ISO 9308-1:1990
(Main)Water quality — Detection and enumeration of coliform organisms, thermotolerant coliform organisms and presumptive Escherichia coli — Part 1: Membrane filtration method
Water quality — Detection and enumeration of coliform organisms, thermotolerant coliform organisms and presumptive Escherichia coli — Part 1: Membrane filtration method
Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement des organismes coliformes, des organismes coliformes thermotolérants et des Escherichia coli présumés — Partie 1: Méthode de filtration sur membrane
Kakovost vode - Ugotavljanje prisotnosti in števila koliformnih organizmov, termotolerantnih koliformnih organizmov in verjetne Escherichia coli - 1. del: Metoda membranske filtracije
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
IS0
INTERNATIONAL
STANDARD 9308-l
First edition
1990-10-01
Water quality - Detection and enumeration of
coliform organisms, thermotolerant coliform
organisms and presumptive Escherichia co/i -
Part 1:
Membrane filtration method
- Recherche et dgnombrement des organismes
Qualit de I’eau
coliformes, des organismes coliformes thermotol&ants et des
Escherichia coli p-&urn& -
Partie I: Methode de filtration sur membrane
Reference number
IS0 9308-l : 1990(E)
---------------------- Page: 1 ----------------------
IS0 9308-1:1990(E)
Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (IS0 member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through IS0
technical committees. Each member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the
work. IS0 collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an Interna-
tional Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies
casting a vote.
International Standard IS0 9308-I was prepared by Technical Committee
ISO/TC 147, Water quality.
IS0 9308 consists of the following parts, under the general title Water
quality - Detection and enumeration of coiiform organisms,
thermotolerant coliform organisms and presumptive Escherichia coli:
- Part I: Membrane filtration method
- Part 2: Multiple tube (most probable number) method
Annexes A and B of this part of IS0 9308 are for information only.
0 IS0 1990
All rights reserved. No part of this publication may be reproduced or utilized in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without
permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
l CH-1211 Genke 20 l Switzerland
Case Postale 56
Printed in Switzerland
ii
---------------------- Page: 2 ----------------------
IS0 93084:1990(E)
Introduction
The presence and extent of faecal pollution is an important factor in
assessing the quality of a body of water. Examination of water samples
for the presence of members of the coliform group of organismsl), which
normally inhabit the bowel of man and other warm-blooded animals,
provides an indication of such pollution. As the ability of some members
of the coliform group of organism to survive in water is limited, their
numbers can also be used to estimate the degree of recent faecal pol-
lution.
See annex A for further microbi ological information relevant to water ex-
1)
am ination for the coli form group of 0 rganism s.
. . .
Ill
---------------------- Page: 3 ----------------------
This page intentionally left blank
---------------------- Page: 4 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD IS0 93084:1990(E)
Water quality - Detection and enumeration of coliform
organisms, thermotolerant coliform organisms and
presumptive Escherichia co/i -
Part 1:
Membrane filtration method
IS0 3696:1987, Water for analytical laboratory use -
1 Scope
Specification and test methods.
This part of IS0 9308 specifies a method for the de-
IS0 5667-l :1980, Water quality - Sampling -
tection and enumeration in water of coliform
Part 1: Guidance on the design of sampling pro-
organisms, thermotolerant coliform organisms and
grammes.
presumptive kcherichia coli (presumptive E. coli)
after filtration through a membrane, subsequent
IS0 5667-2:1982, Water quality - Sampling -
culture on a differential lactose medium (see
Part 2: Guidance on sampling techniques.
IS0 7704) and calculation of their numbers in the
sample.
IS0 5667-3:1985, Water quality - Sampling -
Part 3: Guidance on the preservation and handling
This method can be applied to all types of water
of samples.
except where the presence of suspended matter in-
terferes with filtration or large numbers of other
organisms may interfere with growth. IS0 6887:1983, Microbiology - General guidance for
the preparation of dilutions for microbiological ex-
The choice of tests used in the detection and confir-
amina tion.
mation of the coliform group of organisms, including
E. co/i, can be regarded as part of a continuous se-
IS0 7704:1985, Water quality - Evaluation of mem-
quence. The extent of confirmation with a particular
brane filters used for microbiological analyses.
sample depends partly on the nature of the water
and partly on the reasons for the examination. In
IS0 8199:1988, Water quality - General guide to the
practice, the detection in water of presumptive
enumeration of micro-organisms by culture.
E. co/i as defined in 3.3 usually provides an indi-
cation of recent faecal pollution.
3 Definitions
2 Normative references
For the purposes of this part of IS0 9308, the follow-
ing definitions apply.
The following standards contain provisions which,
through reference in this text, constitute provisions
3.1 coliform organisms: Organisms capable of
of this part of IS0 9308. At the time of publication,
forming colonies aerobically at either
the editions indicated were valid. All standards are
35 “C + 0,5 “C or 37 “C + 0,5 “C on a selective
subject to revision, and parties to agreements based
and differential lactose culture medium with the
on this part of IS0 9308 are encouraged to investi-
production of acid (and aldehyde) within 24 h.
gate the possibility of applying the most recent edi-
tions of the standards indicated below. Members of
3.2 thermotolerant coliform organisms: Coliform
IEC and IS0 maintain registers of currently valid
organisms as described in 3.1 which have the same
International Standards.
1
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IS0 9308-l :I 990(E)
fermentative properties within 24 h, at either 5.3 Isolation media
44 “C + 0,25 “C or 44,5 OC + 0,25 “C.
