ISO 16649-2:2001
(Main)Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of beta-glucuronidase-positive Escherichia coli — Part 2: Colony-count technique at 44 degrees C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glucuronide
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of beta-glucuronidase-positive Escherichia coli — Part 2: Colony-count technique at 44 degrees C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glucuronide
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement des Escherichia coli bêta-glucuronidase positive — Partie 2: Technique de comptage des colonies à 44 degrés C au moyen de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl bêta-D-glucuronate
La présente partie de l'ISO 16649 spécifie une méthode horizontale pour le dénombrement des Escherichia coli bêta-glucuronidase positive dans des produits alimentaires destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation des animaux. Elle utilise une technique de comptage des colonies après incubation à 44 °C sur un milieu solide contenant un substrat chromogénique pour la détection de l'enzyme bêta-glucuronidase. AVERTISSEMENT - Certaines souches d'Escherichia coli qui ne poussent pas à 44 °C et, en particulier, celles qui sont bêta-glucuronidase négative, telles que les Escherichia coli O157, ne peuvent pas être mises en évidence.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16649-2
First edition
2001-04-15
Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Horizontal method for the
enumeration of����-glucuronidase-positive
Escherichia coli —
Part 2:
Colony-count technique at 44 °C using
5-bromo-4-chloro-3-indolyl ����-D-glucuronide
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement
des Escherichia coli�-glucuronidase positive —
Partie 2: Technique de comptage des colonies à 44 °C au moyen de
5-bromo-4-chloro-3-indolyl�-D-glucuronate
Reference number
©
ISO 2001
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Tel. + 41 22 749 01 11
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Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this part of ISO 16649 may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
International Standard ISO 16649-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products,
Subcommittee SC 9, Microbiology.
ISO 16649 consists of the following parts, under the general title Microbiology of food and animal feeding stuffs —
Horizontal method for the enumeration of�-glucuronidase-positive Escherichia coli:
� Part 1: Colony-count technique at 44 °C using membranes and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl�-D-glucuronide
� Part 2: Colony-count technique at 44 °C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl�-D-glucuronide
� Part 3: Most probable number technique
Introduction
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not be appropriate in every
detail for certain products. In this case, different methods which are specific to these products may be used if
absolutely necessary for justified technical reasons. Nevertheless, every attempt should be made to apply this
horizontal method as far as possible.
When this part of ISO 16649 is next reviewed, account will be taken of all information then available regarding the
extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from this method in the
case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate and, for certain groups of products, International
Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this horizontal method. It is hoped
that when such standards are reviewed they will be changed to comply with this part of ISO 16649 so that
eventually the only remaining departures from this horizontal method will be those necessary for well-established
technical reasons.
This International Standard describes two horizontal methods (ISO 16649-1 and ISO 16649-2) for the enumeration
of�-glucuronidase-positive Escherichia coli.
The user may choose either ISO 16649-1 or ISO 16649-2. Either part is for general application. However,
ISO 16649-1 should be used for foodstuffs which may contain severely stressed cells.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16649-2:2001(E)
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal
method for the enumeration of ��-glucuronidase-positive
��
Escherichia coli —
Part 2:
Colony-count technique at 44 °C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl
��-D-glucuronide
��
1 Scope
This part of ISO 16649 specifies a horizontal method for the enumeration of �-glucuronidase-positive Escherichia
coli in products intended for human consumption or for the feeding of animals. It uses a colony-count technique
at 44 °C on a solid medium containing a chromogenic ingredient for detection of the enzyme�-glucuronidase.
WARNING — Strains of Escherichia coli which do not grow at 44 °C and, in particular, those that are
��-glucuronidase negative, such as Escherichia coli O157, will not be detected.
��
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this part of ISO 16649. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these publications
do not apply. However, parties to agreements based on this part of ISO 16649 are encouraged to investigate the
possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For undated
references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC maintain
registers of currently valid International Standards.
ISO 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial
suspension and decimal dilutions.
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General rules for microbiological examinations.
3 Terms and definitions
For the purposes of this part of ISO 16649, the following terms and definitions apply.
3.1
����-glucuronidase-positive Escherichia coli
bacteria which at 44 °C form typical blue colony on tryptone-bile-glucuronide medium (TBX) under the conditions
specified in this part of ISO 16649
3.2
enumeration of��-glucuronidase-positive Escherichia coli
��
determination of the number of colony-forming units (CFU) of�-glucuronidase-positive Escherichia coli, per millilitre
or per gram of sample, when test and calculations are carried out in accordance with this part of ISO 16649
4Principle
4.1 Duplicate plates of tryptone-bile-glucuronic medium (TBX) are inoculated with the specified quantity of the
test sample or the initial suspension.
Under the same conditions, using decimal dilutions of the test sample or of the initial suspension, two plates per
dilution are inoculated.
The dishes are incubated for 18 h to 24 h at 44 °C� 1 °C then examined to detect the presence of colonies which,
from their characteristics, are considered to be�-glucuronidase-positive Escherichia coli.
4.2 The number of colony-forming units (CFU) of �-glucuronidase-positive Escherichia coli per gram or per
millilitre of sample is calculated (see clause 10).
5 Diluent and culture media
For current laboratory practice, see ISO 7218.
5.1 Diluent
See ISO 6887-1 or the specific International Standard dealing with the product to be examined.
