ISO 11063:2012
(Main)Soil quality — Method to directly extract DNA from soil samples
Soil quality — Method to directly extract DNA from soil samples
This International Standard specifies a method for direct extraction of DNA from soil samples to analyse the global structure and the abundance of soil bacterial communities using PCR-based technologies. This method is mainly dedicated to agricultural and forest soils. This method can possibly not be suitable for soils rich in organic matter (e.g. peat soils) or soils heavily polluted with organic pollutants or heavy metals. The direct extraction of DNA from soil samples provides unique insight into the richness and structure of microbial communities which are key parameters to estimate the biodiversity of soil microbiota. Molecular approaches based on PCR (polymerase chain reaction) amplification of soil DNA constitute a promising domain and can contribute in the near future to the development of routine tools to monitor the microbiota of soil environments. Users of the method ought to be aware that although soil submitted to the DNA extraction procedure is sieved thoroughly (2 mm mesh, procedure described in 5.1), plant residues can still remain in soil samples and, as a result, traces of plant DNA can contaminate the soil DNA extract.
Qualité du sol — Méthode pour extraire directement l'ADN d'échantillons de sol
La présente Norme internationale spécifie une méthode pour extraire directement l'ADN d'échantillons de sol en vue d'analyser la structure globale et l'abondance des communautés microbiennes du sol en utilisant des techniques de PCR. Cette méthode est principalement destinée aux sols agricoles et forestiers. Cette méthode peut ne pas être appropriée aux sols riches en matières organiques (par exemple sols de tourbières) ou aux sols très pollués par des polluants organiques ou des métaux lourds. L'extraction directe de l'ADN d'échantillons de sol fournit des informations précieuses sur l'abondance et la structure des communautés microbiennes qui sont des paramètres clés pour estimer la biodiversité des communautés microbiennes telluriques. Les approches moléculaires utilisant l'amplification PCR (amplification en chaîne par polymérisation) de l'ADN extrait du sol offrent des perspectives prometteuses et peuvent contribuer, dans un futur proche, au développement d'outils de routine permettant de surveiller la qualité de la composante microbienne des sols. L'utilisateur de la méthode doit savoir que, même si le sol soumis au mode opératoire d'extraction de l'ADN est soigneusement tamisé (mailles de 2 mm, mode opératoire décrit en 5.1), des résidus végétaux peuvent demeurer dans les échantillons de sol et de ce fait, l'extrait d'ADN prélevé du sol peut être contaminé par des traces d'ADN végétal.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11063
First edition
2012-02-01
Soil quality — Method to directly extract
DNA from soil samples
Qualité du sol — Méthode pour extraire directement l’ADN
d’échantillons de sol
Reference number
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Published in Switzerland
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Contents Page
Foreword .iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Test materials . 2
5.1 Soil . 2
5.2 Chemicals . 2
5.3 Buffers and reagents . 3
6 Apparatus . 4
7 Procedures . 4
7.1 Preparation of soil samples . 4
7.2 Mechanical and chemical lyses . 4
7.3 Protein precipitation . 4
7.4 Nucleic acid precipitation and washing . 4
7.5 Nucleic acid storage . 4
8 Estimation of soil DNA quality and quantity . 5
8.1 Soil DNA quality and purity. 5
8.2 Soil DNA quantity . 5
9 Validation of the extraction procedure . 5
10 International ring test . 5
11 Test report . 5
Annex A (informative) International ring test for evaluating soil DNA extraction procedure . 7
Bibliography .21
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ISO 11063:2012(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International
Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 11063 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological methods.
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Introduction
DNA (deoxyribonucleic acid) is an essential component of any living organism coding for enzymes responsible
for any biological activities. The study of DNA sequences from DNA sources extracted from different matrixes,
by means of numerous molecular approaches, provides molecular markers that can be used to sharply
distinguish and identify different organisms (bacteria, archaea and eucaryotes).
Up to now, most of the studies aiming to develop microbial soil quality indicators applicable to complex
environments, such as soil, were biased by the unculturability of many microorganisms and the lack of sensitivity
[16]
of traditional microbiological methods . The recent development of numerous molecular biology methods
based primarily on amplification of soil-extracted nucleic acids have provided a pertinent alternative to classical
culture-based microbiological methods, providing unique insight into the composition, richness, and structure
[15], [18], [26], [27], [36]
of microbial communities . DNA-based approaches are now well-established in soil ecology
and serve as genotypic (= molecular genetic) markers for determining microbial diversity.
The results of molecular analyses of soil microbial communities and/or populations rely on two main parameters:
a) the extraction of DNA representative of the indigenous bacterial community composition;
b) PCR bias, such as the choice of primers, the concentration of amplified DNA, errors in the PCR, or
[23], [26], [38], [40]
even the method chosen for analysis . Recently, numerous studies have investigated new
[20]
methods to improve extraction, purification, amplification, and quantification of DNA from soils .
The aim of this International Standard is to describe the procedure used to extract DNA directly from soil
samples. The reproducibility of this soil DNA extraction procedure was assessed in an international ring-test
study (Annex A). The reproducibility of this soil DNA extraction procedure was successfully evaluated on both
quantitative (q-PCR) and qualitative (A-RISA) approaches.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 11063:2012(E)
Soil quality — Method to directly extract DNA from soil samples
1 Scope
This International Standard specifies a method for direct extraction of DNA from soil samples to analyse the
global structure and the abundance of soil bacterial communities using PCR-based technologies. This method
is mainly dedicated to agricultural and forest soils. This method can possibly not be suitable for soils rich in
organic matter (e.g. peat soils) or soils heavily polluted with organic pollutants or heavy metals.
The direct extraction of DNA from soil samples provides unique insight into the richness and structure of
microbial communities which are key parameters to estimate the biodiversity of soil microbiota. Molecular
approaches based on PCR (polymerase chain reaction) amplification of soil DNA constitute a promising
domain and can contribute in the near future to the development of routine tools to monitor the microbiota of
soil environments.