- -
Use one or more of the following culture media ei-
NOTE 1 As gas production is not detectable on mem-
ther in solid form with agar or as a broth for satu-
branes, the organisms obtained by membrane filtration
rating absorbent pads. Instructions for preparing the
are not necessarily the same as those detected by the
media are given in annex B.
multiple tube [most probable number (MPN)] method.
5.3.1 Lactose TTC agar with Tergitol 72)
3.3 presumptive Escherichia coli (presumptive
E. co/i): Thermotolerant coliform organisms as de-
53.2 Lactose agar with Tergitol P)
scribed in 3.2 which also produce gas from lactose
(and mannitol) as well as indole from tryptophan
53.3 Membrane enriched Teepol broth2)
within 24 h, at either 44 “C + 0,25 “C or
-
44,5 “C + 0,25 “C.
-
53.4 Membrane lauryl sulfate broth
4 Principle 5.3.5 Endo medium
Filtration of a test portion of the sample through a
5.3.6 LES Endo agar
membrane which retains the organisms; placing the
membrane on either a selective lactose agar culture
53.7 mFC medium
medium or on an absorbent pad saturated with a
selective liquid medium containing lactose.
5.4 Confirmatory media
Incubation of the membrane for 24 h at either 35 “C
or 37 “C for the detection of coiiform organisms, or
Use one or more of the following.
alternatively at 44 “C for the presence of
thermotolerant coliform organisms,
5.4.1 Medium for gas production
Direct count of characteristic colonies formed on the
Lactose peptone water.
membrane; subculture of some of these colonies for
confirmatory tests for gas and for indole production.
5.4.2 Medium for indole production
Calculation of the numbers of coliform organisms,
thermotolerant coliform organisms and presumptive
Tryptone water.
E. co/i likely to be present in 100 ml of the sample.
5.4.3 Single-tube medium for both gas and indole
production
5 Diluent, culture media and reagents
Lauryl tryptose mannitol broth with tryptophan.
5.1 Basic materials
5.5 Reagents
Use ingredients of uniform quality and chemicals of
analytical grade for the preparation of culture media
5.5.1 Kovacs’ reagent for indole
and reagents and follow the instructions given in
annex B. For information on storage see IS0 8199.
5.5.2 Oxidase reayent for the oxidase test
Alternatively, use dehydrated complete media and
follow strictly the manufacturer’s instructions.
6 Apparatus
For the preparation of media, use glass-distilled
water or de-ionized water free from substances
Usual microbiological laboratory equipment, includ-
which might inhibit bacterial growth under the con-
ing
ditions of the test, and in accordance with IS0 3696.
6.1 Hot-air oven for dry-heat sterilization and an
5.2 Diluent
autoclave.
For making sample dilutions, use one of the diluents Apart from apparatus supplied sterile, glassware
recommended in annex B. Prepare the diluent ac- and other equipment shall be sterilized according to
cording to the instructions given in annex B. the instructions given in IS0 8199.
2) Tergitol 7, Teepol broth are examples of suitable products available commercially. This information is given for the
convenience of users of this part of IS0 9308 and does not constitute an endorsement by IS0 of these products.
2
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IS0 9308=1:1990(E)
8.2.2 For thermotolerant coliform organisms, incu-
6.2 Incubator or water bath, thermostatically
bate the membrane for 18 h to 24 h at either
controlled at either 35 OC + 0,s OC or
-
44 “C + 0,25 “C or 44,5 “C + 0,25 “C.
37 OC + 0,5 “C.
- - -
NOTES
6.3 Incubator or water bath, thermostatically
3 The same medium can generally be used for both
44 “C + 0,25 “C or
controlled at either
-
coliform organisms and thermotolerant coliform
44,5 “C + 0,25 “C.
-
organisms, but mFC medium should be used only at
44 OC, and Endo and LES Endo media should be used at
35 “C or 37 OC.
6.4 pH meter.
4 A preliminary period at a lower temperature such as
30 OC for the first 4 h of incubation is recommended to
6.5 Apparatus for membrane filtration.
resuscitate stressed organisms, especially in the exam-
ination of drinking water.
6.6 Membrane filters, usually about 47 mm or
50 mm in diameter, with filtration characteristics 83 . Examination of membranes
equivalent to a rated nominal pore diameter of
0,45 pm. If not obtained sterile, they shall be steri-
8.3.1 Coliform organisms
lized according to the manufacturer’s instructions.
Examine the membranes and count as presumptive
coliform organisms all colonies, irrespective of size,
6.7 Forceps, for handling membranes.
which show, after incubation at 35 “C or 37 OC, the
following characteristics.
7 Sampling
-
On lactose TTC agar with Tergitol (5.3.1): a yel-
low, orange or brick red colouration with a yellow
Take the samples and deliver them to the laboratory
central halo in the medium under the membrane.
in accordance with IS0 8199, IS0 5667-1, IS0 5667-2
and IS0 5667-3.
-
on lactose agar with Tergitol 7 (5.3.2): a yellow
central halo in the medium under the membrane.
~
8 Procedure
On membrane enriched Teepol broth (5.3.3): a
yellow colour extending on to the membrane.
8.1 Preparation of the sample, filtration and
-
On membrane lauryl sulfate broth (5.3.4): a yel-
inoculation of media
low colour extending on to the membrane.
For preparation of the sample, making dilutions, fil-
-
On Endo agar or broth (5.3.5): a dark red colour
tration and inoculation of isolation media, follow the
with a golden-green metallic sheen.
instructions given in IS0 8199 and IS0 6887.
-
On LES Endo agar (5.3.6): a dark red colour with
a golden-green metallic sheen.
