ISO 8692:2012
(Main)Water quality — Fresh water algal growth inhibition test with unicellular green algae
Water quality — Fresh water algal growth inhibition test with unicellular green algae
ISO 8692:2012 specifies a method for the determination of the growth inhibition of unicellular green algae by substances and mixtures contained in water or by waste water. This method is applicable for substances that are easily soluble in water. With modifications to this method, as specified in ISO 14442 and ISO 5667-16, the inhibitory effects of poorly soluble organic and inorganic materials, volatile compounds, heavy metals and waste water can be tested. A rapid algal growth inhibition screening test for waste water is described in an annex. An alternative test procedure with algae from algal beads, with direct measurement of algal growth in spectrophotometric cells, is described in an annex.
Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de la croissance des algues d'eau douce avec des algues vertes unicellulaires
L'ISO 8692:2012 spécifie une méthode de détermination de l'inhibition de la croissance des algues vertes unicellulaires par des substances et des mélanges contenus dans l'eau ou par des eaux résiduaires. Cette méthode peut être utilisée avec des substances aisément solubles dans l'eau. En apportant à cette méthode les modifications spécifiées dans l'ISO 14442 et l'ISO 5667-16, il est possible d'évaluer les effets inhibiteurs des substances inorganiques et organiques faiblement solubles, des composés volatils, des métaux lourds et des eaux résiduaires. L'Annexe A décrit un essai de détection rapide de l'inhibition de la croissance des algues par des eaux résiduaires. L'Annexe B décrit un mode opératoire alternatif utilisant des algues provenant de billes d'alginate avec mesurage direct de la croissance algale dans des cellules spectrophotométriques.
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 8692
Третье издание
2012-02-15
Качество воды. Тест на подавление
роста водорослей в пресной воде с
применением одноклеточных зеленых
водорослей
Water quality — Fresh water algal growth inhibition test with unicellular
green algae
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
ISO 8692:2012(R)
©
ISO 2012
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 8692:2012(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или смотреть на экране, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на установку интегрированных шрифтов в компьютере, на котором ведется редактирование. В случае загрузки
настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение лицензионных условий
фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe – торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованным для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General Info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже.
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO 2012
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO, которое должно быть получено после запроса о разрешении, направленного по
адресу, приведенному ниже, или в комитет-член ISO в стране запрашивающей стороны.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright @ iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2012 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 8692:2012(R)
Содержание Страница
Предисловие .iv
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Термины и определения .2
4 Принцип.2
5 Реактивы и среда .3
6 Аппаратура.5
7 Методика .5
7.1 Приготовление питательной среды .5
7.2 Предварительное приготовление культуры и инокулята.6
7.3 Выбор концентраций анализируемой пробы.6
7.4 Приготовление анализируемой пробы и исходных растворов.6
7.5 Приготовление опытных и контрольных партий .7
7.6 Инкубация .7
7.7 Измерения.8
8 Критерии достоверности .8
9 Расчет .8
9.1 Построение кривых роста .8
9.2 Расчет ингибирования в процентах.9
9.3 Определение E C (например, E C и E C ).9
r x r 10 r 50
10 Выражение результатов .10
11 Интерпретация результатов.10
12 Прецизионность.10
13 Протокол испытания.11
Приложение A (информативное) Быстрый скрининг торможения роста водорослей в
сточных водах.13
Приложение B (информативное) Процедура тестирования водорослей из слоя
макроводорослей с прямым измерением роста водорослей в
спектрофотометрических ячейках.16
Приложение C (информативное) Метод иммобилизации водорослей в альгинатных
гранулах.21
Библиография.23
© ISO 2012 – Все права сохраняются iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 8692:2012(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в
деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие связи с
ISO, также принимают участие в этой работе. ISO работает в тесном сотрудничестве с Международной
электротехнической комиссией (IEC) по всем вопросам стандартизации в области электротехники.
Проекты международных стандартов разрабатываются в соответствии с правилами, приведенными в
Директивах ISO/IEC, Часть 2.
Основная задача технических комитетов – разработка международных стандартов. Проекты
международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам на
голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения не менее
75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Следует иметь в виду, что, возможно, некоторые элементы настоящего документа могут быть
объектом патентных прав. ISO не несет ответственности за определение некоторых или всех таких
патентных прав.
ISO 8692 подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 147, Качество воды, Подкомитетом SC 5,
Биологические методы.
Данное третье издание отменяет и заменяет второе издание (ISO 8692:2004), переработанное
технически.
iv © ISO 2012 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 4 ----------------------
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 8692:2012(R)
Качество воды. Тест на подавление роста водорослей в
пресной воде с применением одноклеточных зеленых
водорослей Ошибка! Источник ссылки не найден.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Лица, пользующиеся данным международным стандартом, должны быть
ознакомлены с обычной лабораторной практикой. В данном стандарте не ставится цель
рассмотреть все проблемы безопасности, если они возникают, связанные с его применением.
Пользователь сам несет ответственность за разработку соответствующих правил безопасности
и охраны здоровья и за обеспечение соответствия условиям национальных регламентов.
ВАЖНО — Необходимо, чтобы испытания проводились в соответствии с данным
международным стандартом квалифицированным персоналом.
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает метод определения подавления роста
одноклеточных зеленых водорослей веществами и смесями, содержащимися в воде, или сточными
водами. Этот метод применим к веществам, которые легко растворяются в воде.
В связи с корректировкой этого метода, как указано в ISO 14442 и ISO 5667-16, может быть
протестировано ингибирующее действие плохо растворимых органических и неорганических веществ,
летучих соединений, тяжелых металлов и сточных вод.
Скрининговый тест сточных вод на быстрое подавление роста водорослей описан в Приложении А.
Альтернативная процедура тестирования водорослей из гранул водорослей с прямым измерением
роста водорослей в спектрофотометрических ячейках описана в Приложении В.
2 Нормативные ссылки
Следующие нормативные документы необходимы для применения настоящего международного
стандарта. Для жестких ссылок применяется только то издание, на которое дается ссылка. Для
плавающих ссылок применяется самое последнее издание нормативного ссылочного документа
(включая любые изменения).
ISO 5667-16, Качество воды. Отбор проб. Часть 16. Руководство по биотестированию проб
ISO/TR 11044, Качество воды. Научные и технические аспекты испытаний на подавление роста
водорослей
ISO 14442, Качество воды. Руководящие указания по испытанию на торможение
малорастворимыми веществами, летучими соединениями, металлами и сточными водами роста
водорослей
ISO/TS 20281, Качество воды. Руководящие указания по статистической интерпретации данных по
экотоксикологии
© ISO 2012 – Все права сохраняются 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 8692:2012(R)
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применяются следующие термины и определения.
3.1
плотность клеток
cell density
n
количество клеток на единицу объема среды
ПРИМЕЧАНИЕ Плотность клеток выражается количеством клеток на миллилитр.
3.2
эффективная концентрация
effective concentration
концентрация анализируемой пробы (EC ), при которой измеряют эффект x % по сравнению с
x
контрольной пробой
ПРИМЕЧАНИЕ Чтобы однозначно обозначить значение EC, выводимое из скорости роста клеток, предлагается
использовать обозначение “E C”.
r
3.3
наименьшее неэффективное разбавление
lowest ineffective dilution
LID
степень разбавления, при которой не наблюдается торможение роста клеток, или наблюдаются
эффекты, не превышающие характерную для теста изменчивость.
[13]
ПРИМЕЧАНИЕ Взят из ISO 15088:2007 , 3.5.
3.4
удельная скорость роста
specific growth rate
μ
пропорциональна скорости увеличения плотности клеток в единицу времени:
1dn
μ =
ntd
где
n плотность клеток, выраженная в количестве клеток на миллилитр;
t время, выраженное в сутках.
1
−
ПРИМЕЧАНИЕ Удельная скорость роста выражается в обратных сутках (сутки ).
[ISO/TR 11044:2008, 3.2]
4 Принцип
Штаммы монотипичных видов водорослей культивируют для нескольких поколений в определенной
среде, содержащей диапазон концентраций анализируемой пробы, приготовленной путем смешивания
соответствующих количеств питательной среды, анализируемой пробы и инокулята клеток водорослей
в экспоненциальной фазе роста. Опытные порции инкубируют в течение (72 ± 2) ч, во время которых
плотность клеток в каждом испытуемом растворе измеряют, по крайней мере, каждые 24 ч.
2 © ISO 2012 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 8692:2012(R)
Подавление роста клеток определяют как снижение удельной скорости роста относительно
контрольных культур, выращенных в идентичных условиях.
5 Реактивы и среда
5.1 Тест-микроорганизм, используют любой из следующих видов планктонных пресноводных
водорослей:
1) 2)
a) Desmodesmus subspicatus (R. Chodat) E. Hegewald и A. Schmidt (86.81 SAG );
3) TM 2) 2) 2)
b) Pseudokirchneriella subcapitata (Korshikov) Hindak (ATCC® 22662 , CCAP 278/4 или 61.81 SAG ).
