ISO 14852:1999
(Main)Determination of the ultimate aerobic biodegradability of plastic materials in an aqueous medium — Method by analysis of evolved carbon dioxide
Determination of the ultimate aerobic biodegradability of plastic materials in an aqueous medium — Method by analysis of evolved carbon dioxide
Évaluation de la biodégradabilité aérobie ultime des matériaux plastiques en milieu aqueux — Méthode par analyse du dioxyde de carbone libéré
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14852
First edition
1999-05-15
Determination of the ultimate aerobic
biodegradability of plastic materials in an
aqueous medium — Method by analysis of
evolved carbon dioxide
Évaluation de la biodégradabilité aérobie ultime des matériaux plastiques
en milieu aqueux — Méthode par analyse du dioxyde de carbone libéré
A
Reference number
ISO 14852:1999(E)
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ISO 14852:1999(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard ISO 14852 was prepared by Technical Committee ISO/TC 61, Plastics, Subcommittee SC 5,
Physical-chemical properties.
Annexes A to E of this International Standard are for information only.
© ISO 1999
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means, electronic
or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
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Internet iso@iso.ch
Printed in Switzerland
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ISO 14852:1999(E)
Introduction
With the increasing use of plastics, their recovery and disposal have become a major issue. As a first priority,
recovery should be promoted. Complete recovery of plastics, however, is difficult. For example, plastic litter, which
comes mainly from consumers, is difficult to recover completely. Additional examples of plastics which are difficult to
recover are fishing tackle, agricultural mulches and water-soluble polymers. These plastic materials tend to leak
from closed waste-management cycles into the environment. Biodegradable plastics are now emerging as one of
the options available to solve such environmental problems. Plastic materials, such as products or packaging, which
are sent to composting facilities should be potentially biodegradable. Therefore it is very important to determine the
potential biodegradability of such materials and to obtain an indication of their biodegradability in natural
environments.
iii
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Determination of the ultimate aerobic biodegradability of plastic
materials in an aqueous medium — Method by analysis of evolved
carbon dioxide
WARNING — Sewage, activated sludge, soil and compost may contain potentially pathogenic organisms.
Therefore appropriate precautions should be taken when handling them. Toxic test compounds and those
whose properties are unknown should be handled with care.
1 Scope
This International Standard specifies a method, by measuring the amount of carbon dioxide evolved, for the
determination of the degree of aerobic biodegradability of plastic materials, including those containing formulation
additives. The test material is exposed in a synthetic medium under laboratory conditions to an inoculum from
activated sludge, compost or soil.
If an unadapted activated sludge is used as the inoculum, the test simulates the biodegradation processes which
occur in a natural aqueous environment; if a mixed or pre-exposed inoculum is used, the method can be used to
investigate the potential biodegradability of a test material.
The conditions used in this International Standard do not necessarily correspond to the optimum conditions allowing
maximum biodegradation to occur, but the standard is designed to determine the potential biodegradability of plastic
materials or give an indication of their biodegradability in natural environments.
The method enables the assessment of the biodegradability to be improved by calculating a carbon balance
(optional, see annex C).
The method applies to the following materials:
Natural and/or synthetic polymers, copolymers or mixtures thereof.
Plastic materials which contain additives such as plasticizers, colorants or other compounds.
Water-soluble polymers.
Materials which, under the test conditions, do not inhibit the microorganisms present in the inoculum. Inhibitory
[2]
effects can be determined using an inhibition control or by another appropriate method (see e.g. ISO 8192 ). If
the test material is inhibitory to the inoculum, a lower test concentration, another inoculum or a pre-exposed
inoculum can be used.
2 Normative references
The following standards contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of this
International Standard. At the time of publication, the editions indicated were valid. All standards are subject to
revision, and parties to agreements based on this International Standard are encouraged to investigate the
possibility of applying the most recent editions of the standards indicated below. Members of IEC and ISO maintain
registers of currently valid International Standards.
ISO 8245:1999, Water quality — Guidelines for the determination of total organic carbon (TOC) and dissolved
organic carbon (DOC).
1
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ISO 14852:1999(E)
1)
ISO 9439:— ,
Water quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous
medium — Carbon dioxide.evolution test.
ISO 10634:1995, Water quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic
compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
ISO/TR 15462:1997, Water quality — Selection of tests for biodegradability.
3 Definitions
For the purposes of this International Standard, the following definitions apply:
3.1
ultimate aerobic biodegradation
the breakdown of an organic compound by microorganisms in the presence of oxygen into carbon dioxide, water
and mineral salts of any other elements present (mineralization) plus new biomass
3.2
activated sludge
biomass produced in the aerobic treatment of waste water by the growth of bacteria and other microorganisms in
the presence of dissolved oxygen
3.3
concentration of suspended solids in an activated sludge
the amount of solids obtained by filtration or centrifugation of a known volume of activated sludge and drying at
o
about 105 C to constant mass
3.4
dissolved inorganic carbon
DIC
that part of the inorganic carbon in water which cannot be removed by specified phase separation, for example by
-2
centrifugation at 40 000 m×s for 15 min or by membrane filtration using membranes with pores of 0,2 mm to
0,45 mm diameter
3.5
theoretical amount of evolved carbon dioxide
ThCO
2
the maximum theoretical amount of carbon dioxide evolved after completely oxidizing a chemical compound,
calculated from the molecular formula and expressed as milligrams of carbon dioxide evolved per milligram or gram
of test compound
3.6
total organic carbon
TOC
all the carbon present in organic matter which is dissolved or suspended in water
3.7
dissolved organic carbon
DOC
that part of the organic carbon in water which cannot be removed by specified phase separation, for example by
-2
centrifugation at 40 000 m⋅s for 15 min or by membrane filtration using membranes with pores of 0,2 mm to
0,45 mm diameter
1)
To be published. (Revision of ISO 9439:1990)
2
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3.8
lag phase
the time, measured in days, from the start of a test until adaptation and/or selection of the degrading
microorganisms is achieved and the degree of biodegradation of a chemical compound or organic matter has
increased to about 10 % of the maximum level of biodegradation
3.9
maximum level of biodegradation
the degree of biodegradation, measured in per cent, of a chemical compound or organic matter in a test, above
which no further biodegradation takes place during the test
3.10
biodegradation phase
the time, measured in days, from the end of the lag phase of a test until about 90 % of the maximum level of
biodegradation has been reached
3.11
plateau phase
the time, measured in days, from the end of the biodegradation phase until the end of a test
3.12
pre-exposure
the pre-incubation of an inoculum in the presence of the chemical compound or organic matter under test, with the
aim of enhancing the ability of the inoculum to biodegrade the test material by adaptation and/or selection of the
microorganisms
3.13
pre-conditioning
the pre-incubation of an inoculum under the conditions of the subsequent test in the absence of the chemical
compound or organic matter under test, with the aim of improving the test by acclimatization of the microorganisms
to the test conditions
4 Principle
The biodegradability of a plastic material is determined using aerobic microorganisms in an aqueous system. The
test mixture contains an inorganic medium, the organic test material (the sole source of carbon and energy) with a
concentration between 100 mg/l and 2 000 mg/l of organic carbon, and activated sludge or a suspension of active
soil or compost as the inoculum. The mixture is agitated in test flasks and aerated with carbon-dioxide-free air over
a period of time depending on the biodegradation kinetics, but not exceeding 6 months. The carbon dioxide evolved
during the microbial degradation is determined by a suitable analytical method, examples of which are given in
annexes A and B.