8.1.1 For coliform organisms, filter the required
volume of the sample, or a dilution of it, through one
membrane. Place on the medium chosen, ensuring 8.3.2 Thermotolerant coliform organisms
that no air is trapped underneath it.
Regard as presumptive thermotolerant coliform
organisms all colonies which show, after incubation
8.1.2 For thermotolerant coliform organisms, filter
at 44 OC, the same colonial characteristics as those
the required volume of the sample, or a dilution of
described in 8.3.1. With mFC medium (5.3.7), such
it, through one membrane. Place on the medium
colonies are blue in colour.
chosen, ensuring that no air is trapped underneath
it.
8.4 Confirmatory tests
The volume of sample filtered should be the
NOTE 2
same as in 8.1.1.
It is important to note that the counts of colonies on
membranes at 35 “C or 37 “C and at 44 OC are only
presumptive coliform results. Since gas production
82 . Incubation of membranes
is not detected, there is also an additional
presumption that the organisms forming colonies
can also produce gas from lactose. For the exam-
8.2.1 For coliform organisms, incubate the mem-
ination of raw or partly-treated waters, this may be
brane for 18 h to 24 h at either 35 “C - + 0,5 “C or
sufficient, but for potable supplies and other cir-
37 “C + 0,s “C.
-
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IS0 93084:1990(E)
porta nt to carry out confirmatory 8.5.1 Carry out the oxidase test with pure subcul-
cumst antes, it is im
ultures. tures of lactose-fermenting organisms, grown on
tests, preferabl pure subc
Y on
nutrient agar medium, as follows:
- place 2 to 3 drops of freshly prepared oxidase
8.4.1
Subculture, incubation and examination
reagent (5.5.2) on a filter paper in a Petri dish;
-
with a glass rod, swab stick or platinum (not
8.4.1 .I Coliform organisms
nichrome) wire loop, smear some of the growth
on the prepared filter paper (see note 7);
To confirm the membrane results, subculture each
colony (8.3.1) or a representative number of them to
-
regard the a ppeara nce 0 f a deep blue-purple
tubes of lactose peptone water (5.4-l) and incubate
colour within 10 s as a pos itive reaction.
at 35 “C or 37 “C for 48 h: gas production within this
period confirms the presence of coliform organisms.
NOTE 8 On each occasion that the oxidase reagent
is used, control tests should be conducted with cul-
tures of an organism known to give a positive reaction
8.4.1.2 Thermotolerant coliform organisms and
(Pseudomonas aeruginosa) and a negative reaction
presumptive E. co/i
(E. co/i).
For thermotolerant coliform organisms and
presumptive E. co/i on membranes, whether incu-
9 Expression of results
bated at 44 “C or at 35 OC or 37 “C, subculture each
colony (8.32) or a representative number of them,
From the numbers of characteristic colonies counted
to tubes of lactose peptone water and tryptone water
on the membranes and taking account of the results
and incubate at 44 “C for 24 h. Gas production in
of the confirmatory tests performed, calculate the
lactose peptone water confirms the presence of
numbers of coliform organisms, thermotolerant
thermotolerant coliform organisms, and develop-
coliform organisms and presu
...
SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 9308-1:1998
01-februar-1998
Kakovost vode - Ugotavljanje prisotnosti in števila koliformnih organizmov,
termotolerantnih koliformnih organizmov in verjetne Escherichia coli - 1. del:
Metoda membranske filtracije
Water quality -- Detection and enumeration of coliform organisms, thermotolerant
coliform organisms and presumptive Escherichia coli -- Part 1: Membrane filtration
method
Qualité de l'eau -- Recherche et dénombrement des organismes coliformes, des
organismes coliformes thermotolérants et des Escherichia coli présumés -- Partie 1:
Méthode de filtration sur membrane
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 9308-1:1990
ICS:
07.100.20 Mikrobiologija vode Microbiology of water
SIST ISO 9308-1:1998 en
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
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IS0
INTERNATIONAL
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First edition
1990-10-01
Water quality - Detection and enumeration of
coliform organisms, thermotolerant coliform
organisms and presumptive Escherichia co/i -
Part 1:
Membrane filtration method
- Recherche et dgnombrement des organismes
Qualit de I’eau
coliformes, des organismes coliformes thermotol&ants et des
Escherichia coli p-&urn& -
Partie I: Methode de filtration sur membrane
Reference number
IS0 9308-l : 1990(E)
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Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (IS0 member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through IS0
technical committees. Each member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the
work. IS0 collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an Interna-
tional Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies
casting a vote.
International Standard IS0 9308-I was prepared by Technical Committee
ISO/TC 147, Water quality.
IS0 9308 consists of the following parts, under the general title Water
quality - Detection and enumeration of coiiform organisms,
thermotolerant coliform organisms and presumptive Escherichia coli:
- Part I: Membrane filtration method
- Part 2: Multiple tube (most probable number) method
Annexes A and B of this part of IS0 9308 are for information only.
0 IS0 1990
All rights reserved. No part of this publication may be reproduced or utilized in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without
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Introduction
The presence and extent of faecal pollution is an important factor in
assessing the quality of a body of water. Examination of water samples
for the presence of members of the coliform group of organismsl), which
normally inhabit the bowel of man and other warm-blooded animals,
provides an indication of such pollution. As the ability of some members
of the coliform group of organism to survive in water is limited, their
numbers can also be used to estimate the degree of recent faecal pol-
lution.
See annex A for further microbi ological information relevant to water ex-
1)
am ination for the coli form group of 0 rganism s.
. . .
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INTERNATIONAL STANDARD IS0 93084:1990(E)
Water quality - Detection and enumeration of coliform
organisms, thermotolerant coliform organisms and
presumptive Escherichia co/i -
Part 1:
Membrane filtration method
IS0 3696:1987, Water for analytical laboratory use -
1 Scope
Specification and test methods.
