Microbiology of the food chain — Method validation — Part 4: Protocol for method validation in a single laboratory

This document specifies the general principles and the technical protocols for single-laboratory validation of methods for microbiology in the food chain. The protocols in this document only validate the method for the laboratory conducting the study. This document is applicable to single-laboratory validation of: — methods used in the analysis (detection or quantification) of microorganisms in: — products intended for human consumption; — products intended for animal feeding; — environmental samples in the area of food and feed production, handling; — samples from the primary production stage; — methods for the confirmation or typing of microorganisms. This validation will replace only the confirmation or typing procedure of a specified method (see Annex G). This document is, in particular, applicable to bacteria and fungi. Some clauses can be applicable to other (micro)organisms or their metabolites, to be determined on a case-by-case basis. Single-laboratory validation is required if an interlaboratory validation in accordance with ISO 16140-2 is not appropriate. Possible applications are: — validation of an in-house method; — method evaluation study in the validation process of a reference method in accordance with ISO 17468; — extension of the scope of an ISO 16140-2 validated method, e.g. category extension or test portion size; — modifications of existing methods. Single-laboratory validation is the second step in the standardization of a reference method (see ISO 17468). It is only applicable to methods that are fully specified with regard to all relevant parameters (including tolerances on temperatures and specifications on culture media) and that have already been optimized.

Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 4: Protocole pour la validation de méthodes dans un seul laboratoire

Le présent document établit les principes généraux ainsi que les protocoles techniques pour la validation dans un seul laboratoire des méthodes applicables à la microbiologie de la chaîne alimentaire. Les protocoles du présent document valident la méthode uniquement pour le laboratoire effectuant l'étude. Le présent document est applicable à la validation dans un seul laboratoire de: — méthodes utilisées pour l'analyse (détection ou quantification) de micro-organismes présents dans: — les produits destinés à la consommation humaine; — les produits destinés à l'alimentation animale; — les échantillons environnementaux dans les domaines de la production et de la manutention de produits alimentaires; — les échantillons au stade de la production primaire; — méthodes de confirmation ou de typage de micro-organismes. Cette validation remplacera uniquement le mode opératoire de confirmation ou de typage d'une méthode spécifiée (voir l'Annexe G). Le présent document est notamment applicable aux bactéries et aux champignons. Certains articles peuvent être applicables à d'autres (micro-)organismes ou à leurs métabolites, qui doivent être déterminés au cas par cas. La validation dans un seul laboratoire est requise si une validation interlaboratoires conformément à l'ISO 16140‑2 n'est pas appropriée. Les applications possibles sont les suivantes: — validation d'une méthode interne; — étude d'évaluation de méthode lors du processus de validation d'une méthode de référence conformément à l'ISO 17468; — extension du domaine d'application d'une méthode validée de l'ISO 16140‑2, par exemple extension de catégorie ou taille de la prise d'essai; — modifications de méthodes existantes. La validation dans un seul laboratoire est la deuxième étape de la normalisation d'une méthode de référence (voir l'ISO 17468). Elle est uniquement applicable aux méthodes qui sont intégralement spécifiées par rapport à tous les paramètres pertinents (notamment les tolérances sur les températures et les spécifications sur les milieux de culture) et qui ont déjà été optimisées.

General Information

Status
Published
Publication Date
08-Jul-2020
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
25-Apr-2020
Completion Date
09-Jul-2020
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16140-4
First edition
2020-07
Microbiology of the food chain —
Method validation —
Part 4:
Protocol for method validation in a
single laboratory
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes —
Partie 4: Protocole pour la validation de méthodes dans un seul
laboratoire
Reference number
ISO 16140-4:2020(E)
ISO 2020
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 16140-4:2020(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2020

All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may

be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting

on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address

below or ISO’s member body in the country of the requester.
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CH-1214 Vernier, Geneva
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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2020 – All rights reserved
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ISO 16140-4:2020(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 2

4 General principles of the single-laboratory detection or quantification method

validation .................................................................................................................................................................................................................... 4

4.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 4

4.2 Principles of the factorial approach ...................................................................................................................................... 5

4.3 Principles of the conventional approach .......................................................................................................................... 5

5 Technical protocol for validation — Factorial approach ............................................................................................ 7

5.1 Qualitative methods............................................................................................................................................................................ 7

5.1.1 Single-laboratory method validation study against a reference method ........................ 7

5.1.2 Single-laboratory method validation study without a reference method ...................13

5.2 Quantitative methods .....................................................................................................................................................................15

5.2.1 Single-laboratory method validation study against a reference method .....................15

5.2.2 Single-laboratory method validation study without a reference method ...................18

6 Technical protocol for validation — Conventional approach .............................................................................19

6.1 Qualitative methods.........................................................................................................................................................................19

6.1.1 Single-laboratory method validation study against a reference method .....................19

6.1.2 Single-laboratory method validation study without a reference method ...................20

6.2 Quantitative methods .....................................................................................................................................................................21

6.2.1 Single-laboratory method validation study against a reference method .....................21

6.2.2 Single-laboratory method validation study without a reference method ...................23

7 Summary of acceptability limits .......................................................................................................................................................26

Annex A (informative) List of factors and factor levels for factorial method validation .............................27

Annex B (informative) Calculation of in-house reproducibility for qualitative methods

based on the LOD study described in 6.1.2.3 ..................................................................................................................29

Annex C (informative) Example of a factorial single-laboratory method validation study for

a quantitative method against a reference method ......................................................................................................30

Annex D (informative) Example of a factorial single-laboratory method validation study for

a qualitative method against a reference method ..........................................................................................................36

Annex E (informative) Example of a factorial single-laboratory method validation study for

the variability of the LOD for a qualitative method without a reference method ....................40

Annex F (informative) Determination of precision if the artificially contaminated samples

are unstable ............................................................................................................................................................................................................43

Annex G (informative) Protocol for single-laboratory validation of alternative methods for

microbiological confirmation and typing procedures ...............................................................................................45

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................46

© ISO 2020 – All rights reserved iii
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ISO 16140-4:2020(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso .org/

iso/ foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,

Microbiology, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical

Committee CEN/TC 463, Microbiology of the food chain, in accordance with the Agreement on technical

cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
A list of all parts in the ISO 16140 series can be found on the ISO website.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
iv © ISO 2020 – All rights reserved
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ISO 16140-4:2020(E)
Introduction
0.1 The ISO 16140 series

The ISO 16140 series has been expanded in response to the need for various ways to validate or verify

test methods. It is the successor to ISO 16140:2003. The ISO 16140 series consists of six parts with the

general title, Microbiology of the food chain — Method validation:
— Part 1: Vocabulary;

— Part 2: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods against a reference method;

— Part 3: Protocol for the verification of reference methods and validated alternative methods in a single

laboratory;
— Part 4: Protocol for method validation in a single laboratory;

— Part 5: Protocol for factorial interlaboratory validation for non-proprietary methods;

— Part 6: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods for microbiological confirmation

and typing procedures.

ISO 17468 is a closely linked International Standard, which establishes technical rules for the

development and validation of standardized methods.
In general, two stages are needed before a method can be used in a laboratory.

— The first stage is the validation of the method. Validation is conducted using a study in a single

laboratory followed by an interlaboratory study (see ISO 16140-2, ISO 16140-5 and ISO 16140-6).

In the case when a method is validated within one laboratory (as described in this document), no

interlaboratory study is conducted.

— The second stage is method verification, where a laboratory demonstrates that it can satisfactorily

perform a validated method. This is described in ISO 16140-3. Verification is only applicable to

methods that have been validated using an interlaboratory study.

In general, two types of methods are distinguished: reference methods and alternative methods.

A reference method is defined in ISO 16140-1:2016, 2.59, as an “internationally recognized and widely

accepted method”. The note to entry clarifies that “these are ISO standards and standards jointly

published by ISO and CEN or other regional/national standards of equivalent standing”.

In the ISO 16140 series, reference methods include standardized reference (ISO and CEN) methods as

defined in ISO 17468:2016, 3.5, as a “reference method described in a standard”.

An alternative method (method submitted for validation) is defined in ISO 16140-1:2016, 2.4, as a

“method of analysis that detects or quantifies, for a given category of products, the same analyte as

is detected or quantified using the corresponding reference method”. The note to entry clarifies that:

“The method can be proprietary. The term ‘alternative’ is used to refer to the entire ‘test procedure

and reaction system’. This term includes all ingredients, whether material or otherwise, required for

implementing the method.”.

This document, ISO 16140-4, addresses validation within a single laboratory. The results are therefore

only valid for the laboratory that conducted the study. In this case, verification (as described in

ISO 16140-3) is not applicable. ISO 16140-5 describes protocols for non-proprietary methods where a

more rapid validation is required or when the method to be validated is highly specialized and the

number of participating laboratories required by ISO 16140-2 cannot be reached. This document

and ISO 16140-5 can be used for validation against a reference method. This document (regarding

qualitative and quantitative methods) and ISO 16140-5 (regarding quantitative methods only) can also

be used for validation without a reference method.
© ISO 2020 – All rights reserved v
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ISO 16140-4:2020(E)

The flow chart in Figure 1 gives an overview of the links between the different parts mentioned above.

It also guides the user in selecting the right part of the ISO 16140 series, taking into account the purpose

of the study and the remarks given above.
Figure 1 — Flow chart for application of the ISO 16140 series

NOTE In this document, the words “category”, “type” and/or “item” are sometimes combined with “(food)”

to improve readability. However, the word “(food)” is interchangeable with “(feed)” and other areas of the food

chain as mentioned in Clause 1.

