ISO 16140-4:2020

Microbiology of the food chain — Method validation — Part 4: Protocol for method validation in a single laboratory

This document specifies the general principles and the technical protocols for single-laboratory validation of methods for microbiology in the food chain. The protocols in this document only validate the method for the laboratory conducting the study. This document is applicable to single-laboratory validation of: — methods used in the analysis (detection or quantification) of microorganisms in: — products intended for human consumption; — products intended for animal feeding; — environmental samples in the area of food and feed production, handling; — samples from the primary production stage; — methods for the confirmation or typing of microorganisms. This validation will replace only the confirmation or typing procedure of a specified method (see Annex G). This document is, in particular, applicable to bacteria and fungi. Some clauses can be applicable to other (micro)organisms or their metabolites, to be determined on a case-by-case basis. Single-laboratory validation is required if an interlaboratory validation in accordance with ISO 16140-2 is not appropriate. Possible applications are: — validation of an in-house method; — method evaluation study in the validation process of a reference method in accordance with ISO 17468; — extension of the scope of an ISO 16140-2 validated method, e.g. category extension or test portion size; — modifications of existing methods. Single-laboratory validation is the second step in the standardization of a reference method (see ISO 17468). It is only applicable to methods that are fully specified with regard to all relevant parameters (including tolerances on temperatures and specifications on culture media) and that have already been optimized.

Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 4: Protocole pour la validation de méthodes dans un seul laboratoire

Le présent document établit les principes généraux ainsi que les protocoles techniques pour la validation dans un seul laboratoire des méthodes applicables à la microbiologie de la chaîne alimentaire. Les protocoles du présent document valident la méthode uniquement pour le laboratoire effectuant l'étude. Le présent document est applicable à la validation dans un seul laboratoire de: — méthodes utilisées pour l'analyse (détection ou quantification) de micro-organismes présents dans: — les produits destinés à la consommation humaine; — les produits destinés à l'alimentation animale; — les échantillons environnementaux dans les domaines de la production et de la manutention de produits alimentaires; — les échantillons au stade de la production primaire; — méthodes de confirmation ou de typage de micro-organismes. Cette validation remplacera uniquement le mode opératoire de confirmation ou de typage d'une méthode spécifiée (voir l'Annexe G). Le présent document est notamment applicable aux bactéries et aux champignons. Certains articles peuvent être applicables à d'autres (micro-)organismes ou à leurs métabolites, qui doivent être déterminés au cas par cas. La validation dans un seul laboratoire est requise si une validation interlaboratoires conformément à l'ISO 16140‑2 n'est pas appropriée. Les applications possibles sont les suivantes: — validation d'une méthode interne; — étude d'évaluation de méthode lors du processus de validation d'une méthode de référence conformément à l'ISO 17468; — extension du domaine d'application d'une méthode validée de l'ISO 16140‑2, par exemple extension de catégorie ou taille de la prise d'essai; — modifications de méthodes existantes. La validation dans un seul laboratoire est la deuxième étape de la normalisation d'une méthode de référence (voir l'ISO 17468). Elle est uniquement applicable aux méthodes qui sont intégralement spécifiées par rapport à tous les paramètres pertinents (notamment les tolérances sur les températures et les spécifications sur les milieux de culture) et qui ont déjà été optimisées.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 08-Jul-2020
• ICS: 07.100.30 - Food microbiology
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 9 - Microbiology
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 9/WG 3 - Method validation
• Current Stage: 9020 - International Standard under periodical review
• Start Date: 15-Jul-2025
• Completion Date: 15-Jul-2025

Relations

• Consolidates: ISO 4990:2015 - Steel castings — General technical delivery requirements
• Effective Date: 06-Jun-2022
• Amended By: ISO 16140-4:2020/FDAmd 2 - Microbiology of the food chain — Method validation — Part 4: Protocol for method validation in a single laboratory — Amendment 2: Protocol for single-laboratory validation of identification methods of microorganisms
• Effective Date: 04-Nov-2023
• Amended By: ISO 16140-4:2020/Amd 1:2024 - Microbiology of the food chain — Method validation — Part 4: Protocol for method validation in a single laboratory — Amendment 1: Validation of a larger test portion size for qualitative methods
• Effective Date: 06-Jun-2022
• Revised: ISO 16140:2003/Amd 1:2011 - Microbiology of food and animal feeding stuffs — Protocol for the validation of alternative methods — Amendment 1
• Effective Date: 29-Mar-2014
• Revised: ISO 16140:2003 - Microbiology of food and animal feeding stuffs — Protocol for the validation of alternative methods
• Effective Date: 29-Mar-2014