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Эти два вида не проявляют идентичной реакции на токсичные вещества.
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Оба вида водорослей представляют собой планктонные зеленые водоросли, принадлежащие к
классу Sphaeropleales (Chlorophyta, Chlorophyceae) и, как правило, являются одноклеточными.
Рекомендуемые штаммы можно получить в виде альгологически чистых, нестерильных культур из
следующих коллекций:
— SAG — Sammlung von Algenkulturen Göttingen [Göttingen Algal Culture Collection], Германия
www.epsag.uni-goettingen.de (представлен 2012-01-30);
— ATCC — American Type Culture Collection, США
www.atcc.org (представлен 2012-01-30);
— CCAP — Culture Collection of Algae and Protozoa, Великобритания
www.ccap.ac.uk (представлен 2012-01-30);
— ALCP — Algothèque du Laboratoire de Cryptogamie, Франция
www.mnhn.fr (представлен 2012-01-30).
Исходные культуры могут храниться в среде, указанной в 5.3. и 7.1. Однако часто необходимо
проводить пересев (раз в неделю), чтобы предотвратить отсутствие роста. Исходная культура может
храниться в течение длительного периода на более богатых водорослевых средах, таких как те,
которые рекомендованы коллекцией культур.
В качестве альтернативы, водоросли могут храниться в течение нескольких месяцев на чашках с
) [1]
4
агаровой средой или в альгинатных гранулах без потери жизнеспособности . Водоросли можно легко
восстановить из агара или выделить из гранул водорослей (см. Приложение С), когда необходимо
провести тесты на токсичность.
1) Этот вид ранее был известен как Scenedesmus subspicatus Chodat.
2) Торговые названия штаммов являются примерами подходящих штаммов, имеющихся в продаже. Эта
информация приведена для удобства пользователей данного документа и не служит поддержкой ISO этих
продуктов.
3) Этот вид ранее был известен как Selenastrum capricornutum Prinz. Новое название взято из коллекций культур.
4) Гранулы водорослей, поставляемые MicroBioTests Inc., Mariakerke-Gent, Бельгия, являются примером
подходящего продукта, имеющегося в продаже. Эта информация приведена для удобства пользователей
данного документа и не служит поддержкой ISO этих продуктов. Могут использоваться эквивалентные продукты,
если соблюдены критерии применимости, установленные в данном документе.
© ISO 2012 – Все права сохраняются 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 8692:2012(R)
Появление клеток и идентичность тестовых организмов должны быть подтверждены
микроскопическими исследованиями.
5.2 Вода, деионизированная или эквивалентной чистоты (проводимость <10 мкСм/см),
используемая для приготовления питательной среды и растворов испытуемого вещества.
Следует предпринять меры предосторожности, чтобы избежать загрязнения воды неорганическими
или органическими веществами в процессе приготовления и хранения. Не использовать оборудование,
изготовленное из меди.
5.3 Питательные вещества
Готовят четыре питательных исходных раствора в воде, в соответствии с составами, указанными в
Таблице 1.
Впоследствии эти растворы разводят (см. 7.1 и 7.4) для достижения конечной концентрации
питательных веществ в тестируемых растворах. Однако вместо этого, макронутриенты можно
добавить непосредственно в воду.
Все используемые химические вещества должны иметь лабораторную степень чистоты.
Стерилизуют исходные растворы с помощью мембранной фильтрации (средний диаметр пор 0,2 мкм)
или обработкой в автоклаве [(120 ± 2) °C, 15 мин]. Хранят растворы в темном месте при температуре
4 °C.
Исходный раствор 4 не обрабатывают в автоклаве, чтобы избежать потерь на испарение NaHCO , а
3
стерилизуют через мембранный фильтр.
Таблица 1 — Массовые концентрации питательных веществ в испытуемом растворе
Окончательная
Массовая концентрация
Исходный раствор Питательное вещество массовая концентрация
в исходном растворе
в испытуемом растворе
NH Cl 15 мг/л (N: 3,9 мг/л)
1,5 г/л
4
MgCl ⋅6H O 12 мг/л (Mg: 2,9 мг/л)
2 2 1,2 г/л
1: Макронутриенты CaCl ⋅2H O 1,8 г/л
2 2 18 мг/л (Ca: 4,9 мг/л
MgSO ⋅7H O 1,5 г/л
15 мг/л (S: 1,95 мг/л)
4 2
0,16 г/л
KH PO
2 4 1,6 мг/л (P: 0,36 мг/л)
FeCl ⋅6H O 64 мг/л 64 мкг/л (Fe: 13 мкг/л
3 2
2: Fe-EDTA
Na EDTA⋅2H O 100 мг/л 100 мкг/л
2 2
a
H BO 185 мг/л
3 3 185 мкг/л (B: 32 мкг/л)
MnCl ⋅4H O 415 мг/л
2 2 415 мкг/л (Mn: 115 мкг/л)
ZnCl 3 мг/л 3 мкг/л (Zn: 1,4 мкг/л)
2
3: Следовые элементы
CoCl ⋅6H O 1,5 мг/л 1,5 мкг/л (Co: 0,37 мкг/л)
2 2
0,01 мкг/л (Cu: 3,7 мкг/л)
CuCl ⋅2H O 0,01 мг/л
2 2
7 мкг/л (Mo: 2,8 мкг/л)
Na MoO ⋅2H O 7 мг/л
2 4 2
4: NaHCO NaHCO 50 г/л 50 мг/л (C: 7,14 мг/л)
3 3
a
H BO можно растворить, добавив 0,1 моль/л NaOH.
3 3
4 © ISO 2012 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 8692:2012(R)
6 Аппаратура
Все оборудование, которое вступает в контакт с испытательной средой, должно быть изготовлено из
стекла или другого химически инертного материала.
Используется обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее.
6.1 Терморегулируемая камера или помещение с регулируемой температурой, с белым
люминесцентным светом, обеспечивающим непрерывное, равномерное освещение в соответствии с
требованиями, предъявляемыми к испытанию в 7.6.
6.2 Прибор для измерения плотности клетки водоросли, предпочтительно счетчик частиц,
способный подсчитывать количество частиц в диапазоне размеров от 2,5 мкм до 25 мкм (сферический
диаметр), или микроскоп и счетная камера.
С другой стороны, плотность водорослей может быть определена путем косвенной процедуры с
[2] [3]
применением, например, флуориметра (например, флуоресценция in vitro или флуоресценция in
)
5
vivo с усиленной DCMU , если он достаточно чувствителен и достаточно хорошо коррелирует с
4
плотностью клеток. Используемый прибор должен быть способен измерять плотность клеток до 10
клеток/мл и отличать рост водорослей от возмущающих воздействий, таких как присутствие твердых
4
частиц и цвет пробы. Спектрофотометры могут быть достаточно чувствительными, чтобы измерить 10
клеток/мл, при условии, что используется соответствующая длина пути (до 10 см). Тем не менее, этот
метод особенно чувствителен к помехам от взвесей и окрашенных веществ при низкой плотности
клеток (см. ISO/TR 11044).
6.3 Сосуды для культивирования (стекло), например, 250 мл конические колбы с
воздухопроницаемыми пробками.
6.4 Устройства для мембранной фильтрации, использующие фильтры со средним диаметром пор
0,2 мкм.
6.5 Автоклав.
6.6 pH-метр.
7 Методика
7.1 Приготовление питательной среды
Готовят питательную среду, добавляя установленный объем питательных исходных растворов (5.3) к
воде (5.2).
Добавляют приблизительно к 500 мл воды (5.2):
— 10 мл исходного раствора 1 (5.3);
— 1 мл исходного раствора 2 (5.3);
— 1 мл исходного раствора 3 (5.3);
— 1 мл исходного раствора 4 (5.3).
Доводят до 1 000 мл водой.
5) DCMU это 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевина (CAS No. 330-54-1).
© ISO 2012 – Все права сохраняются 5
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 8692:2012(R)
Перед использованием уравновешивают среду, выдерживая ее в течение ночи в контакте с воздухом,
или пропуская через нее в течение 30 мин барботажный отфильтрованный воздух. После
уравновешивания, при необходимости, регулируют рН до 8,1 ± 0,2, используя либо 1 моль/л соляной
кислоты, либо 1 моль/л раствора едкого натра.
Эта питательная среда буферизуется за счет бикарбонатов и атмосферного СО . Различные значения
2
−
рН, могут быть получены путем изменения концентрации HCO и/или концентрации CO в атмосфере
2
3
(требуются закрытые сосуды), как определено в ISO 14442. Если такие изменения необходимы для
того, чтобы выполнить тест при другом, конкретном значении рН, они должны быть четко
мотивированы и оговорены.
7.2 Предварительное приготовление культуры и инокулята
Предварительное культивирование должно быть начато за 2 – 4 дня до начала проведения теста.
