ISO 17512-1:2008
(Main)Soil quality — Avoidance test for determining the quality of soils and effects of chemicals on behaviour — Part 1: Test with earthworms (Eisenia fetida and Eisenia andrei)
Soil quality — Avoidance test for determining the quality of soils and effects of chemicals on behaviour — Part 1: Test with earthworms (Eisenia fetida and Eisenia andrei)
ISO 17512-1:2008 specifies a rapid screening method for evaluating the habitat function of soils and the influence of contaminants and chemicals on earthworm behaviour. The sublethal test is a rapid method that reflects the bioavailability of contaminant mixtures in natural soils and substances spiked into soils to Eisenia fetida and Eisenia andrei. The avoidance behaviour of the worms is the measurement endpoint of the test. This test is not intended to replace the earthworm reproduction test. Two different designs (a two section unit and a six section unit) have been developed and successfully applied. Both designs are applicable to either single-concentration (e. g. for assessing the quality of a field soil) or multi-concentration (e. g. for assessing the toxicity of a spiked chemical) tests. In both cases, the earthworms are allowed to make the initial choice on which compartment, control and a treatment [in the two section test vessel between right and left side; in the six section test vessel between the (3 + 3) alternating compartments], to enter.
Qualité du sol — Essai d'évitement pour contrôler la qualité des sols et les effets des produits chimiques sur le comportement — Partie 1: Essai avec des vers de terre (Eisenia fetida et Eisenia andrei)
L'ISO 17512-1:2008 spécifie une méthode d'essai biologique de dépistage rapide permettant d'évaluer la fonction d'habitat des sols ainsi que l'influence des contaminants et des produits chimiques sur le comportement des vers de terre. Cet essai sublétal constitue une méthode rapide qui reflète la biodisponibilité pour les espèces Eisenia fetida et Eisenia andrei des mélanges de contaminants dans les sols naturels et des sols dopés en substances. Le comportement d'évitement des vers constitue le critère d'effet de cet essai. Ce dernier n'est pas destiné à remplacer l'essai de reproduction des vers de terre. Deux modèles de conception différente (récipient d'essai à deux compartiments et récipient d'essai à six compartiments) ont été mis au point et mis en œuvre avec succès. Les deux modèles conviennent soit aux essais à une seule concentration (par exemple pour évaluer la qualité d'un sol naturel), soit aux essais à plusieurs concentrations (par exemple pour évaluer la toxicité d'un sol dopé par un produit chimique). Dans les deux cas, on laisse aux vers de terre le choix initial du compartiment où pénétrer: sol témoin et un traitement [dans le récipient d'essai à deux compartiments, choix entre le côté droit ou gauche; dans le récipient d'essai à six compartiments, choix entre les compartiments disposés de façon alternée (3 + 3)].
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 17512-1
First edition
2008-12-15
Soil quality — Avoidance test for
determining the quality of soils and
effects of chemicals on behaviour —
Part 1:
Test with earthworms (Eisenia fetida and
Eisenia andrei)
Qualité du sol — Essai d'évitement pour contrôler la qualité des sols et
les effets des produits chimiques sur le comportement —
Partie 1: Essai avec des vers de terre (Eisenia fetida et Eisenia andrei)
Reference number
ISO 17512-1:2008(E)
©
ISO 2008
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ISO 17512-1:2008(E)
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ISO 17512-1:2008(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction.v
1 Scope.1
2 Normative references.1
3 Terms and definitions .2
4 Principle .2
5 Reagents and materials .3
6 Apparatus.4
7 Procedure.5
7.1 Appropriate concentration range .5
7.2 Testing of soils .5
7.3 Testing of chemical.6
7.4 Reference substance .6
7.5 Validity criteria.6
8 Calculation and expression of results .6
9 Test report.7
Annex A (informative) Test chambers .8
Annex B (informative) Example of a breeding technique for Eisenia fetida and Eisenia andrei.11
Annex C (informative) Further test organisms.12
Annex D (informative) Contaminants that earthworms can detect and avoid in the avoidance test.13
Annex E (normative) Testing of chemicals in the avoidance test .14
Annex F (normative) Determination of water-holding capacity .16
Annex G (informative) Comparison of the results obtained in the two section chamber and six
section chamber system .17
Annex H (informative) Influence of soil properties on avoidance behaviour — Basis for the
threshold value of 20 % .20
Annex I (informative) Data gained in “dual” tests with the same (untreated) control soil on both
sides of the test vessels .22
Bibliography.24
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ISO 17512-1:2008(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 17512-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
methods.