Standards Content (Sample)

DRAFT INTERNATIONAL STANDARD
ISO/DIS 16140-4
ISO/TC 34/SC 9 Secretariat: AFNOR
Voting begins on: Voting terminates on:
2017-12-15 2018-03-09
Microbiology of the food chain — Method validation —
Part 4:
Protocol for single-laboratory (in-house) method
validation
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes —
Partie 4: Protocole pour la validation de méthodes internes dans un laboratoire
ICS: 07.100.30
THIS DOCUMENT IS A DRAFT CIRCULATED
This document is circulated as received from the committee secretariat.
FOR COMMENT AND APPROVAL. IT IS
THEREFORE SUBJECT TO CHANGE AND MAY
NOT BE REFERRED TO AS AN INTERNATIONAL
STANDARD UNTIL PUBLISHED AS SUCH.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
ISO/CEN PARALLEL PROCESSING
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL,
TECHNOLOGICAL, COMMERCIAL AND
USER PURPOSES, DRAFT INTERNATIONAL
STANDARDS MAY ON OCCASION HAVE TO
BE CONSIDERED IN THE LIGHT OF THEIR
POTENTIAL TO BECOME STANDARDS TO
WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
Reference number
NATIONAL REGULATIONS.
ISO/DIS 16140-4:2017(E)
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED
TO SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS,
NOTIFICATION OF ANY RELEVANT PATENT
RIGHTS OF WHICH THEY ARE AWARE AND TO
©
PROVIDE SUPPORTING DOCUMENTATION. ISO 2017

ISO/DIS 16140-4:2017(E)
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written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
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ii © ISO 2017 – All rights reserved

ISO/DIS 16140-4:2017(E)
Contents
Foreword . 4
Introduction. 5
1 Scope . 9
2 Normative references . 9
3 Terms and definitions . 10
4 General principles of the single-laboratory method validation . 12
4.1 General . 12
4.2 Principles for factorial approach . 13
4.3 Principles for conventional approach . 13
5 Factorial approach . 14
5.1 Qualitative methods . 14
5.1.1 Single-laboratory method validation study against reference method . 14
5.1.2 Single-laboratory method validation study without a reference method . 19
5.2 Quantitative methods . 21
5.2.1 Single-laboratory method validation study against a reference method . 21
5.2.2 Single-laboratory method validation study without a reference method . 24
6 Conventional approach . 25
6.1 Qualitative methods . 25
6.1.1 Single-laboratory method validation study against reference method . 25
6.1.2 Single-laboratory method validation study without a reference method . 26
6.2 Quantitative methods . 27
6.2.1 Single-laboratory method validation study against reference method . 27
6.2.2 Single-laboratory method validation study without a reference method . 29
Annex A (normative) — List of factors for factorial study design . 32
Annex B (informative) — Single-laboratory precision study or qualitative methods . 34
Annex C (informative) — Example of a single-laboratory method validation study for a
quantitative method against a reference method . 36
C.1 Study design . 36
C.2 Calculations and summary of data . 38
C.2.1 Summary of the results . 38
C.2.2 Relative trueness . 39
C.2.2 Accuracy profile . 40
C.2.3 Precision data . 41
Annex D (informative) — Example of a single-laboratory method validation study for a qualitative
method against a reference method . 42
Annex E (informative) — Determination of precision in the case that the inoculum is unstable . 45
E.1 General . 45
E.2 Adjustment of measurement values in the case of a linear trend . 45
E.3 Adjustment of measurement values by using a reference method . 46
Bibliography . 47

ISO/DIS 16140-4:2017(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of any
patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or on
the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the World
Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL:
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology (Working Group WG 3, Method validation).
A list of all parts of the ISO 16140 series can be found on the ISO website.

