ISO/TS 5594:2022
(Main)Soil and water quality — Guidance and requirements for designing an interlaboratory trial for validation of biotests
Soil and water quality — Guidance and requirements for designing an interlaboratory trial for validation of biotests
This document aims to assist in designing and organizing trials for validation of biotests. The validation activities during the different steps of the standardization process are described. This document comprises the overall data evaluation and subsequent validation study conclusion. This document is intended for the validation of biotests which can differ in their experimental design and endpoints. It is possible that some of the requirements of this document are not applicable to all test methods.
Qualité de l’eau et du sol — Recommandations et exigences relatives à la conception d’un essai interlaboratoires pour la validation des essais biologiques
This document aims to assist in designing and organizing trials for validation of biotests. The validation activities during the different steps of the standardization process are described. This document comprises the overall data evaluation and subsequent validation study conclusion. This document is intended for the validation of biotests which can differ in their experimental design and endpoints. It is possible that some of the requirements of this document are not applicable to all test methods.
General Information
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TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 5594
First edition
2022-11
Soil and water quality — Guidance
and requirements for designing an
interlaboratory trial for validation of
biotests
Qualité de l’eau et du sol — Recommandations et exigences relatives à
la conception d’un essai interlaboratoires pour la validation des essais
biologiques
Reference number
ISO/TS 5594:2022(E)
© ISO 2022
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ISO/TS 5594:2022(E)
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Published in Switzerland
ii
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ISO/TS 5594:2022(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
5 Requirements, design and organization of method validation testing round(s).4
5.1 General . 4
5.2 Prevalidation — Minimum requirements of test method performance . 4
5.3 First validation step — Demonstration of participating laboratories’ readiness for
testing . 5
5.4 Second validation step — Demonstration of laboratory capability and
transferability of the biotest . 5
5.5 Third validation step — Method validation . 6
5.5.1 General . 6
5.5.2 Participating laboratories . 6
5.5.3 Samples . 6
5.5.4 Experimental design . 7
5.5.5 Supporting information for participants . 7
5.5.6 Data analysis and statistical evaluation of interlaboratory testing . 8
6 Assessment . .8
7 Documentation and reporting . 9
Annex A (informative) Determination of accuracy (trueness and precision) in case the
results of ecotoxicity tests are expressed as toxicity metrics .10
Annex B (informative) Estimation of the repeatability standard deviation .15
Annex C (informative) Calculation and reporting of uncertainty of s .17
R
Annex D (informative) Validation schema .19
Annex E (informative) Questionnaire (example) .20
Annex F (informative) Specific features of terrestrial biotests which are recommended to
be addressed by lead laboratories .22
Annex G (informative) Specific features of water biotests which are recommended to be
addressed by lead laboratories .25
Annex H (informative) Summary of interlaboratory trials performed within the validation
of terrestrial biotests .27
Annex I (informative) Summary of interlaboratory trials performed within the validation
of water biotests .33
Bibliography .40
iii
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ISO/TS 5594:2022(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological characterization, in collaboration with Technical Committee ISO/TC 147, Water quality,
Subcommittee SC 5, Biological methods.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
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ISO/TS 5594:2022(E)
Introduction
Validation of an ISO biotest standard aims to estimate the uncertainty of results by means of an
interlaboratory trial. This validation program typically involves three major steps.
a) Demonstration of readiness for testing: This 1st step is an opportunity for the lead laboratory to
ensure that recommended instrumentation is in place and that test organism and cell cultures have
been established using performance measures to ensure healthy organisms or cultures are used in
testing. These conditions are typically part of the clause/subclause entitled "Test organisms" or
"Test material" in an ISO standard.
b) Demonstration of laboratory capability and transferability of the biotest: In this 2nd step, the
participating laboratories aim to achieve successful control performance during this preliminary
interlaboratory testing round with a reference compound added either to a solid matrix or to a
liquid medium according to the biotest method to be validated. The ability to conduct the testing
standard is demonstrated by fulfilling the validity criteria (e.g. variability of controls expressed
as the coefficient of variation for the number of juveniles in a reproduction test) and qualifies the
laboratory for the final method validation step.
c) Method validation: The 3rd step involves only laboratories who have demonstrated the expertise in
conducting the ISO standard under development (step b). In case of validation of an ecotoxicological
or microbiological testing method, one or two rounds of interlaboratory method validation trial
using a contaminated environmental sample (or samples) are conducted and the results from
each round are used to calculate the intralaboratory and interlaboratory variability of the ISO
testing standard as a demonstration of method precision (Annex A). If repeated testing runs of
the biotest are feasible, repeatability is determined. For the validation of ecotoxicological methods
it can be useful to evaluate the correctness of the measured effect – the measurement trueness.
This holds true especially for methods of which the results are reported in terms of a quantitative
measurement such as a biological equivalence concentration. Obtained results are used for
confirming or adjusting the validity criteria.
For the validation study, representative samples should be selected according to the intended scope
of the standard (e.g. contaminated soils, amended soils, soils after remediation, waste materials,
wastewaters, eluates, surface water, groundwater, sediments and extracted samples).
An overall schema of the validation process can be found in Annex D.
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TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 5594:2022(E)
Soil and water quality — Guidance and requirements for
designing an interlaboratory trial for validation of biotests
1 Scope
This document aims to assist in designing and organizing trials for validation of biotests. The validation
activities during the different steps of the standardization process are described. This document
comprises the overall data evaluation and subsequent validation study conclusion.
This document is intended for the validation of biotests which can differ in their experimental design
and endpoints. It is possible that some of the requirements of this document are not applicable to all
test methods.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
control
material and/or matrix that duplicates all factors that can affect results except the specific condition or
treatment being studied
Note 1 to entry: In toxicity tests, the control should have all the same conditions as in the treatment exposure but
without the toxicant.
[SOURCE: Environment Canada 2005]
3.2
endpoint
statistically derived toxicity threshold (e.g. EC50)
[SOURCE: Environment Canada 2005, modified — The recommendation not to use the term for observed
variables, such as size, is deleted]
3.3
lead laboratory
laboratory responsible for organization of the interlaboratory validation study
1
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ISO/TS 5594:2022(E)
3.4
measurement trueness
trueness of measurement
trueness
closeness of agreement between the average of an infinite number of replicate measured quantity
values and a reference quantity value
Note 1 to entry: The requirement for an infinite number of replicate measurements has a theoretical background.
In practice a large series of test results is used to estimate the measurement trueness.
[SOURCE: ISO/IEC Guide 99:2007 2.14, modified — Notes to entry have been replaced]
3.5
performance characteristics
measures of the performance of a test under specific conditions, including its reliability and accuracy
Note 1 to entry: Performance characteristics are an indication of the test’s usefulness, limitations, and relevance.
[SOURCE: OECD 2005]
3.6
precision
closeness of agreement between indications or measured quantity values obtained by replicate
measurements on the same or similar objects under specified conditions
Note 1 to entry: Measurement precision is usually expressed numerically by measures of imprecision, such as
standard deviation, variance, or coefficient of variation under the specified conditions of measurement.
Note 2 to entry: The ‘specified conditions’ can be, for example, repeatability conditions (3.10) of measurement,
intermediate precision conditions of measurement, or reproducibility conditions (3.12) of measurement
(see ISO 5725-1).
Note 3 to entry: Measurement precision is used to define measurement repeatability (3.9), intermediate
measurement precision, and measurement reproducibility (3.11).
Note 4 to entry: Sometimes “measurement precision” is erroneously used to mean measurement accuracy.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.7
prevalidation
initial phase(s) of a validation study
Note 1 to entry: A small-scale study intended to obtain preliminary information on the relevance and reliability
of a test method. Based on the outcome of those studies, the test method protocol may be modified or optimized
to reduce intra- and/or interlaboratory variability and increase accuracy in subsequent validation studies. If
available, literature data may be used for this purpose.
[SOURCE: OECD: 2005, modified — Reasons for performing prevalidation are not included]
3.8
reference compound
chemical for which the response of the test organism is known
3.9
repeatability
measurement precision (3.6) under a set of repeatability conditions (3.10) of measurement
[SOURCE: JCGM 200:2012]
2
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ISO/TS 5594:2022(E)
3.10
repeatability condition
condition of measurement, out of a set of conditions that includes the same measurement procedure,
same operators, same measuring system, same operating conditions and same location, and replicate
measurements on the same or similar objects over a short period of time
Note 1 to entry: A condition of measurement is a repeatability condition only with respect to a specified set of
repeatability conditions.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.11
reproducibility
measurement precision (3.6) under reproducibility conditions (3.12) of measurement
Note 1 to entry: Relevant statistical terms are given in ISO 5725-1 and ISO 5725-2.
3.12
reproducibility condition
condition of measurement, out of a set of conditions that includes different locations, operators,
measuring systems, and replicate measurements on the same or similar objects
Note 1 to entry: The different measuring systems may use different measurement procedures.
Note 2 to entry: A specification should give the conditions changed and unchanged, to the extent practical.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.13
interlaboratory method validation trial
interlaboratory validation study in which all laboratories perform the same biotest using the same
material under testing and the same test protocol
Note 1 to entry: The purpose of the test is to determine inter laboratory and, whenever possible, intra laboratory
variability.
3.14
transferability
ability of a test procedure to be accurately and reliably performed in independent, competent
laboratories
[SOURCE: OECD: 2005]
4 Principle
Validation of a proposed test method is achieved through the demonstration of reasonable coefficients
of intralaboratory and interlaboratory variation, which have participated in the formal method
validation testing round(s) (i.e. the 3rd validation step, 5.5). Repeatability should preferentially be
determined. However, on occasion, the duration or workload of the test method prevents the analysis
by individual laboratories from being repeated. In case of missing experimental data obtained under
repeatability conditions, it is proposed to estimate repeatability from the confidence limits of the
toxic metric that integrates the variability of repeated measures of the biological variable in each
treatment/dilution (see Reference [67]). If appropriate, the measurement trueness of the method can
be determined in line with the method validation, in particular for methods the results of which are
reported in biological equivalence (BEQ) concentrations (see ISO 23196). The final decision to include
the measurement trueness in the interlaboratory method validation trial has to be taken by the lead
laboratory in consultation with other experts involved in the development of the method.
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ISO/TS 5594:2022(E)
5 Requirements, design and organization of method validation testing round(s)
5.1 General
A prerequisite for the performance of an interlaboratory trial is the method development has been
completed. As the aim of this kind of interlaboratory comparison is to evaluate the performance
characteristics of a biotest, technical aspects are defined within an interlaboratory method validation
trial procedure prepared by the lead laboratory and unique to each round of interlaboratory testing.
Specific features which are recommended to be addressed by lead laboratories are summarized in
Annexes F and G for terrestrial and water tests, respectively.
A lead laboratory should be able to demonstrate their level of competency for planning and conducting
the interlaboratory method validation trial. For example, the laboratory proposing to lead the validation
effort can state the years of experience of participating staff in conducting environmental toxicology
or microbiological testing (e.g., 10 + years); provide proof of recognised quality service through a
laboratory certification or accreditation program; provide proof that they have a track record in
planning and conducting multi-laboratory testing studies; demonstrate in writing that their staff have
a clear understanding of all steps the laboratory would be responsible for leading an inter-laboratory
validation program; clearly state their willingness to provide the materials to culture or holding and
acclimation organisms required to conduct the new biological testing standard prior to and during the
full validation testing round; or, state their willingness to provide remote or on-site training to assist
participating laboratories with preliminary steps needed to show their readiness to conduct the new
testing procedure. Specific suggestions and further details on steps and capability of a lead laboratory
and their staff are outlined in ISO 17043.