ISO 16140-6 is somewhat different from the other parts in the ISO 16140 series in that it relates to

a very specific situation where only the confirmation procedure of a method is to be validated [e.g.

the biochemical confirmation of Enterobacteriaceae (see ISO 21528-2)]. The confirmation procedure

advances a suspected (presumptive) result to a confirmed positive result. The validation of alternative

typing techniques (e.g. serotyping of Salmonella) is also covered by ISO 16140-6. The validation study

in ISO 16140-6 clearly defines the selective agar(s) from which strains can be confirmed using the

alternative confirmation method. If successfully validated, the alternative confirmation method can

only be used if strains are recovered on an agar that was used and shown to be acceptable within the

validation study. Figure 2 shows the possibilities where an alternative confirmation method validated

in accordance with ISO 16140-6 can be applied (see text in the boxes).
vi © ISO 2020 – All rights reserved
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ISO 16140-4:2020(E)
Figure 2 — Use of validated alternative confirmation methods (see ISO 16140-6)

EXAMPLE An example application of a validated alternative confirmation method is as follows.

An alternative confirmation method based on ELISA has been validated (in accordance with ISO 16140-6) to

replace the biochemical confirmation for Salmonella as described in ISO 6579-1. In the validation study, XLD

(mandatory agar in accordance with ISO 6579-1) plus BGA and a specified chromogenic agar (two optional agars

for second plating in accordance with ISO 6579-1) were used as the agars to start the confirmation. The validated

confirmation method can be used to replace the biochemical confirmation under the following conditions:

— by laboratories using the ISO 6579-1; or

— by laboratories using an ISO 16140-2 validated alternative method that refers to ISO 6579-1 for confirmation; or

— by laboratories using an ISO 16140-2 validated alternative method that starts the confirmation from XLD

and/or BGA agar and/or the specified chromogenic agar.
The validated confirmation method cannot be used under the following conditions:

— by laboratories using an ISO 16140-2 validated alternative method that refers only to agars other than those

included in the validation to start the confirmation (e.g. Hektoen agar and SS agar only); or

— by laboratories using an ISO 16140-2 validated alternative method that refers only to a confirmation

procedure that does not require isolation on agar.
0.2 Validation protocols in the ISO 16140 series

An interlaboratory validation study, in accordance with ISO 16140-2, requires at least eight laboratories

for quantitative methods and at least ten laboratories for qualitative methods. ISO 16140-5 is intended

to be used for interlaboratory studies comprising four to seven laboratories for quantitative methods

and four to nine laboratories for qualitative methods. ISO 16140-5 can only be used for non-proprietary

methods. Table 1 provides an overview of the different protocols.
© ISO 2020 – All rights reserved vii
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ISO 16140-4:2020(E)

Table 1 — Overview of different validation protocols described in the ISO 16140 series

Number of participating
With reference method Without reference method
laboratories
This document: This document:

1 — factorial (see 5.1.1 and 5.2.1), or — factorial (see 5.1.2 and 5.2.2), or

— conventional (see 6.1.1 and 6.2.1) — conventional (see 6.1.2 and 6.2.2)

4 to 7 (quantitative method)/ ISO 16140-5: for non-proprietary ISO 16140-5: for non-proprietary

4 to 9 (qualitative method) methods only quantitative methods only
≥ 8 (quantitative method)/ ISO 16140-2: for the interlaboratory
Not applicable
≥ 10 (qualitative method) study part

The aim of this document is to assess the performance of detection or quantification methods within

a single laboratory, typically across a number of (food) categories and (food) types. Single-laboratory

validation of alternative methods for microbiological confirmation and typing procedures can also

be performed under certain conditions: the general principles are the same as those described in

ISO 16140-6 for the validation of alternative (proprietary) methods for microbiological confirmation

and typing procedures (except there is no interlaboratory study). Further information is given in

Annex G.

The protocols in this document only validate the method for the particular laboratory. A generalization

to other laboratories is not within the scope of these protocols. However, extension to other laboratories

is possible if this document is used as the first phase of validation of a reference method, to be followed

by an interlaboratory study as described in ISO 17468.

If a reference method is available, the validation of a method is conducted by comparing the alternative

method to the reference method. This allows inclusion of naturally contaminated samples in the

validation process and thus provides a more realistic picture of the performance of the method. If no

reference method is available, the validation process is based on samples with known contamination

levels only. This document provides protocols for both situations.

The general principles for single-laboratory validations of detection and quantification methods are the

same as those described in ISO 16140-2 for the validation of alternative (proprietary) methods against

a reference method. This document cannot be used without ISO 16140-1 or ISO 16140-2, as many

definitions and procedures are given in these International Standards. In addition to the validation

parameters described in ISO 16140-2, this document describes the calculation of in-house repeatability

and in-house reproducibility. Calculation of these parameters is not required if an interlaboratory study

is to be conducted after the single-laboratory validation (i.e. if the single-laboratory validation is only

the first phase of validation). Reliability of performance parameters obtained with this document is

comparable to ISO 16140-2. This also means that the workload associated with the technical protocols

for the single laboratory is comparable with the method comparison study of ISO 16140-2.

This document provides two strategies for the single-laboratory method validation of detection and

quantification methods. The first strategy is based on a factorial approach while the second strategy

uses the conventional approach derived from the protocols of ISO 16140-2. In addition, protocols for the

determination of the in-house reproducibility for quantitative methods are described.

The advantages of using a factorial approach, over the conventional approach, are that it takes into

account specific conditions that the laboratory encounters during routine testing and provides more

information on the factors (technicians, culture media, etc.) that vary within the laboratory across

relevant (food) items, while using fewer samples to assess the performance of the method. The factorial

approach offers assessment of the precision of quantitative methods. It allows computation of reliable

and representative single-laboratory method validation parameters such as in-house reproducibility

standard deviation, LOD or RLOD values because it provides information on the variability of these

values under different measurement conditions. The factorial approach requires fewer test results in

order to obtain similar or higher levels of reliability compared to the conventional approach.

viii © ISO 2020 – All rights reserved
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16140-4:2020(E)
Microbiology of the food chain — Method validation —
Part 4:
Protocol for method validation in a single laboratory
1 Scope

This document specifies the general principles and the technical protocols for single-laboratory

validation of methods for microbiology in the food chain. The protocols in this document only validate

the method for the laboratory conducting the study.
This document is applicable to single-laboratory validation of:

— methods used in the analysis (detection or quantification) of microorganisms in:

— products intended for human consumption;
— products intended for animal feeding;
— environmental samples in the area of food and feed production, handling;
— samples from the primary production stage;

— methods for the confirmation or typing of microorganisms. This validation will replace only the

confirmation or typing procedure of a specified method (see Annex G).

This document is, in particular, applicable to bacteria and fungi. Some clauses can be applicable to other

(micro)organisms or their metabolites, to be determined on a case-by-case basis.

Single-laboratory validation is required if an interlaboratory validation in accordance with ISO 16140-2

is not appropriate. Possible applications are:
— validation of an in-house method;

— method evaluation study in the validation process of a reference method in accordance with

ISO 17468;

— extension of the scope of an ISO 16140-2 validated method, e.g. category extension or test portion size;

— modifications of existing methods.

Single-laboratory validation is the second step in the standardization of a reference method

(see ISO 17468). It is only applicable to methods that are fully specified with regard to all relevant

parameters (including tolerances on temperatures and specifications on culture media) and that have

already been optimized.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and

decimal dilutions for microbiological examination
© ISO 2020 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 16140-4:2020(E)

ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for

microbiological examinations

ISO 16140-1:2016, Microbiology of the food chain — Method validation — Part 1: Vocabulary

ISO 16140-2:2016, Microbiology of the food chain — Method validation — Part 2: Protocol for the validation

of alternative (proprietary) methods against a reference method
3 Terms and definitions

For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16140-1 and the following apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
block

group of settings (3.12) that are conducted in parallel or in a short time interval, and that are used for

the same samples
EXAMPLE Block = settings conducted in parallel =
technician “a” + culture medium “b” + temperature “a” + incubation condition “a”
and

technician “b” + culture medium “a” + temperature “b” + incubation condition “b”.

Note 1 to entry: This definition is based on how ISO 3534-3:2013, 3.1.25, defines “block”. In ISO 3534-3:2013,

3.1.25, the definition is more general as it is defining a block as a set of experimental units that are homogenous

in some sense. The statistical meaning is the same.
3.2
factor

qualitative or quantitative parameter within the method that can be varied at two or more levels within

the limits of the specified method
EXAMPLE Technician.

Note 1 to entry: In this document, only those factors that are in line with the protocol of the method are

considered.
3.3
factor level
value of the factors (3.2) within the experimental design
EXAMPLE Technician “a”, technician “b”, etc.

Note 1 to entry: In this document, each factor is varied at two factor levels: “a” and “b”.

Note 2 to entry: This definition is based on how ISO 3534-3:2013, 3.1.12, defines “factor level”. In ISO 3534-3:2013,

3.1.12, the definition is more general, but the statistical meaning is the same.
3.4
in-house repeatability

measurement precision under a set of in-house repeatability conditions in a specific laboratory

Note 1 to entry: In-house repeatability conditions include the same measurement procedure, same technicians,

same measuring system, same operating conditions, same location and replicate measurements on the same or

similar objects over a short period of time in a particular laboratory.
2 © ISO 2020 – All rights reserved
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 16140-4:2020(E)
3.5
in-house reproducibility

measurement precision under a set of in-house reproducibility conditions in a specific laboratory

Note 1 to entry: In-house reproducibility conditions include different technicians, different operating conditions

and replicate measurements on the same or similar objects over a longer period of time in a particular laboratory.

3.6
level of detection
LOD

measured analyte concentration, obtained by a given measurement procedure,

for which the probability of detection (3.9) is x

EXAMPLE LOD is the level of detection for which 50 % of tests give a positive result.

