d’agiter hori-
zontalement les tubes bouchés à une fréquence de
8 Préparation de l’échantillon pour essai
240 min-’, avec un déplacement latéral de 3,5 cm,
ou broyeur B billes de Dangoumau.1)
Préparer un échantillon pour essai conformément à
I‘ISO 664, à partir de l’échantillon pour laboratoire
6.4 Papier filtre, vitesse moyenne, plié en V.
tel qu’il est recu ou après séparation des impuretés.
Sécher les graines ayant une humidité supérieure
6.5 Spectromètre, permettant d’effectuer les me-
à 10 YO (m/m) pendant 12 h à 45 ‘C afin de réduire
surages d’absovbance entre 600 nm et 700 nm avec
la teneur en eau à 10 O/O (m/nz) ou moins, sans dé-
une largeur de bande spectrale de 2 nm.
composer les pigments de chlorophylle.
Si le spectromètre ne permet pas d’obienir une lar-
Transférer 50 g de l‘échantillon pour essai dans le
geur de bande de 2 nm, il convient de procéder à
moulin mécanique (6.2) et moudre les graines jus-
un étalonnage à la chlorophylle A pure, comme dé-
qu’à obtention d’une poudre homogène. Si l’on uti-
crit dans l’annexe B.
lise un moulin de petites dimensions, par exemple
un moulin à café, moudre plusieurs quantités élé-
6.6 Cuves, ayant un parcours optique au moins
mentaires de 10 g puis les mélanger soi-
égal à 10 mm.
gneusement.
6.7 Pipettes, de 30 ml, conformes aux prescriptions
9 Mode opératoire
de I’ISO 648, classe A, ou dispositif automatique
permettant de délivrer des quantités de 30 ml avec
9.1 Prise d’essai
une erreur inférieure à 1 Yo.
Peser, à 1 mg près, 4 g de l’échantillon pour essai
6.8 Tubes de culture, de 20 ml, munis de bouchons.
(article 8) dans un tube en acier inoxydable ou dans
le réceptacle du broyeur de Dangoumau (6.3).
7 Échantillon nage 9.2 Extraction
II est essentiel que l’échantillon réceptionné par le
9.2.1 Ajouter, à la pipette (6.7), 30 ml du solvant
laboratoire soit réellement représentatif et non en-
d’extraction (5.1) dans le tube ou le réceptacle.
dommagé ou modifié durant le transport et I‘entre-
posage. Si l‘on utilise un tube. introduire trois billes en acier
1) Le broyeur à billes de Dangoumau est un exemple d’appareil approprié disponible sur le marché. Cette information est
donnée à l’intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que I’ISO approuve OU
recommande l’emploi exclusif de l’appareil ainsi désigné.
2
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IS0 10519:1992(F)
‘
inoxydable et agiter pendant 1 h. Pour le broyeur de en eau de l‘échantillon, déterminée conforrnément
Dangoumau, introduire des billes en acier (au moins à I’ISO 665.
quatre de taille moyenne) dans le réceptacle et
procéder à l’extraction pendani 20 min.
11 Précision
9,2.2 Laisser reposer l’extrait pendant 10 min, puis
11 .I Résultats des essais interlaboratoires
décanter au travers du papier filtre (6.4), dans un
tube de culture (6.8), un volume suffisant du filtrat
Un essai interlaboratoire a été effectué par 16 labo-
pour remplir la cuve du spectromètre (6.6). Boucher
ratoires selon l’lS0 5725. Les valeurs de répétabilité
le tube aussitôt que possible afin de réduire I’éva-
et de reproductibilité figurant dans le tableau 1 ont
poration au minimum.
été obtenues.
NOTE 1 La présence de plus d‘une phase dans le sol-
vant d’extraction indique la présence d’une humidité ex-
Tableau 1 - Résultats statistiques des essais
cessive, soit dans l’échantillon [qui devrait contenir moins
interla boratoires
de 10 % (nz/m) d’humidité], soit dans les solvants (qui
I l I
devraient être anhydres).