This part of IS0 9308 specifies a method for the de-
IS0 5667-l :1980, Water quality - Sampling -
tection and enumeration in water of coliform
Part 1: Guidance on the design of sampling pro-
organisms, thermotolerant coliform organisms and
grammes.
presumptive kcherichia coli (presumptive E. coli)
after filtration through a membrane, subsequent
IS0 5667-2:1982, Water quality - Sampling -
culture on a differential lactose medium (see
Part 2: Guidance on sampling techniques.
IS0 7704) and calculation of their numbers in the
sample.
IS0 5667-3:1985, Water quality - Sampling -
Part 3: Guidance on the preservation and handling
This method can be applied to all types of water
of samples.
except where the presence of suspended matter in-
terferes with filtration or large numbers of other
organisms may interfere with growth. IS0 6887:1983, Microbiology - General guidance for
the preparation of dilutions for microbiological ex-
The choice of tests used in the detection and confir-
amina tion.
mation of the coliform group of organisms, including
E. co/i, can be regarded as part of a continuous se-
IS0 7704:1985, Water quality - Evaluation of mem-
quence. The extent of confirmation with a particular
brane filters used for microbiological analyses.
sample depends partly on the nature of the water
and partly on the reasons for the examination. In
IS0 8199:1988, Water quality - General guide to the
practice, the detection in water of presumptive
enumeration of micro-organisms by culture.
E. co/i as defined in 3.3 usually provides an indi-
cation of recent faecal pollution.
3 Definitions
2 Normative references
For the purposes of this part of IS0 9308, the follow-
ing definitions apply.
The following standards contain provisions which,
through reference in this text, constitute provisions
3.1 coliform organisms: Organisms capable of
of this part of IS0 9308. At the time of publication,
forming colonies aerobically at either
the editions indicated were valid. All standards are
35 “C + 0,5 “C or 37 “C + 0,5 “C on a selective
subject to revision, and parties to agreements based
and differential lactose culture medium with the
on this part of IS0 9308 are encouraged to investi-
production of acid (and aldehyde) within 24 h.
gate the possibility of applying the most recent edi-
tions of the standards indicated below. Members of
3.2 thermotolerant coliform organisms: Coliform
IEC and IS0 maintain registers of currently valid
organisms as described in 3.1 which have the same
International Standards.
1
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IS0 9308-l :I 990(E)
fermentative properties within 24 h, at either 5.3 Isolation media
44 “C + 0,25 “C or 44,5 OC + 0,25 “C.
- -
Use one or more of the following culture media ei-
NOTE 1 As gas production is not detectable on mem-
ther in solid form with agar or as a broth for satu-
branes, the organisms obtained by membrane filtration
rating absorbent pads. Instructions for preparing the
are not necessarily the same as those detected by the
media are given in annex B.
multiple tube [most probable number (MPN)] method.
5.3.1 Lactose TTC agar with Tergitol 72)
3.3 presumptive Escherichia coli (presumptive
E. co/i): Thermotolerant coliform organisms as de-
53.2 Lactose agar with Tergitol P)
scribed in 3.2 which also produce gas from lactose
(and mannitol) as well as indole from tryptophan
53.3 Membrane enriched Teepol broth2)
within 24 h, at either 44 “C + 0,25 “C or
-
44,5 “C + 0,25 “C.
-
53.4 Membrane lauryl sulfate broth
4 Principle 5.3.5 Endo medium
Filtration of a test portion of the sample through a
5.3.6 LES Endo agar
membrane which retains the organisms; placing the
membrane on either a selective lactose agar culture
53.7 mFC medium
medium or on an absorbent pad saturated with a
selective liquid medium containing lactose.
5.4 Confirmatory media
Incubation of the membrane for 24 h at either 35 “C
or 37 “C for the detection of coiiform organisms, or
Use one or more of the following.
alternatively at 44 “C for the presence of
thermotolerant coliform organisms,
5.4.1 Medium for gas production
Direct count of characteristic colonies formed on the
Lactose peptone water.
membrane; subculture of some of these colonies for
confirmatory tests for gas and for indole production.
5.4.2 Medium for indole production
Calculation of the numbers of coliform organisms,
thermotolerant coliform organisms and presumptive
Tryptone water.
E. co/i likely to be present in 100 ml of the sample.
5.4.3 Single-tube medium for both gas and indole
production
5 Diluent, culture media and reagents
Lauryl tryptose mannitol broth with tryptophan.
5.1 Basic materials
5.5 Reagents
Use ingredients of uniform quality and chemicals of
analytical grade for the preparation of culture media
5.5.1 Kovacs’ reagent for indole
and reagents and follow the instructions given in
annex B. For information on storage see IS0 8199.
5.5.2 Oxidase reayent for the oxidase test
Alternatively, use dehydrated complete media and
follow strictly the manufacturer’s instructions.
6 Apparatus
For the preparation of media, use glass-distilled
water or de-ionized water free from substances
Usual microbiological laboratory equipment, includ-
which might inhibit bacterial growth under the con-
ing
ditions of the test, and in accordance with IS0 3696.
6.1 Hot-air oven for dry-heat sterilization and an
5.2 Diluent
autoclave.
For making sample dilutions, use one of the diluents Apart from apparatus supplied sterile, glassware
recommended in annex B. Prepare the diluent ac- and other equipment shall be sterilized according to
cording to the instructions given in annex B. the instructions given in IS0 8199.