5.2 Culture medium: Tryptone-bile-glucuronic medium (TBX)
5.2.1 Composition
Enzymatic digest of casein 20,0 g
Bile salts No. 3 1,5 g
a
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl�-D-glucuronic acid (BCIG) 144�mol
b
3ml
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
c
Agar
9gto18 g
Water 1 000 ml
a
e.g. 0,075 g of cyclohexylammonium salt.
b
Dimethyl sulfoxide is harmful by inhalation and contact. The use of a fume
cupboard when handling is advised. Because of this toxicity, a diluent
recommended by the manufacturer may be used.
c
Depending on the gel strength of the agar.
5.2.2 Preparation
Dissolve the BCIG in the dimethyl sulfoxide or in the diluent recommended by the manufacturer. Dissolve all
components in the water and heat to boiling.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization, it is 7,2� 0,2 at 25 °C.
Sterilize the medium in the autoclave set at 121 °C for 15 min. Immediately cool the medium in the water bath (6.3)
at 44 °Cto47 °C.
2 © ISO 2001 – All rights reserved
6 Apparatus and glassware
Usual microbiological equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet sterilization (autoclave).
6.2 Incubators, capable of operating at 44 °C� 1 °C.
6.3 Water-bath, capable of being maintained at 44°Cto47 °C.
6.4 Test tubes, flasks or bottles of suitable capacity.
6.5 Pipettes or micropipettes, total delivery (blow out), having wide openings and having a nominal capacity
of 1 ml and 10 ml, graduated respectively in 0,1 ml and 0,5 ml divisions.
6.6 Petri dishes, of approximately 90 mm diameter.
6.7 pH-meter, capable of measuring to an accuracy of� 0,1 pH unit.
Its minimum measuring threshold shall be 0,01 pH unit. The pH-meter shall be equipped with either manual or
automatic temperature equalization.
7 Sampling
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this part of ISO 16649. If there is no specific International Standard,
it is recommended that the parties concerned come to an agreement on this subject.
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with the specific International Standard appropriate to the product
concerned. If there is no specific International Standard available, it is recommended that the parties concerned
come to an agreement on this subject.
9 Procedure
9.1 Test portion, initial suspension and dilutions
See ISO 6887-1 and any specific International Standard appropriate to the product.
9.2 Inoculation and incubation
9.2.1 Using a sterile pipette or a micropipette (6.5), transfer to a sterile Petri dish (6.6) 1 ml of the test sample (if
–1
liquid), or 1 ml of the initial dilution (10 ) in the case of other products.
Inoculate two plates per dilution.
Repeat the procedure with the further decimal dilutions, if necessary, using a new sterile pipette for each dilution.
9.2.2 Pour into each Petri dish approximately 15 ml of the TBX medium (5.2), previously cooled at 44°Cto 47°C
in the water bath (6.3).
Carefully mix the inoculum with the medium and allow the mixture to solidify, with the Petri dishes standing on a
cool horizontal surface.
The time which elapses between the distribution of the inoculum in a dish and pouring of the medium shall not
exceed 15 min.
9.2.3 Invert the inoculated dishes (9.2.2) so that the bottom is uppermost and place them in an incubator (6.2)
setat44 °C for 18 h to 24 h. The total incubation time shall not be longer than 24 h.
WARNING — If the presence of stressed cells is suspected, incubate for an initial period of 4 h at 37 °C,
and then raise the incubation temperature to 44 °C for 18 h to 24 h. The incubation temperature shall not
exceed 45 °C.
9.3 Counting the colony-forming units
After the specified period of incubation (9.2.3) count the typical CFU of�-glucuronidase-positive Escherichia coli in
each dish containing less than 150 typical CFU and less than 300 total (typical and non-typical) CFU.
If they form part of the retained dishes, the dishes containing 0 typical CFU should be taken into consideration in
the different calculation methods defined in clause 10.
10 Expression of results
10.1 General
The calculation in 10.2 takes into account those cases most frequently encountered when conducting tests in
accordance with good laboratory practice. Some special, fairly improbable, cases can arise (e.g. very different CFU
numbers between the two dishes from the same dilution, or very different proportions from that of the dilution factor
between the dishes from two successive dilutions). It is then necessary that the counting results be examined,
interpreted and possibly rejected by a competent microbiologist.
10.2 Calculation
For a result to be valid, in general it is considered that it is necessary to count the CFU on at least one dish
containing as a minimum 15 blue CFU.
Calculate N, the number of CFU of�-glucuronidase-positive Escherichia coli present in the test sample per millilitre
or per gram, as the weighted mean from two successive dilutions using the following equation:
a
�
N � (1)
Vn(0�,1n)d
where
a is the sum of the CFU counted on all the dishes retained from two successive dilutions, at least one of
�
which contains a minimum 15 blue CFU;
n is the number of dishes retained at the first dilution;
V is the volume of inoculum, in millilitres, applied to each dish;
4 © ISO 2001 – All rights reserved
n is the number of dishes retained at the second dilution;
d is the dilution factor corresponding to the first dilution retained [d = 1 in the case (liquid products)
where the directly inoculated test sample is retained].
Round off the results to two significant figures (see ISO 7218).
