SIST ISO 6340:1998
(Main)Water quality - Detection of Salmonella species
Water quality - Detection of Salmonella species
Specifies a method for the detection of Salmonella in water samples for monitoring purposes. Applicable to all kinds of water, except raw sewage.
Qualité de l'eau -- Recherche et dénombrement de Salmonella
Kakovost vode - Ugotavljanje prisotnosti vrst Salmonella
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
IS0
INTERNATIONAL
6340
STANDARD
First edition
1995-12-01
Water quality - Detection of Salmonella
species
- Recherche de Salmonella
Qua/S de I ’eau
Reference number
IS0 6340:1995(E)
---------------------- Page: 1 ----------------------
IS0 6340:1995(E)
Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (IS0 member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through IS0
technical committees. Each member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. IS0
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard IS0 6340 was prepared by Technical Committee
lSO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4, Microbiological
methods.
Annexes A and B of this International Standard are for information only.
0 IS0 1995
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
for Standardization
International Organization
titzerland
Case Postale 56 l CH-121 1 Geneve 20 l SW
Printed in Switzerland
II
---------------------- Page: 2 ----------------------
0 IS0 IS0 6340: 1995(E)
Introduction
Salmonella species are bacteria which are widely distributed all over the
world. They are usually classified as pathogens, although their virulence
and pathogenesis vary widely. The natural hosts of Salmonella species
include humans, agricultural and domestic livestock and wild animals in-
cluding birds. Humans and animals may excrete these bacteria while
carrying them asymptomatically, as well as during disease. It is therefore
impossible to eliminate them from the environment. Due to the severe
diseases which can follow the infection of humans, the transmission of
Salmonella species via different vehicles has to be minimized.
Since water is one of the vehicles, the presence or absence of SaImoneh
species should be monitored in water. Salmonella species may be present
in all types of domestic and agricultural sewage, fresh waters, including
ground and drinking waters, and also sea water.
The detection of Salmonella in water usually requires a concentration step.
Since cells of Salmonella species may be injured in the aqueous environ-
ment, their detection in water usually requires a pre-enrichment step. The
procedure described in this International Standard consists of regular
enrichment(s), selection and confirmation steps.
. . .
III
---------------------- Page: 3 ----------------------
This page intentionally left blank
---------------------- Page: 4 ----------------------
IS0 6340: 1995(E)
INTERNATIONAL STANDARD 0 ISo
Water quality - Detection of Salmonella species
WARNING - In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests for
detecting Salmonella species are undertaken in properly equipped laboratories, under the control
of skilled microbiologists only, and that great care is taken in the disposal of all incubated
materials.
IS0 6579:1993, Microbiology - General guidance on
1 Scope
methods for the detection of Salmonella.
This International Standard specifies a method for the
detection of SaImonella species in water samples for
3 Definitions
monitoring purposes. In special epidemiological situ-
ations, other media may also be required.
For the purposes of this International Standard, the
following definitions apply.
The method can be applied to all kinds of water, ex-
cept raw sewage.
3.1 Salmonella species: Gram-negative, oxidase-
negative, facultatively anaerobic, non-sporeforming,
rod-shaped bacteria which generally form colonies of
2 mm to 4 mm in diameter on solid selective media.
2 Normative references
They form typical colonies on solid selective media
and display the biochemical and serological charac-
The following standards contain provisions which,
teristics described when tests are carried out in ac-
through reference in this text, constitute provisions
cordance with this International Standard.
of this International Standard. At the time of publi-
cation, the editions indicated were valid. All standards
3.2 detection of SalmoneUa organisms: Determi-
are subject to revision, and parties to agreements
nation of the presence of these bacteria in a particular
based on this International Standard are encouraged
volume, when tests are carried out in accordance with
to investigate the possibility of applying the most re-
this International Standard.
cent editions of the standards indicated below.
Members of IEC and IS0 maintain registers of cur-
rently valid International Standards.
4 Principle
I SO 3696: 1987, Water for analytical laboratory use -
The detection of SaImoneIla species requires four
Specification and test methods.
successive stages.
IS0 5667-l : 1980, Water quality - Sampling -
4.1 Pre-enrichment
Part 7: Guidance on the design of sampling pro-
grammes.
Pre-enrichment is necessary to enable injured cells to
grow. If necessary, samples can be concentrated us-
IS0 5667-2:1991, Water quality - Sampling -
ing membrane filtration. The membrane filter with
Part 2: Guidance on sampling techniques.
cells, or a known volume of sample or its dilution, is
transferred to non-selective broth (buffered peptone
I SO 5667-3: 1994, Water quality - Sampling -
water) for incubation at the optimal temperature for
Part 3: Guidance on the preservation and handling of
mesophilic bacteria.
samples.
1
---------------------- Page: 5 ----------------------
Q IS0
IS0 6340: 1995(E)
4.2 Enrichment in selective liquid medium 5 Culture media and confirmation media
Use reagents of analytical quality for the preparation
A selective enrichment step is necessary to increase
of culture media, unless otherwise specified. Prepare
the proportion of SaImoneIla species in relation to
media using glass-distilled water, or water of equiv-
background flora. For this purpose, inoculum from
alent quality, complying with grade 3 of IS0 3696.
pre-enrichment broth is transferred to malachite
green/magnesium chloride (modified Rappaport-
If commercially available dehydrated media are used,
Vassiliadis) medium which is incubated at an elevated
prepare them according to the manufacturer ’s in-
temperature to increase its selectivity.
structions and add selective agents as supplements
to give the specified concentrations.
NOTE 1 For the detection of Salmonella typhi, which is
usually not important for water quality monitoring but may
All pH values given in this International Standard are
be required under special circumstances, selenite cystine
for media after sterilization; for pH correction, use
medium (also available as dehydrated complete medium
from different manufacturers) can be used for incubating sodium hydroxide or hydrochloric acid at concen-
the cultures at 36 “C + 2 “C for up to 24 h. In certain special
trations of 1 mol/l each.
epidemiological situations, addition of other media may be
necessary.
5.1 Culture media
5.1 .I Pre-enrichment medium: buffered peptone
4.3 Selection on agar media
water
Solid selective media are used after the liquid
5.1 .I .I
Composition
enrichment steps for the detection and isolation of
Salmonella species. In order to increase the prob-
Single
Double
ability of detecting Salmonella organisms, at least two
strength
strength
different media are inoculated from selective
enrichment cultures:
Peptone
log
20 g
- brilliant green/phenol red lactose agar; Sodium chloride (NaCI)
59 IQ
Disodium hydrogen phosphate
- xylose lysine deoxycholate agar;
dodecahydrate
(Na,HPO,.12H,O)
9g
18g
- bismuth sulfite agar (optional).
Potassium dihydrogen phos-
115 g 39
phate (KH,PO,)
Water to 1 000 ml to 1 000 ml
4.4 Confirmation
5.1 .I .2 Preparation
The occurrence of typical colonies of Salmonella spe-
cies on selective agar media is not sufficient evidence
Dissolve all the constituents in water by heating gen-
for the presence of Salmonella species. Therefore, it
tly, but do not boil the solution.
is necessary to subculture presumptive Salmonella
colonies on different media for biochemical and Adjust the pH to 7,2 + O,l, with sodium hydroxide
-
serological confirmation (see table I). solution or hydrochloric acid.