Users of the method ought to be aware that although soil submitted to the DNA extraction procedure is sieved
thoroughly (2 mm mesh, procedure described in 5.1), plant residues can still remain in soil samples and, as a
result, traces of plant DNA can contaminate the soil DNA extract.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document
(including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under
aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
soil DNA
DNA extracted from soil-living microorganisms and remaining DNA from dead microorganisms
4 Principle
DNA is directly extracted from 0,25 g soil samples using the following extraction procedure. This method
reliably allowed analysing the global structure of bacterial and archeal communities and could be adapted
[32]
(extraction from a 1 g soil sample) to assess the global structure of fungal communities . Soil samples added
with an extraction buffer are submitted to mechanical and chemical lyses. The lysis step, e.g. by bead beating,
is a crucial step to also extract DNA from microbes that are difficult to lyse. After a brief centrifugation, soil
debris are removed and proteins are precipitated with potassium acetate. After centrifugation, the supernatant
is recovered and nucleic acids are precipitated with ice-cold isopropanol. After centrifugation, the nucleic acids
pellet is washed with 70 % ethanol and suspended in sterile ultra-pure water. DNA quality is then checked by
electrophoresis on an agarose gel and the DNA quantity is estimated using a spectro-fluorimeter. A schematic
overview of the procedure is given in Figure 1.
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5 Test materials
5.1 Soil
Soil samples should be collected and sieved (2 mm mesh). If samples are not immediately processed, they
should be stored for up to two years at −20 °C or up to 10 years at −80 °C or in liquid nitrogen (−180 °C) as
specified in ISO 10381-6. If soil samples are frozen, they may be thawed only once. Some of these storage
conditions are currently under testing.
Figure 1 — Schematic overview of soil DNA extraction procedure
5.2 Chemicals
5.2.1 Tris[hydroxymethyl]aminomethane, C H NO (CAS No. 77-86-1).
4 11 3
5.2.2 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA), C H N O Na ·2 H O (CAS No. 6381-92 6).
10 14 2 8 2 2
5.2.3 Sodium chloride, NaCl (CAS No. 7647-14-5).
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5.2.4 Sodium dodecyl sulfate (SDS), CH (CH ) OSO Na (CAS No. 151-21-3).
3 2 11 3
5.2.5 Polyvinylpyrrolidone (PVP), [C H NO] (CAS No. 9003-39-8).
6 9 n
5.2.6 Sodium acetate, CH COONa (CAS No. 6131-90-4).
3
5.2.7 Acetic acid or glacial acetic acid, CH COOH (CAS No. 64-19-7).
3
5.2.8. Isopropanol, CH CHOHCH (CAS No. 67-63-0).
3 3
5.2.9 Ethanol, CH CH OH (CAS No. 64-17-5).
3 2
5.2.10 Molecular-biology-grade water, H O.
2
5.3 Buffers and reagents
Buffers and reagents (except intercalent molecules) used for soil DNA extraction are sterilized (120 °C for
20 min) and stored at room temperature. Ethanol and isopropanol are stored at −20 °C.
5.3.1 Tris-HCl, 1 mol/l, 121,14 g of tris in 1 000 ml of H O, adjusting with 4 mol/l HCl to pH 8,0.
2
5.3.2 EDTA, 0,5 mol/l, 186,10 g of EDTA in 1 000 ml of H O, adjusting with NaOH (10 mol/l) to pH 8,0.
2
5.3.3 NaCl, 1 mol/l, 58,44 g of NaCl in 1 000 ml of H O.
2
5.3.4 PVP 40, 20 %, 200 g of PVP in 1 000 ml of H O.
2
5.3.5 SDS, 20 %, 200 g of SDS in 1 000 ml of H O.
2
5.3.6 Homogenization buffer (newly prepared just before being used), 100 ml of 1 mol/l tris-HCl (pH 8,0), 200 ml
of 0,5 mol/l EDTA (pH 8,0), 100 ml of 1 mol/l NaCl, 50 ml of 20 % PVP 40, 100 ml of 20 % SDS in 450 ml of H O.
2
5.3.7 Sodium acetate, 5 mol/l (pH 5,5), 410,15 g of CH COONa in 800 ml of H O. Add 120 ml of acetic acid
3 2
and then adjust the pH to 5,5 with glacial acetic acid. Add water to make up to 1 000 ml.
5.3.8 Ethanol, 70 %, 700 ml of pure ethanol in 300 ml of H O.
2
5.3.9 TE buffer, pH 8,0, 10 mmol/l tris-HCl, 1 mmol/l EDTA.
5.3.10 Glass beads (106 µm).
5.3.11 Glass beads (2 mm).
5.3.12 Ethidium bromide, 5 mg of ethidium bromide in 1 000 ml of H O.
2
5.3.13 Fluorescent nucleic acid stain, excitation at 480 nm and emission at 520 nm.
5.3.14 Pure DNA (100 ng/µl)
5.3.15 TBE buffer × 10, pH 8,0, 108 g of tris base, 55 g of boric acid, 40 ml of 0,5 mol/l EDTA (pH 8,0) in
1 000 ml of H O.
2
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5.3.16 TBE buffer × 1, 100 ml of TBE buffer × 10 in 900 ml of H O.
2
6 Apparatus
Use standard laboratory equipment including pipettes, a centrifuge, fume hood cabinet, horizontal
electrophoresis system and the following.
-1
6.1 Mini-bead beating apparatus, with a beating frequency varying from, for example, 100 min to
-1
2 600 min and a 16 mm amplitude of agitation.
6.2 Spectro-fluorimeter, allowing the quantification of double-strand DNA at 520 nm with a fluorescent
nucleic acid stain excited at 480 nm.
7 Procedures
7.1 Preparation of soil samples
Weigh 0,25 g of soil (equivalent dry mass) in 2 ml micro-tubes just before extracting, or immediately freeze the
soil sample in liquid nitrogen and keep it frozen at −80 °C until its use.
7.2 Mechanical and chemical lyses
Add 0,5 g of 106 µm glass beads (wear a mask for protection) and two glass beads (2 mm diameter) to the soil
sample. Add 1 ml of homogenization buffer (composition given in 5.3.6). Agitate the soil samples 1 600g for
30 s (16 mm of amplitude) using a bead-beating system (tube support previously placed at −20 °C). Incubate
at 70 °C for 10 min. Centrifuge for 1 min at 14 000g (4 °C). Carefully recover the supernatant and transfer it to
a new 2 ml microtube.
7.3 Protein precipitation
To the supernatant obtained in 7.2, add 5 mol/l sodium acetate (pH 5,5) (composition given in 5.3.7) of an
amount that is 1/10 of the volume of the supernatant. Mix by vortexing and incubate on ice for 10 min. Centrifuge
for 5 min at 14 000g (4 °C). Carefully recover the supernatant and transfer it to a new 1,5 ml microtube.