Note 1 to entry: The term “level of detection” is used for qualitative methods in microbiology based on replicate

analyses with three different contamination levels of the target analyte in a tested matrix. The replicates

are analysed, and the number of positive results is recorded (e.g. 20 %, 70 % and 100 %) respectively at each

contamination level. These data are then used to determine the number of cells that would give 50 % positive

using a generalized linear model (see ISO 16140-2). This differs from the procedure used for chemical and physical

methods for which a “limit of detection” is defined as the lowest quantity of an analyte that can be distinguished

from the absence of that analyte with a stated confidence level.

[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.35, modified — Note 1 to entry has been slightly modified.]

3.7
limit of quantification
LOQ
limit of determination

lowest analyte concentration that can be quantified with an acceptable level of

precision and trueness under the conditions of the test
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.36]
3.8
orthogonal design

factorial design, in which for every pair of factors (3.2), each combination of factor levels (3.3) occurs

the same number of times across the possible factor levels

Note 1 to entry: This definition is based on how ISO 3534-3:2013, 3.1.31, defines “orthogonal array”, but for

“orthogonal design”, a more general and more theoretical definition is used.
3.9
probability of detection
POD

proportion of positive analytical outcomes for a qualitative method for a given matrix at a given analyte

level or concentration

Note 1 to entry: For qualitative methods, POD represents the probability of detection.

[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.53, modified — Note 1 to entry has been added.]
3.10
relative level of detection
RLOD

level of detection (3.6) at P = 0,50 (LOD ) of the alternative (proprietary) method divided by the level of

detection at P = 0,50 (LOD ) of the reference method

Note 1 to entry: For purposes of alternative-method acceptance, the derived RLOD is checked with the

acceptability limit for conformity.
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.61]
© ISO 2020 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 16140-4:2020(E)
3.11
single-laboratory method validation
in-house method validation
establishment of the performance characteristics of a method fo
...

DRAFT INTERNATIONAL STANDARD
ISO/DIS 16140-4
ISO/TC 34/SC 9 Secretariat: AFNOR
Voting begins on: Voting terminates on:
2017-12-15 2018-03-09
Microbiology of the food chain — Method validation —
Part 4:
Protocol for single-laboratory (in-house) method
validation
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes —
Partie 4: Protocole pour la validation de méthodes internes dans un laboratoire
ICS: 07.100.30
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ISO/DIS 16140-4:2017(E)
Contents

Foreword .......................................................................................................................................................................... 4

Introduction..................................................................................................................................................................... 5

1 Scope ............................................................................................................................................................................... 9

2 Normative references ............................................................................................................................................... 9

3 Terms and definitions ........................................................................................................................................... 10

4 General principles of the single-laboratory method validation ............................................................ 12

4.1 General ................................................................................................................................................................................... 12

4.2 Principles for factorial approach ................................................................................................................................ 13

4.3 Principles for conventional approach ....................................................................................................................... 13

5 Factorial approach .................................................................................................................................................. 14

5.1 Qualitative methods ......................................................................................................................................................... 14

5.1.1 Single-laboratory method validation study against reference method ............................................. 14

5.1.2 Single-laboratory method validation study without a reference method ......................................... 19

5.2 Quantitative methods ...................................................................................................................................................... 21

5.2.1 Single-laboratory method validation study against a reference method .......................................... 21

5.2.2 Single-laboratory method validation study without a reference method ......................................... 24

6 Conventional approach ......................................................................................................................................... 25

6.1 Qualitative methods ......................................................................................................................................................... 25

6.1.1 Single-laboratory method validation study against reference method ............................................. 25

6.1.2 Single-laboratory method validation study without a reference method ......................................... 26

6.2 Quantitative methods ...................................................................................................................................................... 27

6.2.1 Single-laboratory method validation study against reference method ............................................. 27

6.2.2 Single-laboratory method validation study without a reference method ......................................... 29

Annex A (normative) — List of factors for factorial study design ............................................................. 32

Annex B (informative) — Single-laboratory precision study or qualitative methods ...................... 34

Annex C (informative) — Example of a single-laboratory method validation study for a

quantitative method against a reference method .......................................................................................... 36

C.1 Study design ........................................................................................................................................................................ 36

C.2 Calculations and summary of data ............................................................................................................................. 38

C.2.1 Summary of the results .......................................................................................................................................... 38

C.2.2 Relative trueness ...................................................................................................................................................... 39

C.2.2 Accuracy profile ......................................................................................................................................................... 40

C.2.3 Precision data ............................................................................................................................................................. 41

Annex D (informative) — Example of a single-laboratory method validation study for a qualitative

method against a reference method .................................................................................................................... 42

Annex E (informative) — Determination of precision in the case that the inoculum is unstable . 45

E.1 General ............................................................................................................................................................. 45

E.2 Adjustment of measurement values in the case of a linear trend ........................................... 45

E.3 Adjustment of measurement values by using a reference method ........................................ 46

Bibliography ................................................................................................................................................................. 47

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ISO/DIS 16140-4:2017(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO

collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of any

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the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the World

Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL:

www.iso.org/iso/foreword.html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,

Microbiology (Working Group WG 3, Method validation).
A list of all parts of the ISO 16140 series can be found on the ISO website.
© ISO 2017 – All rights reserved 4
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ISO/DIS 16140-4:2017(E)
Introduction

The ISO 16140 series has been elaborated in response to the need for various ways to validate or verify

test methods. It is the successor of ISO 16140:2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs —

Protocol for the validation of alternative methods. ISO 16140 series consists of several parts with the

general title, Microbiology of the food chain — Method validation:
 Part 1: Vocabulary

 Part 2: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods against a reference method

 Part 3: Protocol for the verification of reference and validated alternative methods implemented in a

single laboratory
 Part 4: Protocol for single-laboratory (in-house) method validation

 Part 5: Protocol for factorial interlaboratory validation for non-proprietary methods

 Part 6: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods for microbiological

confirmation and typing procedures

ISO 17468, Microbiology of the food chain — Technical requirements and guidance on establishment or

[2]

revision of a standardized reference method , is a closely linked International Standard. This International

Standard, which establishes technical rules for the development and validation of standardized methods,

is intended for the development of standardized methods by ISO/TC 34, Food products, Subcommittee

SC 9, Microbiology and CEN/TC 275/WG 6, Microbiology of the food chain.
In general two stages are needed before a method can be used in a laboratory:

 The first stage is the validation of the method. This is either conducted in several laboratories (parts

2 and 5 of ISO 16140) or in one laboratory (part 4 of ISO 16140).

 The second stage is method verification, where a laboratory demonstrates that it can satisfactorily

perform a validated method. This is described in part 3 of ISO 16140 (method verification). In part 3,

a separation is made between verification of (food) items that are included in the validation study

and (food) items that are not tested in the validation study but belong within the scope of validation.

NOTE 1 Standardized reference methods (with and without published validation data) only require verification

before implementation in the laboratory.

NOTE 2 In this part of ISO 16140, the words ‘category’, ‘type’ and ‘item’ are sometimes combined with ‘food’ to

improve the readability of this document. However, the word ‘food’ is interchangeable with ‘feed’ and the other

areas of the food chain as mentioned in the Scope of ISO 16140-4.

Part 4 of ISO 16140 addresses validation within a single laboratory. The results are therefore only valid

in the laboratory which conducted the study. In this case, verification (part 3 of ISO 16140) is not required.

Part 5 of ISO 16140 describes protocols for situations where a more rapid validation is required or when

the method to be validated is highly specialised, and, the number of participating laboratories required

by ISO 16140-2 cannot be reached.

The flow chart in Figure 1 gives an overview of the links between the different parts mentioned above. It

also guides the users in selecting the right part of the ISO 16140 series, taking into account the purpose

of the study and the remarks given above. For this, it is important to distinguish between 'reference

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ISO/DIS 16140-4:2017(E)

method' and 'standardized reference method'. A reference method is an internationally recognized and

widely accepted method (term 2.59 of ISO 16140-1:2016) and a standardized reference method is a

reference method described in a standard (term 3.5 of ISO 17468:2016). In the ISO 16140 series,

reference method includes standardized reference method. The flow diagram acknowledges that

published validation data may not be available for some standardized reference methods.

Figure 1 — Flow chart for application of the different parts of the ISO 16140-series

Part 6 of ISO 16140, is somewhat different from the other parts in the ISO 16140 series in that it relates

to a very specific situation where only the confirmation procedure of a method is validated. The

confirmation procedure advances a suspected (presumptive) result to a confirmed positive result. The

typing of pure strains (e.g. serotyping of Salmonella) is included in part 6 of ISO 16140.

An interlaboratory study, according to ISO 16140-2 (proprietary methods), requires at least

8 laboratories for quantitative methods and 10 laboratories for qualitative methods. ISO 16140-5 is

intended to be used for interlaboratory studies comprising 4-7 laboratories for quantitative methods and

4-9 laboratories for qualitative methods. ISO 16140-5 can only be used for non-proprietary methods.

Table 1 provides an overview of the different protocols.
Table 1 — Overview of different validation protocols described in ISO 16140
Number of laboratories With reference method Without reference method
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ISO/DIS 16140-4:2017(E)

1 Part 4 of ISO 16140: factorial or conventional Part 4 of ISO 16140: factorial or conventional

4 to 7 (quantitative method)/ Part 5 of ISO 16140: for non-proprietary Part 5 of ISO 16140: for non-proprietary

4 to 9 (qualitative method) methods only methods only

≥ 8 (quantitative method)/ Part 2 of ISO 16140 (for the interlaboratory Not available

≥ 10 (qualitative method) study part)

The aim of the single-laboratory validation studies described in this part of ISO 16140 is to assess the

performance of a method within a single laboratory, typically across a number of (food) categories and

(food) types. The protocols in this part of ISO 16140 only validate the method for the particular

laboratory. A generalization to other laboratories is not within the scope of these protocols. However,

extension to other laboratories is possible if ISO 16140-4 is used as the first phase of validation, followed

[2]
by an interlaboratory study as described in ISO 17468 .