Dispense the medium into culture bottles/tubes.
NOTE 2 Commercially available identification kits suitable
for the identification of Salmonella species can be used in-
Sterilize the medium in the autoclave (6.1.2) at
stead of the tests listed in table I, provided that they are
used according to the manufacturer ’s instructions and on 121 “C + 1 “Cfor 15 min.
-
condition that they can be considered at least as reliable as
the tests listed in table 1. Store in a refrigerator for up to 3 months.
---------------------- Page: 6 ----------------------
IS0 6340: 1995(E)
Q IS0
5.1.3 Optional enrichment medium: selenite
5.1.2 Enrichment medium: malachite
cystine
green/magnesium chloride (modified
Rappaport-Vassiliadis medium)
5.1.3.1 Composition
Casein-peptone
59
5.1.2.1 Composition
L-Cystine WI g
Lactose
4g
Disodium hydrogen phosphate (Na,HPO,)
log
Basic medium
Sodium hydrogen selenite (NaHSeO,)
4g
Peptone, enzymatic digest of animal tissue
49 to 1 000 ml
Water
Peptone, from soybeans
lg
Sodium chloride (NaCI) 8g
5.1.3.2 Preparation
Dipotassium hydrogen phosphate trihydrate
(K2HP0,.3H20) O,4 g
Dissolve all the constituents in water by heating gen-
Potassium dihydrogen phosphate (KH,PO,) 08 g
tly, but do not boil the solution.
to 1 000 ml
Water
CAUTION - Do not sterilize the medium in the
autoclave. Apply sterile filtration instead, and do
Supplement 1 1)
not use the medium if red sediments appear.
Magnesium chloride hexahydrate (MgCI,.GH,O) 3L7 g
to 100 ml
Water
Adjust the pH to 7,0 + 0,2.
-
1) As this salt is very hygroscopic, it is advisable either to
WARNING - Inhalation of sodium hydrogen
store it in a dessicator or to dissolve the entire contents of a
selenite dust and direct contact with the skin is
newly opened container of magnesium chloride in such a way
that the mass concentration of magnesium chloride very dangerous. The dust irritates the eyes, skin
hexahydrate is 28,6 g/l in the final medium. The magnesium
and mucous membranes and can penetrate skin
chloride solution can be stored for a long time in a sealed con-
both as a powder and as a solution. It has long-
tainer.
term health effects and may be carcinogenic. Re-
action with acids liberates gaseous hydrogen
selenide, which is very dangerous if inhaled and
Supplement 2
irritate the eyes and mucous membranes. Sodium
Malachite green oxalate
014 g
hydrogen selenite and its solution must be han-
Water to 100 ml
dled under a hood using gloves and, if required, a
respirator mask should be used. Contact with ac-
ids must be avoided. Store in tightly closed con-
tainers in a well-ventilated area that is dry and
separated from acids.
5.1.2.2 Preparation
5.1.4 Selective solid media
Dissolve all the constituents of the basic medium in
5.1.4.1 Brilliant green/phenol red lactose agar
water by heating gently, but do not boil the solution.
(according to Edel and Kampelmacher)
Add the prepared magnesium chloride solution (sup-
plement I) and 10 ml of the malachite green solution
5.1.4.1 .I Composition
(supplement 2) to the basic medium.
Basic medium
Adjust the pH to 5,2 + O,l, with sodium hydroxide
-
Meat extract powder
5g
solution or hydrochloric acid.
Peptone, enzymatic digest of animal tissue
5g
Dispense about 10 ml of the medium into each cul- Disodium hydrogen phosphate (Na,HPO,)
lg
ture tube.
Sodium dihydrogen phosphate (NaH,PO,)
05 g
Agar about 15 g
Sterilize the medium in the autocl ave (6.1.2) at
Water
to 900 ml
1
115 “C + 1 “C for 15 min. I
-
3
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0 IS0
IS0 6340:1995(E)
Supplement
Supplement 1
Phenol red 0,4 g
Lactose log
Water to 100 ml
Sucrose
IQ
Phenol red a09 g
to 100 ml
Water
5.1.4.2.2 Preparation
Supplement 2
Dissolve all the constituents, including 20 ml of the
Brilliant green 0,5 g
phenol red solution (supplement), by heating to bring
to 100 ml
Water
to the boil.
Adjust the pH to 7,4 + - 0,l.
5.1.4.1.2 Preparation
CAUTION - To avoid overheating, do not prepare
portions larger than 1 litre at a time. Do not ster-
Dissolve all the constituents of the basic medium in
ilize the medium in the autoclave. After prep-
water,, and sterilize in the autoclave (6.1.2) at
aration, transfer to a water bath at 50 “C and pour
121 “C + 1 “Cfor 15 min.
-
into Petri dishes (6.7) as soon as the medium has
cooled.
Prepare supplement 1 by dissolving the constituents
in sterile water. Heat the solution in a water bath
(6.2) at 70 “C for 20 min. Cool it to 55 “C + 1 “C and
-
5.1.4.3 Bismuth sulfite agar (according to Wilson
use it immediately.
and Blair)
Prepare supplement 2 by dissolving the brilliant green
in the water. Store the solution for at least 1 day in the
5.1.4.3.1 Composition
dark to allow autosterilization to occur.
L
Add the prepared sugar/phenol red solution (sup- Basic medium
plement I) and 1 ml of the brilliant green solution
Meat extract
5g
(supplement 2) to the agar before distribution into
Peptone, enzymatic digest of animal tissue
IQ
Petri dishes (6.7); ensure that the final pH is
D(+)-Glucose
5g
7,0 + 0,l. Immediately before use, dry the agar plates
-
Disodium hydrogen phosphate (Na,HPO,)
4g
until the surface of the agar is dry. Use freshly pre-
Iron sulfate heptahydrate (FeSO,.7H,O)
0,3 g
pared plates.
Bismuth sulfite [Bi2(S0J3]
&I
Agar about 15 g
Water to 1 000 ml
5.1.4.2 Xylose lysine deoxycholate agar
1
Supplement
5.1.4.2.1 Composition
Brilliant green
0,5 g
Water
to 100 ml
Basic medium
3,5 g
D(+)-Xylose
59
L(+)
...
SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 6340:1998
01-februar-1998
Kakovost vode - Ugotavljanje prisotnosti vrst Salmonella
Water quality - Detection of Salmonella species
Qualité de l'eau -- Recherche et dénombrement de Salmonella
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 6340:1995
ICS:
07.100.20 Mikrobiologija vode Microbiology of water
SIST ISO 6340:1998 en
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
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IS0
INTERNATIONAL
6340
STANDARD
First edition
1995-12-01
Water quality - Detection of Salmonella
species
- Recherche de Salmonella
Qua/S de I ’eau
Reference number
IS0 6340:1995(E)
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SIST ISO 6340:1998
IS0 6340:1995(E)
Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (IS0 member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through IS0
technical committees. Each member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. IS0
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard IS0 6340 was prepared by Technical Committee
lSO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4, Microbiological
methods.
Annexes A and B of this International Standard are for information only.