The level of biodegradation is determined by comparing the amount of carbon dioxide evolved with the theoretical
amount (ThCO ) and expressed in per cent. The test result is the maximum level of biodegradation, determined
2
from the plateau phase of the biodegradation curve. Optionally, a carbon balance may be calculated to give
additional information on the biodegradation (see annex C).
Unlike ISO 9439, which is used for a variety of organic compounds, this International Standard is specially designed
for the determination of the biodegradability of plastic materials. The special requirements necessary affect the
choice of the inoculum and the test medium, and there is the possibility of improving the evaluation of the
biodegradability by calculating a carbon balance.
5 Test environment
Incubation shall take place in the dark or in diffuse light in an enclosure which is free from vapours inhibitory to
microorganisms and which is maintained at a constant temperature, preferably between 20 °C and 25 °C, to an
accuracy of ± 1 °C, or at any other appropriate temperature depending on the inoculum used and the environment
to be assessed.
NOTE With a compost inoculum, higher temperatures may be appropriate.
3
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6 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade.
6.1 Distilled or deionized water, free of toxic substances (copper in particular) and containing less than 2 mg/l of
DOC.
6.2 Test medium.
Depending on the purpose of the test, different test media may be used. For example, if simulating a natural
environment use the standard test medium (6.2.1). If a test material is used at higher concentrations, use the
optimized test medium (6.2.2) with higher buffering capacity and nutrient concentrations.
6.2.1 Standard test medium
6.2.1.1 Solution A
Dissolve
anhydrous potassium dihydrogen phosphate (KH PO ) 8,5 g
2 4
anhydrous dipotassium hydrogen phosphate (K HPO ) 21,75 g
2 4
disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na HPO ×2H O) 33,4 g
2 4 2
ammonium chloride (NH Cl) 0,5 g
4
in water (6.1) and make up to 1000 ml.
NOTE The correct composition of the solution can be checked by measuring the pH, which should be 7,4.
6.2.1.2 Solution B
Dissolve 22,5 g of magnesium sulfate heptahydrate (MgSO ×7H O) in water (6.1) and make up to 1000 ml.
4 2
6.2.1.3 Solution C
Dissolve 36,4 g of calcium chloride dihydrate (CaCl ×2H O) in water (6.1) and make up to 1000 ml.
2 2
6.2.1.4 Solution D
Dissolve 0,25 g of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl ×6H O) in water (6.1) and make up to 1000 ml.
3 2
Prepare this solution freshly before use to avoid precipitation, or add a drop of concentrated hydrochloric acid (HCl)
or a drop of 0,4 g/l aqueous solution of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
6.2.1.5 Preparation
To prepare 1 litre of test medium, add, to about 500 ml of water (6.1),
10 ml of solution A;
1 ml of each of solutions B to D.
Make up to 1000 ml with water (6.1).
6.2.2 Optimized test medium
This optimized medium is highly buffered and contains more inorganic nutrients. This is necessary to keep the pH
constant in the system during the test, even at high concentrations of the test material. The medium contains about
2400 mg/l of phosphorus and 50 mg/l of nitrogen and is therefore suitable for concentrations in the test material of
4
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up to 2000 mg/l of organic carbon. If higher or lower test-material concentrations are used, increase or decrease
respectively the nitrogen content to keep the C:N ratio at about 40:1.
6.2.2.1 Solution A
Dissolve
anhydrous potassium dihydrogen phosphate (KH PO ) 37,5 g
2 4
disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na HPO ×2H O) 87,3 g
2 4 2
ammonium chloride (NH Cl) 2,0 g
4
in water (6.1) and make up to 1000 ml.
6.2.2.2 Solution B
Dissolve 22,5 g of magnesium sulfate heptahydrate (MgSO ×7H O) in water (6.1) and make up to 1000 ml.
4 2
6.2.2.3 Solution C
Dissolve 36,4 g of calcium chloride dihydrate (CaCl ×2H O) in water (6.1) and make up to 1000 ml.
2 2
6.2.2.4 Solution D
Dissolve 0,25 g of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl ×6H O) in water (6.1) and make up to 1000 ml (see second
3 2
paragraph of 6.2.1.4).
6.2.2.5 Solution E (trace-element solution, optional)
Dissolve in 10 ml of aqueous HCl solution (25 %, 7,7 mol/l), in the following sequence:
70 mg of ZnCl , 100 mg of MnCl ×4H O, 6 mg of H BO , 190 mg of CoCl ×6H O, 3 mg of CuCl ×2H O, 240 mg of
2 2 2 3 3 2 2 2 2
NiCl ×6H O, 36 mg of Na MoO ×2H O, 33 mg of Na WO ×2H O and 26 mg of Na SeO ×5H O
2 2 2 4 2 2 4 2 2 3 2
and make up to 1000 ml with water (6.1).
6.2.2.6 Solution F (vitamin solution, optional)
Dissolve in 100 ml of water (6.1) 0,6 mg of biotine, 2,0 mg of niacinamide, 2,0 mg of p-aminobenzoate, 1,0 mg of
panthotenic acid, 10,0 mg of pyridoxal hydrochloride, 5,0 mg of cyanocobalamine, 2,0 mg of folic acid, 5,0 mg of
riboflavin, 5,0 mg of DL-thioctic acid and 1,0 mg of thiamine dichloride or use a solution of 15 mg of yeast extract in
100 ml of water (6.1). Filter the solution for sterilization using membrane filters (see 7.6).
NOTE Solutions E and F are optional and are not required if a sufficient concentration of the inoculum is used, e.g.
activated sludge, soil or compost. It is recommended that 1 ml portions be prepared and kept refrigerated until use.
6.2.2.7 Preparation
To prepare 1 litre of test medium, add, to about 800 ml of water (6.1),
100 ml of solution A;
1 ml of each of solutions B to D and, optionally, E and F.
Make up to 1000 ml with water (6.1) and measure the pH.
NOTE The correct composition of the test medium can be checked by measuring the pH, which should be 7,0 ± 0,2.
6.3 Pyrophosphate solution.
Dissolve 2,66 g of sodium pyrophosphate (Na P O ) in water (6.1) and make up to 1000 ml.
4 2 7
5
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7 Apparatus
Ensure that all glassware is thoroughly cleaned and, in particular, free from organic or toxic matter.