Take as the result the number of�-glucuronidase-positive Escherichia coli per
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16649-2
First edition
2001-04-15
Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Horizontal method for the
enumeration of����-glucuronidase-positive
Escherichia coli —
Part 2:
Colony-count technique at 44 °C using
5-bromo-4-chloro-3-indolyl ����-D-glucuronide
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement
des Escherichia coli�-glucuronidase positive —
Partie 2: Technique de comptage des colonies à 44 °C au moyen de
5-bromo-4-chloro-3-indolyl�-D-glucuronate
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ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
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Subcommittee SC 9, Microbiology.
ISO 16649 consists of the following parts, under the general title Microbiology of food and animal feeding stuffs —
Horizontal method for the enumeration of�-glucuronidase-positive Escherichia coli:
� Part 1: Colony-count technique at 44 °C using membranes and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl�-D-glucuronide
� Part 2: Colony-count technique at 44 °C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl�-D-glucuronide
� Part 3: Most probable number technique
Introduction
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not be appropriate in every
detail for certain products. In this case, different methods which are specific to these products may be used if
absolutely necessary for justified technical reasons. Nevertheless, every attempt should be made to apply this
horizontal method as far as possible.
When this part of ISO 16649 is next reviewed, account will be taken of all information then available regarding the
extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from this method in the
case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate and, for certain groups of products, International
Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this horizontal method. It is hoped
that when such standards are reviewed they will be changed to comply with this part of ISO 16649 so that
eventually the only remaining departures from this horizontal method will be those necessary for well-established
technical reasons.
This International Standard describes two horizontal methods (ISO 16649-1 and ISO 16649-2) for the enumeration
of�-glucuronidase-positive Escherichia coli.
The user may choose either ISO 16649-1 or ISO 16649-2. Either part is for general application. However,
ISO 16649-1 should be used for foodstuffs which may contain severely stressed cells.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16649-2:2001(E)
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal
method for the enumeration of ��-glucuronidase-positive
��
Escherichia coli —
Part 2:
Colony-count technique at 44 °C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl
��-D-glucuronide
��
1 Scope
This part of ISO 16649 specifies a horizontal method for the enumeration of �-glucuronidase-positive Escherichia
coli in products intended for human consumption or for the feeding of animals. It uses a colony-count technique
at 44 °C on a solid medium containing a chromogenic ingredient for detection of the enzyme�-glucuronidase.
WARNING — Strains of Escherichia coli which do not grow at 44 °C and, in particular, those that are
��-glucuronidase negative, such as Escherichia coli O157, will not be detected.
��
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this part of ISO 16649. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these publications
do not apply. However, parties to agreements based on this part of ISO 16649 are encouraged to investigate the
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registers of currently valid International Standards.
ISO 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial
suspension and decimal dilutions.
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General rules for microbiological examinations.
3 Terms and definitions
For the purposes of this part of ISO 16649, the following terms and definitions apply.
3.1
����-glucuronidase-positive Escherichia coli
bacteria which at 44 °C form typical blue colony on tryptone-bile-glucuronide medium (TBX) under the conditions
specified in this part of ISO 16649
3.2
enumeration of��-glucuronidase-positive Escherichia coli
��
determination of the number of colony-forming units (CFU) of�-glucuronidase-positive Escherichia coli, per millilitre
or per gram of sample, when test and calculations are carried out in accordance with this part of ISO 16649
4Principle
4.1 Duplicate plates of tryptone-bile-glucuronic medium (TBX) are inoculated with the specified quantity of the
test sample or the initial suspension.
Under the same conditions, using decimal dilutions of the test sample or of the initial suspension, two plates per
dilution are inoculated.
The dishes are incubated for 18 h to 24 h at 44 °C� 1 °C then examined to detect the presence of colonies which,
from their characteristics, are considered to be�-glucuronidase-positive Escherichia coli.
4.2 The number of colony-forming units (CFU) of �-glucuronidase-positive Escherichia coli per gram or per
millilitre of sample is calculated (see clause 10).
5 Diluent and culture media
For current laboratory practice, see ISO 7218.
5.1 Diluent
See ISO 6887-1 or the specific International Standard dealing with the product to be examined.
5.2 Culture medium: Tryptone-bile-glucuronic medium (TBX)
5.2.1 Composition
Enzymatic digest of casein 20,0 g
Bile salts No. 3 1,5 g
a
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl�-D-glucuronic acid (BCIG) 144�mol
b
3ml
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
c
Agar
9gto18 g
Water 1 000 ml
a
e.g. 0,075 g of cyclohexylammonium salt.
b
Dimethyl sulfoxide is harmful by inhalation and contact. The use of a fume
cupboard when handling is advised. Because of this toxicity, a diluent
recommended by the manufacturer may be used.
c
Depending on the gel strength of the agar.
5.2.2 Preparation
Dissolve the BCIG in the dimethyl sulfoxide or in the diluent recommended by the manufacturer. Dissolve all
components in the water and heat to boiling.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization, it is 7,2� 0,2 at 25 °C.
Sterilize the medium in the autoclave set at 121 °C for 15 min. Immediately cool the medium in the water bath (6.3)
at 44 °Cto47 °C.
2 © ISO 2001 – All rights reserved
6 Apparatus and glassware
Usual microbiological equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet sterilization (autoclave).