7.4 Nucleic acid precipitation and washing
Perform all these steps below a fume hood because of dangerous isopropanol vapours. Liquid and solid
wastes shall be evacuated as chemical waste.
To the supernatant obtained in 7.3, add cold isopropanol (-20 °C) of an amount that is 1/1 of the volume of the
supernatant. Incubate the samples at −20 °C for 15 min. Centrifuge for 30 min at 14 000g (4 °C). Carefully
eliminate the supernatant. Wash the nucleic acids pellet with cold 70 % ethanol (do not resuspend the pellet).
Centrifuge for 15 min at 14 000g (4 °C). Eliminate any traces of ethanol and let the nucleic acid pellet dry for
15 min at 37 °C. Suspend the pellet in 100 µl of ultra-pure water or TE buffer (pH 8) (composition given in 5.3.9).
7.5 Nucleic acid storage
Aliquot the soil DNA (4 × 25 µl) and store the DNA samples at −20 °C until their use. Repeated freezing and
thawing of the DNA extracts should be omitted.
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8 Estimation of soil DNA quality and quantity
8.1 Soil DNA quality and purity
The quality and the size of the soil DNA are checked by electrophoresis on 1 % agarose gels in TBE buffer. Gels
are stained with appropriate staining (e.g. ethidium bromide, 5 mg/l). The purity of the soil DNA is assessed by
[11]
spectrophotometry at 260 nm for the DNA analysis and at 400 nm for humic acid substances .
The step of chemical and mechanical lysis is critical, and it should be adequate to lyse a representative portion
[39]
of microbes but avoid fragmentation of the DNA .
DNA extracts which are still slightly brownish need a further DNA purification.
8.2 Soil DNA quantity
The soil DNA content is determined using a fluorescent nucleic acid stain (5.3.13) which fluoresces when
intercalated within the double helix of DNA. A calibration curve relating the amount of standard DNA (5 ng,
10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 150 ng and 200 ng of pure DNA) to the amount of fluorescence quantified is
established and used to estimate the amount of DNA extracted from the soil. Measurements are performed
using a spectro-fluorimeter (6.2). The analysis is carried out by relevant software.
Alternatively, the soil DNA content can be determined by resolving soil DNA extracts by electrophoresis in a
1 % agarose gel, stained with ethidium bromide and photographed under a camera. Dilutions of pure DNA
were included in each gel and a standard curve of DNA concentration (1 000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng,
62,5 ng to 31,25 ng). The ethidium bromide intensity was integrated to establish a standard curve used for
estimating soil DNA concentration as described previously by Reference [32].
Alternatively, the soil DNA content can be determined by spectrophotometry at 260 nm when soil DNA is lowly
contaminated with humic acid substances (400 nm) and proteins (A260/A280 averaging 1,6).
9 Validation of the extraction procedure
The laboratory can validate the procedure of soil DNA extraction by processing the reference soil and comparing
the obtained yield of soil DNA extraction to the expected one.
10 International ring test
This method for extracting soil DNA was evaluated through an international ring test involving nine different
laboratories working on six different European soils. The report of this ring test is provided in Annex A.
11 Test report
The test report shall include the following information:
a) a reference to this International Standard: ISO 11063:2012;
b) soil collection, including date and place (GPS coordinates) of collection;
c) treatment and storage of soil sample (e.g. sieving method, conditions and length of storage);
d) physical and chemical characteristics of the soil;
e) quantity of soil used for DNA extraction;
f) date(s) of extraction;
g) duration of nucleic acids storage (if appropriate);
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ISO 11063:2012(E)
h) tables of results including concentration of soil DNA extracts and amount of DNA extracted per gram of
soil (dry weight equivalent);
i) any details not specified in this International Standard or which are optional, as well as any effect which
may have affected the results.
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Annex A
(informative)
International ring test for evaluating soil DNA extraction procedure
A.1 Introduction
Up to now, most of the microbial diversity studies conducted in complex ecosystems, such as soil, has been
biased essentially by the unculturability of many microorganisms and the lack of sensitivity of traditional
microbiological methods. In the past decade, applications of numerous molecular biology methods based
primarily on amplification of indirect or direct soil-extracted nucleic acids (DNA or DNA/RNA) have provided
a pertinent alternative to classical culture-based microbiological methods, providing unique insight into the
[15], [18], [26], [27], [36]
composition, richness and structure of microbial communities . DNA-based approaches
are now well-established in soil ecology and serve as genotypic (= molecular genetic) markers for determining
microbial diversity.
However, the results of molecular analysis of microbial communities rely mostly on two main parameters:
a) the extraction of DNAs representative of the indigenous bacterial community composition;
b) PCR bias, such as the choice of primers, the concentration of amplified DNA, errors in the PCR, or even
the method chosen for analysis. Recently, numerous studies have investigated new methods to improve
extraction, purification, amplification, and quantification of DNA from soils.
Although comparative studies have been performed to analyse the efficiency of methods for extraction and
purification of soil DNA recovered, the reproducibility of soil DNA extraction within different laboratories has not
yet been assessed. Therefore, in this context, the aim of this study was to evaluate the reproducibility of a soil
DNA extraction method developed by Reference [20].
A.2 Materials and methods
A.2.1 Laboratories involved in the study
Nine different laboratories from six European countries (France, Finland, Germany, Spain, Italy and Sweden)
were involved in the international ring test with the following organization. Laboratory in charge of the program:
INRA/Université de Bourgogne, Laboratoire de Microbiologie du Sol et de l’Environnement, (Dijon, France).
The participant laboratories are listed below: Institut National de l’Environnement Industriel et des Risques,
INERIS (Verneuil-en-Halatte, France); IPL santé, environnement durables Est, Laboratoire Etudes et Expertises
(Nancy, France); Swedish University of Agricultural Sciences (Uppsala, Sweden); GSF Munich (Munich,
Germany); Julius Kühn-Institut Bundesforschungsinsinstitut für Kulturpflanzen, JKI (Brauschweig, Germany);
Universita di Catania, DACPA-Sezione Scienze Agrochimiche (Catania, Italy); CSIC, Estacion Experimental
del Zaidin (Grenada, Spain); University of Helsinki (Helsinki, Finland).
A working group constituted of each responsible scientist of each research laboratory was established. The
main objectives of the working group were to:
— design the set-up of the inter-laboratories assay,
— analyse and discuss the results produced in this study.