Required is usual laboratory equipment, plus the following:
7.1 Test flasks: glass vessels (e.g. bottles or conical flasks) designed to allow gas purging and shaking or stirring,
and fitted with tubing impermeable to CO . The vessels shall be located in a constant-temperature room or in a
2
thermostatted apparatus (e.g. water-bath).
7.2 CO -free-air production system, capable of supplying CO -free air at a flow rate between 50 ml/min and
2 2
100 ml/min to each test flask, held constant to within ± 10 % (see example of system, including test vessels, in
annex A).
7.3 Analytical instrument for determining carbon dioxide, consisting of any suitable apparatus with sufficient
accuracy, e.g. a CO or DIC analyser or apparatus for titrimetric determination after complete absorption in a basic
2
solution (see examples in annex B). Note that, if an analyser with an IR detector, for instance, is used, CO -free air
2
is not necessary.
7.4 Analytical equipment for measuring total organic carbon (TOC) and dissolved organic carbon (DOC)
(see ISO 8245).
7.5 Analytical balance (usual laboratory equipment).
or with membrane filters (0,45 mm pore size) which neither adsorb nor release
7.6 Centrifuge, filtration device
organic carbon significantly.
7.7 pH meter (usual laboratory equipment).
7.8 Magnetic stirrer or shaking device (usual laboratory equipment).
8 Procedure
8.1 Test material
The test material shall be of known mass and contain sufficient carbon to yield CO in a quantity that can be
2
adequately measured by the analytical system used. Calculate the TOC from the chemical formula or determine it
by a suitable analytical technique (e.g. elemental analysis or measurement in accordance with ISO 8245) and
calculate the ThCO . Use a concentration of test material such that the TOC content is at least 100 mg/l. The
2
maximum amount of test material is limited by the oxygen supply to the test system and the test medium used.
When using the optimized test medium (6.2.2) the test-material concentration shall be such that the TOC does not
exceed about 2 000 mg/l, i.e. a C:N ratio of about 40:1. If higher concentrations are to be tested, increase the
nitrogen amount in the test medium.
NOTE The test material should preferably be used in powder form, but it may also be introduced as films, pieces,
fragments or shaped articles. The form and shape of the test material may influence its biodegradability. Similar shapes should
preferably be used if different kinds of plastic material are to be compared. If the test material is used in the form of a powder,
particles of known, narrow size distribution should be used. A particle-size distribution with the maximum at 250 mm diameter is
recommended. Also, the size of the test equipment used may depend on the form of the test material. It should be ascertained
that no substantial mechanical aberrations occur due to the test conditions, for example due to the type of stirring mechanism
used. Processing of the test material (e.g. the use of powder in the case of composites) should not influence significantly the
degradation behaviour of the material. Optionally, record the hydrogen, oxygen, nitrogen, phosphorus and sulfur contents and
the molecular mass of a polymeric test material, using for example liquid exclusion chromatography (see e.g.
[1]
ASTM D 3536-91 or any other applicable standard method). Preferably, plastic materials without additives such as
plasticizers should be tested. When the material does contain such additives, information on their biodegradability will be
needed to assess the biodegradability of the polymeric material itself.
For details on how to handle poorly water-soluble compounds, see ISO 10634.
6
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8.2 Reference material
Use aniline and/or a well defined biodegradable polymer (for example microcrystalline cellulose powder, ashless
cellulose filters or poly-ß-hydroxybutyrate) as a reference material. If possible, the TOC, form and size should be
comparable to that of the test material.
As a negative control, a non-biodegradable polymer (e.g. polyethylene) in the same form as the test material can
optionally be used.
8.3 Preparation of the inoculum
Activated sludge from a sewage-treatment plant treating predominantly domestic sewage is a suitable source of the
inoculum. It is obtained from an active aerobic environment and is available over a wide geographical area in which
a broad range of plastic materials has to be tested. Alternatively, soil and/or compost suspensions can be used for
inoculation, as with some plastic materials the activity of fungi is important for biodegradation. When biodegradation
in a specific waste-treatment system is to be determined, collect the inoculum from that environment.
The inoculum can be prepared from the sources described in 8.3.1 and 8.3.2, or from a mixture of these sources in
order to obtain a varied and concentrated microbial flora with sufficient biodegradation activity. If the endogenous
respiration of the inoculum is too high, stabilize the inoculum by aeration before use. Harmonize the test
temperature with the inoculum used (see note to clause 5).
NOTE It may be useful to determine the colony-forming units (cfu) of the inoculum used. The test mixture should preferably
-6
contain about 10 cfu/ml.
8.3.1 Inoculum from wastewater-treatment plants
Take a sample of activated sludge collected from a well-operated sewage-treatment plant or a laboratory plant
handling predominantly domestic sewage. Mix well, keep the sample under aerobic conditions and use preferably
on the day of collection (at least within 72 h).
[3]
Before use, determine the concentration of suspended solids (use e.g. ISO 11923 ). If necessary, concentrate the
sludge by settling so that the volume of sludge added to the test assay is minimal. Add a suitable volume to obtain
suspended solids in the range 30 mg/l to 1000 mg/l in the final mixture.
NOTE 1 When biodegradation processes in a natural environment are to be simulated or when a carbon balance
determination (see annex C) is to be carried out, an inoculum concentration of 30 mg/l suspended solids is recommended. As
solid matter can interfere with the carbon balance determination, the following procedure for preparing the inoculum is
recommended. Take 500 ml of the activated sludge and homogenize for 2 min at medium speed in a blender or in a suitable
high-speed mixer. Allow to settle until the supernatant liquid contains no significant amounts of suspended matter, but in any
case for at least 30 min. Decant a sufficient volume of the supernatant liquid and add it to the test flasks to obtain a
concentration of 1 % (V/V) to 5 % (V/V) in the test medium. Avoid carrying over sludge particles.
NOTE 2 An inoculum may be pre-conditioned, but normally no pre-exposed inoculum should be used, especially in the case
of standard tests simulating biodegradation behaviour in natural environments. Depending on the purpose of the test, a pre-
exposed inoculum may also be used, provided this is clearly stated in the test report (e.g. per cent biodegradation = x %, using
pre-exposed inocula) and the method of pre-exposure detailed in the test report. Pre-exposed inocula can be obtained from
suitable laboratory biodegradation tests (see ISO/TR 15462) conducted under a variety of conditions or from samples collected
from locations where relevant environmental conditions exist (e.g. contaminated areas or industrial treatment plants).
8.3.2 Inoculum from soil and/or compost
Suspend 10 g of non-sterile, fertile soil or compost from a composting plant treating predominantly organic waste in
100 ml of the test medium (6.2.1 or 6.2.2) or in a pyrophosphate solution (6.3) which is commonly used in soil
microbiology. Allow to settle for about 30 min. Decant and filter the supernatant liquid through a coarse porous filter
and add the inoculum to the test flasks to obtain a concentration of 1 % (V/V) to 5 % (V/V) in the test medium.