3
Питательная среда (7.1) засевается при достаточно низкой плотности клеток (например, от 5 × 10
4
клеток/мл до 10 клеток/мл в течение 3 дней предварительного культивирования) для того, чтобы
поддерживать экспоненциальный рост клеток до начала теста. Предварительно выращенные культуры
должны быть инкубированы в тех же условиях, что и во время теста (7.6).
Эту предварительно выращенную в экспоненциальной фазе культуру используют в качестве инокулята
для проведения теста. Измеряют плотность клеток в предварительно выращенных культурах
непосредственно перед использованием, чтобы рассчитать необходимый объем инокулята.
7.3 Выбор концентраций анализируемой пробы
Водоросли должны подвергаться воздействию концентраций анализируемой пробы в геометрической
прогрессии с коэффициентом, не превышающим 3,2 (например, 1,0 мг/л, 1,8 мг/л, 3,2 мг/л, 5,6 мг/л и
10 мг/л).
Концентрации следует выбирать так, чтобы получить, по меньшей мере, одно значение подавления
ниже и одно значение подавления выше предполагаемого параметра E C . Кроме того, следует
r x
включить, по крайней мере, два уровня подавления между 10 % и 90 %, чтобы предоставить данные
для регрессионного анализа.
Может быть проведен ограниченный тест только с одной концентрацией, чтобы продемонстрировать
отсутствие токсичности. Количество реплик для этой концентрации должно быть не менее шести.
Если необходимо определить “наименьшее неэффективное разбавление” (LID) сточных вод, должны
применяться следующие серии разбавлений: 1:1,25, 1:2, 1:3, 1:4, 1:6, 1:8, 1:12.
ПРИМЕЧАНИЕ Подходящий диапазон концентраций лучше всего определяется путем проведения
предварительного диапазонового теста, охватывающего несколько порядков модуля разности в тестовой
концентрации. Репликация тестовых концентраций не является обязательным требованием для предварительного
теста.
7.4 Приготовление анализируемой пробы и исходных растворов
Анализируемая проба может представлять собой водную (например, сточные воды) или неводную
(например, химическое вещество или смесь химикатов) субстанцию, на которой определяется
подавляющее действие роста водорослей.
Если анализируемая проба представляет собой водный раствор (например, сточных вод), то следует
рассмотреть вопрос о предварительной обработке (например, фильтрация, нейтрализация) в
зависимости от происхождения пробы и цели теста. К пробе добавляют питательные исходные
растворы (5.3), подготовленные в соответствии с 7.1.
6 © ISO 2012 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 8692:2012(R)
Для неводных анализируемых проб, как правило, необходимо приготовить исходные растворы. Способ
приготовления растворов должен быть тщательно подобран с учетом свойств пробы. Исходные
растворы обычно готовят путем растворения анализируемой пробы в питательной среде. Изменения
необходимы, когда анализируемая проба не растворяется полностью в питательной среде, как
определено в ISO 14442 и ISO 5667-16.
Обычно, тест проводится без регулировки рН среды после добавления анализируемой пробы. Тем не
менее, некоторые вещества могут оказывать токсическое действие вследствие чрезмерной
кислотности или щелочности. Для того, чтобы определить токсичность пробы независимо от рН,
следует отрегулировать рН водной пробы или исходного раствора (до разбавление в серии) в
соответствии с рН культуральной среды, используя либо 1 моль/л соляной кислоты или 1 моль/л
раствора едкого натра (см. ISO 5667-16).
7.5 Приготовление опытных и контрольных партий
Готовят опытные партии, смешивая в сосудах для испытания соответствующие объемы
анализируемой пробы или исходные растворы (7.4) анализируемой пробы, питательную среду (7.1) и
инокулят (7.2). Общий объем, концентрации добавленных нутриентов питательной среды и плотность
клеток должны быть одинаковыми во всех сосудах. Готовят не менее трех одинаковых партий для
каждой концентрации анализируемой пробы.
Исходная плотность клеток должна быть достаточно низкой, чтобы позволить экспоненциальный рост
в контрольной культуре на протяжении всего испытания без отклонения рН более чем на 1,5 рН
единицы (см. Раздел 8). Таким образом, исходные значения плотности клеток не должны превышать
4
10 клеток/мл.
Готовят шесть повторных контрольных партий в каждой тестовой концентрации, добавляя
соответствующий объем инокулята к питательной среде.
Измеряют pH повторной партии в каждой испытуемой концентрации и в одной контрольной повторной
пробе.
При необходимости готовят одну серию концентраций анализируемой пробы без водорослей в
качестве фона для определения плотности клеток.
Количество реплик на концентрацию может быть снижено на основе статистических данных (см.
ISO/TS 20281) в случае увеличения количества концентраций и уменьшения интервала концентрации.
В случае испытания химических веществ для целей регистрации, воздействие концентрации в начале,
во время и в конце экспозиции должно быть проверено с помощью специального химического анализа.
Для этого может потребоваться получение дополнительных партий для анализа. Более подробную
[4]
информацию можно найти в OECD 201 .
7.6 Инкубация
Сосуды для испытания должны быть достаточно закрытыми, чтобы избежать загрязнения воздуха и
уменьшить испарение воды, но они не должны быть герметичными, чтобы позволить CO поступать в
2
сосуды (достаточно иметь небольшое отверстие). Инкубируют сосуды при температуре (23 ± 2) °С под
непрерывным белым светом. Интенсивность света при среднем уровне испытательной среды должна
2 2
быть равномерной в пределах ± 10 % и в диапазоне от 60 мкмоль/(м с) до 120 мкмоль/(м с) при
измерении в фотосинтетически эффективном диапазоне длин волн от 400 нм до 700 нм с
использованием соответствующего рецептора.
Важно отметить, что метод измерения, в частности тип рецептора (коллектор), влияет на измеренное
значение. Сферические рецепторы (которые реагируют на свет из всех углов выше и ниже плоскости
измерения) и "косинусные" рецепторы (которые реагируют на свет из всех углов выше плоскости
измерения) являются предпочтительными по сравнению с однонаправленными рецепторами. Они
дают более высокие значения для источника света многоточечного типа, описанного в Примечании.
© ISO 2012 – Все права сохраняются 7
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 8692:2012(R)
ПРИМЕЧАНИЕ Интенсивность света, указанная в первом абзаце настоящего подраздела, может быть
достигнута с помощью 4 – 6 люминесцентных ламп универсального белого (природного) типа, т.е. номинальный
цвет стандартного цвета 2 (цветовая температура 4 300 K). Оптимальное расстояние лампы от культуральной
среды водорослей составляет примерно 0,35 м.
Для приборов для измерения света, откалиброванных в люксах, приемлемым для испытания является
эквивалентный диапазон от 6 000 лк до 10 000 лк.
Тестирование окрашенных растворов требует конкретных изменений в соответствии с ISО 14442.
Непрерывно встряхивая, перемешивают или аэрируют культуры, чтобы сохранить клетки в свободной
суспензии и облегчить перенос массы CO из воздуха в воду, и в свою очередь уменьшить отклонение
2
значения рН.
7.7 Измерения
Измеряют плотность клеток в каждой испытуемой партии (включая контрольные), по крайней мере,
каждые 24 часа. Перед измерением тщательно перемешивают опытные партии. Желательно, чтобы
аликвоты, извлеченные из сосудов для измерения, не заменялись.
Номинальная плотность клеток может использоваться в качестве исходной плотности клеток, и тогда
не потребуется измерять исходную плотность.
Тест должен длиться в течение (72 ± 2) ч.
В конце теста измеряют рН проб, по крайней мере, из одной повторной партии при каждой
концентрации анализируемой пробы и одной контрольной повторной пробы.
8 Критерии достоверности
Считается, что тест достоверен при соблюдении следующих условий.
−1
a) Средняя скорость роста в контрольных повторных пробах должна быть не менее 1,4 d . Эта
скорость роста соответствует увеличению плотности клеток на коэффициент 67 за 72 ч.
b) Коэффициент вариации скорости роста в контрольных повторных пробах не должен превышать
5 %.
c) pH в контрольных повторных пробах не должен увеличиваться во время теста более чем на 1,5 по
сравнению с питательной средой.
Увеличение рН в ходе испытаний может оказать значительное влияние на результаты и, поэтому
установлен предел в 1,5 единиц. Эти изменения, однако, всегда должны быть настолько низкими,
насколько это возможно, например, при непрерывном встряхивании во время испытания.
Если эти критерии не выполняются, изучают экспериментальные методы и используют инокулят из
других источников, если это необходимо.