Within the interlaboratory method validation trial, the lead laboratory should:
— be responsible for the organization and performance of the three validation steps (5.3, 5.4, 5.5) or
interlaboratory testing rounds;
— prepare an interlaboratory method validation trial procedure for each round of testing, defining all
technical aspects of the performance of the biotest;
— supply the participants with the necessary instructions, test samples (e.g. contaminated soils,
amended soils, soils after remediation, waste materials, wastewaters, eluates, surface water,
groundwater, sediments and extracted samples) and materials selected by the lead laboratory, for
each testing round;
— be responsible for the analysis and reporting of results from each testing round;
— be responsible for requesting feedback from laboratory participants on the proposed interlaboratory
method validation trial procedure prior to each testing round, through an organized tele- or video
conference or e-mail exchange.
An example of different roles of personnel involved in organising of the interlaboratory method
validation trial can be found in ISO 5725-2:2019, Clause 6.
Unless requested otherwise by the lead laboratory, it is highly recommended to transfer all results
along with all test condition parameter measurements, immediately after completion of testing for
each specific testing round.
5.2 Prevalidation — Minimum requirements of test method performance
The primary step of method validation should rely on a thorough evaluation of the peer-reviewed
scientific literature and other relevant and credible reports and publications providing information
about the performance of the test method. This literature review should aim at identifying experimental
conditions which can have an impact on the outputs of a biotest. As a result, additional laboratory
experiments can be performed to refine and optimize the procedure accordingly. Special attention
should be paid to the ecological relevance of organisms and biological responses used in biological,
ecological and ecotoxicological testing with respect to the properties of the matrix to be considered, e.g.
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pH, organic matter, conductivity, clay content or turbidity. The interlaboratory method validation trial
design should cover the range of properties appropriate for the testing matrix (e.g. water, sediment,
soil) for which the biotest is relevant.
For the optimization of the biotest for ecotoxicity testing, controls have to be defined which differentiate
effects of intrinsic properties of the test samples from those caused by contaminants. For example, the
validation of a test with regards to its applicability in the risk assessment of contaminated sites, should
include a contaminated as well as a reference soil sample. The reference soil sample should have similar
intrinsic properties to the contaminated one, but contain no or negligible levels of the contaminants.
Test methods are often defined for two or more different type(s) of samples, for instance, contaminated
sites, amended soils, soils after remediation, waste materials (e.g. dredged material, municipal sludge
from a wastewater treatment plant, composed material, or manure, especially those for possible land
disposal), wastewaters, eluates, surface water, groundwater, sediments, chemicals. Ideally, the test
method is validated using the most applicable contaminant or contaminated media type. However, full
validation of a method that incorporates a large variety of samples is typically not possible. It can be
unnecessary to perform such a wide validation if a limited number of samples is, to the lead laboratory
experts' opinion, considered representative of the most important fields of application. For example,
the validation of a test method for evaluating the quality of surface waters (e.g. river water samples
from a non-polluted upstream area and a downstream point affected by diffuse pollution or an effluent
discharge), or the efficiency of wastewater treatment plants (e.g. using liquid samples of pre-treatment
influent and/or final treated effluent) should consider the selection of samples appropriate for the
application purpose.
5.3 First validation step — Demonstration of participating laboratories’ readiness for
testing
The first step is to demonstrate the readiness of participating laboratories to culture test organisms
or cell cultures and to conduct the testing standard. It is recommended to evaluate readiness of the
participating laboratories using a questionnaire or survey completed by each participant (Annex E).
This questionnaire provides information to the validation trial coordinator of the lead laboratory
regarding the available technical know-how, experience and resources for the culturing of test
organisms and conductance of the test procedure.
5.4 Second validation step — Demonstration of laboratory capability and
transferability of the biotest
The second step of interlaboratory testing is used to perform a preliminary assessment of the
transferability and reliability of the test and to identify possible limitations of the test. Occasionally,
interlaboratory method validation trial rounds involving experienced laboratory participants do
not generate comparable data. In such a situation, the lead laboratory can further restrict method
options to bring a higher degree of standardization prior to the next round of inter-lab testing or can
conduct or sponsor additional method research to further standardize the culturing or testing parts
of the methodology. Results of the second validation step can be used in the design of the future
interlaboratory validation testing round.
At least one laboratory independent from the laboratory that developed the test method conducts the
full biotest for an initial assessment and review of its interlaboratory transferability and preliminary
reproducibility. Participating laboratories perform the biotest in control conditions and with a reference
compound with known toxicity at a specific test concentration or known concentration range provided
by the lead laboratory. Results are evaluated by the lead laboratory which can lead to optimization of
the organisms’ culturing and/or testing procedure. Only laboratories who pass the proposed validity
criteria (e.g. variability of controls expressed as the coefficient of variation, sensitivity, biological
response rate of the tested organisms in controls) should participate in the method validation testing
round (see 5.5). Involvement of inexperienced laboratories is outlined in 5.5.2. Integration of these
laboratories sometimes results in less precise conclusions leading to questions of test transferability.
In cases where the test method fails to provide sufficient reproducibility, depending on the degree of
failure, it can be considered for further optimization or can require further test method research. All
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requirements specified for the interlaboratory method validation trial in 5.5.5 are valid for the second
step.
5.5 Third validation step — Method validation
5.5.1 General
The third step involves a testing round (or rounds) to achieve method validation. The interlaboratory
method validation trial procedure is designed to evaluate the interlaboratory variability of the results
obtained. This is done by conducting the same measurements using the full test method in each
participating laboratory. Repeatability (intralaboratory variability) can be estimated if the testing
and data analyses are repeated by each laboratory. An alternative approach for the estimation of
repeatability using the confidence limits of the toxic metric that integrates the variability of repeated
measures of the biological variable in each treatment/dilution can be found in Annex B. If th
...
ISO/TC 190/SC 4
Date : : 2022-1011
ISO/DTSTS 5594:2022(F)
ISO/TC 190/SC 4
Secrétariat : : AFNOR
Qualité de l’eau et du sol — Recommandations et exigences relatives à la
conception d’un essai interlaboratoires pour la validation des essais biologiques
Soil and water quality — Guidance and requirements for designing an interlaboratory
trial for validation of biotests
ICS : 13.080.30 ; 13.060.70
Type du document : Norme internationale
Sous-type du document :
Stade du document : (60) Publication
Langue du document : F
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peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique
ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur l’internet ou sur un Intranet, sans
autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci--après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Fax + 41 22 749 09 47
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www.iso.org
Publié en Suisse
© ISO 2022 – Tous droits réservés 2
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ISO/TS 5594:2022(F)
Sommaire Page
Avant-propos . iv
Introduction . v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 3
5 Exigences, conception et organisation de la ou des campagnes d’essais de validation
de la méthode . 4
5.1 Généralités . 4
5.2 Prévalidation — Exigences minimales relatives aux performances de la méthode
d’essai . 5
5.3 Première étape de validation — Démonstration de l’état de préparation
des laboratoires participants en vue des essais . 5
5.4 Deuxième étape de validation — Démonstration de l’aptitude du laboratoire et de la
transférabilité de l’essai biologique . 6
5.5 Troisième étape de validation — Validation de la méthode . 6
5.5.1 Généralités . 6
5.5.2 Laboratoires participants . 6
5.5.3 Échantillons . 7
5.5.4 Plan d’expérimentation . 8
5.5.5 Informations à fournir aux participants . 8
5.5.6 Analyse de données et évaluation statistique des essais interlaboratoires . 8
6 Évaluation . 9
7 Documentation et rapport . 10
Annexe A (informative) Détermination de l’exactitude (justesse et fidélité) lorsque les
résultats des essais d’écotoxicité sont exprimés en descripteurs de toxicité . 11
Annexe B (informative) Estimation de l’écart-type de répétabilité . 17
Annexe C (informative) Calcul et rapport d’incertitude de s . 19
R
Annexe D (informative) Schéma de validation . 22
Annexe E (informative) Questionnaire (exemple) . 24
Annexe F (informative) Caractéristiques spécifiques des essais biologiques terrestres
recommandés par les laboratoires de référence . 26
Annexe G (informative) Caractéristiques spécifiques des essais biologiques aquatiques
recommandés par les laboratoires de référence . 30
Annexe H (informative) Résumé des essais interlaboratoires réalisés dans le cadre de la
validation d’essais biologiques terrestres . 32
Annexe I (informative) Résumé des essais interlaboratoires réalisés dans le cadre de la
validation d’essais biologiques aquatiques . 36
Bibliographie . 41
© ISO 2022 – Tous droits réservés 3
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ISO/TS 5594:2022(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en
général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit
de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales
et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la
normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l'élaboration
du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-proposle lien suivant : .
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190 Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique, en collaboration avec le comité technique CENISO/TC 147, Qualité de l'eau,
sous--comité SC 5, Méthodes biologiques.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
4 © ISO 2022 – Tous droits réservés
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ISO/TS 5594:2022(F)
Introduction
La validation d’une norme ISO relative à des essais biologiques a pour but d’estimer l’incertitude des
résultats au moyen d’un essai interlaboratoires. Ce programme de validation comporte généralement
trois étapes majeures.
a) Démonstration de l’état de préparation en vue des essais: cette première étape donne au laboratoire
de référence l’occasion de s’assurer que l’instrumentation recommandée est en place et que les
organismes d’essai et les cultures cellulaires ont été établis en utilisant des mesurages de
performance afin de garantir l’utilisation de cultures ou d’organismes sains lors des essais. Ces
conditions sont généralement spécifiées dans l’article ou le paragraphe intitulé «Organismes d’essai»
ou «Matériaux d’essai» dans une norme ISO.
b) Démonstration de l’aptitude du laboratoire et de la transférabilité de l’essai biologique: au cours
de cette deuxième étape, les laboratoires participants ont pour but d’atteindre les performances dans
les conditions contrôlées pendant cette campagne d’essais interlaboratoires préliminaires, en
ajoutant un composé de référence à une matrice solide ou à un milieu liquide, selon la méthode
d’essai biologique à valider. La capacité de mise en œuvre de la norme d’essai est démontrée lorsque
les critères de validité (par exemple la variabilité des témoins exprimée par le coefficient de variation
du nombre de jeunes dans le cadre d’un essai de reproduction) et qualifie le laboratoire pour
la dernière étape de validation de la méthode.
c) Validation de la méthode: la troisième étape n’implique que les laboratoires qui ont démontré leur
expertise à mettre en œuvre la norme ISO en cours d’élaboration (étape b). En cas de validation
d’une méthode d’essai écotoxicologique ou microbiologique, une ou deux campagnes d’essais
interlaboratoires de validation d’une méthode utilisant un ou plusieurs échantillons
environnementaux sont menées, et les résultats de chaque campagne servent à calculer la variabilité
intralaboratoire et interlaboratoires de la norme d’essai ISO afin de démontrer la fidélité de la
méthode (Annexe A). Si la répétition des campagnes d’essais biologiques est possible, la répétabilité
est déterminée. Pour la validation des méthodes écotoxicologiques, il peut s’avérer utile d’évaluer
l’exactitude de l’effet mesuré – la justesse de mesure. CeciCela prévaut en particulier pour les
méthodes dont les résultats sont rapportés sous forme de mesurage quantitatif tel qu’une
concentration biologique équivalente. Les résultats obtenus servent à confirmer ou ajuster les
critères de validité.
Pour l’étude de validation, il convient de choisir des échantillons représentatifs en fonction du domaine
d’application prévu de la norme (par exemple sols contaminés, sols amendés, sols après remédiation,
déchets, eaux usées, éluats, eaux de surface, eaux souterraines, sédiments et échantillons extraits).
L’Annexe D fournit un schéma global du processus de validation.