6.2 Incubators, capable of operating at 44 °C� 1 °C.
6.3 Water-bath, capable of being maintained at 44°Cto47 °C.
6.4 Test tubes, flasks or bottles of suitable capacity.
6.5 Pipettes or micropipettes, total delivery (blow out), having wide openings and having a nominal capacity
of 1 ml and 10 ml, graduated respectively in 0,1 ml and 0,5 ml divisions.
6.6 Petri dishes, of approximately 90 mm diameter.
6.7 pH-meter, capable of measuring to an accuracy of� 0,1 pH unit.
Its minimum measuring threshold shall be 0,01 pH unit. The pH-meter shall be equipped with either manual or
automatic temperature equalization.
7 Sampling
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this part of ISO 16649. If there is no specific International Standard,
it is recommended that the parties concerned come to an agreement on this subject.
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with the specific International Standard appropriate to the product
concerned. If there is no specific International Standard available, it is recommended that the parties concerned
come to an agreement on this subject.
9 Procedure
9.1 Test portion, initial suspension and dilutions
See ISO 6887-1 and any specific International Standard appropriate to the product.
9.2 Inoculation and incubation
9.2.1 Using a sterile pipette or a micropipette (6.5), transfer to a sterile Petri dish (6.6) 1 ml of the test sample (if
–1
liquid), or 1 ml of the initial dilution (10 ) in the case of other products.
Inoculate two plates per dilution.
Repeat the procedure with the further decimal dilutions, if necessary, using a new sterile pipette for each dilution.
9.2.2 Pour into each Petri dish approximately 15 ml of the TBX medium (5.2), previously cooled at 44°Cto 47°C
in the water bath (6.3).
Carefully mix the inoculum with the medium and allow the mixture to solidify, with the Petri dishes standing on a
cool horizontal surface.
The time which elapses between the distribution of the inoculum in a dish and pouring of the medium shall not
exceed 15 min.
9.2.3 Invert the inoculated dishes (9.2.2) so that the bottom is uppermost and place them in an incubator (6.2)
setat44 °C for 18 h to 24 h. The total incubation time shall not be longer than 24 h.
WARNING — If the presence of stressed cells is suspected, incubate for an initial period of 4 h at 37 °C,
and then raise the incubation temperature to 44 °C for 18 h to 24 h. The incubation temperature shall not
exceed 45 °C.
9.3 Counting the colony-forming units
After the specified period of incubation (9.2.3) count the typical CFU of�-glucuronidase-positive Escherichia coli in
each dish containing less than 150 typical CFU and less than 300 total (typical and non-typical) CFU.
If they form part of the retained dishes, the dishes containing 0 typical CFU should be taken into consideration in
the different calculation methods defined in clause 10.
10 Expression of results
10.1 General
The calculation in 10.2 takes into account those cases most frequently encountered when conducting tests in
accordance with good laboratory practice. Some special, fairly improbable, cases can arise (e.g. very different CFU
numbers between the two dishes from the same dilution, or very different proportions from that of the dilution factor
between the dishes from two successive dilutions). It is then necessary that the counting results be examined,
interpreted and possibly rejected by a competent microbiologist.
10.2 Calculation
For a result to be valid, in general it is considered that it is necessary to count the CFU on at least one dish
containing as a minimum 15 blue CFU.
Calculate N, the number of CFU of�-glucuronidase-positive Escherichia coli present in the test sample per millilitre
or per gram, as the weighted mean from two successive dilutions using the following equation:
a
�
N � (1)
Vn(0�,1n)d
where
a is the sum of the CFU counted on all the dishes retained from two successive dilutions, at least one of
�
which contains a minimum 15 blue CFU;
n is the number of dishes retained at the first dilution;
V is the volume of inoculum, in millilitres, applied to each dish;
4 © ISO 2001 – All rights reserved
n is the number of dishes retained at the second dilution;
d is the dilution factor corresponding to the first dilution retained [d = 1 in the case (liquid products)
where the directly inoculated test sample is retained].
Round off the results to two significant figures (see ISO 7218).
Take as the result the number of�-glucuronidase-positive Escherichia coli per
...
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INTERNATIONALE 16649-2
Première édition
2001-04-15
Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour le dénombrement des
Escherichia coli����-glucuronidase
positive —
Partie 2:
Technique de comptage des colonies à
44 °C au moyen de 5-bromo-4-chloro-
3-indolyl����-D-glucuronate
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the
enumeration of�-glucuronidase-positive Escherichia coli —
Part 2: Colony-count technique at 44 °C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl
�-D-glucuronide
Numéro de référence
©
ISO 2001
PDF – Exonération de responsabilité
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responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute responsabilité en la
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forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l’ISO à
l’adresse ci-aprèsouducomité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Case postale 56 � CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiéeaux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude aledroit de fairepartie ducomité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments delaprésente partie de l’ISO 16649 peuvent faire
l’objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
La Norme internationale ISO 16649-2 a étéélaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 9, Microbiologie.
L'ISO 16649 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Microbiologie des aliments —
Méthode horizontale pour le dénombrement des Escherichia coliβ-glucuronidase positive:
� Partie 1: Technique de comptage des colonies à 44 °C au moyen de membranes et de 5-bromo-4-chloro-
3-indolylβ-D-glucuronate
� Partie 2: Technique de comptage des colonies à 44 °C au moyen de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl
β-D-glucuronate
� Partie 3: Technique du nombre le plus probable
Introduction
En raison de la diversité des produits alimentaires, il est possible que la présente méthode horizontale ne soit pas
applicable dans tous ses détails à certains d'entre eux. Dans ce cas, des méthodes différentes, spécifiques à ces
produits, pourront être utilisées si cela s'avère absolument nécessaire pour des raisons techniques justifiées.