9 Расчет
9.1 Построение кривых роста
Вносят в таблицу результаты измерений плотности клеток для каждой испытуемой партии в
соответствии с концентрацией анализируемой пробы и продолж
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 8692
Third edition
2012-02-15
Water quality — Fresh water algal growth
inhibition test with unicellular green algae
Qualité de l’eau — Essai d’inhibition de la croissance des algues d’eau
douce avec des algues vertes unicellulaires
Reference number
ISO 8692:2012(E)
©
ISO 2012
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 8692:2012(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2012
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or ISO’s
member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2012 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 8692:2012(E)
Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents and media . 2
6 Apparatus . 4
7 Procedure . 5
7.1 Preparation of growth medium . 5
7.2 Preparation of pre‑culture and inoculum . 5
7.3 Choice of test sample concentrations . 5
7.4 Preparation of test sample and stock solutions . 5
7.5 Preparation of test and control batches . 6
7.6 Incubation . 6
7.7 Measurements . 7
8 Validity criteria . 7
9 Calculation . 7
9.1 Plotting of growth curves . 7
9.2 Calculation of percentage inhibition . 8
9.3 Determination of E C (e.g. E C and E C ) . 8
r x r 10 r 50
10 Expression of results . 8
11 Interpretation of results . 9
12 Precision . 9
13 Test report . 9
Annex A (informative) Rapid screening of waste water algal growth inhibition . 11
Annex B (informative) Test procedure with algae from algal beads, with direct measurement of algal
growth in spectrophotometric cells .14
Annex C (informative) Procedure for immobilization of algae in alginate beads .19
Bibliography .21
© ISO 2012 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 8692:2012(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International
Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 8692 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological methods.
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 8692:2004), which has been technically revised.
iv © ISO 2012 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 8692:2012(E)
Water quality — Fresh water algal growth inhibition test with
unicellular green algae
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if any,
associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health
practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this International
Standard be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of the growth inhibition of unicellular
green algae by substances and mixtures contained in water or by waste water. This method is applicable for
substances that are easily soluble in water.
With modifications to this method, as specified in ISO 14442 and ISO 5667-16, the inhibitory effects of poorly
soluble organic and inorganic materials, volatile compounds, heavy metals and waste water can be tested.
A rapid algal growth inhibition screening test for waste water is described in Annex A.
An alternative test procedure with algae from algal beads, with direct measurement of algal growth in
spectrophotometric cells, is described in Annex B.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are indispensable
for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition
of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
ISO/TR 11044, Water quality — Scientific and technical aspects of batch algae growth inhibition tests
ISO 14442, Water quality — Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile
compounds, metals and waste water
ISO/TS 20281, Water quality — Guidance on statistical interpretation of ecotoxicity data
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
cell density
n
number of cells per volume of medium
NOTE Cell density is expressed in cells per millilitre.
© ISO 2012 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 8692:2012(E)
3.2
effective concentration
concentration of the test sample (EC ) at which an effect of x % is measured, if compared to the control
x
NOTE To unambiguously denote an EC value deriving from growth rate, it is proposed to use the symbol “E C”.
r
3.3
lowest ineffective dilution
LID
dilution level at which no inhibition, or only effects not exceeding the test-specific variability, are observed
[13]
NOTE Adapted from ISO 15088:2007 , 3.5.
3.4
specific growth rate
m
proportional rate of increase in cell density per time:
1dn
μ =
n dt
where
n is the cell density, expressed in cells per millilitre;
t is the time, expressed in days.
−1
NOTE Specific growth rate is expressed in reciprocal days (day ).
[ISO/TR 11044:2008, 3.2]
4 Principle
Monospecies algal strains are cultured for several generations in a defined medium containing a range of
concentrations of the test sample, prepared by mixing appropriate quantities of growth medium, test sample,
and an inoculum of exponentially growing algal cells. The test batches are incubated for a period of (72 ± 2) h
during which the cell density in each test solution is measured at least every 24 h.
Inhibition is measured as a reduction in specific growth rate relative to control cultures grown under
identical conditions.
5 Reagents and media
5.1 Test organism, using either of the following planktonic fresh water algae species:
1) 2)
a) Desmodesmus subspicatus (R. Chodat) E. Hegewald et A. Schmidt (86.81 SAG );
3)
TM 2) 2) 2)
b) Pseudokirchneriella subcapitata (Korshikov) Hindak (ATCC® 22662 , CCAP 278/4 or 61.81 SAG ).
NOTE 1 The two species do not show identical responses to toxic agents.
NOTE 2 Both algae species are planktonic green algae belonging to the order of Sphaeropleales (Chlorophyta,
Chlorophyceae) and are usually unicellular in culture.
1) This species is formerly known as Scenedesmus subspicatus Chodat.
2) Trade names of strains are examples of suitable strains available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of these products.
3) This species is formerly known as Selenastrum capricornutum Prinz. The new name is currently cited by culture
collections.
2 © ISO 2012 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 8692:2012(E)
The strains recommended are available in unialgal, non-axenic cultures from the following collections:
— SAG — Sammlung von Algenkulturen Göttingen [Göttingen Algal Culture Collection], Germany
www.epsag.uni-goettingen.de (viewed 2012-01-30);
— ATCC — American Type Culture Collection, USA
www.atcc.org (viewed 2012-01-30);
— CCAP — Culture Collection of Algae and Protozoa, UK
www.ccap.ac.uk (viewed 2012-01-30);
— ALCP — Algothèque du Laboratoire de Cryptogamie, France
www.mnhn.fr (viewed 2012-01-30).
Stock cultures can be maintained in the medium specified in 5.3. and 7.1. However, frequent subculturing is
necessary (once a week) to prevent failure of growth. The stock culture can be maintained for extended periods
on richer algal media such as those recommended by the culture collection.
4)
Alternatively, algae can be stored for several months on agar plates or in alginate beads without losing their
[1]
viability . The algae can be easily recovered from the agar or liberated from the algal beads (see Annex C)
when needed to perform the toxicity tests.
The appearance of the cells and the identity of the test organisms should be confirmed by microscopy.
5.2 Water, deionized or of equivalent purity (conductivity <10 µS/cm), for use in the preparation of the growth
medium and test substance solutions.
Take special care to avoid contamination of the water by inorganic or organic substances during preparation
and storage. Do not use equipment made of copper.
5.3 Nutrients
Prepare four nutrient stock solutions in water, according to the compositions given in Table 1.
These solutions are eventually diluted (see 7.1 and 7.4) to achieve the final nutrient concentrations in the test
solutions. However, the macronutrients may instead be added directly to the water.
All chemicals used shall be of reagent-grade quality.
Sterilize the stock solutions by membrane filtration (mean pore diameter 0,2 µm) or by autoclaving [(120 ± 2) °C,
15 min]. Store the solutions in the dark at 4 °C.
Do not autoclave stock solution 4 in order to avoid evaporative loss of NaHCO , but sterilize it by membrane filtration.
3
4) The algal beads supplied by MicroBioTests Inc., Mariakerke-Gent, Belgium are an example of a suitable product
available commercially. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an
endorsement by ISO of this product. Equivalent products may be used if the validity criteria specified in this document are
fulfilled.
© ISO 2012 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 8692:2012(E)
Table 1 — Mass concentrations of nutrients in the test solution
Final mass
Mass concentration
Stock solution Nutrient concentration
in stock solution
in test solution
NH Cl 1,5 g/l 15 mg/l (N: 3,9 mg/l)
4
MgCl⋅6H O 1,2 g/l 12 mg/l (Mg: 2,9 mg/l)
2 2
1: Macronutrients CaCl⋅2H O 1,8 g/l 18 mg/l (Ca: 4,9 mg/l
2 2
MgSO⋅7H O 1,5 g/l 15 mg/l (S: 1,95 mg/l)
4 2
KH PO 0,16 g/l 1,6 mg/l (P: 0,36 mg/l)
2 4
FeCl⋅6H O 64 mg/l 64 µg/l (Fe: 13 µg/l)
3 2
2: Fe-EDTA
Na EDTA⋅2H O 100 mg/l 100 µg/l
2 2
a
H BO 185 mg/l 185 µg/l (B: 32 µg/l)
3 3
MnCl⋅4H O 415 mg/l 415 µg/l (Mn: 115 µg/l)
2 2
ZnCl 3 mg/l 3 µg/l (Zn: 1,4 µg/l)
2
3: Trace elements
CoCl⋅6H O 1,5 mg/l 1,5 µg/l (Co: 0,37 µg/l)
2 2
CuCl⋅2H O 0,01 mg/l 0,01 µg/l (Cu: 3,7 ng/l)
2 2
Na MoO⋅2H O 7 mg/l 7 µg/l (Mo: 2,8 µg/l)
2 4 2
4: NaHCO NaHCO 50 g/l 50 mg/l (C: 7,14 mg/l)
3 3
a
H BO can be dissolved by the addition of 0,1 mol/l NaOH.
3 3
6 Apparatus
All equipment that comes in contact with the test medium shall be made of glass or other chemically inert material.
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1 Temperature‑controlled cabinet or room, with white fluorescent light, providing continuous, uniform
illumination suitable for the lighting requirements specified for the test in 7.6.
6.2 Apparatus for measuring algal cell density, preferably a particle counter capable of counting particles
in the size range 2,5 µm to 25 µm (spherical diameters), or a microscope and a counting chamber.
