ISO 8692:2004

Water quality — Freshwater algal growth inhibition test with unicellular green algae

ISO 8692:2004 specifies a method for the determination of the growth inhibition of unicellular green algae by substances and mixtures contained in water or by wastewater. The method is applicable for substances that are easily soluble in water. With modifications to this method, as described in ISO 14442 and ISO 5667-16, the inhibitory effects of poorly soluble organic and inorganic materials, volatile compounds, heavy metals and waste water can be tested. A rapid algal growth inhibition screening test for wastewater is also included.

Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de la croissance des algues d'eau douce avec des algues vertes unicellulaires

L'ISO 8692:2004 spécifie une méthode de détermination de l'inhibition de la croissance des algues vertes unicellulaires par des substances et des mélanges contenus dans l'eau ou par des eaux résiduaires. Cette méthode peut être utilisée avec des substances aisément solubles dans l'eau. En apportant à cette méthode les modifications décrites dans l'ISO 14442 et l'ISO 5667-16, il est possible de vérifier les effets inhibiteurs des substances inorganiques et organiques faiblement solubles, des composés volatils, des métaux lourds et des eaux résiduaires. Un essai rapide de détection de l'inhibition de la croissance des algues par des eaux résiduaires est également inclus.

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 21-Sep-2004
• Withdrawal Date: 21-Sep-2004
• ICS: 13.060.70 - Examination of biological properties of water
• Technical Committee: ISO/TC 147/SC 5 - Biological methods
• Drafting Committee: ISO/TC 147/SC 5/WG 5 - Toxicity - Algae and aquatic plants
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Completion Date: 13-Feb-2012

Relations

• Revised: ISO 8692:2012 - Water quality — Fresh water algal growth inhibition test with unicellular green algae
• Effective Date: 11-Apr-2009
• Revises: ISO 8692:1989 - Water quality — Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum
• Effective Date: 15-Apr-2008

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 8692
Second edition
2004-10-01

Water quality — Freshwater algal growth
inhibition test with unicellular green
algae
Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de la croissance des algues d'eau
douce avec des algues vertes unicellulaires




Reference number
ISO 8692:2004(E)
©
ISO 2004

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ISO 8692:2004(E)
PDF disclaimer
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Published in Switzerland

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ISO 8692:2004(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope. 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle . 2
5 Reagents and media . 2
6 Apparatus. 4
7 Procedure. 5
8 Validity criteria . 7
9 Calculation. 8
10 Expression of results. 9
11 Interpretation of results. 9
12 Precision . 9
13 Test report. 10
Annex A (informative) Rapid screening of wastewater algal growth inhibition. 12
Bibliography . 15

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ISO 8692:2004(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 8692 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological
methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 8692:1989), which has been technically revised.

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INTERNATIONAL STANDARD ISO 8692:2004(E)

Water quality — Freshwater algal growth inhibition test with
unicellular green algae
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if any,
associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health
practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of the growth inhibition of unicellular
green algae by substances and mixtures contained in water or by wastewater. This method is applicable for
substances that are easily soluble in water.
With modifications to this method, as described in ISO 14442 and ISO 5667-16, the inhibitory effects of poorly
soluble organic and inorganic materials, volatile compounds, heavy metals and waste water can be tested.
A rapid algal growth inhibition screening test for wastewater is included in Annex A.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 5667-16:1998, Water — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
ISO 14442:1999, Water quality — Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials,
volatile compounds, metals and waste water
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
cell density
x
number of cells per unit volume of medium
NOTE Cell density is expressed in cells per millilitre.
3.2
specific growth rate
µ
proportional rate of increase in cell density per unit of time:
1dx
µ =
xtd
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ISO 8692:2004(E)
where
x is the cell density, expressed in cells per millilitre;
t is the time, expressed in days
−1
NOTE Specific growth rate is expressed in inverse days (day ).
3.3
growth medium
mixture of water and nutrients in which algal cells are incubated, which is used for pre-cultures and controls
3.4
test sample
aqueous sample (e.g. wastewater), chemical substance or mixture for which the inhibitory effects on the
growth of algae are determined
3.5
test medium
mixture of water, nutrients and test sample
3.6
test batch
mixture of water, nutrients and test sample (test medium 3.5), inoculated with algae
3.7
control
mixture of water, nutrients (growth medium 3.3) without test sample, inoculated with algae
3.8
effective concentration
E C
r x
concentration of test sample which results in a reduction of x % in the specific growth rate relative to the
controls
NOTE To unambiguously denote an EC value deriving from growth rate it is proposed to use the symbol “E C”.
r
4 Principle
Monospecies algal strains are cultured for several generations in a defined medium containing a range of
concentrations of the test sample, prepared by mixing appropriate quantities of growth medium, test sample
and an inoculum of exponentially growing algal cells. The test batches are incubated for a period of (72 ± 2) h
during which the cell density in each test solution is measured at least every 24 h.
Inhibition is measured as a reduction in growth rate, relative to control cultures grown under identical
conditions.
5 Reagents and media
5.1 Test organism, using either of the following planktonic fresh water algae species:
1)
a) Desmodesmus subspicatus (86.81 SAG).
2)
b) Pseudokirchneriella subcapitata (Korshikov) Hindak (ATCC 22662, CCAP 278/4 or 61.81 SAG).