Néanmoins, tous les efforts doivent être faits pour appliquer cette méthode horizontale chaque fois que possible.
Lors du prochain réexamen périodique de la présente partie de l'ISO 16649, il sera tenu compte de toutes les
évolutions intervenues depuis sa publication et, notamment, dans quelle mesure la présente méthode horizontale
aura été suivie ainsi que les raisons des dérogations dans le cas de produits particuliers.
L'harmonisation de toutes les méthodes d'essai ne peut être réaliséede façon immédiate; de ce fait, il peut déjà
exister des Normes internationales et/ou nationales pour certains groupes de produits, qui ne concordent pas avec
la présente méthode horizontale. Lorsque de telles normes viendront en révision, il serait souhaitable de les aligner
avec les exigences de la présente partie de l'ISO 16649 et de ne conserver que les seules divergences justifiées
indispensables pour des raisons techniques.
La présente Norme internationale décrit deux méthodes horizontales (ISO 16649-1 et ISO 16649-2) pour le
dénombrement des Escherichia coliβ-glucuronidase positive.
L'utilisateur peut choisir aussi bien l'ISO 16649-1 que l'ISO 16649-2. Les deux parties sont d'application générale.
Toutefois, il est recommandé d'utiliser l'ISO 16649-1 pour les produits susceptibles de contenir des bactéries
sévèrement stressées.
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NORME INTERNATIONALE ISO 16649-2:2001(F)
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le
dénombrement des Escherichia coli ��-glucuronidase positive —
��
Partie 2:
Technique de comptage des colonies à 44 °Caumoyende
5-bromo-4-chloro-3-indolyl ����-D-glucuronate
1 Domaine d'application
La présente partie de l’ISO 16649 spécifie une méthode horizontale pour le dénombrement des Escherichia coli
β-glucuronidase positive dans des produits alimentaires destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation
des animaux. Elle utilise une technique de comptage des colonies après incubation à 44 °C sur un milieu solide
contenant un substrat chromogénique pour la détection de l'enzymeβ-glucuronidase.
AVERTISSEMENT — Certaines souches d'Escherichia coli qui ne poussent pas à 44 °C et, en particulier,
celles qui sont β-glucuronidase négative, telles que les Escherichia coli O157, ne peuvent pas être mises
en évidence.
2Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente partie de l'ISO 16649. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
aux accords fondés sur la présente partie de l'ISO 16649 sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les
éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s’applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur.
ISO 6887-1, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions
décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de la suspension
mère et des dilutions décimales.
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Règles générales pour les examens microbiologiques.
3 Termes et définitions
Pour les besoins de la présente partie de l'ISO 16649, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
Escherichia coliβ-glucuronidase positive
bactéries qui, à 44 °C, forment des colonies bleues caractéristiques sur le milieu tryptone-bile-glucuronide (TBX),
dans les conditions spécifiées dans la présente partie de l'ISO 16649
3.2
dénombrement des Escherichia coliβ-glucuronidase positive
détermination du nombre d’unités formant colonie (UFC) d'Escherichia coliβ-glucuronidase positive, par millilitre ou
par gramme d'échantillon, lorsque l'essai et les calculs sont effectuésselon la méthode spécifiée dans la présente
partie de l'ISO 16649
4Principe
4.1 Ensemencement en double du milieu tryptone-bile-glucuronide (TBX) avec une quantité spécifiéede
l’échantillon pour essai ou de la suspension mère.
Dans les mêmes conditions, ensemencement de deux boîtes par dilution, en utilisant les dilutions décimales
obtenues à partir de l'échantillon pour essai ou à partir de la suspension mère.
Incubation des boîtes à 44 °C� 1 °C pendant 18 h à 24 h pour détecter la présence de colonies qui, à partir de
leurs caractéristiques, sont considérées comme étant des Escherichia coliβ-glucuronidase positive.
4.2 Calcul du nombre d’UFC d'Escherichia coli β-glucuronidase positive par gramme ou par millilitre
d'échantillon, à partir du nombre de colonies caractéristiques (voir l’article 10).
5 Diluant et milieux de culture
Pour la pratique courante en laboratoire, voir l'ISO 7218.
5.1 Diluant
Voir l'ISO 6887-1 ou la Norme internationale spécifique traitant du produit à analyser.
5.2 Milieu de culture: Milieu tryptone-bile-glucuronide (TBX)
5.2.1 Composition
Digestat enzymatique de caséine 20,0 g
o
Sels biliaires N31,5g
a
Acide 5-bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-glucuronique (BCIG) 144µmol
b
Sulfoxydedediméthyle (DMSO) 3ml
c
Agar-agar 9 g à 18 g
Eau 1 000 ml
a
Soit, par exemple, 0,075 g de sel de cyclohexylammonium.
b
Le sulfoxyde de diméthyle est nocif par inhalation et contact. L'utilisation d'une
hotte fermée lors de sa manipulation est conseillée. Du fait de cette toxicité, un diluent
recommandé par le fabricant peut être utilisé.
c
Selon le pouvoir gélifiant de l’agar-agar.