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ISO/TS 5594:2022(F)
SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 5594:2022(F)
Qualité de l’eau et du sol — Recommandations et exigences
relatives à la conception d’un essai interlaboratoires pour
la validation des essais biologiques
1 Domaine d’application
Le présent document a pour but de faciliter la conception et l’organisation des essais de validation
d’essais biologiques. Il décrit les activités de validation au cours des différentes étapes du processus
de normalisation et comprend l’évaluation globale des données et la conclusion qui découle de l’étude
de validation.
Le présent document est destiné à la validation d’essais biologiques dont le plan d’expérimentation et
les critères d’effet peuvent différer. Il se peut que certaines exigences du présent document ne soient pas
applicables à toutes les méthodes d’essai.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes ::
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https://www.iso.org/obp ;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https://www.electropedia.org/.
3.1
témoin
matériau et/ou matrice qui reproduit tous les facteurs susceptibles d’avoir un impact sur les résultats,
à l’exception de la condition spécifique ou du traitement étudié
Note 1 à l’article: Dans les essais de toxicité, il convient que le témoin soit soumis à la totalité des conditions
rencontrées lors de l’exposition au traitement, mais sans le produit toxique.
[SOURCE: Environment Canada 2005]
3.2
critère d’effet
seuil de toxicité déterminé par voie statistique (CE50, par exemple)
[SOURCE: Environment Canada 2005, modifié — La recommandation de ne pas utiliser ce terme pour des
variables observées, telle que la taille, a été supprimée]
3.3
laboratoire de référence
laboratoire en charge de l’organisation de l’étude de validation interlaboratoires
© ISO 2022 – Tous droits réservés 1
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ISO/DTS TS 5594:2022(F)
3.4
justesse de mesure
justesse
étroitesse de l’accord entre la moyenne d’un nombre infini de valeurs mesurées répétées et une valeur
de référence
Note 1 à l’article: L’exigence d’un nombre infini de mesures répétées a un fondement théorique. Dans la pratique,
une grande série de résultats d’essai sert à estimer la justesse de mesure.
[SOURCE: Guide ISO/IEC 99:2007, 2.14, modifié — Les Notes à l’article ont été remplacées]
3.5
caractéristiques de performance
mesurages de la performance d’un essai dans des conditions particulières, y compris sa fiabilité et son
exactitude
Note 1 à l’article: Les caractéristiques de performance donnent une indication de l’utilité, des limites et de la
pertinence de l’essai.
[SOURCE: OCDE 2005]
3.6
fidélité
étroitesse de l’accord entre les indications ou les valeurs mesurées obtenues par des mesurages répétés
du même objet ou d’objets similaires dans des conditions spécifiées
Note 1 à l’article: La fidélité est en général exprimée numériquement par des caractéristiques, telles que l’écart--
type, la variance ou le coefficient de variation dans les conditions spécifiées.
Note 2 à l’article: Les conditions spécifiées peuvent être, par exemple, des conditions de répétabilité (3.10),
des conditions de fidélité intermédiaire ou des conditions de reproductibilité (3.12) (voir l’ISO 5725--1).
Note 3 à l’article: La fidélité sert à définir la répétabilité (3.9) de mesure, la fidélité intermédiaire de mesure
et la reproductibilité (3.11) de mesure.
Note 4 à l’article: Le terme «fidélité de mesure» est quelquefois utilisé improprement pour désigner l’exactitude de
mesure.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.7
prévalidation
phase(s) initiale(s) d’une étude de validation
Note 1 à l’article: Cette étude à petite échelle vise à obtenir des informations préliminaires sur la pertinence
et la fiabilité d’une méthode d’essai. Sur la base des résultats de cette étude, il est ensuite permis de modifier ou
d’optimiser le protocole de la méthode d’essai afin de réduire la variabilité intralaboratoire et/ou interlaboratoires
et d’augmenter l’exactitude des études de validation ultérieures. Si elles sont disponibles, les données de la
littérature peuvent être utilisées à cet effet.
[SOURCE: OCDE:2005, modifié — Les raisons de la réalisation d’une prévalidation ne sont pas précisées]
3.8
composé de référence
produit chimique pour lequel la réponse de l’organisme d’essai est connue
3.9
répétabilité
fidélité (3.6) de mesure selon un ensemble de conditions de répétabilité (3.10)
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ISO/TS 5594:2022(F)
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.10
condition de répétabilité
condition de mesurage dans un ensemble de conditions qui comprennent la même procédure de mesure,
les mêmes opérateurs, le même système de mesure, les mêmes conditions de fonctionnement et le même
lieu, ainsi que des mesurages répétés sur le même objet ou des objets similaires pendant une courte
période de temps
Note 1 à l’article: Une condition de mesurage n’est une condition de répétabilité que par rapport à un ensemble
donné de conditions de répétabilité.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.11
reproductibilité
fidélité (3.6) de mesure selon un ensemble de conditions de reproductibilité (3.12)
Note 1 à l’article: Des termes statistiques pertinents sont donnés dans l’ISO 5725--1 et l’ISO 5725--2.
3.12
condition de reproductibilité
condition de mesurage dans un ensemble de conditions qui comprennent des lieux, des opérateurs et des
systèmes de mesure différents, ainsi que des mesurages répétés sur le même objet ou des objets
similaires
Note 1 à l’article: Les différents systèmes de mesure peuvent utiliser des procédures de mesure différentes.
Note 2 à l’article: Il convient qu’une spécification relative aux conditions contienne, dans la mesure du possible,
les conditions que l’on fait varier et celles qui restent inchangées.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.13
essai de validation interlaboratoires d’une méthode
étude de validation interlaboratoires au cours de laquelle tous les laboratoires réalisent le même essai
biologique en utilisant le même matériau en essai et le même protocole d’essai
Note 1 à l’article: L’essai a pour objectif de déterminer la variabilité interlaboratoires et, dans la mesure du
possible, intralaboratoire.
3.14
transférabilité
capacité des laboratoires compétents et indépendants à mettre en œuvre une procédure d’essai
de manière précise et fiable
[SOURCE: OCDE:2005]
4 Principe
La validation d’une méthode d’essai proposée est obtenue par la démonstration de coefficients
de variation raisonnables dansintralaboratoire et entre les laboratoires interlaboratoires raisonnables
qui ont participé aux campagnes d’essais de validation formelle de la méthode (c’est-à-dire à la troisième
étape de validation, 5.5). Il convient, de préférence, de déterminer la répétabilité. Cependant, la durée ou
la charge de travail de la méthode d’essai empêche parfois la répétition de l’analyse par des laboratoires
individuels. En cas d’absence de données expérimentales obtenues dans des conditions de répétabilité, il
est proposé d’estimer la répétabilité à partir des limites de confiance du descripteur de toxicité qui
intègre la variabilité des mesurages répétés de la variable biologique dans chaque traitement/dilution
(voir référence [67]). Le cas échéant, la justesse de mesure de la méthode peut être déterminée en accord
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ISO/DTS TS 5594:2022(F)
avec la validation de la méthode, en particulier pour les méthodes dont les résultats sont rapportés en
concentrations biologiques équivalentes (CBE) (voir l’ISO 23196). La décision finale d’inclure la justesse
de mesure dans l’essai interlaboratoires de validation de la méthode doit être prise par le laboratoire de
référence, après consultation des autres experts impliqués dans l’élaboration de la méthode.
5 Exigences, conception et organisation de la ou des campagnes d’essais
de validation de la méthode
5.1 Généralités
Une condition préalable à la réalisation d’un essai interlaboratoires est que le développement de la
méthode soit achevé. Comme l’objectif de ce type de comparaison interlaboratoires est d’évaluer les
caractéristiques de performance d’un essai biologique, les aspects techniques sont définis dans une
procédure d’essai de validation interlaboratoires de la méthode, préparée par le laboratoire de référence
et unique à chaque campagne d’essais interlaboratoires. Les caractéristiques spécifiques dont l’examen
est recommandé aux laboratoires de référence sont respectivement résumées dans les Annexes F et G
pour les essais terrestres et aquatiques, respectivement.
Il convient qu’un laboratoire de référence soit en mesure de démontrer son niveau de compétence
en matière de planification et de réalisation de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode.
Par exemple, le laboratoire qui propose de diriger le processus de validation peut indiquer les années
d’expérience du personnel participant à la réalisation des essais de toxicologie environnementale ou
de microbiologie (par exemple plus de 10 ans d’expérience) ;); apporter la preuve d’une qualité de service
reconnue par le biais d’un programme de certification ou d’accréditation; fournir la preuve qu’il dispose
d’un dossier de suivi de la planification et de la réalisation d’études d’essais multilaboratoires; démontrer
par écrit que son personnel comprend clairement toutes les étapes dont le laboratoire serait en charge
pour mener un programme de validation interlaboratoires; manifester clairement sa volonté de fournir
les matériaux nécessaires pour la culture ou le maintien et l’acclimatation des organismes requis pour la
mise en œuvre de la nouvelle norme d’essai biologique avant et pendant la campagne d’essais
de validation complète; ou indiquer sa volonté d’assurer une formation à distance ou sur site afin d’aider
les laboratoires participants aux étapes préliminaires nécessaires pour démontrer leur état de
préparation pour la mise en œuvre de la nouvelle procédure d’essai. Des suggestions spécifiques et des
détails supplémentaires concernant les étapes et l’aptitude d’un laboratoire de référence et de son
personnel sont décrits dans l’ISO 17043.
Dans le cadre de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode, il convient que le laboratoire
de référence:
— soit responsable de l’organisation et de l’exécution des trois étapes de validation (5.3, 5.4, 5.5) ou des
campagnes d’essais interlaboratoires;
— prépare une procédure d’essai de validation interlaboratoires de la méthode pour chaque campagne
d’essais, en définissant tous les aspects techniques de l’exécution de l’essai biologique;
— fournisse aux participants les instructions nécessaires, les échantillons pour essai (par exemple sols
pollués, sols amendés, sols après remédiation, déchets, eaux usées, éluats, eaux de surface, eaux
souterraines, sédiments et échantillons extraits) et les matériaux sélectionnés par le laboratoire de
référence, pour chaque campagne d’essais;
— soit en charge de l’analyse et du compte-rendu des résultats de chaque campagne d’essais;
— soit chargé de demander aux laboratoires participants un retour d’information sur la procédure
d’essai de validation interlaboratoires de la méthode proposée, avant chaque campagne d’essais,
en organisant une télé- ou visio-conférence ou par un échange de courrier électronique.
Un exemple des différents rôles du personnel impliqué dans l’organisation de l’essai de validation
.
interlaboratoires de la méthode est donné dans l’ISO 5725--2:2019, Article 6
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ISO/TS 5594:2022(F)
Sauf spécification contraire du laboratoire de référence, il est fortement recommandé de transférer tous
les résultats ainsi que tous les mesurages des paramètres des conditions d’essai, juste après la fin
des essais pour chaque campagne spécifique.
5.2 Prévalidation — Exigences minimales relatives aux performances de la méthode
d’essai
Il convient que la première étape de validation de la méthode repose sur une évaluation minutieuse de la
littérature scientifique évaluée par les pairs et d’autres rapports et publications pertinents et crédibles
fournissant des informations sur les performances de la méthode d’essai. Il est recommandé d’axer cette
revue documentaire sur l’identification des conditions expérimentales susceptibles d’avoir un impact sur
les résultats d’un essai biologique. Des expériences complémentaires peuvent être réalisées en
laboratoire pour affiner et optimiser la procédure en conséquence. Il est recommandé de porter une
attention particulière à la pertinence écologique des organismes ainsi qu’aux réponses biologiques
utilisées dans les essais biologiques, écologiques et écotoxicologiques par rapport aux propriétés de la
matrice à étudier, par exemple le pH, la matière organique, la conductivité, la teneur en argile ou
la turbidité. Il convient que la conception de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode couvre
la plage de propriétés adaptée à la matrice d’essai (par exemple eau, sédiment, sol) pour laquelle l’essai
biologique est pertinent.