Échantillon
9.3 Détermination
Nombre de laboratoires
retenus après élimi- 12 12 IO‘)
Verser le filtrat dans une cuve (6.6) et mesurer I’ab-
nation des aberrants
sorbance avec le spectromètre (6.5) à 665 nm,
705 nm et 625 nm. (Les lectures effectuées à
Moyenne de la teneur
705 nm et 625 nm servent à évaluer le bruit de fond).
en chlorophylle, mg/kg
I I I
Écart-type de
I 0,48 1 0,50 1 0,95
10 Expression des résultats
s,
répétabilité,
Coefficient de variation
0,02 0,03
La teneur en chlorophylle, exprimée en milligram-
de répétabilité
mes par kilogramme de produit tel quel, est donnée
Répétabilité, 2,83 s, 0,65 0,70 2,67
par la formule
I I 1
Écart-type de reproduc-
1 0,63 1 1,28 I 1,99
tibilité, S,
mxl
Coefficient de variation
1 0,06 1 0,06 I 0,06
où
de reproductibilité
Reproductibilité, 2,83 S, 1,13 4,56 5,56
(I‘absorbance corrigée) est égale a
ncorr
AS65 - (A705 + n625)/2;
1) Calcul après éliinination de trois laboratoires avec
est I’absorbance à 665 nm; une différence supérieure à 3 mg/kg entre deux re-
A665
pétitions.
est I’absorbance à 705 nm;
A705
à 625 nm;
est I’absorbance
A625
1 I .2 Répétabilité
k est une constante qui est égale soit à
La différence absolue entre deux résultats d’essai
12,3 pour des spectromètres à largeur de
individuels indépendants, obtenus à l’aide de la
bande spectrale réglée sur 2 nm, soit a
même méthode sur un matériau identique soumis à
la valeur déterminée dans l’annexe B
l’essai dans le même laboratoire et par le même
pour des spectromètres qui ne sont pas
opérateur utilisant le même appareillage et dans un
en mesure d’atteindre une largeur de
court intervalle de temps, ne doit pas être supé-
bande spectrale de 2 nm;
rieure aux valeurs suivantes:
E est le parcours optique, en millimètres,
de la cuve;
teneur en chlorophylle comprise entre
10 mg/kg et 30 mg/kg:
1 mg/kg
112 est la masse, en grammes, de la prise
teneur en chlorophylle supérieure à
d‘essai ;
30 mg/kg: 3 mglkg
V est le volume, en millilitres, du filtrat.
NOTE 2 Les valeurs ne sont pas fixées par des teneurs
Si l’on désire rapporter la teneur en chlorophylle au en chlorophylle inférieures à 10 mg/kg, du fait que l’in-
produit sec, tenir compte dans le calcul de la teneur dustrie accepte une teneur allant juçqu‘à 22 mg/kg.
3
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NOTE 3 Les valeurs ne sont pas fixées par des teneurs
11.3 Reproductibilité
en chlorophylle inférieures à 10 mg/kg, du fait que I’in-
dustrie accepte une teneur allant jusqu’à 22 mg/kg.
La différence absolue entre deux résultats d’essai
individuels indépendants, obtenus à l’aide de la
même méthode sur un matériau identique soumis à 12 Rapport d’essai
l’essai dans des laboratoires différents par des
opérateurs différents utilisant des appareillages dif- Le rapport d’essai doit indiquer la méthode utilisée
férents, ne doit pas être supérieure aux valeurs et les résultats obtenus. II doit, en outre, mentionner
suivantes: tous les détails opératoires non prévus dans la pré-
sente Norme internationale, ou facultatifs, ainsi que
teneur en chlorophylle comprise entre les incidents éventuels susceptibles d’avoir agi sur
10 mg/kg et 30 mg/kg: les résultats.
5 mg/kg
teneur en chlorophylle supérieure à
Le rapport d’essai doit donner tous les rensei-
30 mg/kg: 6 mg/kg
gnements nécessaires à l’identification complète de
l’échantillon.