Higher amounts of inoculum can be used if necessary, but this may cause problems in establishing carbon
balances. The use of compost can increase the number of fungi in the test flasks and improve the biodegradation of
plastic materials. In this case, indicate the state of the compost used in the test report (e.g. mature compost,
compost from the hot phase at about 50 °C).
7
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8.4 Test
Provide a number of flasks, so that the test includes at least the following:
a) Two test flasks for the test material (symbol F ).
T
b) Two flasks for the blank (symbol F ).
B
c) One flask for checking the inoculum activity using a reference material (symbol F ).
C
And, if required:
d) One flask for checking for possible abiotic degradation or non-biological change in the test material such as by
hydrolysis (symbol F ). The test solution in F shall be sterilized, for example by autoclaving or by the addition
S S
of a suitable inorganic toxic compound to prevent microbial activity. Use, for example, 5 ml/l of a solution
containing 10 g/l of mercury(II) chloride (HgCl ). Add the same amount of the toxic substance during the test if
2
required.
e) One flask as a negative control (symbol F ) using a non-biodegradable polymeric substance (e.g.
N
polyethylene) in the same form as the test material.
f) One flask for checking the possible inhibiting effect of the test material on microbial activity (symbol F ). Take
I
care that the ratio of carbon in the test and reference material to nitrogen in the medium is at least about
C:N = 40:1. Add nitrogen if required.
Add appropriate amounts of the test medium (6.2) and the inoculum (see 8.3) to the test flasks as indicated in
table 1.
Table 1 — Final distribution of test and reference materials
Flask Test material Reference material Inoculum
F Test + - +
T
F Test + - +
T
F Blank - - +
B
F Blank - - +
B
F Inoculum check + +
-
C
F Abiotic degradation check (optional) + - -
S
F Inhibition control (optional) + + +
I
F Negative control (optional) - + +
N
Connect the flasks to the CO -free-air production system (see annex A). Incubate at the desired test temperature
2
(see clause 5) and aerate the flasks for 24 h to purge carbon dioxide from the system. At higher temperatures,
prevent any ingress or loss of liquid by means of suitable equipment. Agitate throughout the test with a magnetic
stirrer or shaker. If excessive foaming is observed, replace the air purge by overhead aeration with stirring. After the
pre-aeration period, connect the air exit of each flask to the carbon dioxide trapping or measuring system.
If a carbon balance is to be run (see annex C), remove a known sufficient volume of the inoculated test medium
from each flask or from additional separate flasks for DOC and biomass determination at the beginning and the end
of the incubation period. Consider the removed volume when adjusting the final volume or when calculating the test
results.
Add the test material (8.1), the reference material and the material for the negative control (8.2) to the respective
flasks as indicated in table 1 and start the test by bubbling CO -free air through the flasks to ensure a sufficient
2
quantity of oxygen thoughout the test. A rate of 50 ml/min to 100 ml/min is usually suitable.
8
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ISO 14852:1999(E)
Measure at regular intervals, depending on the carbon dioxide evolution rate, the amount of carbon dioxide evolved
from each bottle, using a suitable and sufficiently accurate method (see annex B).
When a constant level of carbon dioxide release is attained (plateau phase reached) and no further biodegradation
is expected, the test is considered to be completed. The maximum test period is 6 months. In the case of long test
durations, special attention must be paid to the technical system (e.g. tightness of the test vessels and connections,
ensuring no carbon dioxide enters and ensuring there are no leakages).
On the last day of the test, measure the pH, acidify all the bottles with 1 ml of concentrated hydrochloric acid in
order to decompose the carbonates and bicarbonates, and purge to remove the carbon dioxide. Continue aeration
for 24 h and measure the amount of carbon dioxide evolved in each of the series of flasks (F , F , F ,.).
T B C
9 Calculation and expression of results
9.1 Calculation
9.1.1 Theoretical amount of carbon dioxide evolved by the test material
Calculate the theoretical amount of carbon dioxide (ThCO ) evolved, expressed in milligrams, using equation (1):
2
44
ThCO =·mX . . . (1)
2 c·
12
where
m is the mass of test material introduced into the test system, in milligrams;
X is the carbon content of the test material, determined from the chemical formula or calculated from
c
an elemental anlysis and expressed as a mass fraction;
44 and 12 are the molecular mass of carbon dioxide and the atomic mass of carbon, respectively.
Calculate in the same way the theoretical amount of carbon dioxide evolved by the reference material and the
mixture of test and reference material in flask F .
I
9.1.2 Percentage biodegradation from CO evolution
2
Calculate the percentage biodegradation D for the test flasks F from the amount of carbon dioxide evolved for
t T
each measurement interval using equation (2)
CO-CO
() ()
∑ 2 ∑ 2
T B
D =·100 . . . (2)
t
ThCO
2
where
S(CO ) is the amount of carbon dioxide evolved in flask F between the start of the test and time t,
2 T T
expressed in milligrams;
S(CO ) is the amount of carbon dioxide evolved in the blank flask F
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 14852
Première édition
1999-05-15
Évaluation de la biodégradabilité aérobie
ultime des matériaux plastiques en milieu
aqueux — Méthode par analyse du dioxyde
de carbone libéré
Determination of the ultimate aerobic biodegradability of plastic materials in
an aqueous medium — Method by analysis of evolved carbon dioxide
A
Numéro de référence
ISO 14852:1999(F)
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ISO 14852:1999(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 14852 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 61, Plastiques, sous-comité
SC 5, Propriété physicochimiques.
Les annexes A à E de la présente Norme internationale sont données uniquement à titre d’information.
© ISO 1999
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
Internet iso@iso.ch
Imprimé en Suisse
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ISO 14852:1999(F)
Introduction
Les plastiques étant de plus en plus utilisés, leur recyclage et leur mise au rebut sont devenus un problème majeur.
Il convient de favoriser en priorité le naturel. Désormais, les plastiques biodégradables apparaissent comme l'une
des possibilités qui permettent de résoudre ce genre de problème environnemental. Il convient que les matériaux
plastiques sous forme de produits ou d'emballages, qui sont envoyés dans les installations de compostage, soient
biodégradables. Il est donc très important de déterminer leur biodégradabilité potentielle et d'obtenir des indications
sur la biodégradabilité de ce type de matériaux plastiques dans le milieu naturel.
iii
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©
NORME INTERNATIONALE ISO ISO 14852:1999(F)
Évaluation de la biodégradabilité aérobie ultime des matériaux
plastiques en milieu aqueux — Méthode par analyse du dioxyde de
carbone libéré
AVERTISSEMENT — Les eaux usées, les boues activées et les matières en suspension dans le sol et le
compost peuvent contenir des organismes potentiellement pathogènes. Il convient donc de les manipuler
avec les précautions appropriées, de même que les composés à analyser toxiques ou dont les propriétés
ne sont pas connues.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale prescrit une méthode d'évaluation du taux de biodégradabilité aérobie des
matériaux plastiques contenant des additifs, par la détermination du dioxyde de carbone libéré. Le matériau d'essai
en milieu synthétique est exposé dans des conditions de laboratoire à un inoculum provenant de boues activées,
d'échantillons de compost ou de sol.