5.2.2 Préparation
Dissoudre le BCIG dans le sulfoxyde de diméthyle ou dans le diluent recommandé par le fabricant. Dissoudre tous
les composants dans l'eau et porter àébullition.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'aprèsstérilisation il soit de 7,2� 0,2 à 25 °C.
Stériliser le milieu pendant 15 min à l'autoclave (6.1) régléà 121 °C. Refroidir immédiatement le milieu dans le bain
d'eau (6.3) à une température comprise entre 44 °Cet47 °C.
2 © ISO 2001 – Tous droits réservés
6 Appareillage et verrerie
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l'ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave).
6.2 Étuve,réglable à 44 °C� 1 °C.
6.3 Bain d’eau, pouvant être maintenu à une température comprise entre 44 °Cet47 °C.
6.4 Tubes à essai, bouteilles ou flacons, de capacités appropriées.
6.5 Micropipettes ou pipettes àécoulement total, à large ouverture et de capacités nominales de 1 ml et
10 ml, graduées respectivement en 0,1 ml et 0,5 ml.
6.6 Boîtes de Petri,dediamètre d’environ 90 mm.
6.7 pH-mètre, ayant une précision de lecture de� 0,1 unité pH.
Son seuil minimal de mesure doit êtrede0,01unité pH. Le pH-mètre doit être équipé d'un système de
compensation de température soit manuel soit automatique.
7 Échantillonnage
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié
pendant le transport ou le stockage.
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente partie de l’ISO 16649. S'il n'existe pas
de Norme internationale spécifique sur l’échantillonnage du produit concerné, il est recommandé aux parties
concernées de conclure un accord à ce sujet.
8Préparation de l'échantillon pour essai
Préparer l'échantillon pour essai conformément à la Norme internationale spécifique du produit concerné.S'il
n'existe pas de Norme internationale spécifique, il est recommandé aux parties concernées de conclure un accord
à ce sujet.
9 Mode opératoire
9.1 Prise d'essai, suspension mère et dilutions
Voir l'ISO 6887-1 et toute Norme internationale spécifique appropriée au produit concerné.
9.2 Ensemencement et incubation
9.2.1 À l'aide d'une pipette stérile ou d'une micropipette (6.5), transférer dans une boîte de Petri stérile (6.6) 1 ml
–1
de l'échantillon pour essai (s'il est liquide), ou 1 ml de la suspension mère (10 ) dans le cas d'autres produits.
Ensemencer deux boîtes par dilution.
Si nécessaire, répéter ces opérations avec les dilutions décimales suivantes, en utilisant une nouvelle pipette
stérile pour chaque dilution.
9.2.2 Couler dans chaque boîte de Petri environ 15 ml du milieu TBX (5.2), refroidi préalablement dans le bain
d'eau (6.3) à une température comprise entre 44 °Cet47 °C.
Mélanger soigneusement l'inoculum au milieu, et laisser le mélange se solidifier, en posant les boîtes de Petri sur
une surface horizontale fraîche.
Le temps s’écoulant entre le dépôtdel’inoculum dans la boîte de Petri et l’ajout du milieu ne doit pas dépasser
15 min.
9.2.3 Retourner les boîtes ensemencées (9.2.2) de façon que le bas soit tourné vers le haut et les placer dans
une étuve (6.2) réglée à 44 °C pendant 18 h à 24 h. Le temps total d'incubation ne doit pas être supérieur à 24 h.
AVERTISSEMENT — Si la présence de micro-organismes stressés est soupçonnée, incuber d’abord
pendant 4 h à une température de 37 °C, puis pendant 18 h à 24 h à une température de 44 °C. La
température d'incubation ne doit pas dépasser 45 °C.
9.3 Comptage des unités formant colonie (UFC)
Aprèslapériode d'incubation spécifiée (9.2.3), compter les UFC caractéristiques d'Escherichia coliβ-glucuronidase
positive dans chaque boîte contenant moins de 150 UFC caractéristiques et moins de 300 UFC au total (UFC
caractéristiques et non caractéristiques).
Si elles font partie des boîtes retenues, il convient de tenir compte des boîtes contenant 0 UFC caractéristique
dans les différentes méthodes de calcul définies à l'article 10.
10 Expression des résultats
10.1 Généralités
Le calcul défini en 10.2 tient compte des cas le plus fréquemment rencontréslors de la réalisation d'essais
conformément aux bonnes pratiques de laboratoire. Ce
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16649-2
Première édition
2001-04-15
Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour le dénombrement des
Escherichia coli����-glucuronidase
positive —
Partie 2:
Technique de comptage des colonies à
44 °C au moyen de 5-bromo-4-chloro-
3-indolyl����-D-glucuronate
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the
enumeration of�-glucuronidase-positive Escherichia coli —
Part 2: Colony-count technique at 44 °C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl
�-D-glucuronide
Numéro de référence
©
ISO 2001
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier peut
être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifiéà moins que l'ordinateur employéà cet effet ne bénéficie d'une licence autorisant
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matière.