Pour optimiser l’essai biologique pour les essais d’écotoxicité, des témoins doivent être définis pour
différencier les effets des propriétés intrinsèques des échantillons pour essai de ceux causés par les
contaminants. Par exemple, il est recommandé que la validation d’un essai en ce qui concerne son
applicabilité dans l’évaluation des risques des sites pollués comprenne un échantillon de sol pollué ainsi
qu’un échantillon de sol de référence. Il convient que l’échantillon de sol de référence présente des
propriétés intrinsèques similaires à celles de l’échantillon contaminé, mais ne contienne aucun
contaminant ou un niveau de contaminants négligeable.
Des méthodes d’essai sont souvent définies pour au moins deux types d’échantillons différents,
par exemple des sites pollués, des sols amendés, des sols après remédiation, des déchets (par exemple
matériaux de dragage, boues municipales provenant d’une station d’épuration des eaux usées, matières
composées ou lisier, en particulier ceux destinés à un éventuel épandage), des eaux usées, des éluats,
des eaux de surface, des eaux souterraines, des sédiments ou des produits chimiques. Dans une situation
idéale, la méthode d’essai est validée en utilisant le type de contaminant le plus applicable ou le type
de milieu le plus contaminé. Cependant, la validation complète d’une méthode intégrant une grande
diversité d’échantillons n’est généralement pas possible. Il peut être inutile d’effectuer une validation
aussi étendue si un nombre limité d’échantillons est, d’après l’avis des experts du laboratoire de
référence, considéré comme représentatif des domaines d’application les plus importants. Par exemple,
il convient que la validation d’une méthode d’essai destinée à évaluer la qualité des eaux de surface
(par exemple des échantillons d’eau de rivière provenant d’une zone non polluée en amont et d’un point
en aval affecté par une pollution diffuse ou un rejet d’effluents), ou l’efficacité des stations d’épuration
des eaux usées (par exemple en utilisant des échantillons liquides d’effluents ayant été soumis à un
traitement préliminaire et/ou final) tienne compte de la sélection d’échantillons adaptés à l’objectif de
l’application.
5.3 Première étape de validation — Démonstration de l’état de préparation
des laboratoires participants en vue des essais
La première étape consiste à démontrer l’état de préparation des laboratoires participants pour la culture
des organismes d’essai ou des cultures cellulaires et la mise en œuvre de la norme d’essai. Il est
recommandé d’évaluer l’état de préparation des laboratoires participants à l’aide d’une enquête ou d’un
questionnaire complété par chaque participant (Annexe E). Ce questionnaire fournit au coordinateur des
essais de validation du laboratoire de référence, des informations concernant le savoir-faire technique,
l’expérience et les ressources disponibles pour la culture des organismes d’essai et la mise en œuvre
de la procédure d’essai.
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ISO/DTS TS 5594:2022(F)
5.4 Deuxième étape de validation — Démonstration de l’aptitude du laboratoire
et de la transférabilité de l’essai biologique
La deuxième étape de l’essai interlaboratoires consiste à réaliser une évaluation préliminaire de la
transférabilité et de la fiabilité de l’e
...
SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 5594
Première édition
2022-11
Qualité de l’eau et du sol —
Recommandations et exigences
relatives à la conception d’un essai
interlaboratoires pour la validation
des essais biologiques
Soil and water quality — Guidance and requirements for designing an
interlaboratory trial for validation of biotests
Numéro de référence
ISO/TS 5594:2022(F)
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Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
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Publié en Suisse
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ISO/TS 5594:2022(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 3
5 Exigences, conception et organisation de la ou des campagnes d’essais de validation
de la méthode . 4
5.1 Généralités . 4
5.2 Prévalidation — Exigences minimales relatives aux performances de la méthode
d’essai . 5
5.3 Première étape de validation — Démonstration de l’état de préparation
des laboratoires participants en vue des essais . 5
5.4 Deuxième étape de validation — Démonstration de l’aptitude du laboratoire et de
la transférabilité de l’essai biologique . 5
5.5 Troisième étape de validation — Validation de la méthode . 6
5.5.1 Généralités . 6
5.5.2 Laboratoires participants . 6
5.5.3 Échantillons . 7
5.5.4 Plan d’expérimentation . 7
5.5.5 Informations à fournir aux participants . 8
5.5.6 Analyse de données et évaluation statistique des essais interlaboratoires . 8
6 Évaluation . 9
7 Documentation et rapport .10
Annexe A (informative) Détermination de l’exactitude (justesse et fidélité) lorsque les
résultats des essais d’écotoxicité sont exprimés en descripteurs de toxicité .11
Annexe B (informative) Estimation de l’écart-type de répétabilité .16
Annexe C (informative) Calcul et rapport d’incertitude de s .18
R
Annexe D (informative) Schéma de validation .20
Annexe E (informative) Questionnaire (exemple) .21
Annexe F (informative) Caractéristiques spécifiques des essais biologiques terrestres
recommandés par les laboratoires de référence .23
Annexe G (informative) Caractéristiques spécifiques des essais biologiques aquatiques
recommandés par les laboratoires de référence .27
Annexe H (informative) Résumé des essais interlaboratoires réalisés dans le cadre de la
validation d’essais biologiques terrestres .29
Annexe I (informative) Résumé des essais interlaboratoires réalisés dans le cadre de la
validation d’essais biologiques aquatiques .33
Bibliographie .39
iii
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ISO/TS 5594:2022(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190 Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique, en collaboration avec le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-
comité SC 5, Méthodes biologiques.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
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ISO/TS 5594:2022(F)
Introduction
La validation d’une norme ISO relative à des essais biologiques a pour but d’estimer l’incertitude des
résultats au moyen d’un essai interlaboratoires. Ce programme de validation comporte généralement
trois étapes majeures.
a) Démonstration de l’état de préparation en vue des essais: cette première étape donne au
laboratoire de référence l’occasion de s’assurer que l’instrumentation recommandée est en place
et que les organismes d’essai et les cultures cellulaires ont été établis en utilisant des mesurages
de performance afin de garantir l’utilisation de cultures ou d’organismes sains lors des essais.
Ces conditions sont généralement spécifiées dans l’article ou le paragraphe intitulé «Organismes
d’essai» ou «Matériaux d’essai» dans une norme ISO.
b) Démonstration de l’aptitude du laboratoire et de la transférabilité de l’essai biologique: au cours
de cette deuxième étape, les laboratoires participants ont pour but d’atteindre les performances
dans les conditions contrôlées pendant cette campagne d’essais interlaboratoires préliminaires, en
ajoutant un composé de référence à une matrice solide ou à un milieu liquide, selon la méthode
d’essai biologique à valider. La capacité de mise en œuvre de la norme d’essai est démontrée lorsque
les critères de validité (par exemple la variabilité des témoins exprimée par le coefficient de
variation du nombre de jeunes dans le cadre d’un essai de reproduction) et qualifie le laboratoire
pour la dernière étape de validation de la méthode.
c) Validation de la méthode: la troisième étape n’implique que les laboratoires qui ont démontré
leur expertise à mettre en œuvre la norme ISO en cours d’élaboration (étape b). En cas de
validation d’une méthode d’essai écotoxicologique ou microbiologique, une ou deux campagnes
d’essais interlaboratoires de validation d’une méthode utilisant un ou plusieurs échantillons
environnementaux sont menées, et les résultats de chaque campagne servent à calculer la variabilité
intralaboratoire et interlaboratoires de la norme d’essai ISO afin de démontrer la fidélité de la
méthode (Annexe A). Si la répétition des campagnes d’essais biologiques est possible, la répétabilité
est déterminée. Pour la validation des méthodes écotoxicologiques, il peut s’avérer utile d’évaluer
l’exactitude de l’effet mesuré – la justesse de mesure. Cela prévaut en particulier pour les méthodes
dont les résultats sont rapportés sous forme de mesurage quantitatif tel qu’une concentration
biologique équivalente. Les résultats obtenus servent à confirmer ou ajuster les critères de validité.
Pour l’étude de validation, il convient de choisir des échantillons représentatifs en fonction du domaine
d’application prévu de la norme (par exemple sols contaminés, sols amendés, sols après remédiation,
déchets, eaux usées, éluats, eaux de surface, eaux souterraines, sédiments et échantillons extraits).
L’Annexe D fournit un schéma global du processus de validation.
v
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SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 5594:2022(F)
Qualité de l’eau et du sol — Recommandations et exigences
relatives à la conception d’un essai interlaboratoires pour
la validation des essais biologiques
1 Domaine d’application
Le présent document a pour but de faciliter la conception et l’organisation des essais de validation
d’essais biologiques. Il décrit les activités de validation au cours des différentes étapes du processus
de normalisation et comprend l’évaluation globale des données et la conclusion qui découle de l’étude
de validation.
Le présent document est destiné à la validation d’essais biologiques dont le plan d’expérimentation et
les critères d’effet peuvent différer. Il se peut que certaines exigences du présent document ne soient
pas applicables à toutes les méthodes d’essai.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
témoin
matériau et/ou matrice qui reproduit tous les facteurs susceptibles d’avoir un impact sur les résultats,
à l’exception de la condition spécifique ou du traitement étudié
Note 1 à l'article: Dans les essais de toxicité, il convient que le témoin soit soumis à la totalité des conditions
rencontrées lors de l’exposition au traitement, mais sans le produit toxique.
[SOURCE: Environment Canada 2005]
3.2
critère d’effet
seuil de toxicité déterminé par voie statistique (CE50, par exemple)
[SOURCE: Environment Canada 2005, modifié — La recommandation de ne pas utiliser ce terme pour
des variables observées, telle que la taille, a été supprimée]
3.3
laboratoire de référence
laboratoire en charge de l’organisation de l’étude de validation interlaboratoires
1
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ISO/TS 5594:2022(F)
3.4
justesse de mesure
justesse
étroitesse de l’accord entre la moyenne d’un nombre infini de valeurs mesurées répétées et une valeur
de référence
Note 1 à l'article: L’exigence d’un nombre infini de mesures répétées a un fondement théorique. Dans la pratique,
une grande série de résultats d’essai sert à estimer la justesse de mesure.
[SOURCE: Guide ISO/IEC 99:2007, 2.14, modifié — Les Notes à l’article ont été remplacées]
3.5
caractéristiques de performance
mesurages de la performance d’un essai dans des conditions particulières, y compris sa fiabilité et son
exactitude
Note 1 à l'article: Les caractéristiques de performance donnent une indication de l’utilité, des limites et de la
pertinence de l’essai.
[SOURCE: OCDE 2005]
3.6
fidélité
étroitesse de l’accord entre les indications ou les valeurs mesurées obtenues par des mesurages répétés
du même objet ou d’objets similaires dans des conditions spécifiées
Note 1 à l'article: La fidélité est en général exprimée numériquement par des caractéristiques, telles que l’écart-
type, la variance ou le coefficient de variation dans les conditions spécifiées.
Note 2 à l'article: Les conditions spécifiées peuvent être, par exemple, des conditions de répétabilité (3.10),
des conditions de fidélité intermédiaire ou des conditions de reproductibilité (3.12) (voir l’ISO 5725-1).
Note 3 à l'article: La fidélité sert à définir la répétabilité (3.9) de mesure, la fidélité intermédiaire de mesure
et la reproductibilité (3.11) de mesure.