Alternatively, the algal densities may be determined by an indirect procedure using for instance a fluorimeter
[2] 5) [3]
(e.g. in vitro fluorescence or DCMU -enhanced in vivo fluorescence ), when sufficiently sensitive and if
shown to be sufficiently well correlated with cell density. The apparatus used shall be capable of measuring
4
cell densities as low as 10 cells/ml and of distinguishing between algal growth and disturbing effects, e.g. the
presence of particulate matter and the colour of the sample. Spectrophotometers may be sufficiently sensitive
4
to measure 10 cells/ml, providing a sufficient pathlength (up to 10 cm) can be used. However, this technique
is particularly sensitive to interferences from suspended material and coloured substances at low cell densities
(see ISO/TR 11044).
6.3 Culture vessels (glass), e.g. 250 ml conical flasks with air-permeable stoppers.
6.4 Apparatus for membrane filtration, using filters of mean pore diameter 0,2 µm.
6.5 Autoclave.
6.6 pH meter.
5) DCMU is 3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea (CAS No. 330-54-1).
4 © ISO 2012 – All rights reserved
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 8692:2012(E)
7 Procedure
7.1 Preparation of growth medium
Prepare a growth medium by adding an appropriate volume of the nutrient stock solutions (5.3) to water (5.2).
Add to approximately 500 ml of water (5.2):
— 10 ml of stock solution 1 (5.3);
— 1 ml of stock solution 2 (5.3);
— 1 ml of stock solution 3 (5.3);
— 1 ml of stock solution 4 (5.3).
Make up to 1 000 ml with water.
Before use, equilibrate the medium by leaving overnight in contact with air, or by bubbling filtered air through it
for 30 min. After equilibration, adjust the pH if necessary to 8,1 ± 0,2, using either 1 mol/l hydrochloric acid or
1 mol/l sodium hydroxide solution.
This growth medium is buffered by hydrogencarbonate and atmospheric CO . Different pH values may be
2
−
obtained by modifying the concentration of HCO and/or the atmospheric CO concentration (requires closed
2
3
vessels) as specified in ISO 14442. Should such modifications be required in order to perform a test at a
different, specific pH value, these should be clearly motivated and reported.
7.2 Preparation of pre‑culture and inoculum
A pre-culture shall be started 2 d to 4 d before the beginning of the test. Growth medium (7.1) is inoculated
3 4
at a sufficiently low cell density (e.g. 5 × 10 cells/ml to 10 cells/ml for 3 d pre-culturing) in order to maintain
exponential growth until test start. The pre-culture shall be incubated under the same conditions as those in
the test (7.6).
This exponentially growing pre-culture is used as an inoculum for the test. Measure the cell density in the
pre-culture immediately before use in order to calculate the required inoculum volume.
7.3 Choice of test sample concentrations
Algae should be exposed to concentrations of the test sample in a geometric series with a ratio not exceeding
3,2 (e.g. 1,0 mg/l, 1,8 mg/l, 3,2 mg/l, 5,6 mg/l, and 10 mg/l).
The concentrations should be chosen to obtain at least one inhibition below and one inhibition above the
intended E C parameter. Additionally, at least two levels of inhibition between 10 % and 90 % should be
r x
included in order to provide data for regression analysis.
A limit test with only one concentration can be conducted to demonstrate absence of toxicity. The number of
replicates for this one concentration should be at least six.
In case the “lowest ineffective dilution” (LID) of a waste water is to be determined, the following dilution series
shall be used: 1:1,25, 1:2, 1:3, 1:4, 1:6, 1:8, 1:12.
NOTE A suitable concentration range is best determined by carrying out a preliminary range-finding test covering
several orders of magnitude of difference in test concentration. Replication of test concentrations is not a requirement in
the preliminary test.
7.4 Preparation of test sample and stock solutions
Test sample may be aqueous (e.g. waste water) or non-aqueous (e.g. chemical substance or mixture of
chemicals) for which the inhibitory effects on the growth of algae shall be determined.
© ISO 2012 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 8692:2012(E)
If the test sample is aqueous (e.g. waste water), pre-treatment (e.g. filtration, neutralization) should be considered
depending on the nature of the sample and the purpose of the test. Add nutrient stock solutions (5.3), prepared
in accordance with 7.1, to the sample.
For non-aqueous test samples, preparation of stock solutions is generally necessary. The method for preparation
of the stock solutions should be carefully chosen based on the properties of the sample. Stock solutions are
usually prepared by dissolving the test sample in growth medium. Modifications are necessary when the test
sample does not readily dissolve in the growth medium as specified in ISO 14442 and ISO 5667-16.
Usually, the test shall be carried out without adjustment of the pH of the medium after addition of the test
sample. However, some substances may exert a toxic effect due to extreme acidity or alkalinity. In order to
determine the toxicity of a sample independent of pH, adjust the pH of the aqueous sample or stock solution
(before the dilution in series) to that of the culture medium using either 1 mol/l hydrochloric acid or 1 mol/l
sodium hydroxide solution (see ISO 5667-16).
7.5 Preparation of test and control batches
Prepare the test batches by mixing the appropriate volumes of test sample or test sample stock solutions (7.4),
growth medium (7.1) and inoculum (7.2) in the test vessels. The total volume, concentrations of added growth
medium nutrients and cell density shall be the same in all vessels. Prepare at least three replicate batches for
each test sample concentration.
The initial cell density shall be sufficiently low to allow exponential growth in the control culture throughout the
test duration without a pH drift of more than 1,5 pH units (see Clause 8). Therefore, the initial cell densities shall
4
not exceed 10 cells/ml.
Prepare six replicate control batches by adding the appropriate volume of inoculum to growth medium.
Measure the pH of a replicate batch at each test concentration and in one control replicate.
If appropriate, prepare a single concentration series of the test sample without algae to serve as background
for the cell density determinations.
The number of replicates per concentration can be reduced based on statistical considerations (see
ISO/TS 20281), if increasing the number of concentrations and reducing the concentration spacing.
If chemicals are tested for registration purposes, the exposure concentration at the start, during, and at the end
of exposure shall be verified by specific chemical analysis. This can require preparation of additional batches
[4]
for analysis. Further information can be found in OECD 201 .
7.6 Incubation
The test vessels shall be sufficiently covered to avoid airborne contamination and to reduce water evaporation,
but they shall not be airtight in order to allow CO to enter the vessels (a small hole is sufficient). Incubate the
2
test vessels at (23 ± 2) °C, under continuous white light. The light intensity at the average level of the test media
2 2
shall be homogeneous within ±10 % and in the range 60 µmol/(m⋅s) to 120 µmol/(m⋅s) when measured in the
photosynthetically effective wavelength range of 400 nm to 700 nm, using an appropriate receptor.
It is important to note that the method of measurement, in particular the type of receptor (collector), affects
the measured value. Spherical receptors (which respond to light from all angles above and below the plane of
measurement) and “cosine” receptors (which respond to light from all angles above the measurement plane)
are preferred to unidirectional receptors. They give higher readings for a multipoint light source of the type
described in the Note.
NOTE The light intensity specified in the first paragraph of this subclause can be obtained using four to six fluorescent
lamps of the universal white (natural) type, i.e. a rated colour of standard colour 2 (colour temperature of 4 300 K). The
optimum distance of the lamps is approximately 0,35 m from the algal culture medium.
For light-measuring instruments calibrated in lux, an equivalent range of 6 000 lx to 10 000 lx is acceptable
for the test.
6 © ISO 2012 – All rights reserved
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 8692:2012(E)
Testing of coloured test solutions requires specific modifications as specified in ISO 14442.
Continuously shake, stir or aerate the cultures in order to keep the cells in free suspension and to facilitate CO
2
mass transfer from air to water, and in turn reduce pH drift.
7.7 Measurements
Measure the cell density in each test batch (including the controls) at least every 24 h. Mix the test batches
thoroughly before measurement. Aliquots removed from the test vessels for measurements should preferably
not be replaced.
The nominal cell density can be used as the initial cell density and no initial cell density measurement is then required.
The test shall last for (72 ± 2) h.
At the end of the test, measure the pH of samples of at least one replicate batch at each test sample concentration
and one control replicate.
8 Validity criteria
Consider the test valid if the following conditions are met.
−1
a) The average growth rate in the control replicates shall be at least 1,4 d . This growth rate corresponds to
an increase in cell density by a factor 67 in 72 h.
b) The variation coefficient of the growth rate in the control replicates shall not exceed 5 %.
c) The pH in the control shall not have increased during the test by more than 1,5 relative to the pH of the
growth medium.
An increase in pH during the test can have significant influence on the results and therefore a limit of 1,5 units
is set. These variations, however, should always be kept as low as achievable, e.g. by performing continuous
shaking during the test.
If these criteria are not met, examine experimental techniques and use inocula from other sources, if necessary.
9 Calculation
9.1 Plotting of growth curves
Tabulate the cell density measurements for each test batch according to the concentration of the test sample
and the duration of measurement.