ISO/DIS 16140-4:2017(E)
Introduction
The ISO 16140 series has been elaborated in response to the need for various ways to validate or verify
test methods. It is the successor of ISO 16140:2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs —
Protocol for the validation of alternative methods. ISO 16140 series consists of several parts with the
general title, Microbiology of the food chain — Method validation:
 Part 1: Vocabulary
 Part 2: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods against a reference method
 Part 3: Protocol for the verification of reference and validated alternative methods implemented in a
single laboratory
 Part 4: Protocol for single-laboratory (in-house) method validation
 Part 5: Protocol for factorial interlaboratory validation for non-proprietary methods
 Part 6: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods for microbiological
confirmation and typing procedures
ISO 17468, Microbiology of the food chain — Technical requirements and guidance on establishment or
[2]
revision of a standardized reference method , is a closely linked International Standard. This International
Standard, which establishes technical rules for the development and validation of standardized methods,
is intended for the development of standardized methods by ISO/TC 34, Food products, Subcommittee
SC 9, Microbiology and CEN/TC 275/WG 6, Microbiology of the food chain.
In general two stages are needed before a method can be used in a laboratory:
 The first stage is the validation of the method. This is either conducted in several laboratories (parts
2 and 5 of ISO 16140) or in one laboratory (part 4 of ISO 16140).
 The second stage is method verification, where a laboratory demonstrates that it can satisfactorily
perform a validated method. This is described in part 3 of ISO 16140 (method verification). In part 3,
a separation is made between verification of (food) items that are included in the validation study
and (food) items that are not tested in the validation study but belong within the scope of validation.
NOTE 1 Standardized reference methods (with and without published validation data) only require verification
before implementation in the laboratory.
NOTE 2 In this part of ISO 16140, the words ‘category’, ‘type’ and ‘item’ are sometimes combined with ‘food’ to
improve the readability of this document. However, the word ‘food’ is interchangeable with ‘feed’ and the other
areas of the food chain as mentioned in the Scope of ISO 16140-4.
Part 4 of ISO 16140 addresses validation within a single laboratory. The results are therefore only valid
in the laboratory which conducted the study. In this case, verification (part 3 of ISO 16140) is not required.
Part 5 of ISO 16140 describes protocols for situations where a more rapid validation is required or when
the method to be validated is highly specialised, and, the number of participating laboratories required
by ISO 16140-2 cannot be reached.
The flow chart in Figure 1 gives an overview of the links between the different parts mentioned above. It
also guides the users in selecting the right part of the ISO 16140 series, taking into account the purpose
of the study and the remarks given above. For this, it is important to distinguish between 'reference
ISO/DIS 16140-4:2017(E)
method' and 'standardized reference method'. A reference method is an internationally recognized and
widely accepted method (term 2.59 of ISO 16140-1:2016) and a standardized reference method is a
reference method described in a standard (term 3.5 of ISO 17468:2016). In the ISO 16140 series,
reference method includes standardized reference method. The flow diagram acknowledges that
published validation data may not be available for some standardized reference methods.

Figure 1 — Flow chart for application of the different parts of the ISO 16140-series
Part 6 of ISO 16140, is somewhat different from the other parts in the ISO 16140 series in that it relates
to a very specific situation where only the confirmation procedure of a method is validated. The
confirmation procedure advances a suspected (presumptive) result to a confirmed positive result. The
typing of pure strains (e.g. serotyping of Salmonella) is included in part 6 of ISO 16140.
An interlaboratory study, according to ISO 16140-2 (proprietary methods), requires at least
8 la
...