Note 4 à l'article: Le terme «fidélité de mesure» est quelquefois utilisé improprement pour désigner l’exactitude
de mesure.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.7
prévalidation
phase(s) initiale(s) d’une étude de validation
Note 1 à l'article: Cette étude à petite échelle vise à obtenir des informations préliminaires sur la pertinence
et la fiabilité d’une méthode d’essai. Sur la base des résultats de cette étude, il est ensuite permis de modifier
ou d’optimiser le protocole de la méthode d’essai afin de réduire la variabilité intralaboratoire et/ou
interlaboratoires et d’augmenter l’exactitude des études de validation ultérieures. Si elles sont disponibles, les
données de la littérature peuvent être utilisées à cet effet.
[SOURCE: OCDE: 2005, modifié — Les raisons de la réalisation d’une prévalidation ne sont pas précisées]
3.8
composé de référence
produit chimique pour lequel la réponse de l’organisme d’essai est connue
3.9
répétabilité
fidélité (3.6) de mesure selon un ensemble de conditions de répétabilité (3.10)
[SOURCE: JCGM 200:2012]
2
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ISO/TS 5594:2022(F)
3.10
condition de répétabilité
condition de mesurage dans un ensemble de conditions qui comprennent la même procédure de
mesure, les mêmes opérateurs, le même système de mesure, les mêmes conditions de fonctionnement
et le même lieu, ainsi que des mesurages répétés sur le même objet ou des objets similaires pendant une
courte période de temps
Note 1 à l'article: Une condition de mesurage n’est une condition de répétabilité que par rapport à un ensemble
donné de conditions de répétabilité.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.11
reproductibilité
fidélité (3.6) de mesure selon un ensemble de conditions de reproductibilité (3.12)
Note 1 à l'article: Des termes statistiques pertinents sont donnés dans l’ISO 5725-1 et l’ISO 5725-2.
3.12
condition de reproductibilité
condition de mesurage dans un ensemble de conditions qui comprennent des lieux, des opérateurs et
des systèmes de mesure différents, ainsi que des mesurages répétés sur le même objet ou des objets
similaires
Note 1 à l'article: Les différents systèmes de mesure peuvent utiliser des procédures de mesure différentes.
Note 2 à l'article: Il convient qu’une spécification relative aux conditions contienne, dans la mesure du possible,
les conditions que l’on fait varier et celles qui restent inchangées.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.13
essai de validation interlaboratoires d’une méthode
étude de validation interlaboratoires au cours de laquelle tous les laboratoires réalisent le même essai
biologique en utilisant le même matériau en essai et le même protocole d’essai
Note 1 à l'article: L’essai a pour objectif de déterminer la variabilité interlaboratoires et, dans la mesure du
possible, intralaboratoire.
3.14
transférabilité
capacité des laboratoires compétents et indépendants à mettre en œuvre une procédure d’essai
de manière précise et fiable
[S OU RC E: O CDE: 2005 ]
4 Principe
La validation d’une méthode d’essai proposée est obtenue par la démonstration de coefficients
de variation intralaboratoire et interlaboratoires raisonnables qui ont participé aux campagnes d’essais
de validation formelle de la méthode (c’est-à-dire à la troisième étape de validation, 5.5). Il convient,
de préférence, de déterminer la répétabilité. Cependant, la durée ou la charge de travail de la méthode
d’essai empêche parfois la répétition de l’analyse par des laboratoires individuels. En cas d’absence
de données expérimentales obtenues dans des conditions de répétabilité, il est proposé d’estimer
la répétabilité à partir des limites de confiance du descripteur de toxicité qui intègre la variabilité
des mesurages répétés de la variable biologique dans chaque traitement/dilution (voir référence [67]).
Le cas échéant, la justesse de mesure de la méthode peut être déterminée en accord avec la validation
de la méthode, en particulier pour les méthodes dont les résultats sont rapportés en concentrations
biologiques équivalentes (CBE) (voir l’ISO 23196). La décision finale d’inclure la justesse de mesure
dans l’essai interlaboratoires de validation de la méthode doit être prise par le laboratoire de référence,
après consultation des autres experts impliqués dans l’élaboration de la méthode.
3
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5 Exigences, conception et organisation de la ou des campagnes d’essais
de validation de la méthode
5.1 Généralités
Une condition préalable à la réalisation d’un essai interlaboratoires est que le développement de la
méthode soit achevé. Comme l’objectif de ce type de comparaison interlaboratoires est d’évaluer les
caractéristiques de performance d’un essai biologique, les aspects techniques sont définis dans une
procédure d’essai de validation interlaboratoires de la méthode, préparée par le laboratoire de référence
et unique à chaque campagne d’essais interlaboratoires. Les caractéristiques spécifiques dont l’examen
est recommandé aux laboratoires de référence sont respectivement résumées dans les Annexes F et G
pour les essais terrestres et aquatiques, respectivement.
Il convient qu’un laboratoire de référence soit en mesure de démontrer son niveau de compétence
en matière de planification et de réalisation de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode.
Par exemple, le laboratoire qui propose de diriger le processus de validation peut indiquer les années
d’expérience du personnel participant à la réalisation des essais de toxicologie environnementale
ou de microbiologie (par exemple plus de 10 ans d’expérience); apporter la preuve d’une qualité de
service reconnue par le biais d’un programme de certification ou d’accréditation; fournir la preuve qu’il
dispose d’un dossier de suivi de la planification et de la réalisation d’études d’essais multilaboratoires;
démontrer par écrit que son personnel comprend clairement toutes les étapes dont le laboratoire serait
en charge pour mener un programme de validation interlaboratoires; manifester clairement sa volonté
de fournir les matériaux nécessaires pour la culture ou le maintien et l’acclimatation des organismes
requis pour la mise en œuvre de la nouvelle norme d’essai biologique avant et pendant la campagne
d’essais de validation complète; ou indiquer sa volonté d’assurer une formation à distance ou sur site
afin d’aider les laboratoires participants aux étapes préliminaires nécessaires pour démontrer leur état
de préparation pour la mise en œuvre de la nouvelle procédure d’essai. Des suggestions spécifiques et
des détails supplémentaires concernant les étapes et l’aptitude d’un laboratoire de référence et de son
personnel sont décrits dans l’ISO 17043.
Dans le cadre de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode, il convient que le laboratoire
de référence:
— soit responsable de l’organisation et de l’exécution des trois étapes de validation (5.3, 5.4, 5.5) ou
des campagnes d’essais interlaboratoires;
— prépare une procédure d’essai de validation interlaboratoires de la méthode pour chaque campagne
d’essais, en définissant tous les aspects techniques de l’exécution de l’essai biologique;
— fournisse aux participants les instructions nécessaires, les échantillons pour essai (par exemple
sols pollués, sols amendés, sols après remédiation, déchets, eaux usées, éluats, eaux de surface, eaux
souterraines, sédiments et échantillons extraits) et les matériaux sélectionnés par le laboratoire de
référence, pour chaque campagne d’essais;
— soit en charge de l’analyse et du compte-rendu des résultats de chaque campagne d’essais;
— soit chargé de demander aux laboratoires participants un retour d’information sur la procédure
d’essai de validation interlaboratoires de la méthode proposée, avant chaque campagne d’essais,
en organisant une télé- ou visio-conférence ou par un échange de courrier électronique.
Un exemple des différents rôles du personnel impliqué dans l’organisation de l’essai de validation
interlaboratoires de la méthode est donné dans l’ISO 5725-2:2019, Article 6.
Sauf spécification contraire du laboratoire de référence, il est fortement recommandé de transférer
tous les résultats ainsi que tous les mesurages des paramètres des conditions d’essai, juste après la fin
des essais pour chaque campagne spécifique.
4
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ISO/TS 5594:2022(F)
5.2 Prévalidation — Exigences minimales relatives aux performances de la méthode
d’essai
Il convient que la première étape de validation de la méthode repose sur une évaluation minutieuse de la
littérature scientifique évaluée par les pairs et d’autres rapports et publications pertinents et crédibles
fournissant des informations sur les performances de la méthode d’essai. Il est recommandé d’axer
cette revue documentaire sur l’identification des conditions expérimentales susceptibles d’avoir un
impact sur les résultats d’un essai biologique. Des expériences complémentaires peuvent être réalisées
en laboratoire pour affiner et optimiser la procédure en conséquence. Il est recommandé de porter
une attention particulière à la pertinence écologique des organismes ainsi qu’aux réponses biologiques
utilisées dans les essais biologiques, écologiques et écotoxicologiques par rapport aux propriétés de
la matrice à étudier, par exemple le pH, la matière organique, la conductivité, la teneur en argile ou
la turbidité. Il convient que la conception de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode couvre
la plage de propriétés adaptée à la matrice d’essai (par exemple eau, sédiment, sol) pour laquelle l’essai
biologique est pertinent.
Pour optimiser l’essai biologique pour les essais d’écotoxicité, des témoins doivent être définis pour
différencier les effets des propriétés intrinsèques des échantillons pour essai de ceux causés par les
contaminants. Par exemple, il est recommandé que la validation d’un essai en ce qui concerne son
applicabilité dans l’évaluation des risques des sites pollués comprenne un échantillon de sol pollué
ainsi qu’un échantillon de sol de référence. Il convient que l’échantillon de sol de référence présente
des propriétés intrinsèques similaires à celles de l’échantillon contaminé, mais ne contienne aucun
contaminant ou un niveau de contaminants négligeable.
Des méthodes d’essai sont souvent définies pour au moins deux types d’échantillons différents,
par exemple des sites pollués, des sols amendés, des sols après remédiation, des déchets (par exemple
matériaux de dragage, boues municipales provenant d’une station d’épuration des eaux usées, matières
composées ou lisier, en particulier ceux destinés à un éventuel épandage), des eaux usées, des éluats,
des eaux de surface, des eaux souterraines, des sédiments ou des produits chimiques. Dans une situation
idéale, la méthode d’essai est validée en utilisant le type de contaminant le plus applicable ou le type
de milieu le plus contaminé. Cependant, la validation complète d’une méthode intégrant une grande
diversité d’échantillons n’est généralement pas possible. Il peut être inutile d’effectuer une validation
aussi étendue si un nombre limité d’échantillons est, d’après l’avis des experts du laboratoire de
référence, considéré comme représentatif des domaines d’application les plus importants. Par exemple,
il convient que la validation d’une méthode d’essai destinée à évaluer la qualité des eaux de surface
(par exemple des échantillons d’eau de rivière provenant d’une zone non polluée en amont et d’un point
en aval affecté par une pollution diffuse ou un rejet d’effluents), ou l’efficacité des stations d’épuration
des eaux usées (par exemple en utilisant des échantillons liquides d’effluents ayant été soumis à un
traitement préliminaire et/ou final) tienne compte de la sélection d’échantillons adaptés à l’objectif de
l’application.
5.3 Première étape de validation — Démonstration de l’état de préparation
des laboratoires participants en vue des essais
La première étape consiste à démontrer l’état de préparation des laboratoires participants pour la
culture des organismes d’essai ou des cultures cellulaires et la mise en œuvre de la norme d’essai. Il est
recommandé d’évaluer l’état de préparation des laboratoires participants à l’aide d’une enquête ou d’un
questionnaire complété par chaque participant (Annexe E). Ce questionnaire fournit au coordinateur
des essais de validation du laboratoire de référence, des in
...
ISO/TC 190/SC 4
Date: 2022-0509-09
ISO/DTS 5594:2022
ISO/TC 190/SC 4
Secretariat: AFNOR
Soil and water quality — Guidance and requirements for designing an
interlaboratory trial for validation of biotests
German title
French title
ICS:
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ISO/DTS 5594:2022(E)
s© ISO 2022
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no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form or by any
means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an
intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the
address below or ISO’s member body in the country of the requester.