ISO 17512 consists of the following parts, under the general title Soil quality — Avoidance test for determining
the quality of soils and effects of chemicals on behaviour:
⎯ Part 1: Test with earthworms (Eisenia fetida and Eisenia andrei)
The following part is under preparation:
⎯ Part 2: Test with collembolans (Folsomia candida)
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ISO 17512-1:2008(E)
Introduction
Ecotoxicological test systems are applied to obtain information about the effects of contaminants in soil and
are proposed to complement conventional chemical analysis (see ISO 15799). ISO 15799 includes a list and
short characterisation of recommended and standardised test systems. Aquatic test systems with soil eluate
are applied to obtain information about the fraction of contaminants potentially reaching the groundwater by
the water path (retention function of soils), whereas terrestrial test systems are used to assess the habitat
function of soils. As standardised test systems, a mortality test (ISO 11268-1) and a reproduction test
(ISO 11268-2) exist to investigate the habitat function of a soil with respect to earthworms as representatives
of the soil biocenosis.
The reproduction test with earthworms (ISO 11268-2) is applied to detect effects resulting from sublethal
concentrations. Such endpoints are preferably applied to obtain information on environmental effects.
However, the reproduction test is very labour-intensive and time-consuming, needing long incubation periods
with results obtained only after 56 days. As the test period and the work expense dictate the costs of a given
test, it is preferable to obtain the results within a short test period and at a high level of sensitivity. That is
especially the case for the assessment of remediated soils. This feature is offered by the avoidance test with
Eisenia fetida and Eisenia andrei. Experiences gained in a laboratory comparison test with eight contaminated
soils in three laboratories point out that the avoidance test is as sensitive as the reproduction test (Reference
[5]). However, it is not intended to use this test to replace the earthworm reproduction test.
NOTE The results were compared with those of the earthworm acute and reproduction tests carried out with the
same soils. The results showed that with a criterion of > 80 % avoidance response, a 72 % agreement of the results was
achieved.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 17512-1:2008(E)
Soil quality — Avoidance test for determining the quality of
soils and effects of chemicals on behaviour —
Part 1:
Test with earthworms (Eisenia fetida and Eisenia andrei)
1 Scope
This part of ISO 17512 specifies a rapid screening method for evaluating the habitat function of soils and the
influence of contaminants and chemicals on earthworm behaviour.
The sublethal test is a rapid method that reflects the bioavailability of contaminant mixtures in natural soils and
substances spiked into soils to Eisenia fetida and Eisenia andrei. The avoidance behaviour of the worms is
the measurement endpoint of the test. This test is not intended to replace the earthworm reproduction test.
Two different designs (a two section unit and a six section unit) have been developed and successfully
applied. Both designs are applicable to either single-concentration (e.g. for assessing the quality of a field soil)
or multi-concentration (e.g. for assessing the toxicity of a spiked chemical) tests. In both cases, the
earthworms are allowed to make the initial choice on which compartment, control and a treatment [in the two
section test vessel between right and left side; in the six section test vessel between the (3 + 3) alternating
compartments], to enter.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 11268-2:1998, Soil quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) — Part 2: Determination
of effects on reproduction
ISO 11269-2, Soil quality — Determination of the effects of pollutants on soil flora — Part 2: Effects of
chemicals on the emergence and growth of higher plants
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric
method
ISO 15799, Soil quality — Guidance on the ecotoxicological characterization of soil and soil materials
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ISO 17512-1:2008(E)
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
avoidance behaviour
tendency (of an organism) to avoid the test soil while preferring the control soil
3.2
habitat function
ability of soils/soil materials to serve as habitat for micro-organisms, plants and soil-living animals and their
interactions
[ISO 15799:2003]
NOTE Ecotoxicological tests as indicators for the habitat function provide information concerning the respective test
parameter, e.g. acute test for survival, or chronic tests for reproduction.