1) This species is formerly known as Scenedesmus subspicatus Chodat.
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ISO 8692:2004(E)
NOTE 1 Both algae species are planktonic green algae belonging to the order of Chlorococcales (Chlorophyta,
Chlorophyceae), and are usually unicellular in culture.
3)
The strains recommended are available in unialgal, non-axenic cultures from the following collections .
 SAG: Collection of Algal Cultures
Inst. Plant Physiology
University of Göttingen
Nikolausberger Weg 18
D-37073 Göttingen
Germany
 ATCC: American Type Culture Collection
12301 Parklane Drive
Rockville
Maryland 20852
USA
 CCAP: Culture Centre of Algae and Protozoa
Freshwater Biological Association
The Ferry House
Ambleside
Cumbria LA22 OLP
United Kingdom
Algothèque du laboratoire de cryptogamie
Muséum National d'Histoire Naturelle
12, rue Buffon
75005 Paris
France
NOTE 2 Stock cultures can be maintained in the medium described in 5.3. and 7.1. However, a frequent sub-culturing
is necessary (once a week) to prevent failure of growth. The stock culture can be maintained for extended periods on
richer algal media such as those recommended by the culture collection.
4) [1]
Alternatively algae can be stored for several months in alginate beads , without losing their viability . The
algae can be easily liberated from the algal beads when needed to perform the toxicity tests.
5.2 Water, deionized or of equivalent purity (conductivity < 10 µS/cm), for use in the preparation of the
growth medium and test substance solutions.
Take special care to avoid contamination of the water by inorganic or organic substances during preparation
and storage. Equipment made of copper shall not be used.

2) This species is formerly known as Selenastrum capricornutum Prinz. The new name is currently cited by culture
collections.
3) Trade name of strains are examples of suitable strains available commercially. This information is given for the
convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of these products.
4) The algae beads supplied by MICROBIOTESTS Inc., Venecoweg 19, 9810 Nazareth, Belgium. Tel. [phone],
fax [phone], e-mail [e-mail], are an example of a suitable commercially available product. This
information is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by
ISO of this product. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
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ISO 8692:2004(E)
5.3 Nutrients.
Prepare four nutrient stock solutions in water, according to the compositions given in Table 1.
These solutions are eventually diluted (see 7.1 and 7.4) to achieve the final nutrient concentrations in the test
solutions. However, the macro-nutrients may instead be added directly to the water.
All chemicals used shall be of reagent grade quality.
Sterilize the stock solutions by membrane filtration (mean pore diameter 0,2 µm) or by autoclaving (120 °C,
15 min). Store the solutions in the dark at 4 °C.
Do not autoclave stock solution 4 in order to avoid evaporative loss of NaHCO , but sterilize it by membrane
3
filtration.
Table 1 — Mass concentrations of nutrients in the test solution
Final mass
Mass concentration
Stock solution Nutrient concentration
in stock solution
in test solution
NH Cl 1,5 g/l
15 mg/l
4
MgCl ⋅6H O 1,2 g/l 12 mg/l
2 2
Stock solution 1: macro-nutrients CaCl ⋅2H O 1,8 g/l
18 mg/l
2 2
MgSO ⋅7H O 1,5 g/l 15 mg/l
4 2
KH PO
0,16 g/l 1,6 mg/l
2 4
FeCl ⋅6H O 64 mg/l 64 µg/l
3 2
Stock solution 2: Fe-EDTA
Na EDTA⋅2H O 100 mg/l 100 µg/l
2 2
a
H BO 185 mg/l 185 µg/l
3 3
MnCl ⋅4H O 415 mg/l 415 µg/l
2 2
ZnCl 3 mg/l 3 µg/l
2
Stock solution 3: trace elements
CoCl ⋅6H O 1,5 mg/l 1,5 µg/l
2 2
CuCl ⋅2H O 0,01 mg/l 0,01 µg/l
2 2
Na MoO ⋅2H O 7 mg/l 7 µg/l
2 4 2
Stock solution 4: NaHCO NaHCO 50 g/l 50 mg/l
3 3
a
H BO can be dissolved by the addition of 0,1 mol/l NaOH.
3 3

6 Apparatus
All equipment that comes in contact with the test medium shall be made of glass or other chemically inert
material.
Standard laboratory apparatus and the following.
6.1 Temperature-controlled cabinet or room, with a white fluorescent light, providing continuous, uniform
illumination suitable for the lighting requirements as specified for the test in 7.6.
4 © ISO 2004 – All rights reserved