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CH-1214 Vernier, Geneva
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Website: www.iso.orgwww.iso.org
Published in Switzerland
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ISO/DTS 5594:2022(E)
Contents Page
Foreword . iv
Introduction . v
5.5.1 General . 6
5.5.2 Participating laboratories . 7
5.5.3 Samples. 7
5.5.4 Experimental design . 8
5.5.5 Supporting information for participants . 8
5.5.6 Data analysis and statistical evaluation of interlaboratory testing . 9
Annex A (informative) Determination of accuracy (trueness and precision) in case the
results of ecotoxicity tests are expressed as toxicity metrics . 11
Annex B (informative) Estimation of the repeatability of standard deviation . 18
Annex C (informative) Calculation and reporting of uncertainty of s .20
R
Annex D (informative) Validation schema . 23
Annex E (informative) Questionnaire (example) . 25
Annex F (informative) Specific features of terrestrial biotests which are recommended
to be addressed by lead laboratories . 27
Annex G (informative) Specific features of water biotests which are recommended to be
addressed by lead laboratories . 31
Annex H (informative) Summary of interlaboratory trials performed within the
validation of terrestrial biotests . 33
Annex I (informative) Summary of interlaboratory trials performed within the
validation of water biotests . 39
Bibliography . 45
© ISO 2022 – All rights reserved iii
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ISO/DTS 5594:2022(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national
standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally
carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a
technical committee has been established has the right to be represented on that committee.
International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part
in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for
the different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with
the editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject
of patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details
of any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction
and/or on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological characterization, in collaboration with Technical Committee ISO/TC 147, Water quality,
Subcommittee SC 5, Biological methods.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body.
A complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
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iv © ISO 2022 – All rights reserved
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ISO/DTS 5594:2022(E)
Introduction
Validation of an ISO biotest standard aims to estimate the uncertainty of results by means of an
interlaboratory trial. This validation program typically involves three major steps:.
a) Demonstration of readiness for testing: This 1st step is an opportunity for the lead laboratory to
ensure that recommended instrumentation is in place and that test organism and cell cultures
have been established using performance measures to ensure healthy organisms or cultures are
used in testing. These conditions are typically part of an ISO standard sectionthe
clause/subclause entitled "Test organisms" or "Test material;" in an ISO standard.
b) Demonstration of laboratory capability and transferability of the biotest: In this 2nd step, the
participating laboratories would aim to achieve successful control performance during this
preliminary interlaboratory testing round with a reference compound added either to a solid
matrix or to a liquid medium according to the biotest method to be validated. The ability to
conduct the testing standard is demonstrated by fulfilling the validity criteria (e.g. variability of
controls expressed as the coefficient of variation for the number of juveniles in a reproduction
test) and qualifies the laboratory for the final method validation step;.
c) Method Validationvalidation: The 3rd step involves only laboratories who have demonstrated
the expertise in conducting the ISO standard under development (step 2b). In case of validation
of an ecotoxicological or microbiological testing method, one or two rounds of interlaboratory
method validation trial using a contaminated environmental sample (or samples) are conducted
and the results from each round would beare used to calculate the within- and between-
laboratory variability of the ISO testing standard as a demonstration of method precision
(Annex A). If repeated testing runs of the biotest are feasible, repeatability is determined. For the
validation of ecotoxicological methods it can be useful to evaluate the correctness of the
measured effect – the measurement trueness (3.4). This holds true especially for methods of
which the results are reported in terms of a quantitative measurement such as a biological
equivalence concentration. Obtained results are used for confirming or adjusting the validity
criteria.
For the validation study, representative samples should be selected according to the intended scope
of the standard (e.g. contaminated soils, amended soils, soils after remediation, waste materials,
wastewaters, eluates, surface water, groundwater, sediments and extracted samples).
An overall schema of the validation process can be found in Annex D.
© ISO 2022 – All rights reserved v
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ISO/DTS 5594:2022(E)
TECHNICAL SPECIFICATION ISO/DTS 5594:2022(E)
Soil and water quality — Guidance and requirements for
designing an interlaboratory trial for validation of biotests
1 Scope
This document aims to assist in designing and organizing trials for validation of biotests. The
validation activities during the different steps of the standardization process are described. This
document comprises the overall data evaluation and subsequent validation study conclusion.
This document is intended for the validation of biotests which can differ in their experimental design
and endpoints. It is possible that some of the requirements of this guidance document are not
applicable to all test methods.
2 Normative references
ISO 5725-1:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results — Part 1:
General principles and definitions
ISO 5725-2:2019, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results — Part 2:
Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement
method
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminologicalterminology databases for use in standardization at the following
addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https://www.iso.org/obp
— IEC Electropedia: available at https://www.electropedia.org/
3.1
control
material and/or matrix that duplicates all factors that can affect results except the specific condition
or treatment being studied
Note 1 to entry: In toxicity tests, the control should have all the same conditions as in the treatment exposure
but without the toxicant.
[SOURCE: Environment Canada 2005]
© ISO 2022 – All rights reserved
© ISO 2022 – All rights reserved 1
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ISO/DTS 5594:2022(E)
3.2
endpoint
endpoint is generally defined as the statistically derived toxicity threshold (e.g. EC50)
[SOURCE: Environment Canada 2005, modified — The recommendation not to use the term for
observed variables, such as size, is deleted]
3.3
lead laboratory
laboratory selected byresponsible for organization of the member country proposing the new ISO
standardinterlaboratory validation study
3.4
measurement trueness
trueness of measurement
trueness
closeness of agreement between the average of an infinite number of replicate measured quantity
values and a reference quantity value
Note 1 to entry: The requirement for an infinite number of replicate measurements has a theoretical
background. In practice a large series of test results is used to estimate the measurement trueness.
[SOURCE: ISO/IEC Guide 99:2007 2.14, modified — Notes to entry have been replaced]
3.5
performance characteristics
operational characteristics of a test are the measures of itsthe performance of a test under specific
conditions, including its reliability and accuracy, and
Note 1 to entry: Performance characteristics are an indication of the test’s usefulness, limitations, and
relevance.
[SOURCE: OECD 2005]
3.6
precision
closeness of agreement between indications or measured quantity values obtained by replicate
measurements on the same or similar objects under specified conditions
Note 1 to entry: Measurement precision is usually expressed numerically by measures of imprecision, such as
standard deviation, variance, or coefficient of variation under the specified conditions of measurement.
Note 2 to entry: The ‘specified conditions’ can be, for example, repeatability conditions (3.10) of measurement,
intermediate precision conditions of measurement, or reproducibility conditions (3.12) of measurement
(see ISO 5725-1:1994).
Note 3 to entry: Measurement precision is used to define measurement repeatability, (3.9), intermediate
measurement precision, and measurement reproducibility. (3.11).
Note 4 to entry: Sometimes “measurement precision” is erroneously used to mean measurement accuracy.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.7
prevalidation
initial phase(s) of a validation study
2 © ISO 2022 – All rights reserved
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ISO/DTS 5594:2022(E)
Note 1 to entry: A small-scale study intended to obtain preliminary information on the relevance and reliability
of a test method. Based on the outcome of those studies, the test method protocol may be modified or optimized
to reduce intra- and/or interlaboratory variability and increase accuracy in subsequent validation studies. If
available, literature data may be used for this purpose.
[SOURCE: OECD:2005, modified — Reasons for perfomingperforming prevalidation are not included]
3.8
reference compound
chemical for which the response of the test organism is known
3.9
repeatability
measurement precision (3.6) under a set of repeatability conditions (3.10) of measurement
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.10
repeatability conditionscondition
condition of measurement, out of a set of conditions that includes the same measurement procedure,
same operators, same measuring system, same operating conditions and same location, and replicate
measurements on the same or similar objects over a short period of time
Note 1 to entry: A condition of measurement is a repeatability condition only with respect to a specified set of
repeatability conditions.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.11
reproducibility
measurement precision (3.6) under reproducibility conditions (3.12) of measurement
Note 1 to entry: Relevant statistical terms are given in ISO 5725-1:1994 and ISO 5725-2:2019.
3.12
reproducibility conditionscondition
condition of measurement, out of a set of conditions that includes different locations, operators,
measuring systems, and replicate measurements on the same or similar objects
Note 1 to entry: The different measuring systems may use different measurement procedures.
Note 2 to entry: A specification should give the conditions changed and unchanged, to the extent practical.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.13
interlaboratory method validation trial
interlaboratory validation study in which all laboratories perform the same biotest using the same
material under testing and the same test protocol
Note 1 to entry: The purpose of the test is to determine inter laboratory and, whenever possible, intra
laboratory variability.
© ISO 2022 – All rights reserved
© ISO 2022 – All rights reserved 3
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ISO/DTS 5594:2022(E)
3.14
transferability
ability of a test procedure to be accurately and reliably performed in independent, competent
laboratories
]
[SOURCE: OECD:2005
4 Principle
Validation of a proposed test method is achieved through the demonstration of reasonable
coefficients of variation within- and between- laboratories, which have participated in the formal
method validation testing round(s) (i.e. the 3rd validation step, 5.5). Repeatability should
preferentially be determined. However, on occasion, the duration or workload of the test method
prevents the analysis by individual laboratories from being repeated. In case of missing experimental
data obtained under repeatability conditions, it is proposed to estimate repeatability from the
confidence limits of the toxic metric that integrates the variability of repeated measures of the
biological variable in each treatment/dilution (see reference [65Reference [67]). If appropriate, the
measurement trueness (3.4) of the method can be determined in line with the method validation, in
particular for methods the results of which are reported in biological equivalence (BEQ)
concentrations (see ISO 23196). The final decision to include the measurement trueness (3.4) in the
interlaboratory method validation trial (3.13) has to be taken by the lead laboratory in consultation
with other experts from the ISO working groups involved in the development of the standard. method.
5 Requirements, design and organization of method validation testing
round(s)
5.1 General
A prerequisite for the performance of an interlaboratory trial is the method development has been
completed. As the aim of this kind of interlaboratory comparison is to evaluate the performance
characteristics of a biotest, technical aspects are defined within an interlaboratory method validation
trial procedure prepared by the lead laboratory and unique to each round of interlaboratory testing.
Specific features which are recommended to be addressed by lead laboratories are summarized in
Annexes F and G for terrestrial and water tests, respectively.
A lead laboratory should be able to demonstrate their level of competency for planning and
conducting the interlaboratory method validation trial for the validation of the proposed ISO
standard. For example, the laboratory proposing to lead the validation effort can state the years of
experience of participating staff in conducting environmental toxicology or microbiological testing
(e.g., 10 + years); provide proof of recognised quality service through a laboratory certification or
accreditation program; provide proof that they have a track record in planning and conducting multi-
laboratory testing studies; demonstrate in writing that their staff have a clear understanding of all
steps the laboratory would be responsible for leading an inter-laboratory validation program; clearly
state their willingness to provide the materials to culture or holding and acclimation organisms
required to conduct the new biological testing standard prior to and during the full validation testing
round; or, state their willingness to provide remote or on-site training to assist participating
laboratories with preliminary steps needed to show their readiness to conduct the new testing
procedure. Specific suggestions and further details on steps and capability of a lead laboratory and
their staff are outlined in ISO 17043.
Within the interlaboratory method validation trial, the lead laboratory should:
— be responsible for the organization and performance of the three validation steps (5.3, 5.4, 5.5)
or interlaboratory testing rounds;
4 © ISO 2022 – All rights reserved
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ISO/DTS 5594:2022(E)
— prepare an interlaboratory method validation trial procedure for each round of testing, defining
all technical aspects of the performance of the biotest;
— supply the participants with the necessary instructions, test samples (e.g. contaminated soils,
amended soils, soils after remediation, waste materials, wastewaters, eluates, surface water,
groundwater, sediments and extracted samples) and materials selected by the lead laboratory,
for each testing round;
— be responsible for the analysis and reporting of results from each testing round; and
— be responsible for requesting feedback from laboratory participants on the proposed
interlaboratory method validation trial procedure prior to each testing round, through an
organized tele- or video conference or e-mail exchange.