2) Tergitol 7, Teepol broth are examples of suitable products available commercially. This information is given for the
convenience of users of this part of IS0 9308 and does not constitute an endorsement by IS0 of these products.
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8.2.2 For thermotolerant coliform organisms, incu-
6.2 Incubator or water bath, thermostatically
bate the membrane for 18 h to 24 h at either
controlled at either 35 OC + 0,s OC or
-
44 “C + 0,25 “C or 44,5 “C + 0,25 “C.
37 OC + 0,5 “C.
- - -
NOTES
6.3 Incubator or water bath, thermostatically
3 The same medium can generally be used for both
44 “C + 0,25 “C or
controlled at either
-
coliform organisms and thermotolerant coliform
44,5 “C + 0,25 “C.
-
organisms, but mFC medium should be used only at
44 OC, and Endo and LES Endo media should be used at
35 “C or 37 OC.
6.4 pH meter.
4 A preliminary period at a lower temperature such as
30 OC for the first 4 h of incubation is recommended to
6.5 Apparatus for membrane filtration.
resuscitate stressed organisms, especially in the exam-
ination of drinking water.
6.6 Membrane filters, usually about 47 mm or
50 mm in diameter, with filtration characteristics 83 . Examination of membranes
equivalent to a rated nominal pore diameter of
0,45 pm. If not obtained sterile, they shall be steri-
8.3.1 Coliform organisms
lized according to the manufacturer’s instructions.
Examine the membranes and count as presumptive
coliform organisms all colonies, irrespective of size,
6.7 Forceps, for handling membranes.
which show, after incubation at 35 “C or 37 OC, the
following characteristics.
7 Sampling
-
On lactose TTC agar with Tergitol (5.3.1): a yel-
low, orange or brick red colouration with a yellow
Take the samples and deliver them to the laboratory
central halo in the medium under the membrane.
in accordance with IS0 8199, IS0 5667-1, IS0 5667-2
and IS0 5667-3.
-
on lactose agar with Tergitol 7 (5.3.2): a yellow
central halo in the medium under the membrane.
~
8 Procedure
On membrane enriched Teepol broth (5.3.3): a
yellow colour extending on to the membrane.
8.1 Preparation of the sample, filtration and
-
On membrane lauryl sulfate broth (5.3.4): a yel-
inoculation of media
low colour extending on to the membrane.
For preparation of the sample, making dilutions, fil-
-
On Endo agar or broth (5.3.5): a dark red colour
tration and inoculation of isolation media, follow the
with a golden-green metallic sheen.
instructions given in IS0 8199 and IS0 6887.
-
On LES Endo agar (5.3.6): a dark red colour with
a golden-green metallic sheen.
8.1.1 For coliform organisms, filter the required
volume of the sample, or a dilution of it, through one
membrane. Place on the medium chosen, ensuring 8.3.2 Thermotolerant coliform organisms
that no air is trapped underneath it.
Regard as presumptive thermotolerant coliform
organisms all colonies which show, after incubation
8.1.2 For thermotolerant coliform organisms, filter
at 44 OC, the same colonial characteristics as those
the required volume of the sample, or a dilution of
described in 8.3.1. With mFC medium (5.3.7), such
it, through one membrane. Place on the medium
colonies are blue in colour.
chosen, ensuring that no air is trapped underneath
it.
8.4 Confirmatory tests
The volume of sample filtered should be the
NOTE 2
same as in 8.1.1.
It is important to note that the counts of colonies on
membranes at 35 “C or 37 “C and at 44 OC are only
presumptive coliform results. Since gas production
82 . Incubation of membranes
is not detected, there is also an additional
presumption that the organisms forming colonies
can also produce gas from lactose. For the exam-
8.2.1 For coliform organisms, incubate the mem-
ination of raw or partly-treated waters, this may be
brane for 18 h to 24 h at either 35 “C - + 0,5 “C or
sufficient, but for potable supplies and other cir-
37 “C + 0,s “C.
-
---------------------- Page: 9 ----------------------
SIST ISO 9308-1:1998
IS0 93084:1990(E)
porta nt to carry out confirmatory 8.5.1 Carry out the oxidase test with pure subcul-
cumst antes, it is im
ultures. tures of lactose-fermenting organisms, grown on
tests, preferabl pure subc
Y on
nutrient agar medium, as follows:
- place 2 to 3 drops of freshly prepared oxidase
8.4.1
Subculture, incubation and examination
reagent (5.5.2) on a filter paper in a Petri dish;
-
with a glass rod, swab stick or platinum (not
8.4.1 .I Coliform organisms
nichrome) wire loop, smear some of the growth
on the prepared filter paper (see note 7);
To confirm the membrane results, subculture each
colony (8.3.1) or a representative number of them to
-
regard the a ppeara nce 0 f a deep blue-purple
tubes of lactose peptone water (5.4-l) and incubate
colour within 10 s as a pos itive reaction.
at 35 “C or 37 “C for 48 h: gas production within this
period confirms the presence of coliform organisms.
NOTE 8 On each occasion that the oxidase reagent
is used, control tests should be conducted with cul-
tures of an organism known to give a positive reaction
8.4.1.2 Thermotolerant coliform organisms and
(Pseudomonas aeruginosa) and a n
...
ISO
NORME
INTERNATIONALE 93084
Premibre édition
1990-l O-01
Qualité de l’eau - Recherche~ et dénombrement
des organismes coliformes, des organismes
coliformes thermotolérants et des Escherichia
Co/i présumés -
Partie 1:
Méthode de filtration sur membrane
Water quality - Detection and enumeration of coliform organisms,
thermotolerant coliform organisms and presumptive Escherichia coli -
Part 1: Membrane filtration method
Numéro de référence
ISO 9308-l : 19901 F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 9308=1:1990(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres
de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre inté-
ressé par une étude a le droit de faire partie du comit6 technique créé
à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I’ISO participent également aux tra-
vaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique
internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotech-
nique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comit6s techni-
ques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins
des comités membres votants.