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16140-4
First edition
2020-07
Microbiology of the food chain —
Method validation —
Part 4:
Protocol for method validation in a
single laboratory
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes —
Partie 4: Protocole pour la validation de méthodes dans un seul
laboratoire
Reference number
©
ISO 2020
© ISO 2020
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2020 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 General principles of the single-laboratory detection or quantification method
validation . 4
4.1 General . 4
4.2 Principles of the factorial approach . 5
4.3 Principles of the conventional approach . 5
5 Technical protocol for validation — Factorial approach . 7
5.1 Qualitative methods. 7
5.1.1 Single-laboratory method validation study against a reference method . 7
5.1.2 Single-laboratory method validation study without a reference method .13
5.2 Quantitative methods .15
5.2.1 Single-laboratory method validation study against a reference method .15
5.2.2 Single-laboratory method validation study without a reference method .18
6 Technical protocol for validation — Conventional approach .19
6.1 Qualitative methods.19
6.1.1 Single-laboratory method validation study against a reference method .19
6.1.2 Single-laboratory method validation study without a reference method .20
6.2 Quantitative methods .21
6.2.1 Single-laboratory method validation study against a reference method .21
6.2.2 Single-laboratory method validation study without a reference method .23
7 Summary of acceptability limits .26
Annex A (informative) List of factors and factor levels for factorial method validation .27
Annex B (informative) Calculation of in-house reproducibility for qualitative methods
based on the LOD study described in 6.1.2.3 .29
Annex C (informative) Example of a factorial single-laboratory method validation study for
a quantitative method against a reference method .30
Annex D (informative) Example of a factorial single-laboratory method validation study for
a qualitative method against a reference method .36
Annex E (informative) Example of a factorial single-laboratory method validation study for
the variability of the LOD for a qualitative method without a reference method .40
Annex F (informative) Determination of precision if the artificially contaminated samples
are unstable .43
Annex G (informative) Protocol for single-laboratory validation of alternative methods for
microbiological confirmation and typing procedures .45
Bibliography .46
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 463, Microbiology of the food chain, in accordance with the Agreement on technical
cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
A list of all parts in the ISO 16140 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
iv © ISO 2020 – All rights reserved

Introduction
0.1  The ISO 16140 series
The ISO 16140 series has been expanded in response to the need for various ways to validate or verify
test methods. It is the successor to ISO 16140:2003. The ISO 16140 series consists of six parts with the
general title, Microbiology of the food chain — Method validation:
— Part 1: Vocabulary;
— Part 2: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods against a reference method;
— Part 3: Protocol for the verification of reference methods and validated alternative methods in a single
laboratory;
— Part 4: Protocol for method validation in a single laboratory;
— Part 5: Protocol for factorial interlaboratory validation for non-proprietary methods;
— Part 6: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods for microbiological confirmation
and typing procedures.
ISO 17468 is a closely linked International Standard, which establishes technical rules for the
development and validation of standardized methods.
In general, two stages are needed before a method can be used in a laboratory.
— The first stage is the validation of the method. Validation is conducted using a study in a single
laboratory followed by an interlaboratory study (see ISO 16140-2, ISO 16140-5 and ISO 16140-6).
In the case when a method is validated within one laboratory (as described in this document), no
interlaboratory study is conducted.
— The second stage is method verification, where a laboratory demonstrates that it can satisfactorily
perform a validated method. This is described in ISO 16140-3. Verification is only applicable to
methods that have been validated using an interlaboratory study.
In general, two types of methods are distinguished: reference methods and alternative methods.
A reference method is defined in ISO 16140-1:2016, 2.59, as an “internationally recognized and widely
accepted method”. The note to entry clarifies that “these are ISO standards and standards jointly
published by ISO and CEN or other regional/national standards of equivalent standing”.
In the ISO 16140 series, reference methods include standardized reference (ISO and CEN) methods as
defined in ISO 17468:2016, 3.5, as a “reference method described in a standard”.
An alternative method (method submitted for validation) is defined in ISO 16140-1:2016, 2.4, as a
“method of analysis that detects or quantifies, for a given category of products, the same analyte as
is detected or quantified using the corresponding reference method”. The note to entry clarifies that:
“The method can be proprietary. The term ‘alternative’ is used to refer to the entire ‘test procedure
and reaction system’. This term includes all ingredients, whether material or otherwise, required for
implementing the method.”.
This document, ISO 16140-4, addresses validation within a single laboratory. The results are therefore
only valid for the laboratory that conducted the study. In this case, verification (as described in
ISO 16140-3) is not applicable. ISO 16140-5 describes protocols for non-proprietary methods where a
more rapid validation is required or when the method to be validated is highly specialized and the
number of participating laboratories required by ISO 16140-2 cannot be reached. This document
and ISO 16140-5 can be used for validation against a reference method. This document (regarding
qualitative and quantitative methods) and ISO 16140-5 (regarding quantitative methods only) can also
be used for validation without a reference method.
The flow chart in Figure 1 gives an overview of the links between the different parts mentioned above.
It also guides the user in selecting the right part of the ISO 16140 series, taking into account the purpose
of the study and the remarks given above.
Figure 1 — Flow chart for application of the ISO 16140 series
NOTE In this document, the words “category”, “type” and/or “item” are sometimes combined with “(food)”
to improve readability. However, the word “(food)” is interchangeable with “(feed)” and other areas of the food
chain as mentioned in Clause 1.
ISO 16140-6 is somewhat different from the other parts in the ISO 16140 series in that it relates to
a very specific situation where only the confirmation procedure of a method is to be validated [e.g.
the biochemical confirmation of Enterobacteriaceae (see ISO 21528-2)]. The confirmation procedure
advances a suspected (presumptive) result to a confirmed positive result. The validation of alternative
typing techniques (e.g. serotyping of Salmonella) is also covered by ISO 16140-6. The validation study
in ISO 16140-6 clearly defines the selective agar(s) from which strains can be confirmed using the
alternative confirmation method. If successfully validated, the alternative confirmation method can
only be used if strains are recovered on an agar that was used and shown to be acceptable within the
validation study. Figure 2 shows the possibilities where an alternative confirmation method validated
in accord
...