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ISO 8692:2004(E)
6.2 Apparatus for measuring algal cell density, preferably a particle counter, or a microscope and a
counting chamber. Alternatively the algal densities may be determined by an indirect procedure using for
[2] 5) [3]
instance a fluorimeter (e.g. in vitro fluorescence or DCMU -enhanced in vivo fluorescence ), when
sufficiently sensitive and if shown to be sufficiently well correlated with cell density. The apparatus used shall
4
be capable of measuring cell densities as low as 10 cells/ml and to distinguish between algal growth and
disturbing effects, for example the presence of particulate matter and the colour of the sample.
4
Spectrophotometers may be sufficiently sensitive to measure 10 cells/ml providing a sufficient path length (up
to 10 cm) can be used. However, this technique is particularly sensitive to interferences from suspended
material and coloured substances at low cell densities.
6.3 Culture flasks, for example 250 ml conical flasks with air permeable stoppers.
6.4 Apparatus for membrane filtration, using filters of mean pore diameter 0,2 µm.
6.5 Autoclave.
6.6 pH meter.
7 Procedure
7.1 Preparation of growth medium
Prepare a growth medium by adding an appropriate volume of the nutrient stock solutions (5.3) to water.
Add to approximately 500 ml of water:
 10 ml of stock solution 1 (5.3);
 1 ml of stock solution 2 (5.3);
 1 ml of stock solution 3 (5.3);
 1 ml of stock solution 4 (5.3).
Make up to 1 000 ml with water.
When autoclaving is necessary, stock solution 4 should be added afterwards.
Before use, equilibrate it by leaving overnight in contact with air, or by bubbling filtered air through it for 30 min.
After equilibration, adjust the pH if necessary to 8,1 ± 0,2, using either 1 mol/l hydrochloric acid or 1 mol/l
sodium hydroxide solution.
This growth medium is buffered by bicarbonate and atmospheric CO . Different pH values may be obtained by
2
modifying the concentration of HCO and/or the atmospheric CO concentration (requires closed vessels) as
3 2
specified in ISO 14442. Should such modifications be required in order to perform a test at a different, specific
pH value, these should be clearly motivated and reported.
7.2 Preparation of pre-culture and inoculum
A pre-culture shall be started two to four days before the beginning of the test. Growth medium (7.1) is
3 4
inoculated at a sufficiently low cell density (e.g. 5 × 10 cells/ml to 10 cells/ml for three days pre-culturing) in
order to maintain exponential growth until test start. The pre-culture shall be incubated under the same
conditions as those in the test (7.6).

5) DCMU = dichlorophenyldimethyl urea (CAS No. 330-54-1).
© ISO 2004 – All rights reserved 5

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ISO 8692:2004(E)
This exponentially growing pre-culture is used as an inoculum for the test. Measure the cell density in the
pre-culture immediately before use in order to calculate the required inoculum volume.
7.3 Choice of test sample concentrations
Algae should be exposed to concentrations of the test sample in a geometric series with a ratio not exceeding
3,2 (e.g. 1,0 mg/l, 1,8 mg/l, 3,2 mg/l, 5,6 mg/l and 10 mg/l).
The concentrations should be chosen to obtain at least one inhibition below and one inhibition above the
intended E C parameter. Additionally, at least two levels of inhibition between 10 % and 90 % should be
r x
included in order to provide data for regression analysis.
A limit test with only one concentration can be conducted to demonstrate absence of toxicity. The number of
replicates for this one concentration should be six.
NOTE A suitable concentration range is best determined by carrying out a preliminary range-finding test covering
several orders of magnitude of difference in test concentration. Replication of test concentrations is not a requirement in
the preliminary test.
7.4 Preparation of test sample and stock solutions
In case the test sample is aqueous (e.g. wastewater), pre-treatment (e.g. filtration, neutralisation) should be
considered, depending of the nature of the sample and the purpose of the test. Add nutrient stock solutions
(5.3) as described in 7.1 to the sample.
For non-aqueous test samples, preparation of stock solutions is generally necessary. The method for
preparation of the stock solutions should be carefully chosen, based on the properties of the sample. Stock
solutions are normally prepared by dissolving the test sample in growth medium. Modifications are necessary
when the test sample does not readily dissolve in the test medium as specified in ISO 14442 and ISO 5667-16.
Normally, the test shall be carried out without adjustment of the pH of the medium after addition of the test
sample. However, some substances may exert a toxic effect due to extreme acidity or alkalinity. In order to
determine the toxicity of a sample independent of pH, adjust the pH of the aqueous sample or stock solution
(before the dilution in series) to that of the culture medium using either 1 mol/l hydrochloric acid or 1 mol/l
sodium hydroxide solution (see ISO 5667-16).
7.5 Preparation of test and co
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 8692
Deuxième édition
2004-10-01

Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de la
croissance des algues d'eau douce avec
des algues vertes unicellulaires
Water quality — Freshwater algal growth inhibition test with unicellular
green algae




Numéro de référence
ISO 8692:2004(F)
©
ISO 2004

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ISO 8692:2004(F)
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Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
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E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Publié en Suisse

ii © ISO 2004 – Tous droits réservés

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ISO 8692:2004(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives. 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs . 3
6 Appareillage. 5
7 Mode opératoire . 6
8 Critères de validité . 8
9 Calculs. 8
10 Expression des résultats. 10
11 Interprétation des résultats. 10
12 Fidélité. 10
13 Rapport d'essai . 11
Annexe A (informative) Détection rapide de l'inhibition de la croissance algale par les eaux
résiduaires . 12
Bibliographie . 15

© ISO 2004 – Tous droits réservés iii

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ISO 8692:2004(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 8692 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 5, Méthodes
biologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 8692:1989), qui a fait l'objet d'une
révision technique.

iv © ISO 2004 – Tous droits réservés

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NORME INTERNATIONALE ISO 8692:2004(F)

Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de la croissance des
algues d'eau douce avec des algues vertes unicellulaires
AVERTISSEMENT — Il est recommandé que les personnes utilisant la présente Norme internationale
connaissent bien les techniques de laboratoires. La présente Norme internationale ne prétend pas
traiter tous les éventuels problèmes de sécurité liés à son utilisation. La mise en œuvre de règles de
sécurité et de protection de la santé ainsi que le respect de la législation nationale relèvent de la
responsabilité de l'utilisateur.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination de l'inhibition de la croissance des
algues vertes unicellulaires par des substances et des mélanges contenus dans l'eau ou par des eaux
résiduaires. Cette méthode peut être utilisée avec des substances aisément solubles dans l'eau.
En apportant à cette méthode les modifications décrites dans l'ISO 14442 et l'ISO 5667-16, il est possible de
vérifier les effets inhibiteurs des substances inorganiques et organiques faiblement solubles, des composés
volatils, des métaux lourds et des eaux résiduaires.
L'Annexe A décrit un essai rapide de détection de l'inhibition de la croissance des algues par des eaux
résiduaires.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 5667-16:1998, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais
biologiques des échantillons
ISO 14442:1999, Qualité de l'eau — Lignes directrices pour essais d'inhibition de la croissance algale avec
matières peu solubles, composés volatils, métaux et eaux résiduaires
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
concentration cellulaire
x
nombre de cellules par unités de volume de milieu
NOTE La densité cellulaire est exprimée en cellules par millilitre.
© ISO 2004 – Tous droits réservés 1

---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 8692:2004(F)
3.2
taux de croissance spécifique
µ
taux proportionnel d'augmentation de la concentration cellulaire par unité de temps:
1dx
µ =
xtd
ou
x est la concentration cellulaire, exprimée en cellules par millilitre;
t est le temps, exprimé en jours
-1
NOTE Le taux de croissance spécifique est exprimé en jours .
3.3
milieu de croissance
mélange d'eau et de substances nutritives, utilisé pour les pré-cultures et les solutions témoins, dans lequel
les cellules algales sont incubées
3.4
échantillon pour essai
échantillon aqueux (par exemple eaux résiduaires), substance chimique ou mélange pour lequel sont
déterminés les effets d'inhibition de la croissance des algues
3.5
milieu d'essai
mélange d'eau, de substances nutritives et d'échantillon pour essai
3.6
lot d'essai
mélange d'eau, de substances nutritives et d'échantillon pour essai (milieu d'essai, 3.5), inoculé avec des
algues
3.7
solution témoin
mélange d'eau, de substances nutritives (milieu de croissance, 3.3), sans échantillon pour essai, inoculé avec
des algues
3.8
concentration efficace
CE
rx
concentration de l'échantillon pour essai qui entraîne une diminution de x % du taux de croissance spécifique
par rapport aux solutions témoins
NOTE Pour désigner sans ambiguïté une valeur de la concentration efficace (CE) dérivant du taux de croissance, il
est proposé d'utiliser le symbole CE .
r
4 Principe
Des souches d'algues monospécifiques sont mises en culture pendant plusieurs générations dans un milieu
défini, contenant une gamme de concentrations de l'échantillon pour essai préparé en mélangeant des
quantités appropriées de milieu de croissance, d'échantillon pour essai et un inoculum de cellules algales en
phase exponentielle de croissance. Les lots d'essai sont incubées pendant une période de (72 ± 2) h, pendant
laquelle la concentration cellulaire de chacune solution d'essai est mesurée au moins toutes les 24 h.
2 © ISO 2004 – Tous droits réservés