La Norme internationale ISO 9308-l a été élaborée par le comité tech-
nique ISO/TC 147, Qualité de l’eau.
L’ISO 9308 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre gé-
néral Qualité de /‘eau - Recherche et dénombrement des organismes
coliformes, des organismes coliformes thermotolérants et des
Escherichia coli présumés:
- Partie Ir Méthode de filtration sur membrane
- Partie 2: Méfhodk du nombre le plus probable
Les annexes A et B de la présente partie de I’ISO 9308 sont données
uniquement à titre d’information.
0 ISO 1990
Droits de reproduction réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être repro-
duite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou
mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 93084:1990(F)
Introduction
La présence et l’importance de la pollution fécale est un facteur impor-
tant de l’évaluation de la qualité d’une masse d’eau. L’examen
d’échantillons d’eau pour la recherche de bacteries du groupe des or-
ganismes coliformes 1) , normalement présents dans les intestins de
l’homme et des animaux homéothermes, fournit une indication sur ce
type de pollution. L’aptitude de certains membres du groupe coliforme
à vivre dans l’eau étant limitée, leur nombre peut également être utilisé
pour estimer le degré de pollution fécale récente.
pour de plus amples informations microbiologi ques sur
1) Voir annexe A
l’étude de l’eau à la recherche d’organismes du groupe coliforme.
. . .
III
---------------------- Page: 3 ----------------------
Page blanche
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 93084:1990(F)
NORME INTERNATIONALE
Qualité de l’eau - Recherche et dénombrement des
organismes coliformes, des organismes coliformes
thermotolérants et des Escherichia coli présumés -
Partie 1:
Méthode de filtration sur membrane
de I’ISO 9308 sont invitées à rechercher la possi-
1 Domaine d’application
bilité d’appliquer les editions les plus récentes des
normes indiquées ci-aprés. Les membres de la CEI
La présente partie de I’ISO 9308 prescrit une mé-
et de I’ISO possèdent le registre des Normes inter-
thode de recherche et de dénombrement des orga-
nationales en vigueur à un moment donné.
nismes coliformes, des organismes coliformes
thermotolérants et des Escherichia coli présumés
ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire 9 usage analyti-
(E. Co/i présumés) présents dans l’eau après fil-
que - Spécitïcation et méthodes d’essai.
tration sur une membrane, suivie d’une culture sur
un milieu Iactosé sélectif (voir ISO 7704) et calcul de
ISO 5667-1:1980, Qualifë de l’eau - Échantillonnage
leur nombre dans l’échantillon.
- Partie 1: Guide généra/ pour l’établissement des
Cette méthode peut être appliquée à tous les types programmes d’échantillonnage.
d’eau, à moins que des particules en suspension
n’interfèrent avec la filtration ou que d’autres orga- ISO 5667-2:1982, Qualité de l’eau - Échantillonnage
nismes en trop grand nombre n’interferent avec la - Partie 2: Guide général sur les techniques
croissance. d’échantillonnage.
Le choix des essais utilisés pour la recherche et la
ISO 5667.3:1985, Qualité de l’eau - Échantillonnage
confirmation des organismes du groupe coliforme,
- Partie 3: Guide général pour la conservation et la
y compris I’E. coli, peut être considéré comme fai-
manipulation des échantillons.
sant partie d’une séquence continue. L’importance
de la contïrmation pour un échantillon donné dé-
ISO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales
pend en partie de la nature de l’eau, de son usage,
pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
et en partie des raisons ayant conduit à cet examen.
microbiologique.
Dans la pratique, la recherche d’E. coli présumés
dans l’eau comme indiqué en 3.3 fournit géné-
ISO 7704:1985, Qualité de l’eau - Évaluation des
ralement une indication sur une pollution fécale ré-
membranes filtrantes utilisées pour des analyses mi-
cente.
crobiologiques.
ISO 8199:1988, Qualité de /‘eau - Guide général pour
2 Références normatives
le dénombrement des micro-organismes sur milieu
de culture.
Les normes suivantes contiennent des dispositions
qui, par suite de la référence qui en est faite,
constituent des dispositions valables pour la pré-
3 Définitions
sente partie de I’ISO 9308. Au moment de la publi-
cation, les éditions indiquées étaient en vigueur.
Toute norme est sujette à révision et les parties Pour les besoins de la présente partie de I’ISO 9308,
prenantes des accords fondes sur la présente partie les définitions suivantes s’appliquent.
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 93084:1990(F)
3.1 organismes coliformes: Organismes capables d’utiliser des milieux complets déshydratés, suivre
de former des colonies en aérobiose à alors à la lettre les instructions du fabricant.
35 “C + 0,5 OC ou à 37 “C + 0,5 *C sur un milieu
Pour la préparation des milieux, utiliser de l’eau
Iactosé sélectif et différentiel, avec production
distillée ou de l’eau désionisée, exempte de sub-
d’acide (et d’aldéhyde) dans les 24 h.
stances susceptibles d’inhiber la croissance
bactérienne dans les conditions de l’essai et
3.2 organismes coliformes thermotolérants: Orga-
conforme à I’ISO 3696.
nismes coliformes répondant à la définition donnée
en 3.1, présentant les mêmes propriétés de fermen-
tation dans les 24 h, à 44 “C + 0,25 OC ou à
- 5.2 Diluant
44,5 OC + 0,25 OC.