The procedure used for the international ring test study is described below. The working group decided that
this assay should only concern the evaluation of the reproducibility of soil DNA extraction. To do so, the
working group decided that each laboratory should extract DNA from different soil samples following the same
protocol. Further work (DNA purification and DNA analyses) was only done by the laboratory leading this
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project (Laboratoire de Microbiologie du Sol et de l’Environnement, Dijon, France) in order to avoid adding
several biases due to these two additional steps.
Therefore, after soil DNA extraction, each laboratory involved in this project sent their samples to “Laboratoire
de Microbiologie du Sol et de l’Environnement” for further analyses. Upon their arrival, soil DNA samples were
purified as described in A.2.4. Soil DNA extracts were quantified on agarose gel stained with ethidium bromide.
Following purification, extracted soil DNA was further analysed using PCR:
a) 16S rDNA quantitative PCR assay for estimating the total bacterial community abundance in studied soils;
b) pcaH and narG quantitative PCR assay for estimating the narG and pcaH microbial community abundances
in studied soils;
c) A-RISA method (automatic ribosomal intergenic spacer analysis) for studying the structure of the global
bacterial community.
A.2.2 Soil physico-chemical properties and preparation
The working group chose six different soils named soil A, B, C, F, M and soil S (see Table A.1) collected in
different European countries. One soil was PAH-contaminated (collected in Finland), four were agricultural
soils (collected in Sweden and France) whilst one was a forest soil (collected in Germany).
Fresh soil samples were sieved (2 mm mesh) and 250 mg aliquots were prepared in 2 ml tubes. These aliquots
were immediately frozen in liquid nitrogen and stored at −80 °C until their shipment. Five aliquots of each soil were
sent in dry ice to each laboratory where they were stored at −80 °C until soil DNA extraction were carried out.
Table A.1 — Physico-chemical characteristics of the studied soils
Soil
A B C F M S
Forest soil Agricultural Agricultural PAH- Agricultural Agricultural
soil soil contaminated soil soil
soil
Clay % 17,6 nd 43,2 15,5 43,2 47,8
Silt % 26,9 nd 50,3 26,2 23,7 26,8
Sand % 55,5 nd 6,5 58,3 33,1 25,4
Organic C % 7,55 1,45 1,29 1,12 3,27 1,53
Total N % 0,46 0,12 0,14 0,33 0,36 0,16
C/N 16,5 11,7 9,21 33,5 9,11 9,7
Organic matter % 13,1 2,51 3,25 19,3 5,65 2,66
pH 3.76 6,41 7,50 6,22 7,88 7,99
CEC Metson
17,8 8,09 nd 10,7 19,9 12,6
+
(cmol /kg)
P O Olsen % nd 0,09 0,03 nd 0,26 nd
2 5
nd = not determined
CEC: Cation exchange capacity
A.2.3 Soil DNA extraction
The procedure used for soil DNA extraction follows this International Standard. Briefly, 1 ml of a solution
containing 100 mmol/l tris (pH 8,0), 100 mmol/l EDTA, 100 mmol/l NaCl, 1 % (mass fraction) polyvinylpyrrolidone,
and 2 % (mass fraction) sodium dodecyl sulfate was added to 250 mg of soil in a 2 ml mini-bead-beater tube
containing 0,5 g of 106-mm and two 2-mm-diameter glass beads. Samples were then homogenized for 30 s at
1 600g in a mini-bead-beater cell disruptor (6.1), after which the samples were centrifuged at 14 000g for 1 min
at 4 °C. The collected supernatants were incubated for 10 min on ice with 1/10 volume of 5 mol/l sodium acetate
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and centrifuged at 14 000g for 5 min. After precipitation with one volume of ice-cold isopropanol, the nucleic
acids were added with 70 % ethanol. Soil DNA extracts were then shipped to Laboratoire de Microbiologie du
Sol et de l’Environnement (Dijon, France), in dry ice.
It has to be noted that all the soil DNA extractions were done with two identical mini-bead beaters which were
shared between the different laboratories involved in this project.
A.2.4 Soil DNA purification
The procedure used for soil DNA purification consists of two steps:
a) an affinity column constituted of polyvinylpyrrolidone (PVPP) which specifically bounds humic acid substances;
1)
b) an exclusion column constituted of Sepharose 4B as described in Reference [20]. Briefly, PVPP-columns
were prepared by placing 92 mg to 95 mg (i.e. 1,2 cm) of PVPP powder into micro-spin chromatography
2)
columns after which 400 µl of H O were added and the tubes were centrifuged (2 min at 1 000g). The
2
procedure was repeated twice. For the Sepharose-columns, 1 ml of Sepharose 4B was placed in micro-
spin chromatography columns and centrifuged (2 min, 1 100g) after which the columns were washed by
the addition of 500 µl of TE buffer (tris-EDTA, pH 8) and centrifugation of the columns (2 min at 1 100g).
After preparation of the columns, soil DNA extracts were purified by centrifugation of the sample first
through the PVPP-column (1 000g for 4 min at 10 °C). The eluate was collected and was then passed
through a Sepharose-column by centrifugation at 1 500g for 4 min (10 °C).
A.2.5 Soil DNA quantification
The quantity of the extracted soil DNA was determined by resolved samples in 1 % agarose gels. After
3)
electrophoresis, gels were stained with ethidium bromide. Dilutions of calf tymus DNA were included in each
gel and a standard curve of DNA concentrations (60 ng, 30 ng, 15 ng, 7,5 ng and 3,25 ng) was used to estimate
4)
the quantity of DNA in the soil extracts. Obtained pictures of the gels were analysed using ImageQuaNT
software. The quantity of DNA was determined using the standard curve relating the intensity of DNA band to
the amount of DNA in ng. Yield of DNA extraction was calculated from the values as follows:
[yield of DNA, µg/g of soil] = DNA (ng/µl) × 0,4.
Data were analysed using the non-parametric Kruskal-Wallis test (p < 0,05).