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ISO 8692:2004(F)
L'inhibition est quantifiée par la diminution du taux de croissance, par comparaison à des cultures témoins
réalisées dans des conditions identiques.
5 Réactifs
5.1 Organisme d'essai: utiliser l'une des deux espèces suivantes d'algue planctonique d'eau douce:
1)
a) Desmodesmus subspicatus (86.81 SAG).
2)
b) Pseudokirchneriella subcapitata (Korshikov) Hindak (ATCC 22662, CCAP 278/4 ou 61.81 SAG).
NOTE 1 Ces deux espèces algales sont des algues vertes planctoniques appartenant à l'ordre des Chlorococcales
(Chlorophytes, Chlorophycées), qui se trouvent généralement à l'état unicellulaire en culture.
On peut se procurer les souches recommandées sous forme de cultures monospécifiques et non axéniques
3)
auprès de :
Collection of Algal Cultures
 SAG:
Inst. Plant Physiology
Université de Göttingen
Nikolausberger Weg 18
D-37073 Göttingen
Allemagne
American Type Culture Collection
 ATCC:
12301 Parklane Drive
Rockville, Maryland 20852
États-Unis
Culture Centre of Algae and Protozoa
 CCAP:
Freshwater Biological Association
The Ferry House
Ambleside
Cumbria LA22 OLP
Royaume-Uni
Algothèque du laboratoire de cryptogamie
Muséum National d'Histoire Naturelle
12, rue Buffon
75005 Paris
France

1) Cette espèce était antérieurement connue sous la dénomination de Scenedesmus subspicatus Chodat.
2) Cette espèce était antérieurement connue sous la dénomination de Selenastrum capricornutum Prinz. La nouvelle
dénomination est couramment citée par les collections de souches.
3) Les souches désignées par ces appellations commerciales sont des exemples de souches disponibles dans le
commerce. Cette information est donnée pour aider les utilisateurs de la présente Norme internationale; cela ne signifie
pas que l'ISO recommande l'utilisation de ces produits.
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NOTE 2 Il est possible de conserver les cultures mères dans le milieu décrit en 5.3 et 7.1. Cependant, des repiquages
fréquents sont nécessaires (une fois par semaine) pour empêcher toute perturbation de la croissance. La culture mère
peut se conserver plus longtemps sur des milieux pour algues plus riches, tels que ceux recommandés par la collection de
souches.
4)
D'autres algues peuvent être conservées pendant plusieurs mois dans des grains d'alginate sans perte de
[1]
viabilité . Les algues peuvent être facilement retirées des grains d'alginate pour réaliser les essais de toxicité.
5.2 Eau, déionisée ou d'une pureté équivalente (conductivité < 10 µS/cm), pour la préparation du milieu de
croissance et des solutions de substance à expérimenter.
Veiller à éviter toute contamination de l'eau par des substances inorganiques ou organiques pendant la
préparation et le stockage. Aucun matériel en cuivre ne doit être utilisé.
5.3 Substances nutritives.
Préparer quatre solutions mères de substances nutritives dans l'eau, selon les compositions données dans le
Tableau 1.
Ces solutions seront éventuellement diluées (voir 7.1 et 7.4) pour obtenir les concentrations finales en
substances nutritives dans les solutions d'essai. Toutefois, les macro-nutriments peuvent, à l'inverse, être
ajoutés directement dans l'eau.
Tous les produits chimiques utilisés doivent être des réactifs de qualité analytique.
Stériliser les solutions mères par filtration sur membrane (diamètre moyen des pores de 0,2 µm) ou par
passage à l'autoclave (120 °C, 15 min). Conserver les solutions à l'abri de la lumière à 4 °C.
La solution mère 4 ne doit pas être stérilisée en autoclave pour éviter toute perte par évaporation de NaHCO ,
3
mais uniquement par filtration sur membrane.