-
Pour préparer les dilutions de l’échantillon, utiliser
NOTE 1 La production de gaz n’étant pas décelable sur
l’un des diluants recommand’ks dans l’annexe B.
les membranes, les organismes obtenus par filtration sur
Préparer le diluant conformément aux instructions
membrane ne sont pas forcément les mêmes que ceux
données dans l’annexe B.
décelés par la méthode des tubes multiples [nombre le
plus probable (NPP)].
5.3 Milieux d’isolement
3.3 Escherichk coli presumés (E. coli présumés):
Organismes coliformes thermotolérants répondant Utiliser un ou plusieurs des milieux de culture sui-
à la definition donnée en 3.2 qui produisent, en plus, vants soit sous forme solide avec de la gélose, soit
du gaz à partir du lactose (et du mannitol) ainsi que sous forme bouillon pour tampons absorbants satu-
de I’indole à partir du tryptophane dans les 24 h, soit rés. Les instructions pour la préparation des milieux
à 44 “C + 0,25 “C, soit à 44,5 “C + 0,25 “C. sont données dans l’annexe B.
-
-
53.1 Gélose lactosée au TTC et au Tergitol 72)
4 Principe
53.2 Gélose lactosée au Tergltol T2)
Filtration d’une prise d’essai de l’échantillon
homogénéisé sur une membrane stkrile qui retient
53.3 Bouillon enrichi au Teepo12)
les organismes; transfert de la membrane soit sur
un milieu de culture sélectif de gélose lactosée, soit
sur un tampon absorbant saturé d’un milieu liquide 53.4 Bouillon au laurylsulfate
Mectif contenant du lactose.
5.3.5 Milieu endo
Incubation de la membrane pendant 24 h soit à
35 OC ou 37 *C pour la recherche d’organismes co-
5.3.6 Gélose endo LES
Iiformes, soit à 44 “C pour la recherche d’organis-
mes coliformes thermotolérants.
53.7 Milieu mFC
Comptage direct des colonies caractéristiques for-
mées sur la membrane; culture de certaines de ces
5.4 Milieux de confirmation
colonies pour essais de confirmation pour la pro-
duction de gaz et d’indole. Calcul du nombre d’or-
Utiliser un ou plusieurs des milieux suivants.
ganismes coliformes, d’organismes coliformes
thermotolérants et d’Escherichia coli présumés sus-
5.4.1 Milieu pour la production de gaz
ceptibles de se trouver dans 100 ml d’échantillon.
Eau peptonée lactosée.
5 Diluants, milieux de culture et réactifs
5.4.2 Milieu pour la production d’indole
5.1 Produits de base
Eau ttyptonée.
Pour la préparation des milieux de culture et des
5.4.3 Milieu pour tube à essai unique pour
réactifs, utiliser des ingrédients de qualité homo-
production de gaz et d’lndole
géne et des produits chimiques de qualité analyti-
suivre les instructions données dans
que;
l’annexe B. Pour des informations sur la conser- Bouillon tryptosé au mannitol, au laurylsulfate et au
vation, voir ISO 8199. II est possible également tryptophane.
2) Tergitol 7 et Teepol sont des exemples de produits appropriés disponibles sur le marché. Cette information est donnée
à l’intention des utilisateurs de la présente partie de I’ISO 9308 et ne signifie nullement que I’ISO approuve ou recommande
l’emploi exclusif des produits ainsi désignés.
2
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 93084:1990(F)
8.1.1 Pour les organismes coliformes, filtrer le vo-
5.5 Réactifs
lume requis d’échantiflon, ou une dilution de cet
échantillon, sur une membrane. Placer la mem-
S.S.1 Rdactif de Kovacs pour la recherche de
brane sur le milieu choisi, en s’assurant que des
l’indole
bulles d’air ne soient pas emprisonnées sous la
membrane.
5.52 Reactif & l’oxydase pour la recherche de
l’oxydase
8.1.2 Pour les organismes coliformes
thermotokrants, filtrer le volume requis d’échan-
tillon ou une dilution de cet échantillon, sur une
6 Appareillage
membrane. Placer la membrane sur le milieu choisi
en s’assurant que des bulles d’air ne soient pas
Matériel courant de laboratoire microbiologique, y
emprisonnées sous la ‘membrane.
compris
NOTE 2 Le volume d’échantillon filtré devrait être le
même qu’en 8.1.1 .
6.1 Four à air chaud pour stérilisation en chaleur
sèche et autoclave.
Incubation des membranes
82 .
Outre l’appareillage livré stérile, la verrerie et tout
autre matériel doivent être stérilisés conformément
8.2.1 Pour les organismes coliformes, faire incuber
aux instructions données dans I’ISO 8199.
la membrane pendant 18 h à 24 h à 35 OC k 0,5 OC
ou 37 “C + 0,5 “C.
-
6.2 Incubateur ou bain d’eau, réglable à
35 “C + 0,5 “C ou à 37 “C + 0,5 “C.
- -
8.2.2 Pour les organismes coliformes
thermotolérants, faire incuber la membrane pendant
18 h à 24 h à 44 “C + 0,25 “C ou à 44,5 “C
6.3 Incubateur ou bain d’eau, réglable à
+ 0,25 OC.
-
44 “C + 0,25 “C ou à 44,5 “C + 0,25 “C.
-
-
NOTES
6.4 pH-mètre.
3 Le même milieu peut généralement être utilise pour
les organismes coliformes et pour les organismes coli-
formes thermotolérants, mais le milieu mFC devrait être
6.5 Appareillage pour filtration sur membrane.
utilisé uniquement à 44 “C, et tes milieux Endo et Endo
LES à 35 “C ou à 37 “C.