An example of different roles of personnel involved in organising of the interlaboratory method
validation trial can be found in ISO 5725-2:2019, Clause 6.
Unless requested otherwise by the lead laboratory, it is highly recommended to transfer all results
along with all test condition parameter measurements, immediately after completion of testing for
each specific testing round.
5.2 Prevalidation -— Minimum requirements of test method performance
The primary step of method validation should rely on a thorough evaluation of the peer-reviewed
scientific literature and other relevant and credible reports and publications providing information
about the performance of the test method. This literature review should aim at identifying
experimental conditions which can have an impact on the outputs of a biotest. As a result, additional
laboratory experiments can be performed to refine and optimize the procedure accordingly. Special
attention should be paid to the ecological relevance of organisms and biological responses used in
biological, ecological and ecotoxicological testing with respect to the properties of the matrix to be
considered, e.g. pH, organic matter, conductivity, clay content or turbidity. The standard, and
subsequently theThe interlaboratory method validation trial design, should cover the range of
properties appropriate for the testing matrix (e.g. water, sediment, soil, etc.)) for which the biotest is
relevant.
For the optimization of the biotest for ecotoxicity testing, controls have to be defined which will
differentiate effects of intrinsic properties of the test samples from those caused by contaminants.
For example, the validation of a test with regards to its applicability in the risk assessment of
contaminated sites, should include a contaminated as well as a reference soil sample. The reference
soil sample should have similar intrinsic properties to the contaminated one, but contain no or
negligible levels of the contaminants.
Test methods are often defined for two or more different type(s) of samples, for instance,
contaminated sites, amended soils, soils after remediation, waste materials (e.g. dredged material,
municipal sludge from a wastewater treatment plant, composed material, or manure, especially those
for possible land disposal), wastewaters, eluates, surface water, groundwater, sediments, chemicals.
Ideally, the test method is validated using the most applicable contaminant or contaminated media
type. However, full validation of a method that incorporates a large variety of samples is typically not
possible. It can be unnecessary to perform such a wide validation if a limited number of samples is,
to the lead laboratory experts' opinion, considered representative of the most important fields of
application. For example, the validation of a test method for evaluating the quality of surface waters
(of e.g.,. river water samples from a non-polluted upstream area and a downstream point affected by
diffuse pollution or an effluent discharge), or the efficiency of wastewater treatment plants (e.g.,.
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ISO/DTS 5594:2022(E)
using liquid samples of pre-treatment influent and/or final treated effluent) should consider the
selection of samples appropriate for the application purpose.
5.3 First validation step: — Demonstration of participating laboratories’ readiness
for testing
The first step is to demonstrate the readiness of participating laboratories to culture test organisms
or cell cultures and to conduct the testing standard. It is recommended to evaluate readiness of the
participating laboratories using a questionnaire or survey completed by each participant (Annex E).
This questionnaire will provideprovides information to the validation trial coordinator of the lead
laboratory regarding the available technical know-how, experience and resources for the culturing of
test organisms and conductance of the test procedure.
5.4 Second validation step: — Demonstration of laboratory capability and
transferability of the biotest
The second step of interlaboratory testing is used to perform a preliminary assessment of the
transferability and reliability of the test and to identify possible limitations of the test. Occasionally,
interlaboratory method validation trial rounds involving experienced laboratory participants doesdo
not generate comparable data. In such a situation, the lead laboratory can further restrict method
options to bring a higher degree of standardization prior to the next round of inter-lab testing or can
conduct or sponsor additional method research to further standardize the culturing or testing parts
of the methodology. Results of the second validation step can be used in the design of the future
interlaboratory validation testing round.
At least one laboratory independent from the laboratory that developed the test method will
conductconducts the full biotest for an initial assessment and review of its interlaboratory
transferability and preliminary reproducibility. Participating laboratories will perform the biotest in
control conditions and with a reference compound with known toxicity at a specific test
concentration or known concentration range provided by the lead laboratory. Results will beare
evaluated by the lead laboratory which can lead to optimization of the organisms’ culturing and/or
testing procedure. Only laboratories who pass the proposed validity criteria (e.g. variability of
controls expressed as the coefficient of variation, sensitivity, biological response rate of the tested
organisms in controls) should participate in the method validation testing round (see 5.5).
Involvement of inexperienced laboratories is outlined in 5.5.2. Integration of these laboratories
sometimes results in less precise conclusions leading to questions of test transferability. In cases
where the test method fails to provide sufficient reproducibility, depending on the degree of failure,
it can be considered for further optimization or can require further test method research. All
requirements specified for the interlaboratory method validation trial in 5.5.5 are valid for the second
step.
5.5 Third Validation Step:validation dtep — Method validation
5.5.1 General
The third step involves a testing round (or rounds) to achieve method validation. The interlaboratory
method validation trial procedure is designed to evaluate the interlaboratory variability of the results
obtained by applying the draft standard. This is done by conducting the same measurements using
the full test method in each participating laboratory. Repeatability (intralaboratory variability) can
be estimated if the testing and data analyses are repeated by each laboratory. An alternative approach
for the estimation of repeatability would be using the confidence limits of the toxic metric that
integrates the variability of repeated measures of the biological variable in each treatment/dilution
can be found in Annex B. If the output of a standard is not a numerical value (e.g. standard for
extraction of DNA), a specific approach is needed to evaluate reproducibility (see 5.5.6).
6 © ISO 2022 – All rights reserved
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ISO/DTS 5594:2022(E)
5.5.2 Participating laboratories
The number of participants has an influence on the reliability of the statistically calculated
performance data. It is suggested obtainingto obtain valid datasets from a minimum of 6 laboratories
located in 3 different countries. Therefore, it is strongly recommended that a greater number of test
laboratories and countries be invited and participate in interlaboratory method validation trials. The
Annex C provides guidance on how to proceed if a lower number of valid datasets is achieved by
calculating and reporting the uncertainty of the reproducibility variance.
Participation in this kind of trials is voluntary, and each participant laboratory should be given a code
(that can be communicated to the respective laboratory) to maintain anonymous the source of the
validation trial datasets. If the call for participants yields an insufficient number of laboratories that
are experienced with the method, assistance in applying this method should be provided by the lead
laboratory (e.g. offer to train personnel at inexperienced laboratories, host a training workshop,
propose a planning teleconference, etc.).).
An invitation to interested inter-laboratoryinterlaboratory participants shall be circulated well in
advance of the interlaboratory method validation trial launch. It is recommended that the lead
laboratory organizing the interlaboratory program circulate the invitation to potential participating
laboratories five months prior to the start of the first round of interlaboratory testing. Laboratories
should be asked to express their interest in participating within four weeks of receiving the
announcement of the interlaboratory trial.
If a full validation of a method is already present, the ISO working group responsible for the
development of the standard may decide to adopt the method may be adopted without a further
“interlaboratory method validation trial”.
5.5.3 Samples
Sample matrices shall reflect the scope of the draft stand
...
TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 5594
First edition
Soil and water quality — Guidance
and requirements for designing an
interlaboratory trial for validation of
biotests
Member bodies are requested to consult relevant national interests in ISO/TC
147/SC 5 before casting their ballot to the e-Balloting application.
PROOF/ÉPREUVE
Reference number
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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on
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or ISO’s member body in the country of the requester.
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Published in Switzerland
ii
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ISO/TS 5594:2022(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
5 Requirements, design and organization of method validation testing round(s).4
5.1 General . 4
5.2 Prevalidation — Minimum requirements of test method performance . 4
5.3 First validation step — Demonstration of participating laboratories’ readiness for
testing . 5
5.4 Second validation step — Demonstration of laboratory capability and
transferability of the biotest . 5
5.5 Third validation dtep — Method validation . 6
5.5.1 General . 6
5.5.2 Participating laboratories . 6
5.5.3 Samples . 6
5.5.4 Experimental design . 7
5.5.5 Supporting information for participants . 7
5.5.6 Data analysis and statistical evaluation of interlaboratory testing . 8
6 Assessment . .8
7 Documentation and reporting . 9
Annex A (informative) Determination of accuracy (trueness and precision) in case the
results of ecotoxicity tests are expressed as toxicity metrics .10
Annex B (informative) Estimation of the repeatability of standard deviation .15
Annex C (informative) Calculation and reporting of uncertainty of s .17
R
Annex D (informative) Validation schema .19
Annex E (informative) Questionnaire (example) .20
Annex F (informative) Specific features of terrestrial biotests which are recommended to
be addressed by lead laboratories .22
Annex G (informative) Specific features of water biotests which are recommended to be
addressed by lead laboratories .25
Annex H (informative) Summary of interlaboratory trials performed within the validation
of terrestrial biotests .27
Annex I (informative) Summary of interlaboratory trials performed within the validation
of water biotests .32
Bibliography .39
iii
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ISO/TS 5594:2022(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological characterization, in collaboration with Technical Committee ISO/TC 147, Water quality,
Subcommittee SC 5, Biological methods.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
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ISO/TS 5594:2022(E)
Introduction
Validation of an ISO biotest standard aims to estimate the uncertainty of results by means of an
interlaboratory trial. This validation program typically involves three major steps.
a) Demonstration of readiness for testing: This 1st step is an opportunity for the lead laboratory to
ensure that recommended instrumentation is in place and that test organism and cell cultures have
been established using performance measures to ensure healthy organisms or cultures are used in
testing. These conditions are typically part of the clause/subclause entitled "Test organisms" or
"Test material" in an ISO standard.
b) Demonstration of laboratory capability and transferability of the biotest: In this 2nd step, the
participating laboratories aim to achieve successful control performance during this preliminary
interlaboratory testing round with a reference compound added either to a solid matrix or to a
liquid medium according to the biotest method to be validated. The ability to conduct the testing
standard is demonstrated by fulfilling the validity criteria (e.g. variability of controls expressed
as the coefficient of variation for the number of juveniles in a reproduction test) and qualifies the
laboratory for the final method validation step.
c) Method validation: The 3rd step involves only laboratories who have demonstrated the
expertise in conducting the ISO standard under development (step b). In case of validation of an
ecotoxicological or microbiological testing method, one or two rounds of interlaboratory method
validation trial using a contaminated environmental sample (or samples) are conducted and the
results from each round are used to calculate the within- and between-laboratory variability of
the ISO testing standard as a demonstration of method precision (Annex A). If repeated testing
runs of the biotest are feasible, repeatability is determined. For the validation of ecotoxicological
methods it can be useful to evaluate the correctness of the measured effect – the measurement
trueness. This holds true especially for methods of which the results are reported in terms of a
quantitative measurement such as a biological equivalence concentration. Obtained results are
used for confirming or adjusting the validity criteria.
For the validation study, representative samples should be selected according to the intended scope
of the standard (e.g. contaminated soils, amended soils, soils after remediation, waste materials,
wastewaters, eluates, surface water, groundwater, sediments and extracted samples).
An overall schema of the validation process can be found in Annex D.
v
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TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 5594:2022(E)
Soil and water quality — Guidance and requirements for
designing an interlaboratory trial for validation of biotests
1 Scope
This document aims to assist in designing and organizing trials for validation of biotests. The validation
activities during the different steps of the standardization process are described. This document
comprises the overall data evaluation and subsequent validation study conclusion.
This document is intended for the validation of biotests which can differ in their experimental design
and endpoints. It is possible that some of the requirements of this document are not applicable to all
test methods.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
control
material and/or matrix that duplicates all factors that can affect results except the specific condition or
treatment being studied
Note 1 to entry: In toxicity tests, the control should have all the same conditions as in the treatment exposure but
without the toxicant.