0 IS0 1995
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
for Standardization
International Organization
titzerland
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Printed in Switzerland
II
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SIST ISO 6340:1998
0 IS0 IS0 6340: 1995(E)
Introduction
Salmonella species are bacteria which are widely distributed all over the
world. They are usually classified as pathogens, although their virulence
and pathogenesis vary widely. The natural hosts of Salmonella species
include humans, agricultural and domestic livestock and wild animals in-
cluding birds. Humans and animals may excrete these bacteria while
carrying them asymptomatically, as well as during disease. It is therefore
impossible to eliminate them from the environment. Due to the severe
diseases which can follow the infection of humans, the transmission of
Salmonella species via different vehicles has to be minimized.
Since water is one of the vehicles, the presence or absence of SaImoneh
species should be monitored in water. Salmonella species may be present
in all types of domestic and agricultural sewage, fresh waters, including
ground and drinking waters, and also sea water.
The detection of Salmonella in water usually requires a concentration step.
Since cells of Salmonella species may be injured in the aqueous environ-
ment, their detection in water usually requires a pre-enrichment step. The
procedure described in this International Standard consists of regular
enrichment(s), selection and confirmation steps.
. . .
III
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SIST ISO 6340:1998
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IS0 6340: 1995(E)
INTERNATIONAL STANDARD 0 ISo
Water quality - Detection of Salmonella species
WARNING - In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests for
detecting Salmonella species are undertaken in properly equipped laboratories, under the control
of skilled microbiologists only, and that great care is taken in the disposal of all incubated
materials.
IS0 6579:1993, Microbiology - General guidance on
1 Scope
methods for the detection of Salmonella.
This International Standard specifies a method for the
detection of SaImonella species in water samples for
3 Definitions
monitoring purposes. In special epidemiological situ-
ations, other media may also be required.
For the purposes of this International Standard, the
following definitions apply.
The method can be applied to all kinds of water, ex-
cept raw sewage.
3.1 Salmonella species: Gram-negative, oxidase-
negative, facultatively anaerobic, non-sporeforming,
rod-shaped bacteria which generally form colonies of
2 mm to 4 mm in diameter on solid selective media.
2 Normative references
They form typical colonies on solid selective media
and display the biochemical and serological charac-
The following standards contain provisions which,
teristics described when tests are carried out in ac-
through reference in this text, constitute provisions
cordance with this International Standard.
of this International Standard. At the time of publi-
cation, the editions indicated were valid. All standards
3.2 detection of SalmoneUa organisms: Determi-
are subject to revision, and parties to agreements
nation of the presence of these bacteria in a particular
based on this International Standard are encouraged
volume, when tests are carried out in accordance with
to investigate the possibility of applying the most re-
this International Standard.
cent editions of the standards indicated below.
Members of IEC and IS0 maintain registers of cur-
rently valid International Standards.
4 Principle
I SO 3696: 1987, Water for analytical laboratory use -
The detection of SaImoneIla species requires four
Specification and test methods.
successive stages.
IS0 5667-l : 1980, Water quality - Sampling -
4.1 Pre-enrichment
Part 7: Guidance on the design of sampling pro-
grammes.
Pre-enrichment is necessary to enable injured cells to
grow. If necessary, samples can be concentrated us-
IS0 5667-2:1991, Water quality - Sampling -
ing membrane filtration. The membrane filter with
Part 2: Guidance on sampling techniques.
cells, or a known volume of sample or its dilution, is
transferred to non-selective broth (buffered peptone
I SO 5667-3: 1994, Water quality - Sampling -
water) for incubation at the optimal temperature for
Part 3: Guidance on the preservation and handling of
mesophilic bacteria.
samples.
1
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SIST ISO 6340:1998
Q IS0
IS0 6340: 1995(E)
4.2 Enrichment in selective liquid medium 5 Culture media and confirmation media
Use reagents of analytical quality for the preparation
A selective enrichment step is necessary to increase
of culture media, unless otherwise specified. Prepare
the proportion of SaImoneIla species in relation to
media using glass-distilled water, or water of equiv-
background flora. For this purpose, inoculum from
alent quality, complying with grade 3 of IS0 3696.
pre-enrichment broth is transferred to malachite
green/magnesium chloride (modified Rappaport-
If commercially available dehydrated media are used,
Vassiliadis) medium which is incubated at an elevated
prepare them according to the manufacturer ’s in-
temperature to increase its selectivity.
structions and add selective agents as supplements
to give the specified concentrations.
NOTE 1 For the detection of Salmonella typhi, which is
usually not important for water quality monitoring but may
All pH values given in this International Standard are
be required under special circumstances, selenite cystine
for media after sterilization; for pH correction, use
medium (also available as dehydrated complete medium
from different manufacturers) can be used for incubating sodium hydroxide or hydrochloric acid at concen-
the cultures at 36 “C + 2 “C for up to 24 h. In certain special
trations of 1 mol/l each.
epidemiological situations, addition of other media may be
necessary.
5.1 Culture media
5.1 .I Pre-enrichment medium: buffered peptone
4.3 Selection on agar media
water
Solid selective media are used after the liquid
5.1 .I .I
Composition
enrichment steps for the detection and isolation of
Salmonella species. In order to increase the prob-
Single
Double
ability of detecting Salmonella organisms, at least two
strength
strength
different media are inoculated from selective
enrichment cultures:
Peptone
log
20 g
- brilliant green/phenol red lactose agar; Sodium chloride (NaCI)
59 IQ
Disodium hydrogen phosphate
- xylose lysine deoxycholate agar;
dodecahydrate
(Na,HPO,.12H,O)
9g
18g
- bismuth sulfite agar (optional).
Potassium dihydrogen phos-
115 g 39
phate (KH,PO,)
Water to 1 000 ml to 1 000 ml
4.4 Confirmation
5.1 .I .2 Preparation
The occurrence of typical colonies of Salmonella spe-
cies on selective agar media is not sufficient evidence
Dissolve all the constituents in water by heating gen-
for the presence of Salmonella species. Therefore, it
tly, but do not boil the solution.
is necessary to subculture presumptive Salmonella
colonies on different media for biochemical and Adjust the pH to 7,2 + O,l, with sodium hydroxide
-
serological confirmation (see table I). solution or hydrochloric acid.
Dispense the medium into culture bottles/tubes.
NOTE 2 Commercially available identification kits suitable
for the identification of Salmonella species can be used in-
Sterilize the medium in the autoclave (6.1.2) at
stead of the tests listed in table I, provided that they are
used according to the manufacturer ’s instructions and on 121 “C + 1 “Cfor 15 min.
-
condition that they can be considered at least as reliable as
the tests listed in table 1. Store in a refrigerator for up to 3 months.
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IS0 6340: 1995(E)
Q IS0
5.1.3 Optional enrichment medium: selenite
5.1.2 Enrichment medium: malachite
cystine
green/magnesium chloride (modified
Rappaport-Vassiliadis medium)
5.1.3.1 Composition
Casein-peptone
59
5.1.2.1 Composition
L-Cystine WI g
Lactose
4g
Disodium hydrogen phosphate (Na,HPO,)
log
Basic medium
Sodium hydrogen selenite (NaHSeO,)
4g
Peptone, enzymatic digest of animal tissue
49 to 1 000 ml
Water
Peptone, from soybeans
lg
Sodium chloride (NaCI) 8g
5.1.3.2 Preparation
Dipotassium hydrogen phosphate trihydrate
(K2HP0,.3H20) O,4 g
Dissolve all the constituents in water by heating gen-
Potassium dihydrogen phosphate (KH,PO,) 08 g
tly, but do not boil the solution.
to 1 000 ml
Water
CAUTION - Do not sterilize the medium in the
autoclave. Apply sterile filtration instead, and do
Supplement 1 1)
not use the medium if red sediments appear.