The general principles and concepts for single-laboratory validations are the same as those described in

ISO 16140-2 for the validation of alternative (proprietary) methods against a reference method. Part 4

cannot be used without ISO 16140-2, as many definitions and procedures are given in part 2 of ISO 16140.

In addition to the validation parameters described in ISO 16140-2, part 4 of ISO 16140 describes the

calculation of in-house repeatability and in-house reproducibility. Calculation of these parameters is not

required if an interlaboratory study is to be conducted after the single-laboratory validation (i.e. if the

single-laboratory validation is only the first phase of validation).

This part of ISO 16140 provides two strategies for the single-laboratory method validation, using one or

more strains of the target organism. The first strategy is based on a factorial plan while the second

strategy provides method comparison designs derived from the protocols of ISO 16140-2 together with

protocols for the determination of the in-house reproducibility. Protocols are provided for qualitative

and quantitative methods with, and without, reference methods.

Factorial experiments require more experimental control and planning, but involve a smaller number of

experiments compared to the conventional approach, while at the same time providing more information

about the sources of variation. The factorial design offers several advantages. Factorial approach takes

into account the conditions a laboratory encounters during routine testing and provides more

information on the factors that vary within a laboratory (personnel, culture media, etc.) across relevant

(food) matrices, while using fewer samples to assess the performance of the method. In short, it allows

greater efficiency: fewer test results are required in order to obtain comparable levels of reliability.

Different (food) types are included and all identified influence factors are explicitly taken into

consideration and systematically varied across their respective ranges. The design offers assessment of

the precision of quantitative methods. It allows computation of reliable and representative single-

laboratory validation parameters such as in-house reproducibility standard deviation, LOD or RLOD

values because it provides information on the variability of these values under different measurement

conditions. This greatly enhances the value of the validation.

In short, it allows greater efficiency: fewer test results are required in order to obtain comparable levels

of reliability.

If a reference method is available, the validation of a method is conducted by comparing the method to

the reference method. This allows inclusion of naturally contaminated samples in the validation process

and thus provides a more realistic picture of the performance of the method. If no reference method is

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ISO/DIS 16140-4:2017(E)

available, the validation process is based on artificially contaminated samples only. Part 4 of ISO 16140

provides protocols for both situations.
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ISO/DIS 16140-4:2017(E)
Microbiology of the food chain — Method validation — Part 4:
Protocol for single-laboratory (in-house) method validation
1 Scope

This part of ISO 16140 describes the protocols for single-laboratory validation of methods for

microbiology in the food chain. The protocols in this part of ISO 16140 only validate the method for the

laboratory conducting the study.

This part of ISO 16140 is applicable to single-laboratory validation of methods used in the analysis

(detection or quantification) of microorganisms in
 products intended for human consumption,
 products intended for animal feeding,
 environmental samples in the area of food and feed production, handling, and
 samples from the primary production stage.

This part of ISO 16140 is in particular applicable to bacteria and fungi. Some clauses can be applicable to

other (micro)organisms or their metabolites, to be determined on a case-by-case-basis.

Single-laboratory validation is required if an interlaboratory validation according to ISO 16140-2 is not

appropriate, e.g. for in-house methods. Possible applications are:
 validation of new in-house method;
[2]
 the first step in the validation process according to ISO 17468 ;

 extension of the scope of an ISO 16140-2 validated method: e.g. category extension or test portion

size;
 modifications of existing methods.
[2]

Within ISO 17468 , single-laboratory validation is the first step in the standardization of a method. It

can be applied only for methods that are fully specified with regard to all relevant parameters (including

tolerances on temperatures and specifications on culture media) and which have already been optimised.

2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 6887 (series), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and

decimal dilutions for microbiological examination

ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for

microbiological examinations
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ISO/DIS 16140-4:2017(E)

ISO 16140-1:2016, Microbiology of the food chain — Method validation — Part 1: Vocabulary

ISO 16140-2:2016, Microbiology of the food chain — Method validation — Part 2: Protocol for the

validation of alternative (proprietary) methods against a reference method
3 Terms and definitions

For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16140-1 and the following

apply. ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following

addresses:
— IEC Electropedia: available at http://www.electropedia.org/
— ISO Online browsing platform: available at http://www.iso.org/obp
3.1
block

group of settings which have to be conducted in parallel or in a short time interval, and which are used

for the same samples
EXAMPLE Block = settings conducted in parallel =
Technician ‘a’ + culture medium ‘b’ + temperature ‘a’ + incubator ‘a’
AND
Technician ‘b’ + culture medium ‘a’ + temperature ‘b’ + incubator ‘b’
3.2
factor

qualitative or quantitative parameter within the method that can be varied at two or more levels within

the limits of the specified method
EXAMPLE Technician.

Note 1 to entry: In this part of ISO 16140, only those factors that are in line with the prescription of the method are

considered.
3.3
factor level
value of the factors within the experimental design
EXAMPLE Technician ‘a’, Technician ‘b’, etc.

Note 1 to entry: In this part of ISO 16140, each factor is varied at two factor levels, ‘a’ and ‘b’.

3.4
in-house repeatability

measurement precision under a set of in-house repeatability conditions of measurement in a particular

laboratory

Note 1 to entry: In-house repeatability conditions include the same measurement procedure, same technicians,

same measuring system, same operating conditions and same location, and replicate measurements on the same or

similar objects over a short period of time in a particular laboratory.
3.5
in-house reproducibility

measurement precision under a set of in-house reproducibility conditions of measurement in a particular

laboratory
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ISO/DIS 16140-4:2017(E)

Note 1 to entry: In-house reproducibility conditions include different technicians, operating conditions, and

replicate measurements on the same or similar objects over a longer period of time in a particular laboratory.

3.6
level of detection
LOD

‹qualitative methods› measured analyte concentration, obtained by a given measurement procedure, for

which the probability of detection is x

EXAMPLE LOD is the level of detection for which 50 % of tests give a positive result.

Note 1 to entry: The term 'level of detection' is used for qualitative methods in microbiology based on replicate

analyses with three different inoculation levels of the target analyte in a tested matrix. The replicates are analysed,

and the number of positive results is recorded (e.g. 20 %, 70 % and 100 %) respectively at each inoculation level.

These data are then used to determine the number of cells that would give 50 % positive using a generalised linear

model (see ISO 16140-2). This differs from the procedure used for chemical and physical methods for which a 'limit

of detection' is defined as the lowest quantity of an analyte that can be distinguished from the absence of that analyte

with a stated confidence level.
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.35]
3.7
limit of quantification
LOQ
limit of determination

‹quantitative methods› the lowest analyte concentration that can be quantified with an acceptable level

of precision and trueness under the conditions of the test
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.36]
3.8
probability of detection
POD

proportion of positive analytical outcomes for a qualitative method for a given matrix at a given analyte

level or concentration

Note 1 to entry: For qualitative methods, POD represents the probability of detection.

[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.53, modified]
3.9
relative level of detection
RLOD

level of detection at P = 0,50 (LOD ) of the alternative (proprietary) method divided by the level of

detection at P = 0,50 (LOD ) of the reference method

Note 1 to entry: For purposes of alternative-method acceptance, the derived RLOD is checked with the acceptability

limit for conformity.
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.61]
3.10
single-laboratory method validation
in-house method validation

establishment of the performance characteristics of a method for the one particular laboratory in which

the validation is conducted
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ISO/DIS 16140-4:2017(E)
3.11
setting
combination of factor levels
EXAMPLE Technician ‘a’ + culture medium ‘b’ + temperature ‘a’ + etc.

Note 1 to entry: These conditions can be described by the combination of levels of factors varied within the study.

4 General principles of the single-laboratory method validation
4.1 General

A single-laboratory method validation study is the first step in the framework of general method

validation and is needed to assess the performance of the method across a large number of (food) types

and (food) items. The second step is an interlaboratory study to assess the performance of the method

across the required number of laboratories. A single-laboratory method validation study is used to

demonstrate the performance of the method in the laboratory that conducted the study. The results are

only valid for that particular laboratory.

This part of ISO 16140 describes two approaches for single-laboratory validation.

 Factorial approach:
 performance measures derived from ISO 16140-2;
 orthogonal, factorial study design;
 more routine settings covered, less tests than conventional approach required.
 Conventional approach:
 performance measures derived from ISO 16140-2;
 step-wise procedure;
 study design derived from ISO 16140-2.

Validation procedures are dependent on whether the method is qualitative or quantitative, and on

whether a factorial or a conventional approach is chosen. The factorial single-laboratory validation

approach can only be used for a fully developed and optimised method. A conventional approach

investigates the method for one specific setting (that is one set of specific conditions under which the

method is performed). The main differences in approach for the single-laboratory validation covered in

this document are the number of various (food) items and the number of tests required to show that the

method performs adequately. Validation of methods with, and without, a reference method is possible

with the proposed protocols.

The scope of the validation procedure shall be determined at the start of the process, e.g.: validation of

[2]

in-house methods, the first step in the validation process according to ISO 17468 , extension of the scope

of an ISO 16140-2 validated method, modification of existing methods.