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fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir l'exploitation de
ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation, veuillez en informer le
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Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l’ISO à
l’adresse ci-aprèsouducomité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 � CH-1211 Geneva 20
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Fax. + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.ch
Web www.iso.ch
Imprimé en Suisse
ii © ISO 2001 – Tous droits réservés
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiéeaux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude aledroit de fairepartie ducomité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments delaprésente partie de l’ISO 16649 peuvent faire
l’objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
La Norme internationale ISO 16649-2 a étéélaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 9, Microbiologie.
L'ISO 16649 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Microbiologie des aliments —
Méthode horizontale pour le dénombrement des Escherichia coliβ-glucuronidase positive:
� Partie 1: Technique de comptage des colonies à 44 °C au moyen de membranes et de 5-bromo-4-chloro-
3-indolylβ-D-glucuronate
� Partie 2: Technique de comptage des colonies à 44 °C au moyen de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl
β-D-glucuronate
� Partie 3: Technique du nombre le plus probable
Introduction
En raison de la diversité des produits alimentaires, il est possible que la présente méthode horizontale ne soit pas
applicable dans tous ses détails à certains d'entre eux. Dans ce cas, des méthodes différentes, spécifiques à ces
produits, pourront être utilisées si cela s'avère absolument nécessaire pour des raisons techniques justifiées.
Néanmoins, tous les efforts doivent être faits pour appliquer cette méthode horizontale chaque fois que possible.
Lors du prochain réexamen périodique de la présente partie de l'ISO 16649, il sera tenu compte de toutes les
évolutions intervenues depuis sa publication et, notamment, dans quelle mesure la présente méthode horizontale
aura été suivie ainsi que les raisons des dérogations dans le cas de produits particuliers.
L'harmonisation de toutes les méthodes d'essai ne peut être réaliséede façon immédiate; de ce fait, il peut déjà
exister des Normes internationales et/ou nationales pour certains groupes de produits, qui ne concordent pas avec
la présente méthode horizontale. Lorsque de telles normes viendront en révision, il serait souhaitable de les aligner
avec les exigences de la présente partie de l'ISO 16649 et de ne conserver que les seules divergences justifiées
indispensables pour des raisons techniques.
La présente Norme internationale décrit deux méthodes horizontales (ISO 16649-1 et ISO 16649-2) pour le
dénombrement des Escherichia coliβ-glucuronidase positive.
L'utilisateur peut choisir aussi bien l'ISO 16649-1 que l'ISO 16649-2. Les deux parties sont d'application générale.
Toutefois, il est recommandé d'utiliser l'ISO 16649-1 pour les produits susceptibles de contenir des bactéries
sévèrement stressées.
iv © ISO 2001 – Tous droits réservés
NORME INTERNATIONALE ISO 16649-2:2001(F)
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le
dénombrement des Escherichia coli ��-glucuronidase positive —
��
Partie 2:
Technique de comptage des colonies à 44 °Caumoyende
5-bromo-4-chloro-3-indolyl ����-D-glucuronate
1 Domaine d'application
La présente partie de l’ISO 16649 spécifie une méthode horizontale pour le dénombrement des Escherichia coli
β-glucuronidase positive dans des produits alimentaires destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation
des animaux. Elle utilise une technique de comptage des colonies après incubation à 44 °C sur un milieu solide
contenant un substrat chromogénique pour la détection de l'enzymeβ-glucuronidase.
AVERTISSEMENT — Certaines souches d'Escherichia coli qui ne poussent pas à 44 °C et, en particulier,
celles qui sont β-glucuronidase négative, telles que les Escherichia coli O157, ne peuvent pas être mises
en évidence.
2Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente partie de l'ISO 16649. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
aux accords fondés sur la présente partie de l'ISO 16649 sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les
éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s’applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur.
ISO 6887-1, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions
décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de la suspension
mère et des dilutions décimales.
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Règles générales pour les examens microbiologiques.
3 Termes et définitions
Pour les besoins de la présente partie de l'ISO 16649, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
Escherichia coliβ-glucuronidase positive
bactéries qui, à 44 °C, forment des colonies bleues caractéristiques sur le milieu tryptone-bile-glucuronide (TBX),
dans les conditions spécifiées dans la présente partie de l'ISO 16649
3.2
dénombrement des Escherichia coliβ-glucuronidase positive
détermination du nombre d’unités formant colonie (UFC) d'Escherichia coliβ-glucuronidase positive, par millilitre ou
par gramme d'échantillon, lorsque l'essai et les calculs sont effectuésselon la méthode spécifiée dans la présente
partie de l'ISO 16649
4Principe
4.1 Ensemencement en double du milieu tryptone-bile-glucuronide (TBX) avec une quantité spécifiéede
l’échantillon pour essai ou de la suspension mère.
Dans les mêmes conditions, ensemencement de deux boîtes par dilution, en utilisant les dilutions décimales
obtenues à partir de l'échantillon pour essai ou à partir de la suspension mère.
Incubation des boîtes à 44 °C� 1 °C pendant 18 h à 24 h pour détecter la présence de colonies qui, à partir de
leurs caractéristiques, sont considérées comme étant des Escherichia coliβ-glucuronidase positive.
4.2 Calcul du nombre d’UFC d'Escherichia coli β-glucuronidase positive par gramme ou par millilitre
d'échantillon, à partir du nombre de colonies caractéristiques (voir l’article 10).
5 Diluant et milieux de culture
Pour la pratique courante en laboratoire, voir l'ISO 7218.