Magnesium chloride hexahydrate (MgCI,.GH,O) 3L7 g
to 100 ml
Water
Adjust the pH to 7,0 + 0,2.
-
1) As this salt is very hygroscopic, it is advisable either to
WARNING - Inhalation of sodium hydrogen
store it in a dessicator or to dissolve the entire contents of a
selenite dust and direct contact with the skin is
newly opened container of magnesium chloride in such a way
that the mass concentration of magnesium chloride very dangerous. The dust irritates the eyes, skin
hexahydrate is 28,6 g/l in the final medium. The magnesium
and mucous membranes and can penetrate skin
chloride solution can be stored for a long time in a sealed con-
both as a powder and as a solution. It has long-
tainer.
term health effects and may be carcinogenic. Re-
action with acids liberates gaseous hydrogen
selenide, which is very dangerous if inhaled and
Supplement 2
irritate the eyes and mucous membranes. Sodium
Malachite green oxalate
014 g
hydrogen selenite and its solution must be han-
Water to 100 ml
dled under a hood using gloves and, if required, a
respirator mask should be used. Contact with ac-
ids must be avoided. Store in tightly closed con-
tainers in a well-ventilated area that is dry and
separated from acids.
5.1.2.2 Preparation
5.1.4 Selective solid media
Dissolve all the constituents of the basic medium in
5.1.4.1 Brilliant green/phenol red lactose agar
water by heating gently, but do not boil the solution.
(according to Edel and Kampelmacher)
Add the prepared magnesium chloride solution (sup-
plement I) and 10 ml of the malachite green solution
5.1.4.1 .I Composition
(supplement 2) to the basic medium.
Basic medium
Adjust the pH to 5,2 + O,l, with sodium hydroxide
-
Meat extract powder
5g
solution or hydrochloric acid.
Peptone, enzymatic digest of animal tissue
5g
Dispense about 10 ml of the medium into each cul- Disodium hydrogen phosphate (Na,HPO,)
lg
ture tube.
Sodium dihydrogen phosphate (NaH,PO,)
05 g
Agar about 15 g
Sterilize the medium in the autocl ave (6.1.2) at
Water
to 900 ml
1
115 “C + 1 “C for 15 min. I
-
3
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SIST ISO 6340:1998
0 IS0
IS0 6340:1995(E)
Supplement
Supplement 1
Phenol red 0,4 g
Lactose log
Water to 100 ml
Sucrose
IQ
Phenol red a09 g
to 100 ml
Water
5.1.4.2.2 Preparation
Supplement 2
Dissolve all the constituents, including 20 ml of the
Brilliant green 0,5 g
phenol red solution (supplement), by heating to bring
to 100 ml
Water
to the boil.
Adjust the pH to 7,4 + - 0,l.
5.1.4.1.2 Preparation
CAUTION - To avoid overheating, do not prepare
portions larger than 1 litre at a time. Do not ster-
Dissolve all the constituents of the basic medium in
ilize the medium in the autoclave. After prep-
water,, and sterilize in the autoclave (6.1.2) at
aration, transfer to a water bath at 50 “C and pour
121 “C + 1 “Cfor 15 min.
-
into Petri dishes (6.7) as soon as the medium has
cooled.
Prepare supplement 1 by dissolving the constituents
in sterile water. Heat the solution in a water bath
(6.2) at 70 “C for 20 min. Cool it to 55 “C + 1 “C and
-
5.1.4.3 Bismuth sulfite agar (according to Wilson
use it immediately.
and Blair)
Prepare supplement 2 by dissolving the brilliant green
in the water. Store the solution for at least 1 day in the
5.1.4.3.1 Composition
dark to allow autosterilization to occur.
L
Add the prepared sugar/phenol red solution (sup- Basic medium
plement I) and 1 ml of the brilliant green solution
Meat extract
5g
(supplement 2) to the agar before distribution into
Peptone, enzymatic digest of animal tissue
IQ
Petri dishes (6.7); ensure that the final pH is
D(+)-Glucose
5g
7,0 + 0,l. Immediately before use, dr
...
NORME
Iso
INTERNATIONALE
6340
Première édition
1995-12-01
Qualité de l’eau - Recherche de
Salmonella
Wa ter quality - Detection of Salmonella species
Numéro de référence
ISO 6340:1995(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 6340: 1995(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 6340 a été élaborée par le comité technique
ISO/K 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 4, Méthodes microbiologi-
ques.
Les annexes A et B de la présente Norme internationale sont données
uniquement à titre d’information.
0 ISO 1995
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée SOUS quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-1 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
---------------------- Page: 2 ----------------------
6 ISO ISO 6340: 1995(F)
Introduction
Les Sa/mone//a sont des bactéries qui sont largement répandues à travers
le monde. Les Sa/mone//a sont en général considérées comme
pathogènes bien que leur virulence et leur pouvoir pathogène varient
énormément. Les hôtes naturels des Sa/mone//a sont la population hu-
maine, le bétail, les animaux domestiques, ainsi que les animaux sau-
vages, y compris les oiseaux. Êtres humains et animaux peuvent excréter
des Sa/mone//a tout en étant des porteurs asymptomatiques, de même
qu’en cas de maladies. Par conséquent, il est impossible de les éliminer
de l’environnement. Étant donné les affections graves qui peuvent résulter
de l’infection des êtres humains, la transmission des Salmonella par I’in-
termédiaire de différents vecteurs doit être réduite.
Dans la mesure où l’eau fait partie de ces vecteurs, il convient de contrôler
la présence ou l’absence de Salmonella dans l’eau. Les Salmonella peu-
vent être présentes dans les eaux usées agricoles et domestiques, les
eaux douces, y compris les eaux destinées à la consommation humaine
et les eaux souterraines, ainsi que dans les eaux de mer.
La recherche de Salmonella dans l’eau requiert habituellement une étape
de concentration. Dans la mesure où les Sa/mone//a peuvent avoir subi
une altération dans l’environnement aqueux, leur recherche dans l’eau
nécessite habituellement une étape de préenrichissement. Le mode opé-
ratoire décrit dans la présente Norme internationale consiste en des pha-
ses régulières d’enrichissement(s), de sélection et de confirmation.
. . .
III
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 6340:1995(F)
NORME INTERNATIONALE 0 ISO
Qualité de l’eau - Recherche de Salrnonella
AVERTISSEMENT - Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel
d‘effectuer les essais de recherche de Salmonella dans des laboratoires correctement équipés,
uniquement sous la direction de microbiologistes compétents, et de faire très attention à
l’élimination de toutes les substances incubées.
ISO 5667-3: 1994, Qualité de l’eau - Échantillonnage
1 Domaine d’application
- Partie 3: Guide général pour la conservation et la
manipulation des échantillons.
La présente Norme internationale prescrit une mé-
thode pour la recherche de Salmonella dans des
ISO 6579: 1993, Microbiologie - Directives générales
échantillons d’eau à des fins de contrôle. Dans cer-
concernant les méthodes de recherche des
taines situations épidémiologiques, il peut être né-
Salmonella.
cessaire d’utiliser des milieux supplémentaires.