Plot a growth curve for each test concentration and control, as a graph of the logarithm of the mean cell density
against time. A linear growth curve indicates exponential growth, whereas a levelling off indicates that cultures
have entered the stationary phase.
If the control cultures show declining growth rate towards the end of the exposure period, inhibited cultures may
tend to catch up with the controls, falsely indicating a decreased growth-inhibiting effect. In this case, perform
the calculations of growth rate and growth inhibition based on the last measurement within the exponential
growth period in the control cultures.
© ISO 2012 – All rights reserved 7
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 8692:2012(E)
9.2 Calculation of percentage inhibition
First calculate the specific growth rates, m, for each test and control batch replicate, using Equation (1).
lnnn−ln
L0
μ = (1)
tt−
L 0
where
n is the initial cell density;
0
n is the measured cell density at time t ;
L L
t is the time of test start;
0
t is the time of test termination [or the time of the last measurement within the exponential growth
L
period in the control batches (9.1)].
Alternatively, determine the specific growth rate from the slope of the regression line in a plot of the natural
logarithm of the mean cell density against time (9.1).
Calculate the mean value of m for the replicate control batches. Then, calculate the percentage inhibition
(growth rate) for each test batch replicate i, I , using Equation (2).
mi
μμ−
c i
I = ×100 (2)
μi
μ
c
where
m is the growth rate for test batch i;
i
m is the mean growth rate for the control batches.
c
9.3 Determination of E C (e.g. E C and E C )
r x r 10 r 50
Tabulate and plot, for each individual batch, the normalized inhibition, I , against the test concentration on a
mi
logarithmic scale. If the scatter of data points is large, plot mean of replicates with corresponding standard deviations.
Fit a suitable non-linear model to the experimental data points by regression analysis (e.g. see ISO/TS 20281,
References [5] to [8] in order to determine E C values, with their confidence intervals).
r x
If data are too few or uncertain for regression analysis, or if inhibitions appear not to follow a regular
concentration–response relation (e.g. stimulation), then a graphical method can be applied. In this case, draw
a smooth eye-fitted curve of the concentration–response relationship and read E C values from this graph. If
r x
extreme stimulation at intermediate concentrations of the test substance is observed, use of a hormesis model
[8]
should be considered .
If chemicals are tested for registration purposes, the E C should be based on time-weighted average
r x
concentrations calculated from measured concentrations at the start, during, and at the end of the test.
10 Expression of results
Denote EC and EC values based on growth rate as E C and E C . Also indicate clearly the time span
10 50 r 10 r 50
used for the determination, e.g. E C (0 h to 72 h). Report E C and E C values in milligrams per litre or as
r 50 r 10 r 50
percentages with the corresponding confidence intervals.
When testing waste water by means of a graduated dilution, D, the test medium with the highest concentration
at which an
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 8692
Troisième édition
2012-02-15
Qualité de l’eau — Essai d’inhibition de la
croissance des algues d’eau douce avec
des algues vertes unicellulaires
Water quality — Fresh water algal growth inhibition test with
unicellular green algae
Numéro de référence
ISO 8692:2012(F)
©
ISO 2012
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 8692:2012(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2012
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit
de l’ISO à l’adresse ci-après ou du comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2012 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 8692:2012(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 2
5 Réactifs et milieux . 3
6 Appareillage . 4
7 Mode opératoire . 5
7.1 Préparation du milieu de croissance . 5
7.2 Préparation de Ia préculture et de l’inoculum . 5
7.3 Choix des concentrations de la solution pour essai . 6
7.4 Préparation de l’échantillon pour essai et des solutions mères . 6
7.5 Préparation des lots d’essai et des témoins . 6
7.6 Incubation . 7
7.7 Mesurages . 7
8 Critères de validité . 7
9 Calculs . 8
9.1 Représentation graphique des courbes de croissance . 8
9.2 Calcul du pourcentage d’inhibition . 8
9.3 Détermination de CE (par exemple CE et CE ) . 9
rx r10 r50
10 Expression des résultats . 9
11 Interprétation des résultats . 9
12 Fidélité . 9
13 Rapport d’essai .10
Annexe A (informative) Détection rapide de l’inhibition de la croissance algale par les
eaux résiduaires .12
Annexe B (informative) Mode opératoire avec des algues provenant de billes d’alginate, avec
mesurage direct de la croissance algale dans des cellules spectrophotométriques .15
Annexe C (informative) Mode opératoire d’immobilisation des algues dans des billes d’alginate .21
Bibliographie .23
© ISO 2012 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 8692:2012(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits
de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir
identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 8692 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 8692:2004), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
iv © ISO 2012 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 8692:2012(F)
Qualité de l’eau — Essai d’inhibition de la croissance des
algues d’eau douce avec des algues vertes unicellulaires
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale connaisse bien
les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n’a pas pour but de traiter
tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur
d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité, et de s’assurer de la conformité
à la réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément à la présente Norme
internationale soient exécutés par un personnel ayant reçu une formation adéquate.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination de l’inhibition de la croissance
des algues vertes unicellulaires par des substances et des mélanges contenus dans l’eau ou par des eaux
résiduaires. Cette méthode peut être utilisée avec des substances aisément solubles dans l’eau.
En apportant à cette méthode les modifications spécifiées dans l’ISO 14442 et l’ISO 5667-16, il est possible
d’évaluer les effets inhibiteurs des substances inorganiques et organiques faiblement solubles, des composés
volatils, des métaux lourds et des eaux résiduaires.
L’Annexe A décrit un essai de détection rapide de l’inhibition de la croissance des algues par des eaux résiduaires.
L’Annexe B décrit un mode opératoire alternatif utilisant des algues provenant de billes d’alginate avec mesurage
direct de la croissance algale dans des cellules spectrophotométriques.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l’application du présent document. Pour les
références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 5667-16, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques
des échantillons
ISO/TR 11044, Qualité de l’eau — Aspects scientifiques et techniques des essais d’inhibition de croissance
d’un lot d’algues
ISO 14442, Qualité de l’eau — Lignes directrices pour essais d’inhibition de la croissance algale avec des
matières peu solubles, des composés volatils, des métaux et des eaux résiduaires
ISO/TS 20281, Qualité de l’eau — Lignes directrices relatives à l’interprétation statistique de données
écotoxicologiques
© ISO 2012 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 8692:2012(F)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
concentration cellulaire
n
nombre de cellules par unité de volume de milieu
NOTE La concentration cellulaire est exprimée en cellules par millilitre.
3.2
concentration efficace
concentration de l’échantillon pour essai (CE ) à laquelle un effet de x % est mesuré par rapport au témoin
x
NOTE Pour désigner sans ambiguïté une valeur CE déterminée à partir du taux de croissance, il est proposé d’utiliser
le symbole «CE ».
r
3.3
plus faible dilution sans effet
LID
niveau de dilution pour lequel aucune inhibition n’est observée, ou bien uniquement des effets ne dépassant
pas la variabilité spécifique à l’essai
[13]
NOTE Adapté de l’ISO 15088:2007 , 3.5.
3.4
taux de croissance spécifique
m
taux proportionnel d’augmentation de la concentration cellulaire par unité de temps:
1dn
μ =
n dt
où
n est la concentration cellulaire, exprimée en cellules par millilitre;
t est le temps, exprimé en jours.
NOTE Le taux de croissance spécifique est exprimé en jours à la puissance moins un.
[ISO/TR 11044:2008, 3.2]
4 Principe
Des souches d’algues monospécifiques sont mises en culture pendant plusieurs générations dans un milieu
défini contenant une gamme de concentrations de l’échantillon pour essai préparé en mélangeant des quantités
appropriées de milieu de croissance, d’échantillon pour essai et un inoculum de cellules algales en phase
exponentielle de croissance. Les lots d’essai sont incubés pendant une période de (72 ± 2) h, pendant laquelle
la concentration cellulaire de chaque solution d’essai est mesurée au moins toutes les 24 h.
L’inhibition est quantifiée par la diminution du taux de croissance spécifique, par comparaison à des cultures
témoins réalisées dans des conditions identiques.
2 © ISO 2012 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 8692:2012(F)
5 Réactifs et milieux
5.1 Organisme d’essai, utiliser l’une des deux espèces suivantes d’algue planctonique d’eau douce:
1) 2)
a) Desmodesmus subspicatus (R. Chodat) E. Hegewald et A. Schmidt [86.81 SAG ];
3) ® TM 2) 2) 2)
b) Pseudokirchneriella subcapitata (Korshikov) Hindak [ATCC 22662 , CCAP 278/4 ou 61.81 SAG ].
NOTE 1 Les deux espèces ne réagissent pas de façon identique aux agents toxiques.
NOTE 2 Ces deux espèces algales sont des algues vertes planctoniques appartenant à l’ordre des Sphaeropleales
(Chlorophytes, Chlorophycées), qui se trouvent généralement à l’état unicellulaire en culture.