La méthode simule les processus de biodégradation d'un environnement aqueux naturel en cas d'utilisation de
boues activées non adaptées; si, par exemple, on utilise un inoculum mélangé ou pré-exposé, la méthode permet
d'étudier la biodégradabilité potentielle du matériau d'essai.
Les conditions utilisées dans la présente Norme internationale ne correspondent pas nécessairement aux
conditions optimales permettant d'obtenir le taux maximal de biodégradation; cependant, elle est conçue pour
déterminer la biodégradabilité potentielle ou pour donner une indication de la biodégradabilité des matériaux
plastiques dans le milieu naturel.
La méthode permet d'affiner l'évaluation de la biodégradabilité par le calcul d'un bilan de carbone (facultatif, voir
l’annexe C).
La présente méthode s'applique aux matériaux suivants:
polymères naturels et/ou synthétiques, copolymères ou mélanges de ceux-ci;
matériaux plastiques contenant des additifs tels que plastifiants, colorants ou tout autre composé;
polymères hydrosolubles;
mélanges de différents matériaux qui contiennent principalement du carbone organique;
matériaux n'ayant pas d'effet inhibiteur dans les conditions d'essai sur les micro-organismes présents dans
l'inoculum. Les effets inhibiteurs peuvent être déterminés en utilisant un dispositif de contrôle de l'inhibition ou
[2]
par toute autre méthode appropriée (voir, par exemple, l'ISO 8192 ). Si le matériau d'essai a un effet inhibiteur
vis-à-vis de l'inoculum, il est possible d'utiliser une plus faible concentration, un autre inoculum ou un inoculum
pré-exposé.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme internationale. Au moment de la publication, les éditions indiquées
1
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étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de l'ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
ISO 8245:1999, Qualité de l'eau — Lignes directrices pour le dosage du carbone organique total (COT) et carbone
organique dissous (COD).
1)
ISO 9439:— , Qualité de l'eau — Évaluation en milieu aqueux de la biodégradabilité aérobie ultime des composés
organiques — Essai de dégagement de dioxyde de carbone.
ISO 10634:1995, Qualité de l'eau — Lignes directrices pour la préparation et le traitement des composés
organiques peu solubles dans l'eau en vue de l'évaluation de leur biodégradabilité en milieu aqueux
ISO/TR 15462:1997, Qualité de l’eau — Sélection d'essais de biodégradabilité.
3 Définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les définitions suivantes s'appliquent:
3.1
biodégradation aérobie ultime
décomposition d'un composé chimique organique par des micro-organismes en présence d'oxygène, en dioxyde de
carbone, eau et sels minéraux de tous les autres éléments présents (minéralisation) et en une nouvelle biomasse
3.2
boue activée
biomasse formée lors du traitement aérobie de l'eau résiduaire par croissance de bactéries et d'autres micro-
organismes en présence d'oxygène dissous
3.3
concentration de la boue activée en matières solides en suspension
quantité de matières solides obtenue par filtration ou centrifugation d'un volume connu de boue activée et séchage
à 105 °C jusqu'à l'obtention d'une masse constante
3.4
carbone inorganique dissous
CID
proportion du carbone inorganique contenu dans l'eau qui ne peut pas être éliminée par une séparation de phase
-2
spécifique, telle qu'une centrifugation à 40 000 m×s pendant 15 min, ou par une filtration sur membrane au moyen
de membranes ayant des pores de 0,2 μm à 0,45 μm de diamètre
3.5
teneur théorique en dioxyde de carbone libéré
ThCO
2
teneur théorique maximale en dioxyde de carbone libéré après oxydation complète d'un composé chimique,
calculée d'après la formule moléculaire, exprimée en milligrammes de dioxyde de carbone libéré par milligramme
ou gramme de composé à analyser
3.6
carbone organique total
COT
tout le carbone présent dans la matière organique en solution ou suspension dans l'eau
1)
À publier. (Révision de l'ISO 9439:1990)
2
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3.7
carbone organique dissous
COD
proportion du carbone organique contenu dans l'eau qui ne peut pas être éliminée par une séparation de phase
-2
spécifique, telle qu'une centrifugation à 40 000 m×s pendant 15 min, ou par une filtration sur membrane au moyen
de membranes ayant des pores de 0,2 μm à 0,45 μm de diamètre
3.8
phase de latence
durée, mesurée en jours, écoulée à partir du début de l'essai jusqu'à l'obtention de l'adaptation et/ou de la sélection
des micro-organismes qui provoquent la dégradation, et jusqu'à ce que le taux de biodégradation du composé
chimique ou de la matière organique ait atteint environ 10 % du niveau maximal de biodégradation
3.9
niveau maximal de biodégradation
degré de biodégradation, mesuré en pourcentage, d'un composé chimique ou d'un matériau organique lors d'un
essai, au-dessus duquel la biodégradation ne se poursuit pas
3.10
phase de biodégradation
durée, mesurée en jours, depuis la fin de la phase de latence de l'essai jusqu'à ce que l'on ait obtenu environ 90 %
du niveau maximal de biodégradation
3.11
phase stationnaire
durée, mesurée en jours, écoulée entre la fin de la phase de biodégradation et la fin de l'essai
3.12
pré-exposition
pré-incubation d'un inoculum en présence de la matière organique ou du composé chimique à analyser, dans le but
de renforcer la capacité de l'inoculum à biodégrader le matériau d'essai par adaptation et/ou sélection des micro-
organismes
3.13
préconditionnement
pré-incubation d'un inoculum dans les conditions de l'essai effectué ultérieurement, en l'absence de la matière
organique ou du composé chimique à analyser, dans le but d'améliorer l'essai par acclimatation des micro-
organismes aux conditions d'essai
4 Principe
La biodégradabilité d'un matériau plastique est déterminée en utilisant des micro-organismes aérobies en système
aqueux. Le mélange d'essai contient un milieu inorganique, le matériau d'essai organique (comme seule source de
carbone et d'énergie) à une concentration comprise entre 100 mg/l et 2 000 mg/l de carbone organique, et un
inoculum, sous forme de boue activée ou de suspension de compost ou de sol actif. Ce mélange est agité dans des
fioles d'essai et aéré avec de l'air exempt de dioxyde de carbone pendant une durée qui est fonction de la cinétique
de la biodégradation, mais qui ne dépasse pas 6 mois. Le dioxyde de carbone libéré au cours de la dégradation
microbienne est déterminé par une méthode d'analyse appropriée dont un exemple est donné dans les annexes A
et B.