PROJET DE NORME INTERNATIONALE
ISO/DIS 16140-4
ISO/TC 34/SC 9 Secrétariat: AFNOR
Début de vote: Vote clos le:
2017-12-15 2018-03-10
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des
méthodes —
Partie 4:
Protocole pour la validation de méthodes internes dans un
laboratoire
Microbiology of the food chain — Method validation —
Part 4: Protocol for single-laboratory (in-house) method validation
ICS: 07.100.30
CE DOCUMENT EST UN PROJET DIFFUSÉ POUR
OBSERVATIONS ET APPROBATION. IL EST DONC
SUSCEPTIBLE DE MODIFICATION ET NE PEUT
Le présent document est distribué tel qu’il est parvenu du secrétariat du comité.
ÊTRE CITÉ COMME NORME INTERNATIONALE
AVANT SA PUBLICATION EN TANT QUE TELLE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES
FINS INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET
COMMERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR
POSSIBILITÉ DE DEVENIR DES NORMES
POUVANT SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA
RÉGLEMENTATION NATIONALE.
Numéro de référence
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET
ISO/DIS 16140-4:2017(F)
SONT INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS
OBSERVATIONS, NOTIFICATION DES DROITS
DE PROPRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT
ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À
©
FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE. ISO 2017

ISO/DIS 16140-4:2017(F) ISO/DIS 16140-4

Sommaire Page
Avant-propos . v
Introduction . vi
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives .2
3 Termes et définitions .2
4 Principes généraux de la validation de méthodes dans un laboratoire .4
4.1 Généralités .4
4.2 Principes de l’approche factorielle .5
4.3 Principes de l’approche conventionnelle .6
5 Approche factorielle .8
5.1 Méthodes qualitatives .8
5.1.1 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire par rapport à une méthode de
référence .8
5.1.2 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire sans méthode de référence . 13
5.2 Méthodes quantitatives . 15
5.2.1 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire par rapport à une méthode de
référence . 15
5.2.2 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire sans méthode de référence . 18
6 Approche conventionnelle . 20
6.1 Méthodes qualitatives . 20
6.1.1 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire par rapport à une méthode de
référence . 20
6.1.2 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire sans méthode de référence . 21
6.2 Méthodes quantitatives . 22
6.2.1 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire par rapport à une méthode de
référence . 22
6.2.2 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire sans méthode de référence . 24
Annexe A (normative) Liste des facteurs relatifs au plan d’étude factoriel . 27
Annexe B (informative) Étude de fidélité dans un laboratoire pour les méthodes qualitatives . 29
Annexe C (informative) Exemple d’étude de validation de méthodes dans un laboratoire
pour une méthode quantitative par rapport à une méthode de référence . 31
C.1 Plan d’étude . 31
C.2 Calculs et résumé des données . 33
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
C.2.1 Résumé des résultats . 33
C.2.2 Justesse relative . 34
© ISO 2017
C.2.3 Profil d’exactitude . 35
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en oeuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
C.2.4 Données de fidélité . 35
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur. Annexe D (informative) Exemple d’étude de validation de méthodes dans un laboratoire
ISO copyright office pour une méthode qualitative par rapport à une méthode de référence . 36
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva, Switzerland Annexe E (informative) Détermination de la fidélité en cas d’inoculum instable . 39
Tel. [phone]
E.1 Généralités . 39
Fax [phone]
E.2 Ajustement des valeurs de mesure en cas de tendance linéaire . 39
[e-mail]
www.iso.org
Publié en Suisse
iii
ii © ISO 2017 – Tous droits réservés