3.3
limited habitat function
habitat function (3.2) is limited if on average > 80 % of worms are found in the control soil (indication as an
impact on behaviour)
3.4
effective concentration
EC
x
concentration at which a specific effect is detected [where x is a percentage (10, 25, 50) of this effect; e.g.
avoidance]
EXAMPLE In this part of ISO 17512, an EC means the concentration of a substance or mixture of substances in
50
soil that is estimated to cause a behavioural response in 50 % of the test earthworms.
4 Principle
Ten adult earthworms (species Eisenia fetida or Eisenia andrei) are exposed at the same time to a control soil
and a contaminated soil or a soil containing test substances. Test soil and control soil are placed into each
test vessel and the earthworms are thus presented with a choice between the test soil and the control soil.
Two test-vessel designs are available:
a) a two section test vessel; and
b) a six section test vessel.
After an incubation period of two days, the number of worms is determined in all sections of the vessels.
Individual studies (e.g. testing boric acid in one of the two designs in different laboratories) or comparative
investigations (testing the same chemical or soil in the same laboratory, e.g. Reference [8]) have in some
cases shown different results. Recently, both designs were validated in interlaboratory tests in Canada
(Reference [2]) and France; however, no international ring test using both designs in parallel has been
performed so far. Therefore, for the time being, the choice of the design is up to the experimenter. When
doing so, practical considerations like costs of the units as well as the amount of waste produced should also
be taken into consideration.
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ISO 17512-1:2008(E)
5 Reagents and materials
5.1 Boric acid reference toxicant, recommended. H BO has been used historically as a soil
3 3
chemosterilant and is an effective non-selective biocide (relative molecular mass: 61,81). Earthworms can
detect and avoid sublethal concentrations that adversely affect reproduction. Boric acid satisfies the following
criteria that attest to its suitability as a reference toxicant:
a) it is effective at relatively low concentrations that are not strongly influenced by the nature of the
substrate;
b) it is relatively stable and persistent so that concentrations do not change rapidly over the duration of the
test;
c) it is reasonably water soluble or miscible in water, does not volatilise readily, and can be readily mixed
with soils;
d) there is a standard method for measuring boric acid concentrations in soil;
e) it represents a minimal hazard to technicians and it is free of disposal problems.
5.2 Biological material, consisting of adult earthworms of the species Eisenia fetida or Eisenia andrei
(individual mass: between 300 mg and 600 mg). Synchronisation of breeding of the organisms for this test is
not necessary. An example of how to breed compost worms is given in Annex B.
Condition the selected worms for at least one day in the selected control soil (5.4).
NOTE Eisenia fetida and Eisenia andrei are compost worms. Ecologically, these species are not the most important
in soils (Reference [7]). On the other hand, from a practical point of view, compost worms are much more suitable than
any other lumbricid species due to the fact that they reproduce very quickly and easily in the laboratory (i.e. mass cultures
can be obtained). In addition, the sensitivity of these species is more or less of the same order of magnitude in comparison
to other earthworm species. In most cases, the differences between species are — depending on the chemical or
contaminant mixture tested — not larger than a factor of 10 in acute or chronic tests (References [6], [7]). Despite the fact
that other earthworm species have already successfully been used in avoidance tests (see Annex C), a factor describing
their range of avoidance response is not yet known.
5.3 Test substrate. The soil to be tested should be sieved (size of openings, 2 mm) adjusted to about 60 %
of the maximum water holding capacity. The optimum water content is achieved, if there is no standing water
or free water appearing when the soil is compressed.
NOTE For highly silty and loamy soils, it can be difficult to get the necessary amount of soil sieved to u 2 mm with an
acceptable expenditure of work. The holes of the sieves may plug up within several minutes. Frequent cleaning is
necessary. In this case, it is acceptable to sieve the amount of soil needed for the test to u 4 mm.