Le niveau de biodégradation est déterminé en comparant le dioxyde de carbone libéré avec la quantité théorique
(ThCO ) et en l'exprimant en pourcentage. Le résultat d'essai est le niveau maximal de biodégradation déterminé à
2
partir du plateau de la courbe de biodégradation. Il est également possible de calculer le bilan de carbone pour
obtenir des informations supplémentaires sur la biodégradation (voir l’annexe C).
En comparaison avec l'ISO 9439 qui est utilisée pour un large éventail de composés organiques, la présente Norme
internationale est spécifiquement consacrée à la détermination de la biodégradabilité des matériaux plastiques. Les
exigences particulières concernent le choix de l'inoculum et du milieu d'essai, et il est possible d'affiner l'évaluation
de la biodégradabilité par le calcul d'un bilan de carbone.
3
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5 Environnement d'essai
L'incubation doit avoir lieu dans l'obscurité ou sous une lumière diffuse dans une enceinte exempte de vapeurs
inhibitives pour les micro-organismes, qui doit être maintenue à une température constante, de préférence entre
20 °C et 25 °C avec une précision de ± 1 °C, ou à toute autre température appropriée en fonction de l'inoculum
utilisé et de l'environnement d'essai retenu.
NOTE Lorsque l'inoculum provient d'un compost, il peut s'avérer approprié d'utiliser des températures plus élevées.
6 Réactifs
Utiliser exclusivement des réactifs de qualité analytique reconnue.
6.1 Eau distillée ou déminéralisée, exempte de matières toxiques (en particulier, le cuivre) et contenant moins
de 2 mg/l de COD.
6.2 Milieu d'essai.
Il est possible d'utiliser différents milieux d'essai selon le but de l'essai. Par exemple, si l'on simule un
environnement naturel, utiliser le milieu d'essai normal (6.2.1). Si le matériau d'essai est utilisé à des concentrations
plus élevées, utiliser le milieu d'essai optimisé (6.2.2) avec de plus fortes concentrations en nutriments et un
pouvoir tampon plus élevé.
6.2.1 Milieu d'essai normal
6.2.1.1 Solution A
Dissoudre
dihydrogénophosphate de potassium anhydre (KH PO ) 8,5 g
2 4
hydrogénophosphate dipotassique anhydre (K HPO ) 21,75 g
2 4
hydrogénophosphate disodique dihydraté (Na HPO ,2H O) 33,4 g
2 4 2
chlorure d'ammonium (NH Cl) 0,5 g
4
dans de l’eau (6.1), et compléter à 1 000 ml
NOTE La composition adéquate de la solution peut être vérifiée par un mesurage du pH qui devrait être de 7,4.
6.2.1.2 Solution B
Dissoudre 22,5 g de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO ,7H O) dans de l’eau (6.1), et compléter à
4 2
1 000 ml.
6.2.1.3 Solution C
Dissoudre 36,4 g de chlorure de calcium dihydraté (CaCl ,2H O) dans de l’'eau (6.1), et compléter à 1 000 ml.
2 2
6.2.1.4 Solution D
Dissoudre 0,25 g de chlorure de fer(III) hexahydraté (FeCl ,6H O) dans de l’eau (6.1), et compléter à 1 000 ml.
3 2
Préparer une solution fraîche avant utilisation pour éviter qu'il n'y ait précipitation, ou ajouter une goutte d'acide
chlorhydrique concentré (HCl) ou d'une solution aqueuse d'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) à 0,4 g/l.
4
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6.2.1.5 Préparation
Pour 1 litre de milieu d'essai, ajouter à environ 500 ml d'eau (6.1)
10 ml de solution A;
1 ml de chacune des solutions B à D.
Compléter à 1 000 ml avec de l'eau (6.1).
6.2.2 Milieu d'essai optimisé
Le présent milieu d'essai optimisé est fortement tamponné et contient davantage de nutriments inorganiques. Cela
est nécessaire pour maintenir le pH constant dans le système pendant l'essai même lorsque le matériau d'essai est
présent à des concentrations élevées. Ce milieu contient environ 2 400 mg/l de phosphore et 50 mg/l d'azote et il
convient pour des concentrations de matériaux d'essai allant jusqu'à 2 000 mg/l de carbone organique. Si l'on doit
utiliser des concentrations de matériaux d'essai plus élevées ou moins élevées, augmenter ou diminuer, selon le
cas, la teneur en azote pour maintenir un rapport C:N d'environ 40:1.
6.2.2.1 Solution A
Dissoudre
dihydrogénophosphate de potassium anhydre (KH PO ) 37,5 g
2 4
hydrogénophosphate disodique dihydraté (Na HPO ,2H O) 87,3 g
2 4 2
chlorure d'ammonium (NH Cl) 2,0 g
4
dans de l’eau (6.1), et compléter à 1 000 ml
6.2.2.2 Solution B
Dissoudre 22,5 g de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO ,7H O) dans de l’eau (6.1), et compléter à
4 2
1 000 ml.
6.2.2.3 Solution C
Dissoudre 36,4 g de chlorure de calcium dihydraté (CaCl ,2H O) dans de l’eau (6.1), et compléter à 1 000 ml.
2 2
6.2.2.4 Solution D
Dissoudre 0,25 g de chlorure de fer(III) hexahydraté (FeCl ,6H O) dans de l’eau (6.1), et compléter à 1 000 ml
3 2
(voir 6.2.1.4, deuxième alinéa).
6.2.2.5 Solution E (solution d'oligo-éléments, facultative)
Dissoudre dans 10 ml de solution aqueuse de HCl (25 %, 7,7 mol/l) dans l'ordre suivant:
70 mg de ZnCl ; 100 mg de MnCl ,4H O; 6 mg de H BO 190 mg de CoCl ,6H O; 3 mg de CuCl ,2H O; 240 mg
2 2 2 3 3; 2 2 2 2
de NiCl ,6H O; 36 mg de NaMoO ,2H O; 33 mg de Na WO ,2H O; 26 mg de NaSeO ,5H O,
2 2 4 2 2 4 2 3 2
et compléter à 1 000 ml avec de l'eau (6.1).
(solution de vitamines, facultative)
6.2.2.6 Solution F
Dissoudre dans 100 ml d'eau (6.1) 0,6 mg de biotine, 2,0 mg de niacinamide, 2,0 mg de p-aminobenzoate, 1,0 mg
d'acide panthoténique, 10,0 mg de chlorhydrate de pyridoxal, 5,0 mg de cyanocobalamine, 2,0 mg d'acide folique,
5,0 mg de riboflavine, 5,0 mg de DL-acide thioctique et 1,0 mg de dichlorure de thiamine ou utiliser une solution de
15 mg d'extrait de levure dans 100 ml d'eau (6.1). Filtrer la solution en vue de la stérilisation en utilisant les filtres à
membranes (voir 7.6).