ISO/DIS 16140-4
Sommaire Page
Avant-propos . v
Introduction . vi
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives .2
3 Termes et définitions .2
4 Principes généraux de la validation de méthodes dans un laboratoire .4
4.1 Généralités .4
4.2 Principes de l’approche factorielle .5
4.3 Principes de l’approche conventionnelle .6
5 Approche factorielle .8
5.1 Méthodes qualitatives .8
5.1.1 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire par rapport à une méthode de
référence .8
5.1.2 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire sans méthode de référence . 13
5.2 Méthodes quantitatives . 15
5.2.1 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire par rapport à une méthode de
référence . 15
5.2.2 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire sans méthode de référence . 18
6 Approche conventionnelle . 20
6.1 Méthodes qualitatives . 20
6.1.1 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire par rapport à une méthode de
référence . 20
6.1.2 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire sans méthode de référence . 21
6.2 Méthodes quantitatives . 22
6.2.1 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire par rapport à une méthode de
référence . 22
6.2.2 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire sans méthode de référence . 24
Annexe A (normative) Liste des facteurs relatifs au plan d’étude factoriel . 27
Annexe B (informative) Étude de fidélité dans un laboratoire pour les méthodes qualitatives . 29
Annexe C (informative) Exemple d’étude de validation de méthodes dans un laboratoire
pour une méthode quantitative par rapport à une méthode de référence . 31
C.1 Plan d’étude . 31
C.2 Calculs et résumé des données . 33
C.2.1 Résumé des résultats . 33
C.2.2 Justesse relative . 34
C.2.3 Profil d’exactitude . 35
C.2.4 Données de fidélité . 35
Annexe D (informative) Exemple d’étude de validation de méthodes dans un laboratoire
pour une méthode qualitative par rapport à une méthode de référence . 36
Annexe E (informative) Détermination de la fidélité en cas d’inoculum instable . 39
E.1 Généralités . 39
E.2 Ajustement des valeurs de mesure en cas de tendance linéaire . 39
iii
ISO/DIS 16140-4
E.3 Ajustement des valeurs de mesure à l’aide d’une méthode de référence . 40
Bibliographie . 42

iv
ISO/DIS 16140-4
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le
droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 16140-4
Première édition
2020-07
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Validation des
méthodes —
Partie 4:
Protocole pour la validation de
méthodes dans un seul laboratoire
Microbiology of the food chain — Method validation —
Part 4: Protocol for method validation in a single laboratory
Numéro de référence
©
ISO 2020
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2020
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: [phone]
E-mail: [e-mail]
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2020 – Tous droits réservés

Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 2
3 Termes et définitions . 2
4 Principes généraux de la validation dans un seul laboratoire de méthodes de
détection et de quantification. 4
4.1 Généralités . 4
4.2 Principes de l’approche factorielle . 5
4.3 Principes de l’approche conventionnelle . 6
5 Protocole technique de validation — Approche factorielle . 8
5.1 Méthodes qualitatives . 8
5.1.1 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire par rapport à
une méthode de référence . 8
5.1.2 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire sans méthode
de référence . .15
5.2 Méthodes quantitatives .18
5.2.1 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire par rapport à
une méthode de référence .18
5.2.2 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire sans méthode
de référence . .21
6 Protocole technique de validation — Approche conventionnelle .22
6.1 Méthodes qualitatives .22
6.1.1 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire par rapport à
une méthode de référence .22
6.1.2 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire sans méthode
de référence . .23
6.2 Méthodes quantitatives .24
6.2.1 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire par rapport à
une méthode de référence .24
6.2.2 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire sans méthode
de référence . .26
7 Résumé des limites d’acceptabilité .28
Annexe A (informative) Liste des facteurs et niveaux de facteurs relatifs à la validation de la
méthode factorielle .30
Annexe B (informative) Calcul de la reproductibilité interne applicable aux méthodes
qualitatives d’après l’étude LOD décrite en 6.1.2.3 .32
Annexe C (informative) Exemple d’étude factorielle de validation de méthodes dans un seul
laboratoire pour une méthode quantitative par rapport à une méthode de référence .33
Annexe D (informative) Exemple d’étude factorielle de validation de méthodes dans un
seul laboratoire pour une méthode qualitative par rapport à une méthode de référence .39
Annexe E (informative) Exemple d’étude factorielle de validation de méthodes dans seul un
laboratoire pour la variabilité du LOD d’une méthode qualitative sans méthode
de référence .43
Annexe F (informative) Détermination de la fidélité en cas d’échantillons artificiellement
contaminés instables .46
Annexe G (informative) Protocole pour la validation dans un seul laboratoire de méthodes
alternatives pour la confirmation microbiologique et le typage .48
Bibliographie .49
iv © ISO 2020 – Tous droits réservés