6.6 Membranes filtrantes, généralement d’environ
4 Une période préliminaire à une température plus
47 mm ou 50 mm de diamètre, présentant des ca-
basse telle que 30 “C pendant les 4 premkes heures de
ractéristiques de filtration équivalentes à un diamè-
l’incubation est recommandée pour revivifier les organis-
tre nominal des pores de 0,45 pm. Si elles ne sont
mes choqués, en particulier pour l’examen d’eau potable.
pas livrées stériles, elles doivent être stérilisées
conformément aux instructions du fabricant.
8.3 Examen des membranes
6.7 Pinces, pour la manipulation des membranes.
8.3.1 Organismes coliformes
Examiner les membranes et considkrer comme des
7 Échantillonnage
organismes coliformes toutes les colonies, quelle
que soit leur taille, si, après incubation à 35 OC ou
Prélever les échantillons et les transmettre au la-
à 37 OC, elles présentent les caractéristiques sui-
boratoire conformément à I’ISO 8199, I’ISO 5667-1,
vantes.
I’ISO 5667-2 et VIS0 5667-3.
-
Sur gélose Iactosée au TTC et au Tergitol 7
(5.3.1): une coloration jaune, orange ou rouge
8 Mode opératoire
brique avec un halo central jaune sur le milieu
situé sous la membrane.
8.1 Préparation de l’échantillon, filtration et
ensemencement des milieux - Sur gélose Iactosée au Tergitol 7 (5.3.2): un halo
central jaune sur le milieu situé sous la mem-
Pour la préparation de l’échantillon et des dilutions, brane.
la filtration et l’ensemencement des milieux d’iso-
lement, suivre les instructions données dans - Sur le bouillon enrichi au Teepol (5.3.3): une
I’ISO 8199 et I’ISO 6887. couleur jaune s’étendant sur la membrane.
---------------------- Page: 7 ----------------------
. rP+:
ISO 9308-$:1990(F)
- Sur le bouillon au laurylsulfate (5.3.4): une colo-
Kovacs (5.5.1) confirme la présence E. coli présu-
ration jaune s’étendant sur la membrane. més.
NOTES
- Sur gélose ou bouillon endo (5.3.5): une colo-
ration rouge foncée avec un éclat métallique
5 L’utilisation d’un bouillon tryptosé au mannitol, au
vert/dor&
laurylsulfate et au tryptophane permet de prouver à la
fois la production de gaz et d’indole dans un seul tube à
- Sur gélose endo LES (5.3.6): une coloration rouge
essai.
foncée avec 6clat métallique vert/doré.
6 La recherche d’E. coli présumés est considérée
comme une indication suffisante de pollution fécale. Tou-
8.3.2 Organismes coliformes thermotolérants
tefois, d’autres essais de confirmation d’E. coli peuvent
être effectués si on le juge nécessaire (voir 8.5).
Considérer comme coliformes
organismes
7 Lorsqu’on procède à des repiquages de colonies sur
thermotolérants présumés toutes les colonies qui,
membranes dans des tubes de milieux de confirmation, il
après incubation à 44 “C, présentent les mêmes ca-
est preférable de repiquer également sur boîte de milieu
ractéristiques que celles décrites en 8.3.1. Avec le
nutritif gélose pour l’essai à l’oxydase.
milieu mFC (5.3.7), ces colonies ont une coloration
bleue.
8.5 Essai à l’oxydase
8.4 Essais de confirmation
Certaines bactéries présentes dans l’eau peuvent,
II est important de noter que les comptages de co-
à de nombreux égards, être conformes à la défini-
lonies sur membranes à 35 “C et à 44 “C n’indiquent
tion des organismes coliformes, mais elles ne peu-
que la présence d’organismes coliformes présumés.
vent produire de gaz à partir du lactose qu’à des
Dans la mesure où il n’est détecté de production de
températures inférieures à 37 OC. Elles donnent
gaz, il existe une présomption supplémentaire pour
donc des résultats négatifs lors des essais de
que les organismes que composent ces colonies
confirmation normalis& pour les organismes coli-
produisent également du gaz provenant du lactose.
formes et leur présence dans l’eau n’est donc pas
Pour l’examen des eaux non traitées ou par-
consid&ée comme significative. Les espèces
tiellement traitées, ceci peut être suffisant, mais
aéromones, qui se présentent naturellement dans
pour les réserves d’eau potable et dans d’autres
l’eau, ont une température de croissance optimale
cas, il est important d’effectuer des essais de
de l’ordre de 30 “C à 35 OC, mais peuvent néan-
confirmation, de préférence sur des cultures pures.
moins produire des acides et des gaz à partir du
lactose à 37 “C. Elles se distinguent du groupe coli-
8.4,1 Repiquage, incubation et examen
forme par une réaction à l’oxydase positive.
8.4.1 .l Organismes coliformes
8.5.1 Effectuer l’essai à l’oxydase avec des cultu-
Pour confirmer les résultats des membranes, repi- res pures d’organismes en faisant fermenter le lac-
quer chaque colonies (8.3.1) ou un nombre repré- tose, cultivées sur un milieu nutritif à la gélose,
sentatif de ces colones dans des tubes à essai comme suit:
contenant de l’eau peptonée Iactosée (5.4.1) et lais-
ser incuber à 35 “C ou à 37 “C pendant 48 h: la pro- - placer 2 à 3 gouttes de réactif à l’oxydase nou-
duction de gaz pendant cette pério
...
Questions, Comments and Discussion
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