For methods that include a PCR detection step, an assessment of the performance characteristics for the

[3]

PCR based detection step is described in ISO 22118 . It is recommended, to start with the assessment of

[3]

the relevant performance parameters of the PCR step first (based on ISO 22118 ), followed by a

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ISO/DIS 16140-4:2017(E)

validation of the complete analytical procedure (e.g. following ISO 16140-4) to ensure the reliable

detection of the target organism in the samples tested.
The selecti
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 16140-4
Première édition
2020-07
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Validation des
méthodes —
Partie 4:
Protocole pour la validation de
méthodes dans un seul laboratoire
Microbiology of the food chain — Method validation —
Part 4: Protocol for method validation in a single laboratory
Numéro de référence
ISO 16140-4:2020(F)
ISO 2020
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ISO 16140-4:2020(F)
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être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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Publié en Suisse
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ISO 16140-4:2020(F)
Sommaire Page

Avant-propos ................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 2

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 2

4 Principes généraux de la validation dans un seul laboratoire de méthodes de

détection et de quantification................................................................................................................................................................. 4

4.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 4

4.2 Principes de l’approche factorielle ........................................................................................................................................ 5

4.3 Principes de l’approche conventionnelle ......................................................................................................................... 6

5 Protocole technique de validation — Approche factorielle ..................................................................................... 8

5.1 Méthodes qualitatives ....................................................................................................................................................................... 8

5.1.1 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire par rapport à

une méthode de référence ....................................................................................................................................... 8

5.1.2 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire sans méthode

de référence ........................................................................................................................................... ............................15

5.2 Méthodes quantitatives ................................................................................................................................................................18

5.2.1 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire par rapport à

une méthode de référence ....................................................................................................................................18

5.2.2 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire sans méthode

de référence ........................................................................................................................................... ............................21

6 Protocole technique de validation — Approche conventionnelle ..................................................................22

6.1 Méthodes qualitatives ....................................................................................................................................................................22

6.1.1 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire par rapport à

une méthode de référence ....................................................................................................................................22

6.1.2 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire sans méthode

de référence ........................................................................................................................................... ............................23

6.2 Méthodes quantitatives ................................................................................................................................................................24

6.2.1 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire par rapport à

une méthode de référence ....................................................................................................................................24

6.2.2 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire sans méthode

de référence ........................................................................................................................................... ............................26

7 Résumé des limites d’acceptabilité ................................................................................................................................................28

Annexe A (informative) Liste des facteurs et niveaux de facteurs relatifs à la validation de la

méthode factorielle ........................................................................................................................................................................................30

Annexe B (informative) Calcul de la reproductibilité interne applicable aux méthodes

qualitatives d’après l’étude LOD décrite en 6.1.2.3 ..................................................................................................32

Annexe C (informative) Exemple d’étude factorielle de validation de méthodes dans un seul

laboratoire pour une méthode quantitative par rapport à une méthode de référence ..........33

Annexe D (informative) Exemple d’étude factorielle de validation de méthodes dans un

seul laboratoire pour une méthode qualitative par rapport à une méthode de référence .39

Annexe E (informative) Exemple d’étude factorielle de validation de méthodes dans seul un

laboratoire pour la variabilité du LOD d’une méthode qualitative sans méthode

de référence ............................................................................................................................................................................................................43

Annexe F (informative) Détermination de la fidélité en cas d’échantillons artificiellement

contaminés instables ....................................................................................................................................................................................46

Annexe G (informative) Protocole pour la validation dans un seul laboratoire de méthodes

alternatives pour la confirmation microbiologique et le typage ....................................................................48

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ISO 16140-4:2020(F)

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................49

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ISO 16140-4:2020(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 9, Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la

chaîne alimentaire, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération

technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).

Une liste de toutes les parties de la série ISO 16140 se trouve sur le site web de l’ISO.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
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ISO 16140-4:2020(F)
Introduction
0.1 Série ISO 16140

La série ISO 16140 a été étendue en réponse à la nécessité de disposer de différents protocoles pour la

validation ou la vérification des méthodes d’essai. Elle succède à l’ISO 16140:2003. La série ISO 16140

comprend six parties ayant le titre général, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des

méthodes:
— Partie 1: Vocabulaire;

— Partie 2: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) par rapport à une

méthode de référence;

— Partie 3: Protocole pour la vérification de méthodes de référence et de méthodes alternatives validées

dans un seul laboratoire;
— Partie 4: Protocole pour la validation de méthodes dans un seul laboratoire;

— Partie 5: Protocole pour la validation interlaboratoires de méthodes non commerciales par plan

factoriel;

— Partie 6: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) pour la confirmation

microbiologique et le typage.

L’ISO 17468 est une Norme internationale étroitement liée, qui établit les règles techniques pour le

développement et la validation de méthodes normalisées.

En général, deux étapes sont nécessaires avant de pouvoir utiliser une méthode en laboratoire.

— La première étape est la validation de la méthode. Celle-ci est effectuée à l’aide d’une étude dans

un seul laboratoire suivie d’une étude interlaboratoires (voir l’ISO 16140-2, l’ISO 16140-5 et

l’ISO 16140-6). Dans le cas où une méthode est validée dans un seul laboratoire (comme décrit dans

le présent document), aucune étude interlaboratoires n’est effectuée.

— La deuxième étape est la vérification des méthodes, au cours de laquelle un laboratoire prouve qu’il

peut effectuer une méthode validée de manière satisfaisante. Celle-ci est décrite dans l’ISO 16140-3.

La vérification est uniquement applicable aux méthodes qui ont été validées à l’aide d’une étude

interlaboratoires.

On distingue en général deux types de méthodes: les méthodes de référence et les méthodes alternatives.

Une méthode de référence est définie dans l’ISO 16140-1:2016, 2.59, comme étant une «méthode

reconnue internationalement et largement acceptée». La note à l’article clarifie que «ces normes sont

des normes ISO et des normes publiées conjointement par l’ISO et le CEN ou d’autres normes régionales/

nationales de niveau équivalent».

Dans la série ISO 16140, les méthodes de référence comprennent les méthodes de référence normalisées

(ISO et CEN) telles que définies dans l’ISO 17468:2016, 3.5, en tant que «méthode de référence décrite

dans une norme».

Une méthode alternative (méthode soumise à validation) est définie dans l’ISO 16140-1:2016, 2.4, en

tant que «méthode d’analyse permettant de détecter ou de quantifier, pour une catégorie de produits

donnée, le même analyte que celui détecté ou quantifié avec la méthode de référence correspondante».

La note à l’article clarifie que: «La méthode peut être commerciale. L’adjectif ‘alternatif’ se réfère à la

totalité du «mode opératoire d’analyse et du système réactionnel». Ce terme recouvre tous les éléments

nécessaires à la mise en œuvre de la méthode, qu’ils soient matériels ou autres.»

Le présent document, l’ISO 16140-4, traite de la validation dans un seul laboratoire. Par conséquent, les

résultats sont uniquement valides pour le laboratoire effectuant l’étude. Dans ce cas, aucune vérification

(comme décrit dans l’ISO 16140-3) n’est applicable. L’ISO 16140-5 décrit les protocoles applicables aux

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ISO 16140-4:2020(F)

méthodes non commerciales dans lesquelles une validation plus rapide est nécessaire ou dans lesquelles

la méthode à valider est hautement spécialisée, et le nombre de laboratoires participants requis par

l’ISO 16140-2 ne peut pas être atteint. Le présent document et l’ISO 16140-5 peuvent être utilisés pour

la validation avec méthode de référence. Le présent document (pour les méthodes qualitatives et

quantitatives) et l’ISO 16140-5 (pour les méthodes quantitatives uniquement) peuvent également être

utilisés pour la validation sans méthode de référence.

Le logigramme de la Figure 1 donne une vue d’ensemble des relations entre les différentes parties

susmentionnées. Il aide également l’utilisateur à choisir la partie appropriée de la série ISO 16140, en

tenant compte de l’objectif de l’étude et des remarques énoncées ci-dessus.
Figure 1 — Logigramme relatif à l’application de la série ISO 16140

NOTE Dans le présent document, les termes «catégorie», «type» et/ou «élément» sont parfois associés au

terme «(aliment)» pour une meilleure compréhension. Cependant, le terme «(aliment)» peut être remplacé par

«(aliment pour animaux)» et par les autres secteurs de la chaîne alimentaire tels que mentionnés à l’Article 1.

L’ISO 16140-6 est quelque peu différente des autres parties de la série ISO 16140 car elle concerne une

situation très spécifique dans laquelle seul le mode opératoire de confirmation d’une méthode doit

être validé [par exemple, la confirmation biochimique des Enterobacteriaceae (voir l’ISO 21528-2)].

Le mode opératoire de confirmation modifie un résultat suspecté (présomptif) en un résultat positif

confirmé. La validation des méthodes alternatives de typage (par exemple, sérotypage de Salmonella)

est également couverte par l’ISO 16140-6. L’étude de validation de l’ISO 16140-6 définit clairement la ou

les gélose(s) sélective(s) à partir de laquelle/desquelles les souches peuvent être confirmées en utilisant

la méthode alternative de confirmation. Lorsque la méthode alternative de confirmation est validée,

elle ne peut être appliquée que si les souches sont cultivées sur une gélose utilisée et jugée acceptable

lors de l’étude de validation. La Figure 2 illustre les situations dans lesquelles une méthode alternative

de confirmation validée conformément à l’ISO 16140-6 peut être appliquée (voir le texte dans les cases).

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ISO 16140-4:2020(F)

Figure 2 — Utilisation de méthodes alternatives de confirmation (voir l’ISO 16140-6)

EXEMPLE Un exemple d’application d’une méthode alternative de confirmation validée est donné ci-après.