4) Les grains d'alginate fournis par MICROBIOTESTS Inc., Venecoweg 19, 9810 Nazareth, Belgique, tél. [phone],
fax [phone], mél [e-mail], sont un exemple de produit disponible dans le commerce. Cette
information est donnée pour aider les utilisateurs de la présente Norme internationale; cela ne signifie pas que l'ISO
recommande l'utilisation de ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'ils donnent des résultats
équivalents.
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Tableau 1 — Concentrations massiques de substances nutritives dans la solution d'essai
Concentration Concentration
Solution mère Substance nutritive massique massique finale dans
de la solution mère la solution d'essai
NH Cl 1,5 g/l 15 mg/l
4
MgCl ,6H O 1,2 g/l 12 mg/l
2 2
Solution mère 1: macro-nutriments CaCl ,2H O 1,8 g/l 18 mg/l
2 2
MgSO ,7H O 1,5 g/l 15 mg/l
4 2
KH PO 0,16 g/l 1,6 mg/l
2 4
FeCl ,6H O 64 mg/l 64 µg/l
3 2
Solution mère 2: Fe-EDTA
Na EDTA,2H O 100 mg/l 100 µg/l
2 2
a
H BO 185 mg/l 185 µg/l
3 3
MnCl ,4H O 415 mg/l 415 µg/l
2 2
ZnCl 3 mg/l 3 µg/l
2
Solution mère 3: éléments traces
CoCl ,6H O 1,5 mg/l 1,5 µg/l
2 2
CuCl ,2H O 0,01 mg/l 0,01 µg/l
2 2
Na MoO ,2H O 7 mg/l 7 µg/l
2 4 2
Solution mère 4: NaHCO NaHCO 50 g/l 50 mg/l
3 3
a H BO peut être dissous en ajoutant 0,1 N NaOH.
3 3
6 Appareillage
Tout le matériel en contact avec le milieu d'essai doit être en verre ou en matière chimiquement inerte.
Appareillage courant de laboratoire et le matériel suivant.
6.1 Armoire ou pièce à température contrôlée, pourvue d'une lampe fluorescente blanche, fournissant
un éclairage uniforme et continu, répondant aux exigences d'éclairage spécifiées pour l'essai en 7.6.
6.2 Appareil de mesure de la concentration cellulaire algale, de préférence un compte-particules ou un
microscope à chambre de comptage. Les concentrations algales peuvent également être déterminées par
[2]
une méthode indirecte avec, par exemple, un fluorimètre (par exemple fluorescence in vitro ou fluorescence
5) [3]
in vivo induite par le DCMU ) de sensibilité suffisante, et s'il est établi une corrélation acceptable avec la
concentration cellulaire. L'appareil utilisé doit pouvoir permettre de mesurer des concentrations cellulaires
4
aussi faibles que 10 cellules/ml et de distinguer la croissance algale des effets perturbateurs, par exemple la
présence de matières particulaires et la couleur de l'échantillon. Des spectromètres peuvent être assez
4
sensibles pour mesurer 10 cellules/ml à condition que puisse être utilisée une longueur de passage
suffisante (jusqu'à 10 cm). Cependant, cette technique est particulièrement sensible aux interférences venant
de matériaux en suspension et de substances colorées à faibles densités de cellules.
6.3 Flacons de culture, par exemple des fioles coniques de 250 ml avec bouchons perméables à l'air.
6.4 Appareillage pour filtration sur membrane, en utilisant des filtres de diamètre moyen de pore 0,2 µm.
6.5 Autoclave.
6.6 pH-mètre.