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 9, Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la
chaîne alimentaire, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération
technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Une liste de toutes les parties de la série ISO 16140 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
Introduction
0.1  Série ISO 16140
La série ISO 16140 a été étendue en réponse à la nécessité de disposer de différents protocoles pour la
validation ou la vérification des méthodes d’essai. Elle succède à l’ISO 16140:2003. La série ISO 16140
comprend six parties ayant le titre général, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des
méthodes:
— Partie 1: Vocabulaire;
— Partie 2: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) par rapport à une
méthode de référence;
— Partie 3: Protocole pour la vérification de méthodes de référence et de méthodes alternatives validées
dans un seul laboratoire;
— Partie 4: Protocole pour la validation de méthodes dans un seul laboratoire;
— Partie 5: Protocole pour la validation interlaboratoires de méthodes non commerciales par plan
factoriel;
— Partie 6: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) pour la confirmation
microbiologique et le typage.
L’ISO 17468 est une Norme internationale étroitement liée, qui établit les règles techniques pour le
développement et la validation de méthodes normalisées.
En général, deux étapes sont nécessaires avant de pouvoir utiliser une méthode en laboratoire.
— La première étape est la validation de la méthode. Celle-ci est effectuée à l’aide d’une étude dans
un seul laboratoire suivie d’une étude interlaboratoires (voir l’ISO 16140-2, l’ISO 16140-5 et
l’ISO 16140-6). Dans le cas où une méthode est validée dans un seul laboratoire (comme décrit dans
le présent document), aucune étude interlaboratoires n’est effectuée.
— La deuxième étape est la vérification des méthodes, au cours de laquelle un laboratoire prouve qu’il
peut effectuer une méthode validée de manière satisfaisante. Celle-ci est décrite dans l’ISO 16140-3.
La vérification est uniquement applicable aux méthodes qui ont été validées à l’aide d’une étude
interlaboratoires.
On distingue en général deux types de méthodes: les méthodes de référence et les méthodes alternatives.
Une méthode de référence est définie dans l’ISO 16140-1:2016, 2.59, comme étant une «méthode
reconnue internationalement et largement acceptée». La note à l’article clarifie que «ces normes sont
des normes ISO et des normes publiées conjointement par l’ISO et le CEN ou d’autres normes régionales/
nationales de niveau équivalent».
Dans la série ISO 16140, les méthodes de référence comprennent les méthodes de référence normalisées
(ISO et CEN) telles que définies dans l’ISO 17468:2016, 3.5, en tant que «méthode de référence décrite
dans une norme».
Une méthode alternative (méthode soumise à validation) est définie dans l’ISO 16140-1:2016, 2.4, en
tant que «méthode d’analyse permettant de détecter ou de quantifier, pour une catégorie de produits
donnée, le même analyte que celui détecté ou quantifié avec la méthode de référence correspondante».
La note à l’article clarifie que: «La méthode peut être commerciale. L’adjectif ‘alternatif’ se réfère à la
totalité du «mode opératoire d’analyse et du système réactionnel». Ce terme recouvre tous les éléments
nécessaires à la mise en œuvre de la méthode, qu’ils soient matériels ou autres.»
Le présent document, l’IS
...