On peut se procurer les souches recommandées sous forme de cultures monospécifiques et non
axéniques auprès de:
— SAG — Sammlung von Algenkulturen Göttingen, Allemagne
www.epsag.uni-goettingen.de (consulté le 2012-01-30);
— ATCC — American Type Culture Collection, États-Unis
www.atcc.org (consulté le 2012-01-30);
— CCAP — Culture Collection of Algae and Protozoa, Royaume-Uni
www.ccap.ac.uk (consulté le 2012-01-30);
— ALCP — Algothèque du Laboratoire de Cryptogamie, France
www.mnhn.fr (consulté le 2012-01-30).
Il est possible de conserver les cultures mères dans le milieu spécifié en 5.3 et 7.1. Cependant, des repiquages
fréquents sont nécessaires (une fois par semaine) pour empêcher toute perturbation de la croissance. La
culture mère peut se conserver plus longtemps dans des milieux pour algues plus riches, tels que ceux
recommandés par la collection de souches.
Sinon, les algues peuvent être conservées pendant plusieurs mois dans des boîtes de gélose ou dans des
4) [1]
billes d’alginate sans perte de viabilité . Les algues peuvent être facilement retirées de la gélose ou des
billes d’alginate (voir l’Annexe C) pour réaliser les essais de toxicité.
Il convient de confirmer l’aspect des cellules et l’identité des organismes d’essai lors d’un examen au microscope.
5.2 Eau, déionisée ou d’une pureté équivalente (conductivité <10 µS/cm), pour la préparation du milieu de
croissance et des solutions de substance d’essai.
Veiller à éviter toute contamination de l’eau par des substances inorganiques ou organiques pendant la
préparation et le stockage. Ne pas utiliser de matériel en cuivre.
1) Cette espèce était antérieurement connue sous la dénomination de Scenedesmus subspicatus Chodat.
2) Les appellations commerciales des souches sont des exemples de souches appropriées disponibles sur le marché.
Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve
ou recommande l’emploi exclusif des produits ainsi désignés.
3) Cette espèce était antérieurement connue sous la dénomination de Selenastrum capricornutum Prinz. La nouvelle
dénomination est couramment citée par les collections de souches.
4) Les billes d’alginate fournies par MicroBioTests Inc., Mariakerke-Gent, Belgique, sont un exemple de produit disponible
sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que
l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés si
les critères de validité spécifiés dans le présent document sont respectés.
© ISO 2012 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 8692:2012(F)
5.3 Substances nutritives
Préparer quatre solutions mères de substances nutritives dans l’eau, selon les compositions données dans
le Tableau 1.
Ces solutions sont finalement diluées (voir 7.1 et 7.4) pour obtenir les concentrations finales en substances nutritives
dans les solutions d’essai. Toutefois, les macronutriments peuvent, à l’inverse, être ajoutés directement dans l’eau.
Tous les produits chimiques utilisés doivent être des réactifs de qualité analytique.
Stériliser les solutions mères par filtration sur membrane (diamètre moyen des pores de 0,2 µm) ou par passage
à l’autoclave [(120 ± 2) °C, 15 min]. Conserver les solutions à l’abri de la lumière à 4 °C.
La solution mère 4 ne doit pas être stérilisée à l’autoclave pour éviter toute perte par évaporation de NaHCO ,
3
mais uniquement par filtration sur membrane.
Tableau 1 — Concentrations massiques de substances nutritives dans la solution d’essai
Concentration massique
Concentration massique
Solution mère Substance nutritive finale dans la solution
de la solution mère
d’essai
NH Cl 1,5 g/l 15 mg/l (N: 3,9 mg/l)
4
MgCl , 6H O 1,2 g/l 12 mg/l (Mg: 2,9 mg/l)
2 2
1: Macronutriments CaCl , 2H O 1,8 g/l 18 mg/l (Ca: 4,9 mg/l)
2 2
MgSO , 7H O 1,5 g/l 15 mg/l (S: 1,95 mg/l)
4 2
KH PO 0,16 g/l 1,6 mg/l (P: 0,36 mg/l)
2 4
FeCl , 6H O 64 mg/l 64 µg/l (Fe: 13 µg/l)
3 2
2: Fe-EDTA
Na EDTA, 2H O 100 mg/l 100 µg/l
2 2
a
H BO 185 mg/l 185 µg/l (B: 32 µg/l)
3 3
MnCl , 4H O 415 mg/l 415 µg/l (Mn: 115 µg/l)
2 2
ZnCl 3 mg/l 3 µg/l (Zn: 1,4 µg/l)
2
3: Éléments traces
CoCl , 6H O 1,5 mg/l 1,5 µg/l (Co: 0,37 µg/l)
2 2
CuCl , 2H O 0,01 mg/l 0,01 µg/l (Cu: 3,7 ng/l)
2 2
Na MoO , 2H O 7 mg/l 7 µg/l (Mo: 2,8 µg/l)
2 4 2
4: NaHCO NaHCO 50 g/l 50 mg/l (C: 7,14 mg/l)
3 3
a
H BO peut être dissous en ajoutant une solution de NaOH à 0,1 mol/l.
3 3
6 Appareillage
Tout le matériel en contact avec le milieu d’essai doit être en verre ou en matière chimiquement inerte.
Appareillage courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Enceinte ou pièce à température contrôlée, pourvue d’une lampe fluorescente blanche, fournissant un
éclairage uniforme et continu, répondant aux exigences d’éclairage spécifiées pour l’essai en 7.6.
6.2 Appareil de mesure de la concentration cellulaire algale, de préférence un compte-particules capable
de compter les particules de 2,5 µm à 25 µm (diamètres sphériques) ou un microscope à chambre de comptage.
Les concentrations algales peuvent également être déterminées par une méthode indirecte avec, par exemple,
[2] 5)[3]
un fluorimètre (par exemple fluorescence in vitro ou fluorescence in vivo induite par le DCMU ) de sensibilité
5) DCMU est la 3-(3,4-dichlorophényle)-1,1-diméthylurée (n° CAS 330-54-1).
4 © ISO 2012 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 8692:2012(F)
suffisante, et si cette méthode est suffisamment bien corrélée avec la concentration cellulaire. L’appareil
4
utilisé doit pouvoir permettre de mesurer des concentrations cellulaires aussi faibles que 10 cellules/ml et de
distinguer la croissance algale des effets perturbateurs, par exemple la présence de matières particulaires et la
4
coloration de l’échantillon. Des spectrophotomètres peuvent être assez sensibles pour mesurer 10 cellules/ml
à condition qu’un trajet optique suffisant (jusqu’à 10 cm) puisse être utilisé. Cependant, cette technique est
particulièrement sensible aux interférences venant de matériaux en suspension et de substances colorées à
faibles concentrations cellulaires (voir l’ISO/TR 11044).
6.3 Récipients de culture (en verre), par exemple des fioles coniques de 250 ml avec bouchons
perméables à l’air.
6.4 Appareillage pour filtration sur membrane, utilisant des filtres de diamètre moyen de pore 0,2 µm.
6.5 Autoclave.
6.6 pH-mètre.
7 Mode opératoire
7.1 Préparation du milieu de croissance
Préparer un milieu de croissance en ajoutant un volume approprié des solutions mères de substances
nutritives (5.3) à de l’eau (5.2).
Ajouter à environ 500 ml d’eau (5.2):
— 10 ml de solution mère 1 (5.3);
— 1 ml de solution mère 2 (5.3);
— 1 ml de solution mère 3 (5.3);
— 1 ml de solution mère 4 (5.3).
Compléter à 1 000 ml avec de l’eau.
Avant utilisation, équilibrer le milieu en laissant à l’air pendant une nuit ou par un bullage avec de l’air filtré
pendant 30 min. Après obtention de l’état d’équilibre, ajuster le pH à 8,1 ± 0,2, si nécessaire, en utilisant une
solutions d’acide chlorhydrique à 1 mol/l ou une solution d’hydroxyde de sodium à 1 mol/l.
Ce milieu de croissance est tamponné par l’hydrogénocarbonate et le CO atmosphérique. Différentes valeurs
2
−
de pH peuvent être obtenues en modifiant la concentration de HCO et/ou la concentration de CO
2
3
atmosphérique (cela exige l’utilisation de récipients clos) tel que spécifié dans l’ISO 14442. Si de telles
modifications sont nécessaires pour réaliser un essai à une valeur de pH différente spécifique, il convient que
cela soit expliqué et enregistré.
7.2 Préparation de Ia préculture et de l’inoculum
Une préculture doit être lancée deux à quatre jours avant le début de l’essai. Le milieu de croissance (7.1) est
3 4
ensemencé à une concentration cellulaire suffisamment faible (par exemple 5 × 10 cellules/ml à 10 cellules/ml
pour une préculture de trois jours) de façon à maintenir la croissance en phase exponentielle jusqu’au début de
l’essai. La préculture doit être incubée dans les mêmes conditions que l’essai (7.6).
Cette préculture en phase exponentielle de croissance est utilisée comme inoculum pour l’essai. Mesurer
la concentration cellulaire de la préculture immédiatement avant utilisation afin de calculer le volume
d’inoculum nécessaire.