5) DCMU = dichlorophényldiméthyle urée (No CAS 330-54-1).
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7 Mode opératoire
7.1 Préparation du milieu de croissance
Préparer un milieu de croissance en ajoutant un volume approprié de solutions mères de substances
nutritives (5.3) à de l'eau.
Ajouter à environ 500 ml d'eau:
 10 ml de solution mère 1 (5.3);
 1 ml de solution mère 2 (5.3);
 1 ml de solution mère 3 (5.3);
 1 ml de solution mère 4 (5.3).
Compléter à 1 000 ml avec de l'eau.
En cas de passage nécessaire à l'autoclave, il convient d'ajouter la solution mère 4 après cette étape.
Avant l'utilisation, équilibrer en laissant à l'air pendant une nuit ou par un bullage avec de l'air filtré pendant
30 min. Après obtention de l'état d'équilibre, ajuster le pH à 8,1 ± 0,2, si nécessaire, en utilisant des solutions
d'acide chlorhydrique (1 mol/l) ou d'hydroxyde de sodium (1 mol/l).
Le milieu de croissance est tamponné par du bicarbonate et du CO atmosphérique. Différentes valeurs de
2
pH peuvent être obtenues en modifiant la concentration de HCO et/ou la concentration de CO
3 2
atmosphérique (cela exige l'utilisation de récipients clos) tel que spécifié dans l'ISO 14442. Si de telles
modifications sont nécessaires pour réaliser un essai à une valeur de pH différente spécifique, il faut que cela
soit expliqué et enregistré.
7.2 Préparation de Ia préculture et de l'inoculum
Lancer une préculture deux à quatre jours avant le début de l'essai. Le milieu de croissance (7.1) est inoculé
3 4
à une concentration cellulaire suffisamment basse (par exemple 5 ¥ 10 cellules/ml à 10 cellules/ml pour une
préculture de trois jours) de façon à maintenir la croissance en phase exponentielle jusqu'au début de l'essai.
La préculture doit être incubée dans les mêmes conditions que l'essai (7.6).
Cette préculture en phase exponentielle de croissance est utilisée comme inoculum pour l'essai. Mesurer la
concentration cellulaire de la préculture immédiatement avant l'utilisation, afin de calculer le volume
d'inoculum nécessaire.
7.3 Choix des concentrations de la solution pour essai
Il convient d'exposer les algues à des concentrations de la solution pour essai en suivant une progression
géométrique avec un facteur ne dépassant pas 3,2 (par exemple 1,0 mg/l, 1,8 mg/l, 3,2 mg/l, 5,6 mg/l et
10 mg/l).
Il convient de choisir les concentrations de manière à obtenir au moins un effet inhibiteur sur la croissance en
deçà et au-dessus du paramètre CE voulu. Il convient, en outre, d'inclure au moins deux niveaux d'inhibition
rx
entre 10 % et 90 % pour permettre l'obtention de données en vue de l'analyse de régression.
Il est possible de réaliser un essai limite avec une seule concentration pour démontrer l'absence de toxicité. Il
convient de réaliser six réplicats pour cette concentration unique.
NOTE La gamme de concentrations appropriées est déterminée aisément en effectuant un essai préliminaire
permettant de cibler la gamme et couvrant plusieurs ordres de grandeur de différence entre les concentrations d'essai. La
répétition de chaque concentration d'essai n'est pas nécessaire lors de l'essai préliminaire.
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7.4 Préparation des solutions pour essai et des solutions mères
Au cas où la solution pour essai est aqueuse (par exemple eau résiduaire), il est recommandé d'envisager un
prétraitement (filtration, neutralisation par exemple), suivant la nature de l'échantillon et l'objectif de l'essai.
Ajouter à l'échantillon des solutions mères de substances nutritives (5.3), tel que décrit en 7.1.
Pour des échantillons pour essai non aqueux, il est en général nécessaire de préparer des solutions mères. Il
est recommandé de choisir avec soin la méthode de préparation des solutions mères suivant les propriétés de
l'échantillon. Les solutions mères sont normalement préparées en dissolvant l'échantillon pour essai dans le
milieu de croissance. Lorsque l'échantillon pour essai ne se dissout pas aisément dans le milieu d'essai
comme spécifié dans l'ISO 14442 et l'ISO 5667-16, il est nécessaire de procéder à des modifications.
L'essai doit normalement être effectué sans ajustement du pH du milieu après l'ajout de l'échantillon pour
essai. Toutefois, certaines substances peuvent avoir un effet toxique dû à leur extrême acidité ou alcalinité.
Pour évaluer la toxicité d'une substance indépendamment du pH, ajuster le pH de l'échantillon aqueux ou de
la solution mère (avant préparation de la gamme de dilution) en fonction de celui du milieu de culture, en
utilisant des solutions à 1 mol/l d'acide chlorhydrique ou à 1 mol/l d'hydroxyde de sodium (voir l'ISO 5667-16).
7.5 Préparation des lots d'essai et des témoins
Préparer les lots d'essai et les témoins en mélangeant les volumes appropriés d'échantillon pour essai ou de
solutions mères de l'échantillon pour essai, de milieu de croissance et d'inoculum (7.2) dans les récipients
d'essai. Le volume total, les concentrations de substances nutritives ajoutées au milieu de croissance et la
densité de cellule doivent être les mêmes dans tous les récipients.
La concentration cellulaire initiale doit être suffisamment faible pour permettre l'obtention d'une croissance en
phase exponentielle dans la culture témoin pendant toute la durée de l'essai, sans variation du pH supérieure
à 1,5 unité de pH (voir Article 8). Par conséquent, il ne faut pas que les concentrations cellulaires initiales
4
excèdent 10 cellules/ml.
Préparer au moins trois réplicats pour chaque concentration de substance à expérimenter. Prendre six autres
flacons et n'y ajouter que le milieu de culture et l'inoculum sans échantillon pour essai. Ces récipients servent
de témoins. Si cela est approprié, préparer une gamme distincte de concentrations de l'échantillon pour essai