5
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NOTE Les solutions E et F sont facultatives et non requises si l'on utilise un inoculum en concentration suffisante, comme
les boues activées et des échantillons de sol ou de compost. Il est recommandé de préparer et de réfrigérer des prises de 1 ml
jusqu'à utilisation.
6.2.2.7 Préparation
Pour 1 litre de milieu d'essai, ajouter à environ 800 ml d'eau (6.1)
100 ml de solution A;
1 ml de chacune des solutions B à D et facultativement E et F.
Compléter à 1 000 ml avec de l'eau (6.1) et mesurer le pH.
NOTE La composition adéquate du milieu peut être vérifiée par un mesurage du pH qui devrait être de 7,0 ± 0,2.
6.3 Solution de pyrophosphate.
Dissoudre 2,66 g de pyrophosphate de sodium (Na P O ) dans de l’eau (6.1), et compléter à 1 000 ml.
4 2 7
7 Appareillage
S'assurer que la verrerie de laboratoire a été soigneusement nettoyée et, en particulier, qu'elle est exempte de
toute trace de substances organiques ou toxiques.
Matériel courant de laboratoire, et
7.1 Récipients d'essai: fioles en verre (par exemple, flacons ou fioles Erlenmeyer) pouvant être purgées par un
gaz et secouées ou agitées, et comprenant une tubulure étanche au CO . Elles doivent être placées dans une salle
2
à température constante ou dans un appareil thermostaté (par exemple bain-marie).
7.2 Système de production d'air exempt de CO , pouvant fournir un débit compris entre 50 ml/min et
2
100 ml/min, en direction de chacune des fioles d'essai, maintenu constant à ± 10 % près (voir l'exemple de
montage avec les récipients d'essai dans l'annexe A).
7.3 Appareillage analytique pour la détermination du dioxyde de carbone: tout appareillage approprié ayant
une précision suffisante, tel qu'un analyseur de CO ou de CID ou dispositif de dosage titrimétrique après
2
absorption complète dans une solution basique (voir les exemples donnés dans l'annexe B), peut être utilisé. À
noter que, si un analyseur équipé d'un détecteur IR (par exemple) est utilisé, l'air exempt de CO n'est pas
2
indispensable.
7.4 Appareillage analytique pour le mesurage du carbone organique total (COT) et du carbone organique
dissous (COD) (voir l'ISO 8245).
7.5 Balance analytique (matériel courant de laboratoire).
7.6 Centrifugeuse, ou dispositif de filtration équipé de filtres à membranes (grosseur de pore 0,45 mm)
n'absorbant, ni ne relargant le carbone organique de manière significative.
7.7 pH-mètre (matériel courant de laboratoire).
7.8 Agitateur magnétique, ou dispositif d'agitation par va-et-vient (matériel courant de laboratoire).
8 Mode opératoire
8.1 Matériau d'essai
Le matériau d'essai doit avoir une masse connue et contenir suffisamment de carbone pour produire du CO en
2
quantité susceptible d'être adéquatement mesurée par le système d'analyse utilisé. Calculer d'après la formule
6
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chimique ou déterminer le COT par une technique d'analyse appropriée (telle que des analyses élémentaires ou un
mesurage du COT conformément à l'ISO 8245) et calculer la ThCO . Utiliser une concentration de COT dans le
2
matériau d'essai d'au moins 100 mg/l. La quantité maximale de matériau d'essai est limitée par l'apport en oxygène
du système d'essai et par le milieu d'essai utilisé. Dans le cas du milieu d'essai optimisé (6.2.2), la concentration du
matériau d'essai ne doit pas dépasser environ 2 000 mg/l de COT de façon à avoir un rapport C:N d'environ 40:1. Si
l'on doit soumettre à l'essai des concentrations plus élevées, augmenter la quantité d'azote dans le milieu d'essai.
NOTE Il convient d'utiliser, de préférence, un matériau d'essai sous forme de poudre; toutefois, ce dernier peut également
être employé sous forme de films, de morceaux, de fragments ou d'articles façonnés. La forme du matériau d'essai peut influer
sur sa biodégradabilité. Il convient d'utiliser, de préférence, des formes semblables si l'on doit comparer différents types de
matériaux plastiques. Si le matériau d'essai est sous forme de poudre, il est recommandé d'utiliser des particules étroites et
définies ayant une répartition granulométrique connue (diamètre maximal recommandé 250 μm). D'autre part, la forme du
matériau d'essai peut également avoir une influence sur la taille du dispositif d'essai utilisé. En outre, il convient de s'assurer
qu'aucune aberration mécanique importante ne peut être causée par les conditions d'essai, par exemple, causée par le
mécanisme d'agitation utilisé. Il convient que la mise en œuvre du matériau d'essai (par exemple, emploi de poudres pour les
composites) n'influe pas de manière significative sur le comportement de dégradation du matériau. À titre facultatif, il est
[1]
possible d'enregistrer par chromatographie liquide par exclusion (voir, par exemple, l'ASTM D 3536-91 ou toute autre
méthode normalisée applicable) la teneur en hydrogène, oxygène, azote, phosphore et soufre ainsi que la masse moléculaire
de tout matériau d'essai polymère. Il convient, de préférence, de soumettre à l'essai des matériaux plastiques exempts
d'additifs comme les plastifiants. Lorsque le matériau contient de tels additifs, des informations relatives à leur biodégradabilité
seront nécessaires pour évaluer la biodégradabilité du matériau polymère lui-même.
Pour obtenir de plus amples détails sur le mode de manipulation des composés faiblement hydrosolubles, voir
l'ISO 10634.
8.2 Matériau de référence
Utiliser de l'aniline et/ou un polymère biodégradable bien défini (tel que de la poudre de cellulose microcristalline,
des filtres de cellulose exempts de cendres ou du poly-b-hydroxybutyrate) comme matériau de référence. Il
convient, si possible, que le COT, la forme et la taille du matériau de référence soient comparables à ceux du
matériau d'essai soumis à l'évaluation.
Comme substance témoin négative, il est possible d'utiliser un polymère non biodégradable (par exemple du
polyéthylène) sous la même forme que le matériau d'essai.
8.3 Préparation de l'inoculum
Les boues activées provenant d'une installation de traitement traitant des eaux usées principalement domestiques
constituent une source appropriée d'inoculum. Ces boues proviennent d'un environnement aérobie actif et sont
disponibles sur une zone géographique étendue dans laquelle on doit soumettre à l'essai un large éventail de
matériaux plastiques. Une autre solution consiste à utiliser pour l'ensemencement des échantillons de sol et/ou de
compost en suspension. Comme dans le cas de certains matériaux plastiques, l'activité des champignons est
importante pour la biodégradation. Lorsqu'on doit déterminer la biodégradation dans un système de traitement des
eaux usées spécifique, prélever l'inoculum dans l'environnement en question.