A.2.6 Inhibition test
The presence of PCR inhibitors in t
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11063
Première édition
2012-02-01
Qualité du sol — Méthode pour extraire
directement l’ADN d’échantillons de sol
Soil quality — Method to directly extract DNA from soil samples
Numéro de référence
ISO 11063:2012(F)
©
ISO 2012
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ISO 11063:2012(F)
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quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit
de l’ISO à l’adresse ci-après ou du comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Publié en Suisse
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ISO 11063:2012(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction . v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Matériel d’essai . 2
5.1 Sol . 2
5.2 Substances chimiques . 2
5.3 Tampons et réactifs . 3
6 Appareillage . 4
7 Modes opératoires . 4
7.1 Préparation des échantillons de sol . 4
7.2 Lyse mécano-chimique . 4
7.3 Précipitation des protéines . 4
7.4 Précipitation et rinçage des acides nucléiques . 4
7.5 Conservation des acides nucléiques . 4
8 Estimation de la qualité et de la quantité d’ADN du sol . 5
8.1 Qualité et pureté de l’ADN du sol . 5
8.2 Quantité d’ADN du sol. 5
9 Validation du mode opératoire d’extraction . 5
10 Étude interlaboratoires internationale . 5
11 Rapport d’essai . 5
Annexe A (informative) Étude interlaboratoires internationale pour évaluer le mode opératoire
d’extraction de l’ADN du sol . 7
Bibliographie .22
© ISO 2012 – Tous droits réservés iii
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ISO 11063:2012(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits
de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir
identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 11063 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Méthodes biologiques.
iv © ISO 2012 – Tous droits réservés
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ISO 11063:2012(F)
Introduction
L’ADN (acide désoxyribonucléique) est un composant essentiel des organismes vivants codant pour les
enzymes responsables de leurs activités biologiques. L’étude des séquences d’ADN extraits de différentes
matrices biologiques, à l’aide de nombreuses approches moléculaires, permet de fournir des marqueurs
moléculaires qui peuvent être utilisés pour différencier et identifier clairement différents organismes (bactéries,
archées et eucaryotes).
Jusqu’à présent, la plupart des études visant à développer des indicateurs microbiens de la qualité du sol et
applicables aux milieux complexes, tels que le sol, étaient biaisées par la nature incultivable de nombreux micro-
[16]
organismes et par le manque de sensibilité des méthodes microbiologiques classiques . Le développement
récent de nombreuses méthodes de biologie moléculaire reposant principalement sur l’amplification des acides
nucléiques extraits du sol a permis de proposer une alternative pertinente à la microbiologie pasteurienne,
pour fournir des informations précieuses sur la composition, la richesse et la structure des communautés
[15], [18], [26], [27], [36]
microbiennes . Les approches reposant sur l’ADN sont désormais bien établies dans le
domaine de l’écologie microbienne des sols et servent de marqueurs génotypiques (= marqueurs moléculaires)
permettant d’évaluer la diversité microbienne.
Les résultats d’analyses moléculaires des communautés et/ou populations microbiennes du sol reposent sur
deux paramètres principaux:
a) l’extraction d’ADN représentatif de la composition de la communauté bactérienne indigène;
b) les biais introduits par la PCR, notamment le choix des amorces oligonucléotidiques, la concentration en
[23], [26], [38], [40]
ADN amplifié, les erreurs de la PCR ou encore la méthode d’analyse choisie . Récemment,
de nombreuses études ont été menées sur de nouvelles méthodes permettant d’améliorer l’extraction, la
[20]
purification, l’amplification et la quantification de l’ADN des sols .
L’objectif de la présente Norme internationale est de décrire le mode opératoire utilisé pour extraire directement
l’ADN des échantillons de sol. La reproductibilité de ce mode opératoire d’extraction de l’ADN du sol a été
évaluée dans le cadre d’une étude interlaboratoires internationale (Annexe A). La reproductibilité de ce mode
opératoire d’extraction de l’ADN du sol a été évaluée avec succès aussi bien par des approches moléculaires
quantitatives (q-PCR) que qualitatives (A-RISA).
© ISO 2012 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 11063:2012(F)
Qualité du sol — Méthode pour extraire directement l’ADN
d’échantillons de sol
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode pour extraire directement l’ADN d’échantillons de
sol en vue d’analyser la structure globale et l’abondance des communautés microbiennes du sol en utilisant
des techniques de PCR. Cette méthode est principalement destinée aux sols agricoles et forestiers. Cette
méthode peut ne pas être appropriée aux sols riches en matières organiques (par exemple sols de tourbières)
ou aux sols très pollués par des polluants organiques ou des métaux lourds.
L’extraction directe de l’ADN d’échantillons de sol fournit des informations précieuses sur l’abondance et
la structure des communautés microbiennes qui sont des paramètres clés pour estimer la biodiversité des
communautés microbiennes telluriques. Les approches moléculaires utilisant l’amplification PCR (amplification
en chaîne par polymérisation) de l’ADN extrait du sol offrent des perspectives prometteuses et peuvent
contribuer, dans un futur proche, au développement d’outils de routine permettant de surveiller la qualité de la
composante microbienne des sols.
L’utilisateur de la méthode doit savoir que, même si le sol soumis au mode opératoire d’extraction de l’ADN
est soigneusement tamisé (mailles de 2 mm, mode opératoire décrit en 5.1), des résidus végétaux peuvent
demeurer dans les échantillons de sol et de ce fait, l’extrait d’ADN prélevé du sol peut être contaminé par des
traces d’ADN végétal.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l’application du présent document. Pour les
références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence (y compris les éventuels amendements) s’applique.
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage ― Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l’évaluation en laboratoire des processus,
de la biomasse et de la diversité microbiens
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
ADN du sol
ADN extrait de micro-organismes vivant dans le sol et ADN de micro-organismes morts persistant
4 Principe
L’ADN est directement extrait d’échantillons de sol de 0,25 g en appliquant le mode opératoire d’extraction
suivant. Cette méthode a permis d’analyser avec fiabilité la structure globale des communautés bactériennes
et archées et peut être adaptée (extraction à partir d’un échantillon de sol de 1 g) pour évaluer la structure
[32]
globale des communautés fongiques . Les échantillons de sol mélangés avec un tampon d’extraction sont
soumis à une lyse mécano-chimique. L’étape de lyse, à l’aide par exemple d’un broyeur à billes est une étape
cruciale pour extraire l’ADN, même de micro-organismes difficiles à lyser. Après une brève centrifugation,
les débris de sol sont éliminés et les protéines sont précipitées avec de l’acétate de potassium. Après
centrifugation, le surnageant est récupéré et les acides nucléiques sont précipités avec de l’isopropanol froid.