4
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Annexe A
(informative)
Informations sur les règles de sécurité et précautions à observer lors de la
manipulation et le stockage des produits
puis laisser reposer 1 min dans l’obscurité. L’appa-
A.l Risques encourus
rition d’une coloration jaune dans la fraction
aqueuse située à la base du tube indique la pré-
Consulter les fiches techniques fournies par le fa-
sence dans l’éther d’au moins 50 mg/kg de per-
bricant.
oxydes.
A.I.1 Les solvants préconisés dans la présente
Il convient de ne pas utiliser le solvant si l’on ob-
Norme internationale sont des liquides inflamma-
serve la présence de cristaux dans celui-ci. Si les
bles, à point d‘éclair bas. Ils peuvent provoquer un
peroxydes sont présents en quantité suffisante pour
dessèchement ou une irritation de la peau, des yeux
former un précipité (par exemple sous forme de
et des muqueuses.
cristaux), le récipient et son contenu doivent être
mis de côté avec une extrême prudence (voir A.5).
A.1.2 L’éther diéthylique peut former des per-
Les éthers ne doivent jamais être distillés (par
oxydes organiques au cours du stockage. Tous les
exemple, dans un extracteur) sauf si l’on est certain
peroxydes organiques sont des produits hautement
qu’ils ne contiennent pas de peroxydes. II ne faut
inflammables et instables (explosifs). Ils sont dan-
gereux en raison de leur extrême sensibilité à la pas utiliser les bouteilles dans lesquelles la pré-
sence de peroxydes a été mise en évidence (voir
chaleur, au frottement, aux chocs et à la lumière,
A.5).
ainsi qu’aux agents fortement oxydants et réduc-
te U rs.
A.4 Précautions a observer lors de la
A.2 Précautions a observer lors du
manipulation des solvants
stockage de l’éther diéthylique
Pour manipuler les solvants, utiliser des lunettes de
protection, des gants, et une blouse de laboratoire
Entreposer l’éther diéthylique loin de toute source
antistatique (sans polyester). Effectuer les manipu-
de chaleur ou de lumière dans des récipients fer-
lations dans un local bien ventilé (de préférence
més, de préférence ceux qui sont fournis par le fa-
dans une hotte fermée), loin de toute source de
bricant. ll convient d’apposer sur les récipients
chaleur, d’étincelles, ou d’une flamme nue. Effectuer
contenant de l’éther, des étiquettes indiquant les
tout transvasement important de solvants dans une
dates de réception, d’ouverture et d’expiration. II est
hotte fermée. Procéder au transvasement avec pru-
recommandé d’utiliser leur contenu dans le mois
dence, car ces liquides sont non conducteurs et
suivant l’ouverture. Si une bouteille date de plu-
peuvent générer de l’électricité statique. Entreposer
sieurs années, ou si l’on veut observer un dépôt
les volumes importants de solvants dans un endroit
solide autour du bouchon, il est conseillé de ne pas
frais et ventilé. Les séparer des produits oxydants
tenter de l’ouvrir (voir A.3).
et les isoler d’autres matériaux combustibles.
A.3 Précautions a observer lors de la
A.5 Précautions relatives a l’évacuation
manipulation de l’éther diétylique
des produits
Avant toute utilisation d’éther, un essai colorimétri-
que doit être effectué pour déceler la présence
A.5.1 Peroxydes organiques et précurseurs
éventuelle de peroxydes à l’aide du mode opé-
des peroxydes
ratoire suivant.
Consulter systématiquement le responsable de la
IMPORTANT - Cet essai ne doit pas être effectué si
sécurité ou du service d’hygiène avant de procéder
l’on observe la présence de cristaux dans le solvant.
à l’évacuation d’éther contenant des peroxydes. La
ligne de conduite à adopter dépendra de la teneur
Verser dans un tube en verre, 10 ml d’éther
en peroxydes. Ne jamais vider d’éther contenant
diéthylique puis 1 nil d’une solution à 10 % (V/l.’)
des peroxydes dans un évier.
d’iodure de potassium récemment préparée. Agiter
5
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IS0 105191992(F)
A.5.2 Élimination des peroxydes contenus pendant 30 min. II faut ensuite procéder à une dés-
hydratation pour ramener l’éther à une forme utili-
dans l’éther
sable.