Une méthode alternative de confirmation fondée sur un ELISA a été validée (conformément à

l’ISO 16140-6) pour remplacer la confirmation biochimique de Salmonella tel qu’il est décrit dans

l’ISO 6579-1. Lors de l’étude de validation, la gélose XLD (gélose obligatoire conformément à l’ISO 6579-1)

ainsi que la gélose BGA et une gélose chromogène spécifiée (deux géloses facultatives pour le deuxième

ensemencement conformément à l’ISO 6579-1) ont été utilisées pour commencer la confirmation. La

méthode de confirmation validée peut être utilisée pour remplacer la confirmation biochimique dans

les conditions suivantes:
— par des laboratoires utilisant l’ISO 6579-1; ou

— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée de l’ISO 16140-2 faisant référence à

l’ISO 6579-1 pour la confirmation; ou

— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée de l’ISO 16140-2 qui commence la

confirmation avec la gélose XLD et/ou la gélose BGA et/ou la gélose chromogène spécifiée.

La méthode de confirmation validée ne peut pas être utilisée dans les conditions suivantes:

— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée selon l’ISO 16140-2 faisant uniquement

référence à des géloses autres que celles incluses dans la validation pour commencer la confirmation

(par exemple, la gélose Hektoen et la gélose SS uniquement); ou

— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée de l’ISO 16140-2 faisant uniquement

référence à un mode opératoire de confirmation ne nécessitant pas d’isolement sur gélose.

0.2 Protocoles de validation dans la série ISO 16140

Une étude de validation interlaboratoires, conformément à l’ISO 16140-2, requiert au moins

huit laboratoires pour les méthodes quantitatives et dix laboratoires pour les méthodes qualitatives.

L’ISO 16140-5 est destinée à être utilisée lors d’études interlaboratoires comprenant quatre à

sept laboratoires pour les méthodes quantitatives et quatre à neuf laboratoires pour les méthodes

qualitatives. L’ISO 16140-5 ne peut être utilisée que pour des méthodes non commerciales. Le Tableau 1

donne une vue d’ensemble des différents protocoles.
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ISO 16140-4:2020(F)

Tableau 1 — Vue d’ensemble des différents protocoles de validation décrits dans la série

ISO 16140
Nombre de laboratoires
Avec méthode de référence Sans méthode de référence
participants
Le présent document: Le présent document:

— factorielle (voir en 5.1.1 et 5.2.1), — factorielle (voir en 5.1.2 et 5.2.2)

1 ou ou
— conventionnelle (voir en 6.1.1 et — conventionnelle (voir en 6.1.2 et
6.2.1) 6.2.2)
ISO 16140-5: pour les méthodes
4 à 7 (méthode quantitative)/ ISO 16140-5: pour les méthodes non
quantitatives non commerciales
4 à 9 (méthode qualitative) commerciales uniquement
uniquement
≥ 8 (méthode quantitative)/ ISO 16140-2: pour la partie de l’étude
Non applicable
≥ 10 (méthode qualitative) interlaboratoires

L’objectif du présent document est d’évaluer la performance des méthodes de détection ou de

quantification dans un seul laboratoire, généralement dans plusieurs catégories (d’aliments) et types

(d’aliments). La validation dans un seul laboratoire des méthodes alternatives pour la confirmation

microbiologique et le typage peut également être effectuée dans certaines conditions: les principes

généraux sont les mêmes que ceux décrits dans l’ISO 16140-6 pour la validation des méthodes

alternatives (commerciales) pour la confirmation microbiologique et le typage (excepté qu’il n’y a pas

d’étude interlaboratoires). Des informations plus détaillées sont données à l’Annexe G.

Les protocoles du présent document valident la méthode uniquement pour le laboratoire concerné. Ces

protocoles ne permettent pas sa généralisation à d’autres laboratoires. Cependant, il est possible de

l’étendre à d’autres laboratoires si le présent document est utilisé comme première phase de validation

d’une méthode de référence, qui doit être suivie d’une étude interlaboratoires telle que décrite dans

l’ISO 17468.

Si une méthode de référence est disponible, la validation d’une méthode est effectuée en comparant la

méthode alternative avec la méthode de référence. Cela permet d’inclure dans le processus de validation

les échantillons naturellement contaminés et donne ainsi une image plus réaliste de la performance

de la méthode. Si aucune méthode de référence n’est disponible, le processus de validation repose

uniquement sur des échantillons dont les niveaux de contamination sont connus. Le présent document

décrit les protocoles applicables dans les deux cas.

Les principes généraux applicables aux validations dans un seul laboratoire des méthodes de détection

et de quantification sont les mêmes que ceux décrits dans l’ISO 16140-2 pour la validation de méthodes

alternatives (commerciales) par rapport à une méthode de référence. Le présent document ne peut

pas être utilisé sans l’ISO 16140-1 ou l’ISO 16140-2, car de nombreuses définitions et de nombreux

modes opératoires sont donnés dans ces Normes internationales. Outre les paramètres de validation

décrits dans l’ISO 16140-2, le présent document spécifie le calcul de la répétabilité interne et de la

reproductibilité interne. Il est inutile de calculer ces paramètres si une étude interlaboratoires doit

être effectuée après la validation dans un seul laboratoire (c’est-à-dire, si la validation dans un seul

laboratoire n’est que la première phase de la validation). La fiabilité des paramètres de performance

obtenus avec le présent document est comparable à l’ISO 16140-2. Cela signifie également que la charge

de travail associée aux protocoles techniques du laboratoire est comparable à l’étude comparative des

méthodes de l’ISO 16140-2.

Le présent document fournit deux stratégies de validation dans un seul laboratoire des méthodes de

détection et de quantification. La première stratégie repose sur une approche factorielle alors que la

seconde stratégie utilise l’approche conventionnelle extraite des protocoles de l’ISO 16140-2. En outre,

les protocoles de détermination de la reproductibilité interne pour les méthodes quantitatives sont

décrits.

Les avantages de l’utilisation d’une approche factorielle par rapport à l’approche conventionnelle sont

qu’elle tient compte des conditions spécifiques que le laboratoire rencontre pendant les essais de routine

et qu’elle fournit plus d’informations sur les facteurs (techniciens, milieux de culture, etc.) variant dans

le laboratoire pour des matrices (d’aliments) appropriées, tout en utilisant moins d’échantillons pour

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ISO 16140-4:2020(F)

évaluer la performance de la méthode. L’approche factorielle permet d’évaluer la fidélité des méthodes

quantitatives. Elle permet d’obtenir des paramètres de validation des méthodes dans un seul laboratoire

fiables et représentatifs, notamment l’écart-type de reproductibilité interne, les valeurs LOD ou

RLOD, car elle fournit des informations sur la variabilité de ces valeurs dans différentes conditions de

mesure. L’approche factorielle requiert moins de résultats d’essai pour obtenir des niveaux de fiabilité

similaires ou supérieurs à ceux obtenus avec l’approche conventionnelle.
x © ISO 2020 – Tous droits réservés
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NORME INTERNATIONALE ISO 16140-4:2020(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des
méthodes —
Partie 4:
Protocole pour la validation de méthodes dans un seul
laboratoire
1 Domaine d’application

Le présent document établit les principes généraux ainsi que les protocoles techniques pour la validation

dans un seul laboratoire des méthodes applicables à la microbiologie de la chaîne alimentaire. Les

protocoles du présent document valident la méthode uniquement pour le laboratoire effectuant l’étude.

Le présent document est applicable à la validation dans un seul laboratoire de:

— méthodes utilisées pour l’analyse (détection ou quantification) de micro-organismes présents dans:

— les produits destinés à la consommation humaine;
— les produits destinés à l’alimentation animale;

— les échantillons environnementaux dans les domaines de la production et de la manutention de

produits alimentaires;
— les échantillons au stade de la production primaire;

— méthodes de confirmation ou de typage de micro-organismes. Cette validation remplacera

uniquement le mode opératoire de confirmation ou de typage d’une méthode spécifiée (voir

l’Annexe G).

Le présent document est notamment applicable aux bactéries et aux champignons. Certains articles

peuvent être applicables à d’autres (micro-)organismes ou à leurs métabolites, qui doivent être

déterminés au cas par cas.

La validation dans un seul laboratoire est requise si une validation interlaboratoires conformément à

l’ISO 16140-2 n’est pas appropriée. Les applications possibles sont les suivantes:

— validation d’une méthode interne;

— étude d’évaluation de méthode lors du processus de validation d’une méthode de référence

conformément à l’ISO 17468;

— extension du domaine d’application d’une méthode validée de l’ISO 16140-2, par exemple extension

de catégorie ou taille de la prise d’essai;
— modifications de méthodes existantes.

La validation dans un seul laboratoire est la deuxième étape de la normalisation d’une méthode de

référence (voir l’ISO 17468). Elle est uniquement applicable aux méthodes qui sont intégralement

spécifiées par rapport à tous les paramètres pertinents (notamment les tolérances sur les températures

et les spécifications sur les milieux de culture) et qui ont déjà été optimisées.

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ISO 16140-4:2020(F)
2 Références normatives

Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur

contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.

Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les

éventuels amendements).

ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la

suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations

ISO 16140-1:2016, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 1:

Vocabulaire

ISO 16140-2:2016, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 2: Protocole

pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) par rapport à une méthode de référence

3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l’ISO 16140-1 ainsi que les

suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
3.1
bloc

groupe de configurations (3.12) qui doivent être effectuées en parallèle ou dans un court laps de temps,

et qui sont utilisées pour les mêmes échantillons
EXEMPLE Bloc = configurations effectuées en parallèle =

technicien «a» + milieu de culture «b» + température «a» + condition d’incubation «a»

technicien «b» + milieu de culture «a» + température «b» + condition d’incubation «b».

Note 1 à l'article: à l’article Cette définition repose sur la façon dont l’ISO 3534-3:2013, 3.1.25, définit le«bloc».

Dans l’ISO 3534-3:2013, 3.1.25, la définition est plus gén
...