Après centrifugation, le culot d’acides nucléiques est rincé avec de l’éthanol à 70 % et est repris dans de l’eau
stérile de qualité biologie moléculaire. La qualité de l’ADN est ensuite contrôlée par électrophorèse en gel
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d’agarose et la quantité d’ADN est estimée à l’aide d’un spectrofluorimètre. Une représentation schématique
du mode opératoire est donnée à la Figure 1.
5 Matériel d’essai
5.1 Sol
Il convient de prélever des échantillons de sol et de les tamiser (mailles de 2 mm). Si les échantillons ne sont
pas immédiatement traités, il est recommandé de les conserver pendant deux ans maximum à -20 °C ou
pendant 10 ans maximum à -80 °C ou dans de l’azote liquide (-180 °C) comme spécifié dans l’ISO 10381-6.
Si les échantillons de sol sont congelés, ils ne peuvent être décongelés qu’une seule fois. Certaines de ces
conditions de stockage sont actuellement en cours d’évaluation.
Échantillon de sol
Ajout du tampon d’homogénéisation
Broyage à billes
(30 s, 1 600 g)
1/ Lyse mécano-chimique
Incubation à 70 °C pendant 10 min
Centrifugation
(1 min, 14 000 g, 4 °C)
Lysat de sol
Incubation dans un
Ajout d’acétate de sodium 5 mol/l (1/10 V)
bain de glace
2/ Précipitation des
pendant 10 min
protéines
Centrifugation (5 min, 14 000 g, 4 °C)
Extrait brut
Ajout d’isopropanol glacé (1 V)
3/ Précipitation et
Incubation à -20 °C
rinçage des acides
pendant 15 min
nucléiques
Centrifugation (30 min, 14 000 g, 4 °C)
Ajout d’éthanol glacé
à 70 %
Centrifugation (15 min, 14 000 g, 4 °C)
ADN du sol
Figure 1 — Représentation schématique du mode opératoire d’extraction de l’ADN du sol
5.2 Substances chimiques
5.2.1 Tris[hydroxyméthyl]aminométhane, C H NO (n° CAS 77-86-1).
4 11 3
5.2.2 Sel disodique de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), C H N O Na , 2H O
10 14 2 8 2 2
(n° CAS 6381-92-6).
5.2.3 Chlorure de sodium, NaCl (n° CAS 7647-14-5).
2 © ISO 2012 – Tous droits réservés
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ISO 11063:2012(F)
5.2.4 Dodécylsulfate de sodium (SDS), CH (CH ) OSO Na (n° CAS 151-21-3).
3 2 11 3
5.2.5 Polyvinylpyrrolidone (PVP), [C H NO] (n° CAS 9003-39-8).
6 9 n
5.2.6 Acétate de sodium, CH COONa (n° CAS 6131-90-4).
3
5.2.7 Acide acétique ou acide acétique glacial, CH COOH (n° CAS 64-19-7).
3
5.2.8 Isopropanol, CH CHOHCH (n° CAS 67-63-0).
3 3
5.2.9 Éthanol, CH CH OH (n° CAS 64-17-5).
3 2
5.2.10 Eau, qualité biologie moléculaire, H O.
2
5.3 Tampons et réactifs
Les tampons et les réactifs (à l’exception des agents intercalants) utilisés pour l’extraction de l’ADN du sol
sont stérilisés (120 °C pendant 20 min) et stockés à température ambiante. L’éthanol et l’isopropanol sont
stockés à -20 °C.
5.3.1 Tris-HCl 1 mol/l, 121,14 g de tris dans 1 000 ml de H O, en ajustant avec du HCl 4 mol/l à pH 8,0.
2
5.3.2 EDTA 0,5 mol/l, 186,10 g d’EDTA dans 1 000 ml de H O, en ajustant avec du NaOH (10 mol/l) à pH 8,0.
2
5.3.3 NaCl 1 mol/l, 58,44 g de NaCl dans 1 000 ml de H O.
2
5.3.4 PVP 40 à 20 %, 200 g de PVP dans 1 000 ml de H O.
2
5.3.5 SDS à 20 %, 200 g de SDS dans 1 000 ml de H O.
2
5.3.6 Tampon d’homogénéisation (fraîchement préparé juste avant utilisation), 100 ml de tris-HCl 1 mol/l
(pH 8,0), 200 ml d’EDTA 0,5 mol/l (pH 8,0), 100 ml de NaCl 1 mol/l, 50 ml de PVP 40 à 20 %, 100 ml de SDS à
20 % dans 450 ml de H O.
2
5.3.7 Acétate de sodium 5 mol/l (pH 5,5), 410,15 g de CH COONa dans 800 ml de H O. Ajouter 120 ml
3 2
d’acide acétique et ajuster le pH à 5,5 avec de l’acide acétique glacial. Compléter à 1 000 ml en ajoutant de l’eau.
5.3.8 Éthanol à 70 %, 700 ml d’éthanol pur dans 300 ml de H O.
2
5.3.9 Tampon TE, pH 8,0, tris-HCl 10 mmol/l, EDTA 1 mmol/l.
5.3.10 Billes de verre (106 µm).
5.3.11 Billes de verre (2 mm).
5.3.12 Bromure d’éthidium, 5 mg de bromure d’éthidium dans 1 000 ml de H O.
2
5.3.13 Agent intercalant fluorescent des acides nucléiques, excitation à 480 nm et émission à 520 nm.
5.3.14 ADN pur (100 ng/µl).
© ISO 2012 – Tous droits réservés 3
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ISO 11063:2012(F)
5.3.15 Tampon TBE × 10, pH 8,0, 108 g de base tris, 55 g d’acide borique, 40 ml d’EDTA 0,5 mol/l (pH 8,0)
dans 1 000 ml de H O.
2
5.3.16 Tampon TBE × 1, 100 ml de tampon TBE × 10 dans 900 ml de H O.
2
6 Appareillage
Utiliser un matériel de laboratoire courant, notamment pipettes, centrifugeuse, hotte chimique, système
d’électrophorèse horizontale, ainsi que les éléments suivants.
-1 -1
6.1 Broyeur à billes, avec une fréquence de broyage oscillant par exemple entre 100 min et 2 600 min
avec une amplitude d’agitation de 16 mm.
6.2 Spectrofluorimètre, permettant de quantifier l’ADN double brin avec un agent intercalant fluorescent
(excitation à 480 nm et émission à 520 nm).