La méthode peut être applicable à tous les types
d’eaux, excepté les eaux usées brutes. ,
3 Définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale,
2 Références normatives
les définitions suivantes s’appliquent.
Les normes suivantes contiennent des dispositions
qui, par suite de la référence qui en est faite, consti-
3.1 Sa/mone//a: Bactéries Gram-négatives, oxydase
tuent des dispositions valables pour la présente
négatives, anaérobies facultatives, ne formant pas de
Norme internationale. Au moment de la publication,
spore, en forme de bâtonnet, qui forment géné-
les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute
ralement des colonies typiques sur milieu sélectif so-
norme est sujette à révision et les parties prenantes
lide d’un diamètre compris entre 2 mm et 4 mm. Elles
des accords fondés sur la présente Norme internatio-
présentent les caractéristiques biochimiques et
nale sont invitées à rechercher la possibilité d’appli-
sérologiques décrites lorsque les essais sont effec-
quer les éditions les plus récentes des normes
tués conformément à la présente Norme internatio-
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO
nale.
possèdent le registre des Normes internationales en
vigueur à un moment donné.
3.2 recherche de Salmonella: Mise en évidence de
la présence de ces bactéries dans un volume particu-
ISO 3696: 1987, Eau pour laboratoire à usage analyti-
lier, lorsque des essais sont effectués conformément
- Spécification et méthodes d’essai.
que
à la présente Norme internationale.
ISO 5667-l : 1980, Qualité de l’eau - Échantillonnage
- Partie 1: Guide général pour l’établissement des
programmes d’échantillonnage.
4 Principe
ISO 5667-2:1991, Qualité de l’eau - Échantillonnage
- Partie 2: Guide général sur les techniques La recherche de Salmonella nécessite quatre phases
d’échantillonnage. successives.
1
---------------------- Page: 4 ----------------------
0 ISO
ISO 6340: 1995(F)
NOTE 2 Des kits d’identification disponibles dans le
4.1 Préenrichissement
commerce, convenant pour l’identification des SaImonella
peuvent être utilises au lieu des essais figurant dans le ta-
Un préenrichissement est nécessaire pour permettre
bleau 1, sous réserve qu’ils soient utilisés conformément
aux cellules ayant subi une altération de croître. Si
aux instructions du fabricant et qu’ils soient considérés
nécessaire, les échantillons peuvent être concentrés
comme au moins aussi fiables que les essais indiqués dans
par filtration sur membrane. La membrane filtrante
le tableau 1.
ensemencée, ou un volume connu de l’échantillon ou
de sa dilution, est transféré dans un bouillon non sé-
lectif (eau peptonée tamponnée) pour incubation à la 5 Milieux de culture et milieux de
température optimale pour les bactéries mésophiles.
confirmation
Sauf indication contraire, utiliser des réactifs de qua-
4.2 Enrichissement sur milieu sélectif liquide
lité analytique pour la préparation des milieux de
culture. Préparer les milieux en utilisant de l’eau dis-
Une phase d’enrichissement sélectif est nécessaire
tillée ou de l’eau de pureté équivalente, conforme à
pour augmenter la proportion de Salmonella par rap-
la qualité 3 de I’ISO 3696.
port à la flore interférente. Dans ce but, un inoculum
provenant du bouillon de préenrichissement est en-
Lorsque des milieux déshydratés disponibles dans le
semencé sur milieu au vert malachite et au chlorure
commerce sont utilisés, les préparer conformément
de magnésium (Rappaport-Vassiliadis modifié), et
aux instructions du fabricant et ajouter les agents sé-
incubé à température élevée pour augmenter la
lectifs, en tant que suppléments, afin d’obtenir les
sélectivité.
concentrations requises.
NOTE 1 Pour la recherche de Salmonella typhi, qui n’est
Toutes les valeurs de pH données dans la présente
généralement pas importante pour le contrôle de la qualité
Norme internationale sont données pour les milieux
de l’eau, mais qui peut être rendue nécessaire dans des
après stérilisation; pour la correction du pH, utiliser de
circonstances particulières, un milieu à la sélénite-cystine
l’hydroxyde de sodium ou de l’acide chlorhydrique à
(disponible également sous forme de milieu complet dés-
1 mol/1 chacune.
hydrate auprès de différents fabricants) peut être utilisé, en
incubant les cultures à 36 “C + 2 “C pendant une période
allant jusqu’à 24 h. Pour certaines situations épidémiolo-
5.1 Milieux de culture
giques particulières, il peut être nécessaire d’utiliser d’au-
tres milieux.
5.1.1 Milieu de préenrichissement: eau peptonée
tamponnée
4.3 Sélection sur milieux gélosés
5.1 .l .l Composition
Des milieux sélectifs solides sont utilisés après les
phases d’enrichissement pour la recherche et I’iso-
lement des Salmonella. Afin d’accroître la probabilité
Concen- Concen-
tration tration
de détecter des Salmonella, au moins deux milieux
simple double
différents sont ensemencés à partir des cultures en
milieu sélectif d’enrichissement:
Peptone
WJ 20 g
- la gélose lactosée au rouge de phénol et au vert
Chlorure de sodium (NaCI)
59 WI
brillant;
Hydrogénophosphate disodique
dodécahydraté
- la gélose lysine xylose désoxycholate; (Na,HPO,,l ZH,O)
99 WI
Dihydrogénophosphate de po-
- la gélose au sulfite de bismuth (facultatif).
g
tassium (KH,PO,) 1,5 39
Eau, q.s.p. 1 000 ml 1 000 ml
4.4 Confirmation
5.1 .1.2 Préparation
La présence de colonies typiques de Sdmonella sur
milieux gélosés sélectifs n’est pas une preuve suffi-
Dissoudre tous les composants dans de l’eau en
sante de la présence de Salmonella. En conséquence,
chauffant doucement, sans porter à ébullition.
il est nécessaire de repiquer les colonies présumées
de Sdmoneh sur différents milieux pour confirmation Ajuster le pH à 7,2 + 0,l avec une solution d’hy-
biochimique et sérologique (voir tableau 1). droxyde de sodium ou avec de l’acide chlorhydrique.
2
---------------------- Page: 5 ----------------------
0 ISO ISO 6340:1995(F)
Répartir le milieu dans des flacons ou des tubes de Ajuster le pH à 5,2 + 0,l avec une solution d’hy-
droxyde de sodium ou d’acide chlorhydrique.
culture.
le milieu à l’autoclave (6.1.2) à Répartir environ 10 ml du milieu dans chaque tube de
Stériliser
culture.
121 OC + 1 “C pendant 15 min.
-
Conserver au réfrigérateur pendant une période Stériliser le milieu à l’autoclave (6.1.2) à
maximale de 3 mois. 115 “C + 1 “C pendant 15 min.
-
5.1.2 Milieu d’enrichissement: milieu au vert
5.1.3 Milieu d’enrichissement facultatif: milieu à
malachite et au chlorure de magnésium (milieu de
la sélénite-cystine
Rappaport-Vassiliadis modifié)
5.1.3.1 Composition
5.1.2.1 Composition
Peptone de caséine
5g
Milieu de base
L-Cystine
WI g
Peptone, hydrolysat enzymatique de tissu
Lactose
animal - QI
4g
Hydrogénophosphate disodique (Na,HPO,)
Peptone papaïnique 1og
QI
Hydrogénosélénite de sodium (NaHSeO,)
Chlorure de sodium (NaCI) 4g
8g
Eau, q.s.p. 1 000 ml
Hydrogénophosphate de potassium trihydraté
(KJ-IP04,3H,0) 0,4 g
Dihydrogénophosphate de potassium (KH,PO,)
W g
Eau, q.s.p. 1 000 ml
5.1.3.2 Préparation
Dissoudre tous les composants dans de l’eau en
Supplément 1 1)
chauffant doucement, sans porter à ébullition.