sans algues servant de valeur de base pour les déterminations de la concentration cellulaire.
Le nombre de réplicats par concentration peut être réduit pour des raisons statistiques (voir l'ISO/TS 20281) si
l'on augmente le nombre de concentrations et si l'on réduit l'intervalle entre les concentrations.
Mesurer le pH d'un échantillon de chaque lot d'essai ainsi que celui des solutions témoins.
7.6 Incubation
Les récipients doivent être suffisamment couverts pour éviter toute contamination aérienne et pour réduire
l'évaporation de l'eau, mais ils ne doivent pas être étanches à l'air de façon que le CO puisse y pénétrer (une
2
petite ouverture suffit). Incuber les récipients d'essai à 23 °C ± 2 °C sous lumière blanche continue. L'intensité
lumineuse au niveau moyen des milieux d'essai, mesurée à l'aide d'un récepteur approprié dans le domaine
de longueur d'onde effective de la photosynthèse de 400 nm à 700 nm, doit être homogène à ± 10 % et doit
2 2
se situer dans l'intervalle de 60 µmol/(m ·s) à 120 µmol/(m ·s).
II est important de noter que la méthode de mesure, en particulier le type de récepteur (collecteur), influe sur
la valeur mesurée. Les récepteurs sphériques (lesquels répondent à la lumière sous tous les angles au-
dessus et au-dessous du plan de mesure) et les récepteurs hémisphériques (lesquels répondent à la lumière
sous tous les angles au-dessus du plan de mesure) sont préférés aux récepteurs unidirectionnels. Ils donnent
des résultats plus élevés pour une source lumineuse multipoint du type de celle décrite dans la Note.
NOTE L'intensité lumineuse spécifiée ci-dessus peut être obtenue à l'aide de quatre à six lampes fluorescentes du
type lumière blanche universelle (naturelle) {par exemple, un étalon de couleur 2 spécifié (d'une température de couleur
de 4 300 K) conformément à [4]}. La distance optimale des lampes est d'environ 0,35 m du milieu de culture algale.
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Pour les instruments de mesure de la lumière étalonnés en lux, un intervalle équivalent de 6 000 lux à
10 000 lux est acceptable pour l'essai.
Des essais avec des solutions d'essai colorées nécessitent des variantes décrites dans l'ISO 14442.
Secouer, agiter ou aérer les cultures en continu pour maintenir les cellules en suspension, faciliter les
échanges gazeux air/eau (CO ), et par voie de conséquence, réduire la variation du pH.
2
7.7 Mesurages
Mesurer la concentration cellulaire dans chaque récipient (y compris les récipients témoins) au moins toutes
les 24 h. Les parties aliquotes, prélevées dans les milieux d'essai à des fins de mesures, ne devraient pas
être réintroduites dans les récipients.
La concentration cellulaire nominale peut être utilisée en tant que concentration cellulaire initiale; le mesurage
de cette dernière n'apparaît donc pas nécessaire.
L'essai doit durer 72 h ± 2 h.
À la fin de l'essai, mesurer le pH d'un échantillon de chaque lot d'essai (7.5) et d'un échantillon des témoins
(7.5). Il convient de confirmer l'aspect des cellules et l'identité de l'organisme d'essai lors d'un examen au
microscope.
8 Critères de validité
Considérer l'essai comme invalide si les conditions suivantes ne sont pas remplies:
-1
a) le taux de croissance moyen du témoin doit être au moins de 1,4 j . Cela correspond à un augmentaion
de la densité de cellule d'un facteur 67 en 72 h;
b) le coefficient de variation du taux de croissance des solutions témoins ne dépasse pas 5 %;
c) le pH des solutions témoins ne doit pas avoir augmenté de plus de 1,5 unité pendant l'essai par rapport
au pH du milieu de croissance.
Une augmentation du pH pendant l'essai pouvant influer significativement sur les résultats, une limite de
1,5 unité est fixée. Il convient, toutefois, de toujours maintenir ces variations aussi faibles que possible, par
exemple en maintenant une agitation continue pendant l'essai.
Si ces critères ne sont pas satisfaits, passer en revue les techniques expérimentales et utiliser des inoculums
d'origine différente, si nécessaire.
9 Calculs
9.1 Représentation graphique des courbes de croissance
Présenter sous forme de tableau les mesures de concentration cellulaire ou des autres paramètres en
corrélation avec la concentration cellulaire dans le milieu de croissance, en fonction de la concentration de
l'échantillon d'essai et de la durée de mesurage.
Tracer une courbe de la croissance pour chacune des concentrations d'essai et des solutions témoins en
portant le logarithme de la concentration cellulaire moyenne par rapport au temps. Une courbe de croissance
linéaire dénote une croissance exponentielle, alors que l'apparition d'un palier indique que les cultures entrent
dans la phase stationnaire.
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Au cas où, à la fin de la période d'exposition, les cultures témoins montrent un taux de croissance en déclin,
les cultures inhibées peuvent avoir tendance à rattraper les témoins, indiquant faussement un effet d'inhibition
de la croissance en diminution. Dans ce cas, calculer le taux de croissance et l'inhibition de croissance sur la
base des dernières mesures effectuées dans la période de croissance exponentielle des cultures témoins.
9.2 Calcul du pourcentage d'inhibition
Tout d'abord, calculer les taux de croissance spécifiques moyens, µ, pour chaque culture d'essai, d'après
l'Équation (1).
lnxx− ln
L0
µ = (1)
tt−
L0
où
t est l'heure du début de l'essai;
0
t est l'heure de la fin de l'essai [l'heure du dernier mesurage au cours de la phase de croissance
L
exponentielle des cultures témoins (9.1)];
x est la concentration cellulaire nominale initiale;
0
x est la concentration cellulaire mesurée à l'instant t .
L L
Il est également possible de déterminer le taux de croissance moyen à partir de la pente de la droite
...