7 Modes opératoires
7.1 Préparation des échantillons de sol
Peser 0,25 g de sol tamisé (équivalent masse sèche) dans des microtubes de 2 ml juste avant l’extraction ou
congeler immédiatement l’échantillon de sol dans de l’azote liquide et le conserver au congélateur à -80 °C
jusqu’à ce qu’il soit utilisé.
7.2 Lyse mécano-chimique
Ajouter 0,5 g de billes de verre de 106 µm (porter un masque de protection) et deux billes de verre (2 mm de
diamètre) à l’échantillon de sol. Ajouter 1 ml de tampon d’homogénéisation (composition indiquée en 5.3.6).
Agiter les échantillons de sol à 1 600g pendant 30 s (16 mm d’amplitude) à l’aide d’un broyeur à billes (support
de tube préalablement placé à -20 °C). Incuber à 70 °C pendant 10 min. Centrifuger pendant 1 min à 14 000g
(4 °C). Récupérer soigneusement le surnageant et le transférer dans un nouveau microtube de 2 ml.
7.3 Précipitation des protéines
Ajouter au surnageant obtenu en 7.2 de l’acétate de sodium 5 mol/l (pH 5,5) (composition indiquée en 5.3.7)
dans une proportion de 1/10 du volume de surnageant. Mélanger au vortex et incuber dans un bain de glace
pendant 10 min. Centrifuger pendant 5 min à 14 000g (4 °C). Récupérer soigneusement le surnageant et le
transférer dans un nouveau microtube de 1,5 ml.
7.4 Précipitation et rinçage des acides nucléiques
Réaliser l’ensemble de ces étapes sous une hotte chimique en raison de la dangerosité des vapeurs
d’isopropanol. Les déchets liquides et solides doivent être éliminés comme des déchets chimiques.
Ajouter au surnageant obtenu en 7.3 de l’isopropanol glacé (-20 °C) dans une proportion de 1/1 du volume de
surnageant. Incuber les échantillons à -20 °C pendant 15 min. Centrifuger pendant 30 min à 14 000g (4 °C).
Éliminer soigneusement le surnageant. Rincer le culot d’acides nucléiques avec de l’éthanol glacé à 70 % (ne pas
remettre le culot en suspension). Centrifuger pendant 15 min à 14 000g (4 °C). Éliminer toutes traces d’éthanol
et laisser le culot d’acides nucléiques sécher pendant 15 min à 37 °C. Mettre le culot en suspension dans 100 µl
d’eau stérile de qualité biologie moléculaire ou de tampon TE (pH 8,0) (composition indiquée en 5.3.9).
7.5 Conservation des acides nucléiques
Aliquoter l’ADN du sol (4 × 25 µl) et conserver les échantillons d’ADN à -20 °C jusqu’à ce qu’ils soient utilisés.
Il convient d’éviter la répétition de cycles de décongélation/congélation des extraits d’ADN.
4 © ISO 2012 – Tous droits réservés
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8 Estimation de la qualité et de la quantité d’ADN du sol
8.1 Qualité et pureté de l’ADN du sol
La qualité et la taille de l’ADN du sol sont contrôlées par électrophorèse en gel d’agarose à 1 % dans du
tampon TBE. Les gels sont colorés avec un agent intercalant approprié (par exemple bromure d’éthidium,
5 mg/l). La pureté de l’ADN du sol est évaluée par spectrophotométrie à 260 nm pour l’analyse de l’ADN et à
[11]
400 nm pour les substances acides humiques .
L’étape de lyse mécano-chimique étant essentielle, il convient qu’elle soit appropriée pour lyser une partie
[39]
représentative des micro-organismes mais qu’elle évite la fragmentation de l’ADN .
Les extraits d’ADN qui demeurent légèrement brunâtres doivent faire l’objet d’une purification.
8.2 Quantité d’ADN du sol
La teneur en ADN du sol est déterminée en utilisant un agent intercalant (5.3.13) qui devient fluorescent lorsqu’il
est intercalé dans la double hélice d’ADN. Une courbe d’étalonnage mettant en correspondance la quantité
d’ADN étalon (5 ng, 10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 150 ng et 200 ng d’ADN pur) et la quantité de fluorescence
quantifiée est établie et utilisée pour estimer la quantité d’ADN extrait du sol. Les mesurages sont effectués à
l’aide d’un spectrofluorimètre (6.2). L’analyse est réalisée avec un logiciel approprié.
La teneur en ADN du sol peut aussi être déterminée en séparant les extraits d’ADN du sol par électrophorèse
en gel d’agarose à 1 %, coloré au bromure d’éthidium et photographié à l’aide d’un système de prise de vue. Des
dilutions d’ADN pur sont incluses dans chaque gel pour établir une courbe d’étalonnage de la concentration en
ADN (1 000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng, 62,5 ng à 31,25 ng). L’intensité du bromure d’éthidium est intégrée afin
d’établir une courbe d’étalonnage pour estimer la concentration en ADN du sol comme décrit précédemment
par la Référence [32].
Enfin, la teneur en ADN du sol peut aussi être déterminée par spectrophotométrie à 260 nm lorsque l’ADN du
sol est faiblement contaminé par des substances acides humiques (400 nm) et des protéines (rapport moyen
A260/A280 de 1,6).
9 Validation du mode opératoire d’extraction
Le laboratoire peut valider le mode opératoire d’extraction de l’ADN du sol en extrayant l’ADN d’un sol de
référence et en comparant le rendement obtenu avec le résultat attendu.
10 Étude interlaboratoires internationale
Cette méthode d’extraction de l’ADN du sol a été évaluée dans le cadre d’une étude interlaboratoires
internationale impliquant neuf laboratoires différents travaillant sur six sols européens d’origine différente. Le
rapport de cette étude interlaboratoires est fourni dans l’Annexe A.
11 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit comprendre les informations suivantes:
a) une référence à la présente Norme internationale, c’est-à-dire l’ISO 11063:2012;
b) le prélèvement du sol, comprenant la date et le lieu (coordonnées GPS) du prélèvement;
c) le traitement et la conservation de l’échantillon de sol (par exemple méthode de tamisage, conditions et
durée de conservation);
d) les caractéristiques physiques et chimiques du sol;
e) la quantité de sol utilisé pour l’extraction de l’ADN;
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f) la ou les dates d’extraction;
g) la durée de conservation des acides nucléiques (le cas échéant);
h) les tableaux des résultats comprenant la concentration en extraits d’ADN du sol et la quantité d’ADN
extrait par gramme de sol (équivalent masse sèche);
i) tous détails non spécifiés dans la présente Norme internationale ou qui sont facultatifs ainsi que tous
incidents susceptibles d’avoir affecté les résultats.