[SOURCE: Environment Canada 2005]
3.2
endpoint
statistically derived toxicity threshold (e.g. EC50)
[SOURCE: Environment Canada 2005, modified — The recommendation not to use the term for observed
variables, such as size, is deleted]
3.3
lead laboratory
laboratory responsible for organization of the interlaboratory validation study
1
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---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/TS 5594:2022(E)
3.4
measurement trueness
trueness of measurement
trueness
closeness of agreement between the average of an infinite number of replicate measured quantity
values and a reference quantity value
Note 1 to entry: The requirement for an infinite number of replicate measurements has a theoretical background.
In practice a large series of test results is used to estimate the measurement trueness.
[SOURCE: ISO/IEC Guide 99:2007 2.14, modified — Notes to entry have been replaced]
3.5
performance characteristics
measures of the performance of a test under specific conditions, including its reliability and accuracy
Note 1 to entry: Performance characteristics are an indication of the test’s usefulness, limitations, and relevance.
[SOURCE: OECD 2005]
3.6
precision
closeness of agreement between indications or measured quantity values obtained by replicate
measurements on the same or similar objects under specified conditions
Note 1 to entry: Measurement precision is usually expressed numerically by measures of imprecision, such as
standard deviation, variance, or coefficient of variation under the specified conditions of measurement.
Note 2 to entry: The ‘specified conditions’ can be, for example, repeatability conditions (3.10) of measurement,
intermediate precision conditions of measurement, or reproducibility conditions (3.12) of measurement
(see ISO 5725-1).
Note 3 to entry: Measurement precision is used to define measurement repeatability (3.9), intermediate
measurement precision, and measurement reproducibility (3.11).
Note 4 to entry: Sometimes “measurement precision” is erroneously used to mean measurement accuracy.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.7
prevalidation
initial phase(s) of a validation study
Note 1 to entry: A small-scale study intended to obtain preliminary information on the relevance and reliability
of a test method. Based on the outcome of those studies, the test method protocol may be modified or optimized
to reduce intra- and/or interlaboratory variability and increase accuracy in subsequent validation studies. If
available, literature data may be used for this purpose.
[SOURCE: OECD: 2005, modified — Reasons for performing prevalidation are not included]
3.8
reference compound
chemical for which the response of the test organism is known
3.9
repeatability
measurement precision (3.6) under a set of repeatability conditions (3.10) of measurement
[SOURCE: JCGM 200:2012]
2
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ISO/TS 5594:2022(E)
3.10
repeatability condition
condition of measurement, out of a set of conditions that includes the same measurement procedure,
same operators, same measuring system, same operating conditions and same location, and replicate
measurements on the same or similar objects over a short period of time
Note 1 to entry: A condition of measurement is a repeatability condition only with respect to a specified set of
repeatability conditions.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.11
reproducibility
measurement precision (3.6) under reproducibility conditions (3.12) of measurement
Note 1 to entry: Relevant statistical terms are given in ISO 5725-1 and ISO 5725-2.
3.12
reproducibility condition
condition of measurement, out of a set of conditions that includes different locations, operators,
measuring systems, and replicate measurements on the same or similar objects
Note 1 to entry: The different measuring systems may use different measurement procedures.
Note 2 to entry: A specification should give the conditions changed and unchanged, to the extent practical.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.13
interlaboratory method validation trial
interlaboratory validation study in which all laboratories perform the same biotest using the same
material under testing and the same test protocol
Note 1 to entry: The purpose of the test is to determine inter laboratory and, whenever possible, intra laboratory
variability.
3.14
transferability
ability of a test procedure to be accurately and reliably performed in independent, competent
laboratories
[S OU RC E: OECD: 2005 ]
4 Principle
Validation of a proposed test method is achieved through the demonstration of reasonable coefficients
of variation within- and between- laboratories, which have participated in the formal method validation
testing round(s) (i.e. the 3rd validation step, 5.5). Repeatability should preferentially be determined.
However, on occasion, the duration or workload of the test method prevents the analysis by individual
laboratories from being repeated. In case of missing experimental data obtained under repeatability
conditions, it is proposed to estimate repeatability from the confidence limits of the toxic metric that
integrates the variability of repeated measures of the biological variable in each treatment/dilution
(see Reference [67]). If appropriate, the measurement trueness of the method can be determined in line
with the method validation, in particular for methods the results of which are reported in biological
equivalence (BEQ) concentrations (see ISO 23196). The final decision to include the measurement
trueness in the interlaboratory method validation trial has to be taken by the lead laboratory in
consultation with other experts involved in the development of the method.
3
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ISO/TS 5594:2022(E)
5 Requirements, design and organization of method validation testing round(s)
5.1 General
A prerequisite for the performance of an interlaboratory trial is the method development has been
completed. As the aim of this kind of interlaboratory comparison is to evaluate the performance
characteristics of a biotest, technical aspects are defined within an interlaboratory method validation
trial procedure prepared by the lead laboratory and unique to each round of interlaboratory testing.
Specific features which are recommended to be addressed by lead laboratories are summarized in
Annexes F and G for terrestrial and water tests, respectively.
A lead laboratory should be able to demonstrate their level of competency for planning and conducting
the interlaboratory method validation trial. For example, the laboratory proposing to lead the validation
effort can state the years of experience of participating staff in conducting environmental toxicology
or microbiological testing (e.g., 10 + years); provide proof of recognised quality service through a
laboratory certification or accreditation program; provide proof that they have a track record in
planning and conducting multi-laboratory testing studies; demonstrate in writing that their staff have
a clear understanding of all steps the laboratory would be responsible for leading an inter-laboratory
validation program; clearly state their willingness to provide the materials to culture or holding and
acclimation organisms required to conduct the new biological testing standard prior to and during the
full validation testing round; or, state their willingness to provide remote or on-site training to assist
participating laboratories with preliminary steps needed to show their readiness to conduct the new
testing procedure. Specific suggestions and further details on steps and capability of a lead laboratory
and their staff are outlined in ISO 17043.
Within the interlaboratory method validation trial, the lead laboratory should:
— be responsible for the organization and performance of the three validation steps (5.3, 5.4, 5.5) or
interlaboratory testing rounds;
— prepare an interlaboratory method validation trial procedure for each round of testing, defining all
technical aspects of the performance of the biotest;
— supply the participants with the necessary instructions, test samples (e.g. contaminated soils,
amended soils, soils after remediation, waste materials, wastewaters, eluates, surface water,
groundwater, sediments and extracted samples) and materials selected by the lead laboratory, for
each testing round;
— be responsible for the analysis and reporting of results from each testing round;
— be responsible for requesting feedback from laboratory participants on the proposed interlaboratory
method validation trial procedure prior to each testing round, through an organized tele- or video
conference or e-mail exchange.
An example of different roles of personnel involved in organising of the interlaboratory method
validation trial can be found in ISO 5725-2:2019, Clause 6.
Unless requested otherwise by the lead laboratory, it is highly recommended to transfer all results
along with all test condition parameter measurements, immediately after completion of testing for
each specific testing round.
5.2 Prevalidation — Minimum requirements of test method performance
The primary step of method validation should rely on a thorough evaluation of the peer-reviewed
scientific literature and other relevant and credible reports and publications providing information
about the performance of the test method. This literature review should aim at identifying experimental
conditions which can have an impact on the outputs of a biotest. As a result, additional laboratory
experiments can be performed to refine and optimize the procedure accordingly. Special attention
should be paid to the ecological relevance of organisms and biological responses used in biological,
ecological and ecotoxicological testing with respect to the properties of the matrix to be considered, e.g.
4
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ISO/TS 5594:2022(E)
pH, organic matter, conductivity, clay content or turbidity. The interlaboratory method validation trial
design should cover the range of properties appropriate for the testing matrix (e.g. water, sediment,
soil) for which the biotest is relevant.
For the optimization of the biotest for ecotoxicity testing, controls have to be defined which differentiate
effects of intrinsic properties of the test samples from those caused by contaminants. For example, the
validation of a test with regards to its applicability in the risk assessment of contaminated sites, should
include a contaminated as well as a reference soil sample. The reference soil sample should have similar
intrinsic properties to the contaminated one, but contain no or negligible levels of the contaminants.
Test methods are often defined for two or more different type(s) of samples, for instance, contaminated
sites, amended soils, soils after remediation, waste materials (e.g. dredged material, municipal sludge
from a wastewater treatment plant, composed material, or manure, especially those for possible land
disposal), wastewaters, eluates, surface water, groundwater, sediments, chemicals. Ideally, the test
method is validated using the most applicable contaminant or contaminated media type. However, full
validation of a method that incorporates a large variety of samples is typically not possible. It can be
unnecessary to perform such a wide validation if a limited number of samples is, to the lead laboratory
experts' opinion, considered representative of the most important fields of application. For example,
the validation of a test method for evaluating the quality of surface waters (e.g. river water samples
from a non-polluted upstream area and a downstream point affected by diffuse pollution or an effluent
discharge), or the efficiency of wastewater treatment plants (e.g. using liquid samples of pre-treatment
influent and/or final treated effluent) should consider the selection of samples appropriate for the
application purpose.
5.3 First validation step — Demonstration of participating laboratories’ readiness for
testing
The first step is to demonstrate the readiness of participating laboratories to culture test organisms
or cell cultures and to conduct the testing standard. It is recommended to evaluate readiness of the
participating laboratories using a questionnaire or survey completed by each participant (Annex E).
This questionnaire provides information to the validation trial coordinator of the lead laboratory
regarding the available technical know-how, experience and resources for the culturing of test
organisms and conductance of the test procedure.
5.4 Second validation step — Demonstration of laboratory capability and
transferability of the biotest
The second step of interlaboratory testing is used to perform a preliminary assessment of the
transferability and reliability of the test and to identify possible limitations of the test. Occasionally,
interlaboratory method validation trial rounds involving experienced laboratory participants do
not generate comparable data. In such a situation, the lead laboratory can further restrict method
options to bring a higher degree of standardization prior to the next round of inter-lab testing or can
conduct or sponsor additional method research to further standardize the culturing or testing parts
of the methodology. Results of the second validation step can be used in the design of the future
interlaboratory validation testing round.
At least one laboratory independent from the laboratory that developed the test method conducts the
full biotest for an initial assessment and review of its interlaboratory transferability and preliminary
reproducibility. Participating laboratories perform the biotest in control conditions and with a reference
compound with known toxicity at a specific test concentration or known concentration range provided
by the lead laboratory. Results are evaluated by the lead laboratory which can lead to optimization of
the organisms’ culturing and/or testing procedure. Only laboratories who pass the proposed validity
criteria (e.g. variability of controls expressed as the coefficient of variation, sensitivity, biological
response rate of the tested organisms in controls) should participate in the method validation testing
round (see 5.5). Involvement of inexperienced laboratories is outlined in 5.5.2. Integration of these
laboratories sometimes results in less precise conclusions leading to questions of test transferability.
In cases where the test method fails to provide sufficient reproducibility, depending on the degree of
failure, it can be considered for further optimization or can require further test method research. All
5
© ISO 2022 – All rights reserved PROOF/ÉPREUVE
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ISO/TS 5594:2022(E)
requirements specified for the interlaboratory method validation trial in 5.5.5 are valid for the second
step.
5.5 Third validation dtep — Method validation
5.5.1 General
The third step involves a testing round (or rounds) to achieve method validation. The interlaboratory
method validation trial procedure is designed to evaluate the interlaboratory variability of the results
obtained. This is done by conducting the same measurements using the full test method in each
participating laboratory. Repeatability (intralaboratory variability) can be estimated if the testing
and data analyses are repeated by each laboratory. An alternative approach for the estimation of
repeatability using the confidence limits of the toxic metric that integrates the variabili
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.