L'inoculum peut être préparé à partir des sources décrites en 8.3.1 et 8.3.2 ou d'un mélange de ces sources afin
d'obtenir une flore microbienne variée et concentrée avec une activité de biodégradation suffisante. Si la libération
de dioxyde de carbone endogène de l'inoculum est trop élevée, stabiliser ce dernier par aération avant utilisation.
Harmoniser la température d'essai par rapport à l'inoculum utilisé (voir la note dans l’article 5).
NOTE Il peut être utile de déterminer les unités formant colonie (cfu) de l'inoculum utilisé. Il convient, de préférence, que le
-6
mélange d'essai contienne au moins 10 cfu/ml.
8.3.1 Inoculum provenant d'une installation de traitement des eaux résiduaires
Prélever un échantillon de boue activée dans une installation de traitement des eaux usées convenablement
exploitée ou dans une installation expérimentale traitant principalement des eaux usées domestiques. Bien
mélanger, conserver l'échantillon dans des conditions aérobies et l'utiliser, de préférence, le jour du prélèvement
(en l'espace de 72 h).
Avant utilisation, déterminer la concentration en matières solides en suspension (utiliser, par exemple,
[3]
l'ISO 11923 ). Si nécessaire, concentrer la boue par sédimentation de façon que le volume de boue ajouté à
7
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l'échantillon soit minimal. Ajouter un volume approprié pour obtenir entre 30 mg/l et 1 000 mg/l de matières solides
en suspension dans le mélange final.
NOTE 1 Lorsqu'il faut simuler des processus de biodégradation dans un environnement naturel ou effectuer un bilan de
carbone (voir l'annexe C), il est recommandé d'utiliser une concentration d'inoculum en matières solides en suspension de 30
mg/l. Étant donné que les matières solides peuvent influer sur le bilan de carbone, il est recommandé de préparer l'inoculum
selon le mode opératoire suivant. Prélever 500 ml de boue activée et homogénéiser pendant 2 min à moyenne vitesse dans un
malaxeur ou un mélangeur adéquat à haute vitesse. Laisser décanter jusqu'à ce que le surnageant ne contienne plus de
quantités significatives de matières en suspension, mais en tout cas pendant au moins 30 min. Décanter un volume suffisant
de surnageant et l'ajouter aux fioles d'essai pour obtenir une concentration de 1 % (V/V) à 5 % (V/V) dans le milieu d'essai.
Éviter de laisser passer les particules de boue.
NOTE 2 L'inoculum peut être précondionné mais, en principe, il convient de ne pas utiliser d'inoculum pré-exposé, en
particulier dans le cas des essais normalisés simulant la biodégradation en milieu naturel. Selon le but de l'essai, il est
également possible d'utiliser un inoculum pré-exposé à condition que cela soit clairement indiqué dans le rapport d'essai (par
exemple, pourcentage de biodégradation = x %, en utilisant des inoculums pré-exposés) et que la méthode de pré-exposition
soit détaillée dans le rapport d'essai. Les inoculums pré-exposés peuvent être obtenus lors d'essais de biodégradation
appropriés (voir l'ISO/TR 15462) conduits en laboratoire dans des conditions variées, ou à partir d'échantillons prélevés dans
des emplacements où prévalent les conditions environnementales adéquates (par exemple, zones contaminées ou
installations de traitement industrielles).
8.3.2 Inoculum provenant d'un échantillon de sol et/ou compost
Mettre en suspension 10 g de sol fertile, non stérile ou de compost provenant d'une installation de compostage
traitant principalement des déchets organiques, dans 100 ml de milieu d'essai (6.2.1 ou 6.2.2) ou dans la solution
de pyrophosphate (6.3), ce qui est une pratique courante en microbiologie des sols. Laisser reposer pendant
environ 30 min. Décanter et filtrer le surnageant à travers un filtre de porosité grossière et ajouter l'inoculum aux
fioles d'essai pour obtenir une concentration de 1 % (V/V) à 5 % (V/V) dans le milieu d'essai. Il est possible d'utiliser
de plus importantes concentrations, si nécessaire, mais cela peut engendrer des problèmes lors de l'établissement
des bilans de carbone. Le fait d'utiliser du compost peut provoquer l'augmentation du nombre de champignons dans
les fioles d'essai et accroître la biodégradation des matériaux plastiques. Dans ce cas, indiquer dans le rapport
d'essai l'état du compost utilisé (par exemple, compost à maturité, compost en phase de chauffe à environ 50 °C).
8.4 Essai
Prévoir un nombre de fioles tel que l'essai comprenne au moins
a) deux fioles d'essai pour le matériau d'essai (symbole F );
T
b) deux fioles pour le blanc (symbole F );
B
c) deux fioles pour vérifier l'activité de l'inoculum au moyen d'un matériau de référence (symbole F );
C
et, si nécessaire,
d) une fiole destinée à la mise en évidence d'une éventuelle dégradation abiotique ou de toute transformation non
biologique du matériau d'essai comme l'hydrolyse (symbole F ). La solution d'essai dans F doit être stérilisée,
S S
par exemple, par passage en autoclave ou par addition d'un composé inorganique toxique approprié
permettant d'empêcher toute activité microbienne. Utiliser, par exemple, 5 ml/l d'une solution contenant 10 g/l
de chlorure de mercure(II) (HgCl ). Ajouter la même quantité de substance toxique pendant l'essai, si
2
nécessaire;
e) une fiole comme témoin négatif (symbole F ) utilisant une substance polymère non biodégradable (par
N
exemple, polyéthylène) sous la même forme que celle du matériau d'essai;
f) une fiole pour la mise en évidence d'un éventuel effet inhibiteur du matériau d'essai sur l'activité microbienne
(symbole F ). Veiller à ce que le rapport du carbone provenant du matériau d'essai et du matériau de référence,
I
à l'azote contenu dans le milieu, soit d'au moins C:N = 40:1. Ajouter de l'azote, si nécessaire.
Ajouter dans les fioles d'essai les quantités appropriées de milieu d'essai (6.2) et d'inoculum (8.3) conformément au
tableau 1.
8
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ISO 14852:1999(F)
Tableau 1 — Répartition finale des matériaux d'essai et des matériaux de référence
Fiole Matériau Matériau Inoculum
d'essai de référence
F Essai + +
-
T
F Essai
+ +
T -
F Blanc +
--
B
F Blanc
+
B --
F Vérification de l'activité de l'inoculum ++
-
C
F Mise en évidence d'une dégradation abiotique (facultative)
+
S --
F Mise en évidence d'un effet inhibiteur (facultative) ++ +
I
F Témoin négatif (facultatif) ++
N -
Relier les fioles au système de production d'air exempt de dioxyde de carbone (voir l’annexe A). Incuber à la
température d'essai voulue (voir l'article 5) et aérer les fioles pendant 24 h pour purger le dioxyde de carbone hors
du système. Aux températures élevé
...
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