Consulter systématiquement le responsable de la
sécurité ou du service d’hygiène avant de procéder
au traitement des éthers pour éliminer les per-
A.5.3 Évacuation des Solvants utilisés
oxydes. On peut agiter l’éther avec un mélange de
25 % (V/l/) de sulfate ferreux dans une solution à
L’évacuation des solvants utilisés dans les échan-
50 YO (V/v) d’acide sulfurique. Pour une bouteille
tillons pour essai doit s’effectuer par le dispositif de
d’éther de 2,5 I, il suffit normalement d’employer
vidange des solvants, en isolant le siphon avec
50 ml de ce mélange, en agitant périodiquement
250 ml d’eau.
6
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Annexe B
(informative)
Étalonnage des spectromètres ne permettant pas l’obtention d’une largeur de bande
spectrale de 2 nm
B.l Principe 6.4 Étalonnage
Préparation de solutions de chlorophylle A pure.
8.4.1 Détermination de la concentration en
Détermination, à l’aide de ces solutions, de la pente
chlorophylle A dans la solution étalon
de la courbe d’étalonnage du spectromètre.
Transvaser 1,0 ml de la solution étalon de
chlorophylle A (B.2.2) dans une fiole jaugée de
10 ml (B.3.3) et ajuster au trait avec de l’éther
diéthylique (B.2.1). Mesurer I’absorbance de cette
8.2 Réactifs solution avec le spectromètre (B.3.1) à 660 nm (lon-
gueur d’onde du pic) et à 642,5 nm, en utilisant une
cellule de 10 mm de parcours optique et une largeur
8.2.1 Éther diéthylique, de qualité analytique re-
de bande spectrale de 2 nm.
connue.
Calculer la concentration en chlorophylle A, en mil-
8.2.2 Chlorophylle A, solution étalon
ligrammes par litre, dans la solution étalon à l’aide
de la formule
Introduire environ 1 mg de chlorophylle A, cristalli-
sée, de pureté égale ou supérieure à 95 YO, dans
p(chlorophyl1e) = 99,3 x fi660 - 7,8 x A,,,,,
une fiole jaugée de 10 ml, puis dissoudre et corn-
pléter jusqu’au trait avec de l’éther diéthylique
où
(B.2.1).
fi660 est I’absorbance de la solution étalon de
chlorophylle A, à 660 nm;
fi6,*,, est I’absorbance de la solution étalon de
chlorophylle A, à 642,5 nm.
8.3 Appareillage
B.4.2 Préparation de la courbe d’étalonnage
6.3.1 Spectrométre, autre que l’appareil à
étalonner, permettant d’effectuer des inesurages
Dans une série de cinq fioles jaugées de 10,O mi,
d’absorbance entre 600 nm et 700 nm, avec une
introduire 0,200 mi, 0,400 mi, 0,600 mi, 0,800 ml et
largeur de bande spectrale inférieure à 2 nm. Cet
1 O00 ml de la solution étalon de chlorophylle A
instrument est nécessaire pour déterminer la
(B.2.2) dont la concentration a été calculée en
concentration en chlorophylle A dans la solution
8.4.1. Compléter les fioles jusqu’au trait-repère avec
étalon.
le solvant d’extraction (article 5).
B.3.2 Micropipettes, capables de délivrer 0,200 mi,
NOTE 4 Les faibles quantités d’éther diéthylique pré-
0,400 ml, 0,600 ml, 0,800 ml et 1 O00 mi.
sentées dans ces solutions n’affectent pas les résultats.
8.3.3 Fioles jaugées, de 10 ml de capacité.
Mesurer I’absorbance corrigée ficorr (voir
article IO) de ces solutions d’étalonnage avec le
B.3.4 Spectromètre de travail, c‘est-à-dire spectro- spectromètre de travail (B.3.4)
...
Questions, Comments and Discussion
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