PROJET DE NORME INTERNATIONALE
ISO/DIS 16140-4
ISO/TC 34/SC 9 Secrétariat: AFNOR
Début de vote: Vote clos le:
2017-12-15 2018-03-10
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des
méthodes —
Partie 4:
Protocole pour la validation de méthodes internes dans un
laboratoire
Microbiology of the food chain — Method validation —
Part 4: Protocol for single-laboratory (in-house) method validation
ICS: 07.100.30
CE DOCUMENT EST UN PROJET DIFFUSÉ POUR
OBSERVATIONS ET APPROBATION. IL EST DONC
SUSCEPTIBLE DE MODIFICATION ET NE PEUT

Le présent document est distribué tel qu’il est parvenu du secrétariat du comité.

ÊTRE CITÉ COMME NORME INTERNATIONALE
AVANT SA PUBLICATION EN TANT QUE TELLE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES
FINS INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET
COMMERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR
POSSIBILITÉ DE DEVENIR DES NORMES
POUVANT SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA
RÉGLEMENTATION NATIONALE.
Numéro de référence
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET
ISO/DIS 16140-4:2017(F)
SONT INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS
OBSERVATIONS, NOTIFICATION DES DROITS
DE PROPRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT
ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À
FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE. ISO 2017
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ISO/DIS 16140-4:2017(F) ISO/DIS 16140-4
Sommaire Page

Avant-propos ................................................................................................................................................................... v

Introduction ................................................................................................................................................................... vi

1 Domaine d'application ...................................................................................................................................1

2 Références normatives ..................................................................................................................................2

3 Termes et définitions .....................................................................................................................................2

4 Principes généraux de la validation de méthodes dans un laboratoire ......................................4

4.1 Généralités .........................................................................................................................................................4

4.2 Principes de l’approche factorielle ...........................................................................................................5

4.3 Principes de l’approche conventionnelle ...............................................................................................6

5 Approche factorielle .......................................................................................................................................8

5.1 Méthodes qualitatives ....................................................................................................................................8

5.1.1 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire par rapport à une méthode de

référence .............................................................................................................................................................8

5.1.2 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire sans méthode de référence ............ 13

5.2 Méthodes quantitatives .............................................................................................................................. 15

5.2.1 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire par rapport à une méthode de

référence .......................................................................................................................................................... 15

5.2.2 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire sans méthode de référence ............ 18

6 Approche conventionnelle ........................................................................................................................ 20

6.1 Méthodes qualitatives ................................................................................................................................. 20

6.1.1 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire par rapport à une méthode de

référence .......................................................................................................................................................... 20

6.1.2 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire sans méthode de référence ............ 21

6.2 Méthodes quantitatives .............................................................................................................................. 22

6.2.1 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire par rapport à une méthode de

référence .......................................................................................................................................................... 22

6.2.2 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire sans méthode de référence ............ 24

Annexe A (normative) Liste des facteurs relatifs au plan d’étude factoriel ........................................... 27

Annexe B (informative) Étude de fidélité dans un laboratoire pour les méthodes qualitatives .... 29

Annexe C (informative) Exemple d’étude de validation de méthodes dans un laboratoire

pour une méthode quantitative par rapport à une méthode de référence ............................. 31

C.1 Plan d’étude .................................................................................................................................................... 31

C.2 Calculs et résumé des données ................................................................................................................ 33

DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT

C.2.1 Résumé des résultats .................................................................................................................................. 33

C.2.2 Justesse relative ............................................................................................................................................ 34

© ISO 2017

C.2.3 Profil d’exactitude ........................................................................................................................................ 35

Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en oeuvre, aucune partie de cette

publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,

C.2.4 Données de fidélité ...................................................................................................................................... 35

y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur. Annexe D (informative) Exemple d’étude de validation de méthodes dans un laboratoire

ISO copyright office pour une méthode qualitative par rapport à une méthode de référence ................................ 36

CP 401 • Ch. de Blandonnet 8

CH-1214 Vernier, Geneva, Switzerland Annexe E (informative) Détermination de la fidélité en cas d’inoculum instable ............................... 39

Tel. +41 22 749 01 11

E.1 Généralités ...................................................................................................................................................... 39

Fax +41 22 749 09 47

E.2 Ajustement des valeurs de mesure en cas de tendance linéaire ................................................. 39

copyright@iso.org
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Publié en Suisse
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iii
ii © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO/DIS 16140-4
Sommaire Page

Avant-propos ................................................................................................................................................................... v

Introduction ................................................................................................................................................................... vi

1 Domaine d'application ...................................................................................................................................1

2 Références normatives ..................................................................................................................................2

3 Termes et définitions .....................................................................................................................................2

4 Principes généraux de la validation de méthodes dans un laboratoire ......................................4

4.1 Généralités .........................................................................................................................................................4

4.2 Principes de l’approche factorielle ...........................................................................................................5

4.3 Principes de l’approche conventionnelle ...............................................................................................6

5 Approche factorielle .......................................................................................................................................8

5.1 Méthodes qualitatives ....................................................................................................................................8

5.1.1 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire par rapport à une méthode de

référence .............................................................................................................................................................8

5.1.2 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire sans méthode de référence ............ 13

5.2 Méthodes quantitatives .............................................................................................................................. 15

5.2.1 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire par rapport à une méthode de

référence .......................................................................................................................................................... 15

5.2.2 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire sans méthode de référence ............ 18

6 Approche conventionnelle ........................................................................................................................ 20

6.1 Méthodes qualitatives ................................................................................................................................. 20

6.1.1 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire par rapport à une méthode de

référence .......................................................................................................................................................... 20

6.1.2 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire sans méthode de référence ............ 21

6.2 Méthodes quantitatives .............................................................................................................................. 22

6.2.1 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire par rapport à une méthode de

référence .......................................................................................................................................................... 22

6.2.2 Étude de validation de méthodes dans un laboratoire sans méthode de référence ............ 24

Annexe A (normative) Liste des facteurs relatifs au plan d’étude factoriel ........................................... 27

Annexe B (informative) Étude de fidélité dans un laboratoire pour les méthodes qualitatives .... 29

Annexe C (informative) Exemple d’étude de validation de méthodes dans un laboratoire

pour une méthode quantitative par rapport à une méthode de référence ............................. 31

C.1 Plan d’étude .................................................................................................................................................... 31

C.2 Calculs et résumé des données ................................................................................................................ 33

C.2.1 Résumé des résultats .................................................................................................................................. 33

C.2.2 Justesse relative ............................................................................................................................................ 34

C.2.3 Profil d’exactitude ........................................................................................................................................ 35

C.2.4 Données de fidélité ...................................................................................................................................... 35

Annexe D (informative) Exemple d’étude de validation de méthodes dans un laboratoire

pour une méthode qualitative par rapport à une méthode de référence ................................ 36

Annexe E (informative) Détermination de la fidélité en cas d’inoculum instable ............................... 39

E.1 Généralités ...................................................................................................................................................... 39

E.2 Ajustement des valeurs de mesure en cas de tendance linéaire ................................................. 39

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ISO/DIS 16140-4

E.3 Ajustement des valeurs de mesure à l’aide d’une méthode de référence ............................... 40

Bibliographie ............................................................................................................................................................... 42

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ISO/DIS 16140-4
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le

droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.

L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir

www.iso.org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet

de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour

responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails

concernant les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés

lors de l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations

de brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation

de la conformité, ou pour toute autre information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de

l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au commerce (OTC),

voir le lien suivant : www.iso.org/iso/foreword.html.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 9, Microbiologie (Groupe de travail GT 3, Validation des méthodes).

Une liste de toutes les parties de la série ISO 16140 est disponible sur le site Internet de l’ISO.

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ISO/DIS 16140-4
Introduction

La série ISO 16140 a été élaborée en réponse à la nécessité de disposer de différentes techniques de

validation ou de vérification des méthodes d’essai. Elle succède à l’ISO 16140:2003, Microbiologie des

aliments — Protocole pour la validation des méthodes alternatives. La série ISO 16140 comprend

plusieurs parties ayant le titre général Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des

méthodes :
 Partie 1 : Vocabulaire

 Partie 2 : Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) par rapport à une

méthode de référence

 Partie 3 : Protocole pour la vérification des méthodes de référence et des méthodes alternatives

validées appliquées dans un laboratoire

 Partie 4 : Protocole pour la validation de méthodes internes dans un laboratoire

 Partie 5 : Protocole pour la validation interlaboratoires de méthodes non commerciales par plan

factoriel

 Partie 6 : Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) pour la confirmation

microbiologique et le typage

L’ISO 17468, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences et recommandations techniques pour le

[2]

développement ou la révision d’une méthode de référence normalisée , est une Norme internationale

étroitement liée. La présente Norme internationale, qui établit les règles techniques pour le

développement et la validation de méthodes normalisées, est destinée au développement de méthodes

normalisées par l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie et le

CEN/TC 275/GT 6, Microbiologie de la chaîne alimentaire.

En général, deux étapes sont nécessaires avant de pouvoir utiliser une méthode en laboratoire.

 La première étape est la validation de la méthode. Celle-ci est effectuée dans plusieurs laboratoires

(parties 2 et 5 de l’ISO 16140) ou dans un laboratoire (partie 4 de l’ISO 16140).

 La deuxième étape est la vérification des méthodes, au cours de laquelle un laboratoire prouve qu’il

peut effectuer une méthode validée de manière satisfaisante. Celle-ci est décrite dans la partie 3 de

l’ISO 16140 (vérification des méthodes). Dans la partie 3, une distinction est faite entre la

vérification des éléments (d’aliments) inclus dans l’étude de validation et les produits

(alimentaires) qui ne sont pas soumis à essai dans l’étude de validation mais qui font partie du

domaine d’application de la validation.