6 © ISO 2012 – Tous droits réservés
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Annexe A
(informative)
Étude interlaboratoires internationale pour évaluer le mode opératoire
d’extraction de l’ADN du sol
A.1 Introduction
Jusqu’à présent, la plupart des études portant sur la diversité microbienne d’écosystèmes complexes, tels que
le sol, étaient biaisées par la nature incultivable de nombreux micro-organismes et par le manque de sensibilité
des méthodes microbiologiques classiques. Au cours des dix dernières années, l’application de nombreuses
méthodes de biologie moléculaire reposant principalement sur l’amplification des acides nucléiques (ADN ou
ADN/ARN) extraits du sol de manière indirecte ou directe a permis de proposer une alternative pertinente
aux méthodes microbiologiques classiques permettant de mieux décrire la composition, la richesse et la
[15], [18], [26], [27], [36]
structure des communautés microbiennes . Les approches reposant sur l’analyse de l’ADN
sont désormais bien établies dans le domaine de l’écologie des sols et servent de marqueurs génotypiques
(= marqueurs génétiques) permettant d’évaluer la diversité microbienne.
Toutefois, les résultats de l’analyse moléculaire des communautés microbiennes reposent principalement sur
deux paramètres cruciaux:
a) l’extraction d’ADN représentatif de la composition de la communauté bactérienne indigène;
b) les biais introduits par la PCR, notamment le choix des amorces oligonucléotidiques, la concentration en
ADN amplifié, les erreurs de la PCR ou encore la méthode d’analyse choisie. Récemment, de nombreuses
études ont été menées sur de nouvelles méthodes permettant d’améliorer l’extraction, la purification,
l’amplification et la quantification de l’ADN des sols.
Bien que des études comparatives aient été effectuées pour analyser l’efficacité des méthodes d’extraction et
de purification de l’ADN récupéré du sol, la reproductibilité de l’extraction de l’ADN du sol au sein de différents
laboratoires n’a pas encore été évaluée. Dans ce contexte, l’objectif de cette étude était par conséquent
d’évaluer la reproductibilité d’une méthode d’extraction de l’ADN du sol développée par la Référence [20].
A.2 Matériel et méthodes
A.2.1 Laboratoires participant à l’étude
Neuf laboratoires situés dans six pays européens (France, Finlande, Allemagne, Espagne, Italie et Suède)
ont participé à l’étude interlaboratoires internationale selon l’organisation suivante. Laboratoire en charge
du programme: INRA/Université de Bourgogne, Laboratoire de Microbiologie du Sol et de l’Environnement,
(Dijon, France). Les laboratoires participants sont énumérés ci-après: Institut National de l’Environnement
Industriel et des Risques, INERIS (Verneuil-en-Halatte, France); IPL santé, environnement durables Est,
Laboratoire Études et Expertises (Nancy, France); Swedish University of Agricultural Sciences (Uppsala,
Suède); GSF Munich (Munich, Allemagne); Julius Kühn-Institut Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen,
JKI (Braunschweig, Allemagne); Università di Catania, DACPA-Sezione Scienze Agrochimiche (Catane, Italie);
CSIC, Estación Experimental del Zaidín (Grenade, Espagne); University of Helsinki (Helsinki, Finlande).
Un groupe de travail composé de chaque scientifique responsable de chaque laboratoire de recherche a été
constitué. Les principaux objectifs du groupe de travail étaient les suivants:
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— mise en place de l’étude interlaboratoires;
— analyse et discussion des résultats tirés de cette étude.
Le mode opératoire utilisé pour l’étude interlaboratoires internationale est décrit ci-dessous. Le groupe de
travail a décidé que cette étude ne concernerait que l’évaluation de la reproductibilité de l’extraction d’ADN
du sol. Pour cela, le groupe de travail a décidé que chaque laboratoire devait extraire l’ADN de différents
échantillons de sol en suivant le même protocole. L’analyse approfondie des extraits d’ADN (purification et
analyses de l’ADN) a été conduite par le laboratoire en charge de ce projet (Laboratoire de Microbiologie du
Sol et de l’Environnement, Dijon, France) afin d’éviter tous biais dus à ces deux étapes supplémentaires.
Par conséquent, après extraction de l’ADN du sol, chaque laboratoire participant à ce projet a envoyé ses
extraits au Laboratoire de Microbiologie du Sol et de l’Environnement en vue d’analyses supplémentaires. Dès
réception, les échantillons d’ADN du sol ont été purifiés comme décrit en A.2.4. Les extraits d’ADN du sol ont
été quantifiés sur du gel d’agarose coloré au bromure d’éthidium. Après purification, l’ADN extrait du sol a fait
l’objet d’une analyse par PCR:
a) analyse par PCR quantitative de l’ADNr 16S pour estimer l’abondance totale de la communauté bactérienne
dans les sols étudiés;
b) analyse par PCR quantitative des séquences pcaH et narG pour estimer l’abondance des communautés
microbiennes pcaH et narG dans les sols étudiés;
c) A-RISA (analyse automatique des empreintes RISA) pour étudier la structure globale de la communauté
bactérienne.
A.2.2 Propriétés physico-chimiques du sol et préparation
Le groupe de travail a choisi six sols différents, appelés sols A, B, C, F, M et S (voir Tableau A.1), prélevés dans
différents pays européens. Un sol était contaminé par les HAP (celui prélevé en Finlande), quatre étaient des sols
agricoles (ceux prélevés en Suède et en France) et le dernier était un sol forestier (celui prélevé en Allemagne).
Des échantillons de sols frais ont été tamisés (mailles de 2 mm) et des aliquotes de 250 mg ont été préparées
dans des tubes de 2 ml. Ces aliquotes ont été immédiatement congelées dans de l’azote liquide et conservées
à -80 °C jusqu’à ce qu’elles soient expédiées. Cinq aliquotes de chaque sol ont été envoyées à chaque
laboratoire dans de la glace carbonique où elles ont été conservées à -80 °C jusqu’à ce que l’extraction de
l’ADN soit effectuée.
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