Chlorure de magnésium hexahydraté
(MgCI,,6H20) 31,7 g
ATTENTION - Ne pas stériliser le milieu à I’auto-
Eau, q.s.p. 100 ml
clave. Procéder à la place à une filtration stérili-
1) Étant donné que ce sel est très hygroscopique, il est re-
sante; et ne pas utiliser ce milieu en cas
commandé de le conserver dans un dessicateur ou de dissou-
d’apparition de sédiments rouges.
dre le contenu total provenant d’un récipient de chlorure de
magnésium ayant été ouvert récemment, de manière à ce que
la concentration en masse du chlorure de magnésium Ajuster le pH à 7,0 + 0,2.
-
hexahydraté soit de 28,6 g/l dans le milieu final. La solution de
chlorure de magnésium peut être conservée longtemps dans
L’inhalation de poussières
AVERTISSEMENT -
un récipient fermé.
d’hydrogénosélénite de sodium et le contact avec
la peau sont très dangereux. Les poussières irri-
tent les yeux, la peau et les membranes
Supplément 2
muqueuses et I’hydrogénosélénite de sodium peut
Oxalate de vert malachite
0,4 g
pénétrer la peau à la fois sous forme de poudre
Eau, q.s.p. 100 ml
ou en solution. II provoque des effets sur la santé
à long terme et peut être cancérigène. Les réac-
tions avec des acides libèrent de I’hydrure de sé-
lénium gazeux, qui est très dangereux s’il est
5.1.2.2 Préparation
inhalé et irrite les yeux et les membranes
muqueuses. L’hydrogénosélénite de sodium et ses
Dissoudre tous les composants du milieu de base
solutions doivent être manipulés sous une hotte
dans de l’eau en chauffant doucement, sans porter à
en utilisant des gants et, si nécessaire, il convient
ébullition.
d’utiliser un masque. Le contact avec des acides
Ajouter la solution de chlorure de magnésium prépa- doit être évité. Conserver dans des récipients fer-
rée (supplément 1) et 10 ml de solution au vert més hermétiquement, dans un lieu bien ventilé et
malachite (supplément 2) au milieu de base. sec, et séparé des acides.
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 6340: 1995(F)
5.1.4.2 Gélose lysine xylose désoxycholate
5.1.4 Miiieux sélectifs solides
5.1.4.2.1 Composition
5.1.4.1 Gélose lactosée au rouge de phénol et au
vert brillant (selon Edel et Kampelmacher)
Milieu de base
D(+)-Xylose 315 g
L( +)-Lysine 59
5.1.4.1 .l Composition
Désoxycholate de sodium
z5 g
Extrait de levure
39
Milieu de base
Saccharose 7,5 g
Extrait de viande en poudre
5g
Lactose
7,5 g
Peptone, hydrolysat enzymatique de tissu
Chlorure de sodium (NaCI)
5g
animal
5g
Thiosulfate de sodium (Na,S,O,)
68 g
Hydrogénophosphate disodique (Na,HPO,)
1c.l
Citrate de fer(lll) ammoniacal 03 g
Dihydrogénophosphate de sodium (NaH,PO,)
04 g
Gélose environ 13 g
Gélose environ 15 g
Eau, q.s.p. 1 000 ml
Eau, q.s.p. 900 ml
Supplément
Supplément 1
Rouge de phénol
a4 g
Lactose
1og
Eau, qsp. 100 ml
Saccharose
109
Rouge de phénol o,og g
100 ml
Eau, q.s.p.
5.1.4.2.2 Préparation
Dissoudre tous les composants, y compris 20 ml de
Supplément 2
solution au rouge de phénol (supplément) en chauf-
Vert brillant 0,5 g
fant jusqu’à ébullition.
100 ml
Eau, q.s.p.
Ajuster le pH à 7,4 + 0,l.
-
ATTENTION - Ne pas surchauffer, ne pas prépa-
5.1.4.1.2 Préparation
rer de portions supérieures à 1 litre à la fois. Ne
pas stériliser le milieu à l’autoclave. Après prépa-
Dissoudre tous les composants du milieu de base
ration, transférer dans un bain d’eau à 50 “C et
dans de l’eau et stériliser à l’autoclave (6.1.2) à
verser dans des boîtes de Petri (6.7) dès que le
121 “C + 1 “C pendant 15 min.
milieu a refroidi.
Préparer le supplément 1 en dissolvant les compo-
5.1.4.3 Gélose au sulfite de bismuth (selon Wilson
sants dans de l’eau stérile. Chauffer la solution dans
et Blair)
un bain d’eau (6.2) à 70 “C pendant 20 min. La refroi-
dir à 55 “C + 1 “C et l’utiliser immédiatement.
5.1.4.3.1 Composition
Préparer le supplément 2 en dissolvant du vert brillant
dans de l’eau. Conserver la solution pendant au moins
Milieu de base
1 jour à l’obscurité afin qu’une autostérilisation se
Extrait de viande
5g
produise.
Peptone, hydrolysat enzymatique de tissu
animal
WI
Ajouter la solution de sucres au rouge de phénol pré-
o(+)-Glucose
5g
parée (supplément 1) et 1 ml de la solution au vert
Hydrogénophosphate disodique (Na,HPO,)
brillant (supplément 2) à la gélose avant répartition 4g
dans des boîtes de Petri (6.7); s’assurer que l
...
NORME
Iso
INTERNATIONALE
6340
Première édition
1995-12-01
Qualité de l’eau - Recherche de
Salmonella
Wa ter quality - Detection of Salmonella species
Numéro de référence
ISO 6340:1995(F)
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ISO 6340: 1995(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 6340 a été élaborée par le comité technique
ISO/K 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 4, Méthodes microbiologi-
ques.
Les annexes A et B de la présente Norme internationale sont données
uniquement à titre d’information.
0 ISO 1995
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée SOUS quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-1 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
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6 ISO ISO 6340: 1995(F)
Introduction
Les Sa/mone//a sont des bactéries qui sont largement répandues à travers
le monde. Les Sa/mone//a sont en général considérées comme
pathogènes bien que leur virulence et leur pouvoir pathogène varient
énormément. Les hôtes naturels des Sa/mone//a sont la population hu-
maine, le bétail, les animaux domestiques, ainsi que les animaux sau-
vages, y compris les oiseaux. Êtres humains et animaux peuvent excréter
des Sa/mone//a tout en étant des porteurs asymptomatiques, de même
qu’en cas de maladies. Par conséquent, il est impossible de les éliminer
de l’environnement. Étant donné les affections graves qui peuvent résulter
de l’infection des êtres humains, la transmission des Salmonella par I’in-
termédiaire de différents vecteurs doit être réduite.