© ISO 2012 – Tous droits réservés 5
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 8692:2012(F)
7.3 Choix des concentrations de la solution pour essai
Il convient d’exposer les algues à des concentrations de la solution pour essai en suivant une progression
géométrique avec un facteur ne dépassant pas 3,2 (par exemple 1,0 mg/l, 1,8 mg/l, 3,2 mg/l, 5,6 mg/l et 10 mg/l).
Il convient de choisir les concentrations de manière à obtenir au moins un niveau d’inhibition sur la croissance
en deçà et au-dessus du paramètre CE voulu. Il convient, en outre, d’inclure au moins deux niveaux d’inhibition
rx
entre 10 % et 90 % pour permettre l’obtention de données en vue de l’analyse de régression.
Il est possible de réaliser un essai limite avec une seule concentration pour démontrer l’absence de toxicité. Il
convient de réaliser au moins six réplicats pour cette concentration unique.
Si la «plus faible dilution sans effet» (LID) d’une eau résiduaire doit être déterminée, la série de dilutions
suivante doit être utilisée: 1:1,25, 1:2, 1:3, 1:4, 1:6, 1:8, 1:12.
NOTE La gamme de concentrations appropriées est déterminée aisément en effectuant un essai préliminaire
permettant de cibler la gamme et couvrant plusieurs ordres de grandeur de différence entre les concentrations d’essai. La
répétition de chaque concentration d’essai n’est pas nécessaire lors de l’essai préliminaire.
7.4 Préparation de l’échantillon pour essai et des solutions mères
L’échantillon pour essai peut être aqueux (par exemple eau résiduaire) ou non aqueux (par exemple
substance chimique ou mélange de produits chimiques) pour lequel sont déterminés les effets inhibiteurs sur
la croissance des algues.
Si l’échantillon pour essai est aqueux (par exemple eau résiduaire), il est recommandé d’envisager un
prétraitement (par exemple filtration, neutralisation), suivant la nature de l’échantillon et l’objectif de l’essai.
Ajouter à l’échantillon des solutions mères de substances nutritives (5.3) préparées conformément à 7.1.
Pour des échantillons pour essai non aqueux, il est en général nécessaire de préparer des solutions mères.
Il est recommandé de choisir avec soin la méthode de préparation des solutions mères suivant les propriétés
de l’échantillon. Les solutions mères sont habituellement préparées en dissolvant l’échantillon pour essai dans
le milieu de croissance. Lorsque l’échantillon pour essai ne se dissout pas aisément dans le milieu d’essai
comme spécifié dans l’ISO 14442 et l’ISO 5667-16, il est nécessaire de procéder à des modifications.
L’essai doit normalement être effectué sans ajustement du pH du milieu après l’ajout de l’échantillon pour
essai. Toutefois, certaines substances peuvent avoir un effet toxique dû à leur extrême acidité ou alcalinité.
Pour évaluer la toxicité d’une substance indépendamment du pH, ajuster le pH de l’échantillon aqueux ou de la
solution mère (avant préparation de la gamme de dilution) en fonction de celui du milieu de culture, en utilisant
une solution d’acide chlorhydrique à 1 mol/l ou d’hydroxyde de sodium à 1 mol/l (voir l’ISO 5667-16).
7.5 Préparation des lots d’essai et des témoins
Préparer les lots d’essai en mélangeant les volumes appropriés d’échantillon pour essai ou de solutions mères
de l’échantillon pour essai (7.4), de milieu de croissance (7.1) et d’inoculum (7.2) dans les récipients d’essai. Le
volume total, les concentrations de substances nutritives ajoutées au milieu de croissance et la concentration
cellulaire doivent être les mêmes dans tous les récipients. Préparer au moins trois réplicats pour chaque
concentration de l’échantillon soumis à essai.
La concentration cellulaire initiale doit être suffisamment faible pour permettre l’obtention d’une croissance en
phase exponentielle dans la culture témoin pendant toute la durée de l’essai, sans variation du pH supérieure à
1,5 unité de pH (voir l’Article 8). Par conséquent, les concentrations cellulaires initiales ne doivent pas excéder
4
10 cellules/ml.
Préparer six réplicats témoins en ajoutant le volume approprié d’inoculum au milieu de croissance.
Mesurer le pH d’un réplicat pour chaque concentration d’essai et pour le témoin.
Si cela est approprié, préparer une gamme distincte de concentrations de l’échantillon pour essai sans algues
afin de servir de valeur de base pour les déterminations de la concentration cellulaire.
6 © ISO 2012 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 8692:2012(F)
Le nombre de réplicats par concentration peut être réduit pour des raisons statistiques (voir l’ISO/TS 20281) si
l’on augmente le nombre de concentrations et si l’on réduit l’intervalle entre les concentrations.
Si des produits chimiques sont soumis à essai à des fins d’enregistrement, la concentration d’exposition au
début, pendant et à la fin de l’exposition doit être vérifiée par une analyse chimique spécifique. Il peut alors être
nécessaire de préparer des lots additionnels pour analyse. De plus amples informations peuvent être trouvées
[4]
dans l’OCDE 201 .
7.6 Incubation
Les récipients d’essai doivent être suffisamment couverts pour éviter toute contamination aérienne et pour
réduire l’évaporation d’eau, mais ils ne doivent pas être étanches à l’air de façon à ce que le CO puisse y
2
pénétrer (une petite ouverture suffit). Incuber les récipients d’essai à (23 ± 2) °C sous lumière blanche continue.
L’intensité lumineuse au niveau moyen des milieux d’essai, mesurée à l’aide d’un récepteur approprié, doit être
2 2
homogène à ±10 % et doit se situer dans l’intervalle de 60 µmol/(m ⋅s) à 120 µmol/(m ⋅s) dans le domaine de
longueur d’onde effective de la photosynthèse de 400 nm à 700 nm.
II est important de noter que la méthode de mesure, en particulier le type de récepteur (collecteur), influe sur la
valeur mesurée. Les récepteurs sphériques (lesquels répondent à la lumière sous tous les angles au-dessus
et au-dessous du plan de mesure) et les récepteurs hémisphériques (lesquels répondent à la lumière sous
tous les angles au-dessus du plan de mesure) sont préférés aux récepteurs unidirectionnels. Ils donnent des
résultats plus élevés pour une source lumineuse multipoint du type de celle décrite dans la note ci-après.
NOTE L’intensité lumineuse spécifiée dans le premier alinéa du présent paragraphe peut être obtenue à l’aide de
quatre à six lampes fluorescentes du type lumière blanche universelle (naturelle), c’est-à-dire un étalon de couleur 2
spécifié (d’une température de couleur de 4 300 K). La distance optimale des lampes est d’environ 0,35 m du milieu de
culture algale.
Pour les instruments de mesure de lumière étalonnés en lux, un intervalle équivalent de 6 000 lx à 10 000 lx
est acceptable pour l’essai.
Des essais avec des solutions d’essai colorées nécessitent des modifications spécifiques spécifiées dans
l’ISO 14442.
Secouer, agiter ou aérer les cultures en continu pour maintenir les cellules en suspension et pour faciliter les
échanges gazeux air/eau (CO ) et, par voie de conséquence, réduire la variation du pH.
2
7.7 Mesurages
Mesurer la concentration cellulaire dans chaque lot d’essai (y compris les témoins) au moins toutes les 24 h.
Mélanger parfaitement les lots d’essai avant de procéder aux mesurages. Il convient de ne pas réintroduire les
parties aliquotes prélevées dans les récipients d’essai à des fins de mesurages.
La concentration cellulaire nominale peut être utilisée en tant que concentration cellulaire initiale; le mesurage
de cette dernière n’apparaît donc pas nécessaire.
L’essai doit durer (72 ± 2) h.
À la fin de l’essai, mesurer le pH d’au moins un réplicat de chaque concentration d’échantillon pour essai et
d’un réplicat témoin.
8 Critères de validité
Considérer l’essai comme valide si les conditions suivantes sont remplies:
-1
a) Le taux de croissance moyen des réplicats témoins doit être au moins de 1,4 jours . Cela correspond à
une augmentation de la concentration cellulaire d’un facteur 67 en 72 h.
b) Le coefficient de variation du taux de croissance des réplicats témoins ne doit pas dépasser 5 %.
© ISO 2012 – Tous droits réservés 7
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 8692:2012(F)
c) Le pH des témoins ne doit pas avoir augmenté de plus de 1,5 unité pendant l’essai par rapport au pH du
milieu de croissance.
Une augmentation du pH pendant l’essai pouvant influer significativement sur les résultats, une limite de
1,5 unité est fixée. Toutefois, il convient de toujours maintenir ces variations aussi faibles que possible, par
exemple en maintenant une agitation continue pendant l’essai.
Si ces critères ne sont pas satisfaits, vérifier les aspects expérimentaux et utiliser des inoculums d’origine
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.