NOTE 1 Les méthodes de référence normalisées (avec et sans données de validation publiées) doivent

seulement être vérifiées avant d’être appliquées en laboratoire.

NOTE 2 Dans la présente partie de l’ISO 16140, les termes « catégorie », « type » et « élément » sont parfois

associés au terme « aliment » pour mieux comprendre le présent document. Cependant, le terme « aliment » peut

être remplacé par « aliment pour animaux » et par les autres secteurs de la chaîne alimentaire tels que

mentionnés dans le domaine d’application de l’ISO 16140-4.
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ISO/DIS 16140-4

La partie 4 de l’ISO 16140 traite de la validation dans un seul laboratoire. Par conséquent, les résultats

sont uniquement valides dans le laboratoire effectuant l’étude. Dans ce cas, aucune vérification (partie 3

de l’ISO 16140) n’est requise.

La partie 5 de l’ISO 16140 décrit les protocoles applicables aux situations dans lesquelles une validation

plus rapide est nécessaire ou dans lesquelles la méthode à valider est hautement spécialisée, et le

nombre de laboratoires participants requis par l’ISO 16140-2 ne peut pas être atteint.

Le logigramme de la Figure 1 donne un aperçu des relations entre les différentes parties

susmentionnées. Il aide également les utilisateurs à choisir la partie appropriée de la série ISO 16140,

en tenant compte de l’objectif de l’étude et des remarques énoncées ci-dessus. Pour cela, il est

important de faire la distinction entre la « méthode de référence » et la « méthode de référence

normalisée ». Une méthode de référence est une méthode reconnue internationalement et largement

acceptée (terme 2.59 de l’ISO 16140-1:2016) et une méthode de référence normalisée est une méthode

de référence décrite dans une norme (terme 3.5 de l’ISO 17468:2016). Dans la série ISO 16140, la

méthode de référence inclut la méthode de référence normalisée. Le logigramme admet que les données

de validation publiées peuvent ne pas être disponibles pour certaines méthodes de référence

normalisées.

Figure 1 — Logigramme relatif à l’application de différentes parties de la série ISO 16140

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ISO/DIS 16140-4

La partie 6 de l’ISO 16140 est quelque peu différente des autres parties de la série ISO 16140 car elle

concerne une situation très spécifique dans laquelle seul le mode opératoire de confirmation d’une

méthode est validé. Le mode opératoire de confirmation modifie un résultat suspecté (présomptif) en

un résultat positif confirmé. Le typage de souches pures (par exemple, sérotypage de Salmonella) est

inclus dans la partie 6 de l’ISO 16140.

Une étude interlaboratoires, conformément à l’ISO 16140-2 (méthodes commerciales), requiert au

moins 8 laboratoires pour les méthodes quantitatives et 10 laboratoires pour les méthodes qualitatives.

L’ISO 16140-5 est destinée à être utilisée lors d’études interlaboratoires comprenant 4 à 7 laboratoires

pour les méthodes quantitatives et 4 à 9 laboratoires pour les méthodes qualitatives. L’ISO 16140-5 ne

peut être utilisée que pour des méthodes non commerciales. Le Tableau 1 donne un aperçu des

différents protocoles.

Tableau 1 — Aperçu des différents protocoles de validation décrits dans l’ISO 16140

Nombre de laboratoires Avec la méthode de référence Sans la méthode de référence

Partie 4 de l’ISO 16140 : factorielle ou Partie 4 de l’ISO 16140 : factorielle ou

conventionnelle conventionnelle

4 à 7 (méthode quantitative)/ 4 Partie 5 de l’ISO 16140 : pour les méthodes Partie 5 de l’ISO 16140 : pour les méthodes

à 9 (méthode qualitative) non commerciales uniquement non commerciales uniquement

≥ 8 (méthode quantitative)/ Partie 2 de l’ISO 16140 (pour la partie de
Non disponible
≥ 10 (méthode qualitative) l’étude interlaboratoires)

L’objectif des études de validation dans un laboratoire décrites dans la présente partie de l’ISO 16140

est d’évaluer la performance d’une méthode dans un seul laboratoire, généralement dans plusieurs

catégories (d’aliments) et types (d’aliments). Les protocoles décrits dans la présente partie de

l’ISO 16140 ne valident que la méthode correspondant au laboratoire concerné. Ces protocoles de

prévoient pas de la généraliser à d’autres laboratoires. Cependant, il est possible de l’étendre à d’autres

laboratoires si l’ISO 16140-4 est utilisée comme première phase de validation, suivie d’une étude

[2]
interlaboratoires telle que décrite dans l’ISO 17468 .

Les principes généraux et les concepts applicables aux validations dans un laboratoire sont les mêmes

que ceux décrits dans l’ISO 16140-2 pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) par

rapport à une méthode de référence. La partie 4 ne peut pas être utilisée dans l’ISO 16140-2, car de

nombreuses définitions et de nombreux modes opératoires sont donnés dans la partie 2 de l’ISO 16140.

Outre les paramètres de validation décrits dans l’ISO 16140-2, la partie 4 de l’ISO 16140 spécifie le

calcul de la répétabilité interne et de la reproductibilité interne. Il est inutile de calculer ces paramètres

si une étude interlaboratoires doit être effectuée après la validation dans un laboratoire (c’est-à-dire, si

la validation dans un laboratoire n’est que la première phase de la validation).

La présente partie de l’ISO 16140 énonce deux stratégies de validation des méthodes dans un

laboratoire, utilisant une ou plusieurs souches de l’organisme cible. La première stratégie repose sur un

plan factoriel alors que la seconde stratégie fournit des modèles de comparaison de méthodes extraits

des protocoles de l’ISO 16140-2 ainsi que des protocoles de détermination de la reproductibilité

interne. Les protocoles s’appliquent aux méthodes qualitative et quantitative disposant ou non de

méthodes de référence.
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ISO/DIS 16140-4

Les expériences factorielles nécessitent davantage de contrôle et de planification expérimentale, mais

impliquent un nombre d’expériences moins élevé que l’approche conventionnelle, tout en fournissant

plus d’informations sur les sources de variation. Le plan factoriel présente plusieurs avantages.

L’approche factorielle tient compte des conditions qu’un laboratoire rencontre lors des essais de

routine et fournit plus d’informations sur les facteurs variant dans un laboratoire (personnel, milieux de

culture, etc.) dans des matrices (d’aliments) appropriées. De plus, elle utilise moins d’échantillons pour

évaluer la performance de la méthode. En résumé, elle est plus efficace : un nombre moins élevé de

résultats d’essai est requis afin d’obtenir des niveaux de fiabilité comparables.

Différents types (d’aliments) sont inclus et tous les facteurs d’influence identifiés sont explicitement

pris en compte et systématiquement modifiés au sein de leurs gammes respectives. Le plan permet

d’évaluer la fidélité des méthodes quantitatives. Il permet d’obtenir des paramètres de validation dans

un laboratoire fiables et représentatifs, notamment l’écart-type de reproductibilité interne, les valeurs

LOD ou RLOD, car il fournit des informations sur la variabilité de ces valeurs dans différentes

conditions de mesure. La validation est ainsi nettement valorisée.

En résumé, elle est plus efficace : un nombre moins élevé de résultats d’essai est requis afin d’obtenir

des niveaux de fiabilité comparables.

Si une méthode de référence est disponible, la validation d’une méthode est effectuée en comparant la

méthode avec la méthode de référence. Ceci permet d’inclure dans le processus de validation les

échantillons naturellement contaminés et donne ainsi une image plus réaliste de la performance de la

méthode. Si aucune méthode de référence n’est disponible, le processus de validation repose

uniquement sur des échantillons contaminés artificiellement. La partie 4 de l’ISO 16140 décrit les

protocoles applicables dans les deux cas.
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PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 16140-4
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des
méthodes — Partie 4: Protocole pour la validation de méthodes
internes dans un laboratoire
1 Domaine d'application

La présente partie de l’ISO 16140 décrit les protocoles pour la validation de méthodes dans un

laboratoire dans le domaine de la microbiologie de la chaîne alimentaire. Les protocoles décrits dans la

présente partie de l’ISO 16140 valident la méthode uniquement pour le laboratoire effectuant l’étude.

La présente partie de l’ISO 16140 est applicable à la validation dans un laboratoire de méthodes

utilisées pour l’analyse (détection ou quantification) de micro-organismes présents dans :

 les produits destinés à la consommation humaine,
 les produits destinés à l’alimentation animale,

 les échantillons environnementaux dans le domaine de la production et de la manutention de

produits alimentaires, et
 les échantillons au stade de la production primaire.

La présente partie de l’ISO 16140 est notamment applicable aux bactéries et aux champignons. Certains

articles peuvent être applicables à d’autres (micro)organismes ou à leurs métabolites, qui doivent être

déterminés au cas par cas.

La validation dans un laboratoire est requise si une validation interlaboratoires selon l’ISO 16140-2

n’est pas appropriée, par exemple pour les méthodes internes. Les applications possibles sont les

suivantes :
 validation d’une nouvelle méthode interne ;
[2]
 première étape du processus de validation selon l’ISO 17468 ;

 extension du domaine d’application d’une méthode validée de l’ISO 16140-2 : par exemple,

extension de catégorie ou taille de la prise d’essai ;
 modifications de méthodes existantes.
[2]

Dans l’ISO 17468 , la validation dans un laboratoire est la première étape de la normalisation d’une

méthode. Elle peut uniquement s’appliquer aux méthodes qui sont intégralement spécifiées par rapport

à tous les paramètres pertinents (notamment les tolérances sur les températures et les spécifications

sur les milieux de culture) et qui ont déjà été optimisées.
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ISO/DIS 16140-4
2 Références normatives
Les documents sui
...

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