Dans la mesure où l’eau fait partie de ces vecteurs, il convient de contrôler
la présence ou l’absence de Salmonella dans l’eau. Les Salmonella peu-
vent être présentes dans les eaux usées agricoles et domestiques, les
eaux douces, y compris les eaux destinées à la consommation humaine
et les eaux souterraines, ainsi que dans les eaux de mer.
La recherche de Salmonella dans l’eau requiert habituellement une étape
de concentration. Dans la mesure où les Sa/mone//a peuvent avoir subi
une altération dans l’environnement aqueux, leur recherche dans l’eau
nécessite habituellement une étape de préenrichissement. Le mode opé-
ratoire décrit dans la présente Norme internationale consiste en des pha-
ses régulières d’enrichissement(s), de sélection et de confirmation.
. . .
III
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ISO 6340:1995(F)
NORME INTERNATIONALE 0 ISO
Qualité de l’eau - Recherche de Salrnonella
AVERTISSEMENT - Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel
d‘effectuer les essais de recherche de Salmonella dans des laboratoires correctement équipés,
uniquement sous la direction de microbiologistes compétents, et de faire très attention à
l’élimination de toutes les substances incubées.
ISO 5667-3: 1994, Qualité de l’eau - Échantillonnage
1 Domaine d’application
- Partie 3: Guide général pour la conservation et la
manipulation des échantillons.
La présente Norme internationale prescrit une mé-
thode pour la recherche de Salmonella dans des
ISO 6579: 1993, Microbiologie - Directives générales
échantillons d’eau à des fins de contrôle. Dans cer-
concernant les méthodes de recherche des
taines situations épidémiologiques, il peut être né-
Salmonella.
cessaire d’utiliser des milieux supplémentaires.
La méthode peut être applicable à tous les types
d’eaux, excepté les eaux usées brutes. ,
3 Définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale,
2 Références normatives
les définitions suivantes s’appliquent.
Les normes suivantes contiennent des dispositions
qui, par suite de la référence qui en est faite, consti-
3.1 Sa/mone//a: Bactéries Gram-négatives, oxydase
tuent des dispositions valables pour la présente
négatives, anaérobies facultatives, ne formant pas de
Norme internationale. Au moment de la publication,
spore, en forme de bâtonnet, qui forment géné-
les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute
ralement des colonies typiques sur milieu sélectif so-
norme est sujette à révision et les parties prenantes
lide d’un diamètre compris entre 2 mm et 4 mm. Elles
des accords fondés sur la présente Norme internatio-
présentent les caractéristiques biochimiques et
nale sont invitées à rechercher la possibilité d’appli-
sérologiques décrites lorsque les essais sont effec-
quer les éditions les plus récentes des normes
tués conformément à la présente Norme internatio-
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO
nale.
possèdent le registre des Normes internationales en
vigueur à un moment donné.
3.2 recherche de Salmonella: Mise en évidence de
la présence de ces bactéries dans un volume particu-
ISO 3696: 1987, Eau pour laboratoire à usage analyti-
lier, lorsque des essais sont effectués conformément
- Spécification et méthodes d’essai.
que
à la présente Norme internationale.
ISO 5667-l : 1980, Qualité de l’eau - Échantillonnage
- Partie 1: Guide général pour l’établissement des
programmes d’échantillonnage.
4 Principe
ISO 5667-2:1991, Qualité de l’eau - Échantillonnage
- Partie 2: Guide général sur les techniques La recherche de Salmonella nécessite quatre phases
d’échantillonnage. successives.
1
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0 ISO
ISO 6340: 1995(F)
NOTE 2 Des kits d’identification disponibles dans le
4.1 Préenrichissement
commerce, convenant pour l’identification des SaImonella
peuvent être utilises au lieu des essais figurant dans le ta-
Un préenrichissement est nécessaire pour permettre
bleau 1, sous réserve qu’ils soient utilisés conformément
aux cellules ayant subi une altération de croître. Si
aux instructions du fabricant et qu’ils soient considérés
nécessaire, les échantillons peuvent être concentrés
comme au moins aussi fiables que les essais indiqués dans
par filtration sur membrane. La membrane filtrante
le tableau 1.
ensemencée, ou un volume connu de l’échantillon ou
de sa dilution, est transféré dans un bouillon non sé-
lectif (eau peptonée tamponnée) pour incubation à la 5 Milieux de culture et milieux de
température optimale pour les bactéries mésophiles.
confirmation
Sauf indication contraire, utiliser des réactifs de qua-
4.2 Enrichissement sur milieu sélectif liquide
lité analytique pour la préparation des milieux de
culture. Préparer les milieux en utilisant de l’eau dis-
Une phase d’enrichissement sélectif est nécessaire
tillée ou de l’eau de pureté équivalente, conforme à
pour augmenter la proportion de Salmonella par rap-
la qualité 3 de I’ISO 3696.
port à la flore interférente. Dans ce but, un inoculum
provenant du bouillon de préenrichissement est en-
Lorsque des milieux déshydratés disponibles dans le
semencé sur milieu au vert malachite et au chlorure
commerce sont utilisés, les préparer conformément
de magnésium (Rappaport-Vassiliadis modifié), et
aux instructions du fabricant et ajouter les agents sé-
incubé à température élevée pour augmenter la
lectifs, en tant que suppléments, afin d’obtenir les
sélectivité.
concentrations requises.
NOTE 1 Pour la recherche de Salmonella typhi, qui n’est
Toutes les valeurs de pH données dans la présente
généralement pas importante pour le contrôle de la qualité
Norme internationale sont données pour les milieux
de l’eau, mais qui peut être rendue nécessaire dans des
après stérilisation; pour la correction du pH, utiliser de
circonstances particulières, un milieu à la sélénite-cystine
l’hydroxyde de sodium ou de l’acide chlorhydrique à
(disponible également sous forme de milieu complet dés-
1 mol/1 chacune.
hydrate auprès de différents fabricants) peut être utilisé, en
incubant les cultures à 36 “C + 2 “C pendant une période
allant jusqu’à 24 h. Pour certaines situations épidémiolo-
5.1 Milieux de culture
giques particulières, il peut être nécessaire d’utiliser d’au-
tres milieux.
5.1.1 Milieu de préenrichissement: eau peptonée
tamponnée
4.3 Sélection sur milieux gélosés
5.1 .l .l Composition
Des milieux sélectifs solides sont utilisés après les
phases d’enrichissement pour la recherche et I’iso-
lement des Salmonella. Afin d’accroître la probabilité
Concen- Concen-
tration tration
de détecter des Salmonella, au moins deux milieux
simple double
différents sont ensemencés à partir des cultures en
milieu sélectif d’enrichissement:
Peptone
WJ 20 g
- la gélose lactosée au rouge de phénol et au vert
Chlorure de sodium (NaCI)
59 WI
brillant;
Hydrogénophosphate disodique
dodécahydraté
- la gélose lysine xylose désoxycholate; (Na,HPO,,l ZH,O)
99 WI
Dihydrogénophosphate de po-
- la gélose au sulfite de bismuth (facultatif).
g
tassium (KH,PO,) 1,5 39
Eau, q.s.p. 1 000 ml 1 000 ml
4.4 Confirmation
5.1 .1.2 Préparation
La présence de colonies typiques de Sdmonella sur
milieux gélosés sélectifs n’est pas une preuve suffi-
Dissoudre tous les composants dans de l’eau en
sante de la présence de Salmonella. En conséquence,
chauffant doucement, sans porter à ébullition.
il est nécessaire de repiquer les colonies présumées
de Sdmoneh sur différents milieux pour confirmation Ajuster le pH à 7,2 + 0,l avec une solution d’hy-
biochimique et sérologique (voir tableau 1). droxyde de sodium ou avec de l’acide chlorhydrique.