5.1 Diluant
Voir l'ISO 6887-1 ou la Norme internationale spécifique traitant du produit à analyser.
5.2 Milieu de culture: Milieu tryptone-bile-glucuronide (TBX)
5.2.1 Composition
Digestat enzymatique de caséine 20,0 g
o
Sels biliaires N31,5g
a
Acide 5-bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-glucuronique (BCIG) 144µmol
b
Sulfoxydedediméthyle (DMSO) 3ml
c
Agar-agar 9 g à 18 g
Eau 1 000 ml
a
Soit, par exemple, 0,075 g de sel de cyclohexylammonium.
b
Le sulfoxyde de diméthyle est nocif par inhalation et contact. L'utilisation d'une
hotte fermée lors de sa manipulation est conseillée. Du fait de cette toxicité, un diluent
recommandé par le fabricant peut être utilisé.
c
Selon le pouvoir gélifiant de l’agar-agar.
5.2.2 Préparation
Dissoudre le BCIG dans le sulfoxyde de diméthyle ou dans le diluent recommandé par le fabricant. Dissoudre tous
les composants dans l'eau et porter àébullition.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'aprèsstérilisation il soit de 7,2� 0,2 à 25 °C.
Stériliser le milieu pendant 15 min à l'autoclave (6.1) régléà 121 °C. Refroidir immédiatement le milieu dans le bain
d'eau (6.3) à une température comprise entre 44 °Cet47 °C.
2 © ISO 2001 – Tous droits réservés
6 Appareillage et verrerie
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l'ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave).
6.2 Étuve,réglable à 44 °C� 1 °C.
6.3 Bain d’eau, pouvant être maintenu à une température comprise entre 44 °Cet47 °C.
6.4 Tubes à essai, bouteilles ou flacons, de capacités appropriées.
6.5 Micropipettes ou pipettes àécoulement total, à large ouverture et de capacités nominales de 1 ml et
10 ml, graduées respectivement en 0,1 ml et 0,5 ml.
6.6 Boîtes de Petri,dediamètre d’environ 90 mm.
6.7 pH-mètre, ayant une précision de lecture de� 0,1 unité pH.
Son seuil minimal de mesure doit êtrede0,01unité pH. Le pH-mètre doit être équipé d'un système de
compensation de température soit manuel soit automatique.
7 Échantillonnage
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié
pendant le transport ou le stockage.
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente partie de l’ISO 16649. S'il n'existe pas
de Norme internationale spécifique sur l’échantillonnage du produit concerné, il est recommandé aux parties
concernées de conclure un accord à ce sujet.
8Préparation de l'échantillon pour essai
Préparer l'échantillon pour essai conformément à la Norme internationale spécifique du produit concerné.S'il
n'existe pas de Norme internationale spécifique, il est recommandé aux parties concernées de conclure un accord
à ce sujet.
9 Mode opératoire
9.1 Prise d'essai, suspension mère et dilutions
Voir l'ISO 6887-1 et toute Norme internationale spécifique appropriée au produit concerné.
9.2 Ensemencement et incubation
9.2.1 À l'aide d'une pipette stérile ou d'une micropipette (6.5), transférer dans une boîte de Petri stérile (6.6) 1 ml
–1
de l'échantillon pour essai (s'il est liquide), ou 1 ml de la suspension mère (10 ) dans le cas d'autres produits.
Ensemencer deux boîtes par dilution.
Si nécessaire, répéter ces opérations avec les dilutions décimales suivantes, en utilisant une nouvelle pipette
stérile pour chaque dilution.
9.2.2 Couler dans chaque boîte de Petri environ 15 ml du milieu TBX (5.2), refroidi préalablement dans le bain
d'eau (6.3) à une température comprise entre 44 °Cet47 °C.
Mélanger soigneusement l'inoculum au milieu, et laisser le mélange se solidifier, en posant les boîtes de Petri sur
une surface horizontale fraîche.
Le temps s’écoulant entre le dépôtdel’inoculum dans la boîte de Petri et l’ajout du milieu ne doit pas dépasser
15 min.
9.2.3 Retourner les boîtes ensemencées (9.2.2) de façon que le bas soit tourné vers le haut et les placer dans
une étuve (6.2) réglée à 44 °C pendant 18 h à 24 h. Le temps total d'incubation ne doit pas être supérieur à 24 h.
AVERTISSEMENT — Si la présence de micro-organismes stressés est soupçonnée, incuber d’abord
pendant 4 h à une température de 37 °C, puis pendant 18 h à 24 h à une température de 44 °C. La
température d'incubation ne doit pas dépasser 45 °C.
9.3 Comptage des unités formant colonie (UFC)
Aprèslapériode d'incubation spécifiée (9.2.3), compter les UFC caractéristiques d'Escherichia coliβ-glucuronidase
positive dans chaque boîte contenant moins de 150 UFC caractéristiques et moins de 300 UFC au total (UFC
caractéristiques et non caractéristiques).
Si elles font partie des boîtes retenues, il convient de tenir compte des boîtes contenant 0 UFC caractéristique
dans les différentes méthodes de calcul définies à l'article 10.
10 Expression des résultats
10.1 Généralités
Le calcul défini en 10.2 tient compte des cas le plus fréquemment rencontréslors de la réalisation d'essais
conformément aux bonnes pratiques de laboratoire. Ce
...
Questions, Comments and Discussion
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