2
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0 ISO ISO 6340:1995(F)
Répartir le milieu dans des flacons ou des tubes de Ajuster le pH à 5,2 + 0,l avec une solution d’hy-
droxyde de sodium ou d’acide chlorhydrique.
culture.
le milieu à l’autoclave (6.1.2) à Répartir environ 10 ml du milieu dans chaque tube de
Stériliser
culture.
121 OC + 1 “C pendant 15 min.
-
Conserver au réfrigérateur pendant une période Stériliser le milieu à l’autoclave (6.1.2) à
maximale de 3 mois. 115 “C + 1 “C pendant 15 min.
-
5.1.2 Milieu d’enrichissement: milieu au vert
5.1.3 Milieu d’enrichissement facultatif: milieu à
malachite et au chlorure de magnésium (milieu de
la sélénite-cystine
Rappaport-Vassiliadis modifié)
5.1.3.1 Composition
5.1.2.1 Composition
Peptone de caséine
5g
Milieu de base
L-Cystine
WI g
Peptone, hydrolysat enzymatique de tissu
Lactose
animal - QI
4g
Hydrogénophosphate disodique (Na,HPO,)
Peptone papaïnique 1og
QI
Hydrogénosélénite de sodium (NaHSeO,)
Chlorure de sodium (NaCI) 4g
8g
Eau, q.s.p. 1 000 ml
Hydrogénophosphate de potassium trihydraté
(KJ-IP04,3H,0) 0,4 g
Dihydrogénophosphate de potassium (KH,PO,)
W g
Eau, q.s.p. 1 000 ml
5.1.3.2 Préparation
Dissoudre tous les composants dans de l’eau en
Supplément 1 1)
chauffant doucement, sans porter à ébullition.
Chlorure de magnésium hexahydraté
(MgCI,,6H20) 31,7 g
ATTENTION - Ne pas stériliser le milieu à I’auto-
Eau, q.s.p. 100 ml
clave. Procéder à la place à une filtration stérili-
1) Étant donné que ce sel est très hygroscopique, il est re-
sante; et ne pas utiliser ce milieu en cas
commandé de le conserver dans un dessicateur ou de dissou-
d’apparition de sédiments rouges.
dre le contenu total provenant d’un récipient de chlorure de
magnésium ayant été ouvert récemment, de manière à ce que
la concentration en masse du chlorure de magnésium Ajuster le pH à 7,0 + 0,2.
-
hexahydraté soit de 28,6 g/l dans le milieu final. La solution de
chlorure de magnésium peut être conservée longtemps dans
L’inhalation de poussières
AVERTISSEMENT -
un récipient fermé.
d’hydrogénosélénite de sodium et le contact avec
la peau sont très dangereux. Les poussières irri-
tent les yeux, la peau et les membranes
Supplément 2
muqueuses et I’hydrogénosélénite de sodium peut
Oxalate de vert malachite
0,4 g
pénétrer la peau à la fois sous forme de poudre
Eau, q.s.p. 100 ml
ou en solution. II provoque des effets sur la santé
à long terme et peut être cancérigène. Les réac-
tions avec des acides libèrent de I’hydrure de sé-
lénium gazeux, qui est très dangereux s’il est
5.1.2.2 Préparation
inhalé et irrite les yeux et les membranes
muqueuses. L’hydrogénosélénite de sodium et ses
Dissoudre tous les composants du milieu de base
solutions doivent être manipulés sous une hotte
dans de l’eau en chauffant doucement, sans porter à
en utilisant des gants et, si nécessaire, il convient
ébullition.
d’utiliser un masque. Le contact avec des acides
Ajouter la solution de chlorure de magnésium prépa- doit être évité. Conserver dans des récipients fer-
rée (supplément 1) et 10 ml de solution au vert més hermétiquement, dans un lieu bien ventilé et
malachite (supplément 2) au milieu de base. sec, et séparé des acides.
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ISO 6340: 1995(F)
5.1.4.2 Gélose lysine xylose désoxycholate
5.1.4 Miiieux sélectifs solides
5.1.4.2.1 Composition
5.1.4.1 Gélose lactosée au rouge de phénol et au
vert brillant (selon Edel et Kampelmacher)
Milieu de base
D(+)-Xylose 315 g
L( +)-Lysine 59
5.1.4.1 .l Composition
Désoxycholate de sodium
z5 g
Extrait de levure
39
Milieu de base
Saccharose 7,5 g
Extrait de viande en poudre
5g
Lactose
7,5 g
Peptone, hydrolysat enzymatique de tissu
Chlorure de sodium (NaCI)
5g
animal
5g
Thiosulfate de sodium (Na,S,O,)
68 g
Hydrogénophosphate disodique (Na,HPO,)
1c.l
Citrate de fer(lll) ammoniacal 03 g
Dihydrogénophosphate de sodium (NaH,PO,)
04 g
Gélose environ 13 g
Gélose environ 15 g
Eau, q.s.p. 1 000 ml
Eau, q.s.p. 900 ml
Supplément
Supplément 1
Rouge de phénol
a4 g
Lactose
1og
Eau, qsp. 100 ml
Saccharose
109
Rouge de phénol o,og g
100 ml
Eau, q.s.p.
5.1.4.2.2 Préparation
Dissoudre tous les composants, y compris 20 ml de
Supplément 2
solution au rouge de phénol (supplément) en chauf-
Vert brillant 0,5 g
fant jusqu’à ébullition.
100 ml
Eau, q.s.p.
Ajuster le pH à 7,4 + 0,l.
-
ATTENTION - Ne pas surchauffer, ne pas prépa-
5.1.4.1.2 Préparation
rer de portions supérieures à 1 litre à la fois. Ne
pas stériliser le milieu à l’autoclave. Après prépa-
Dissoudre tous les composants du milieu de base
ration, transférer dans un bain d’eau à 50 “C et
dans de l’eau et stériliser à l’autoclave (6.1.2) à
verser dans des boîtes de Petri (6.7) dès que le
121 “C + 1 “C pendant 15 min.
milieu a refroidi.
Préparer le supplément 1 en dissolvant les compo-
5.1.4.3 Gélose au sulfite de bismuth (selon Wilson
sants dans de l’eau stérile. Chauffer la solution dans
et Blair)
un bain d’eau (6.2) à 70 “C pendant 20 min. La refroi-
dir à 55 “C + 1 “C et l’utiliser immédiatement.
5.1.4.3.1 Composition
Préparer le supplément 2 en dissolvant du vert brillant
dans de l’eau. Conserver la solution pendant au moins
Milieu de base
1 jour à l’obscurité afin qu’une autostérilisation se
Extrait de viande
5g
produise.
Peptone, hydrolysat enzymatique de tissu
animal
WI
Ajouter la solution de sucres au rouge de phénol pré-
o(+)-Glucose
5g
parée (supplément 1) et 1 ml de la solution au vert
Hydrogénophosphate disodique (Na,HPO,)
brillant (supplément 2) à la gélose avant répartition 4g
dans des boîtes de Petri (6.7); s’assurer que l
...
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