Determine the water content and the pH in the presence of 1 mol/l KCl, in accordance with ISO 11465 and
ISO 10390, respectively, immediately before the start of the test. In addition, the maximum water holding
capacity shall be determined according to Annex F.
5.4 Control soil: three choices are possible (see also ISO 15799). Option a) is preferred, but since such a
soil is often not available either a standard soil, b), or an artificial soil, c), is possible (potential influences of
these soils are covered by the 80 % assessment criterion, see Clause 8).
a) A control soil as similar as the test soil in all characteristics other than the presence of contaminants.
b) A soil with the characteristics according to ISO 11269-2 [C u 1,5 %, sand (0,063 mm to 2 mm) content
org
of 50 % to 75 %, < 20 % of particles less than 0,02 mm; pH of 5 to 7,5].
c) Artificial soil in accordance with ISO 11268-2.
Natural soils should be sieved and the water content adjusted according to 5.3.
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ISO 17512-1:2008(E)
6 Apparatus
Usual laboratory equipment and in particular the following.
6.1 Containers (see Annex A).
2
6.1.1 Two section chamber: containers of capacity 1 l to 2 l with a cross-sectional area of about 0,02 m ,
such that a depth of 50 mm to 60 mm of the soil is achieved.
Test containers shall permit gaseous exchange between the medium and the atmosphere and access of light
(e.g. by means of a perforated transparent cover), and shall have provisions to prevent worms from escaping
(e.g. by using a tape to fix the cover). To avoid lateral effects of light, glass vessels shall be wrapped.
1)
Two section chambers are commercially available .
NOTE Due to the short test period and the proportionally large volume of soil in the vessels, a reduction of chemical
concentration in the soil resulting from sorption to the vessel walls is negligible. Nevertheless, inert material (e.g. glass or
stainless steel) is preferred.
6.1.2 Six section chamber (circular test units or vessels):
1) stainless steel for testing soil contaminated with organic compounds;
2) plastic (high density inert material) for testing soil contaminated with metals or metalloid compounds.
The circular test unit has a central chamber with six cut pie-shaped interconnecting compartments into which
the test soil is placed; interconnecting holes are located along the bottom of the compartment walls (three per
side) and along the bottom of the central chamber (two per side) so that the worms can move freely between
compartments. The plastic test unit should be wrapped in an opaque material (tin foil) to eliminate light.
Provisions to prevent worms from escaping are necessary.
The six section chamber is not commercially available. Therefore all details necessary to construct such
chambers are presented in the figures and in the text.
6.2 Divider (e.g. plastic or thin sheets of metal):
a) for the two section chamber, to divide the containers vertically into two identical sides;
b) for the six section chamber, to slide along the walls of the compartments at the end of a test to isolate
each section.
6.3 Equipment for measuring the water content of a substrate (according to ISO 11465).
6.4 Test environment.
6.4.1 Enclosure or environmental chamber, capable of being maintained at (20 ± 2) °C.
6.4.2 Light source, capable of delivering a constant light intensity of 400 lx to 800 lx on the containers at a
controlled light/dark cycle of between 12 h/12 h and 16 h/8 h.
NOTE A day/night cycle was chosen so that the conditions are comparable to the acute and reproduction test.
1) Bellaplast No. 597 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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ISO 17512-1:2008(E)
7 Procedure
7.1 Appropriate concentration range
The avoidance test is designed to detect sublethal effects. Therefore, the test is invalid if more than one worm
per vessel (i.e. one out of 10) is dead or missing at the end of the test (see 7.5). In order to avoid mortality, the
performance of a range-finding test is recommended.
7.2 Testing of soils
7.2.1 Two section chamber
At the beginning of the test, the vessels (6.1.1) are divided into two equal sections by means of a vertically
introduced divider. Vessels are filled with sieved soil up to a height of 50 mm to 60 mm. One half of the vessel
is filled with test soil (section A), the other half is filled with control soil (section B). Then the separator is
removed and 10 worms are placed on to the separating line of each test vessel (from there they have the
possibility to dig quickly into the soil, using the slit left by the divider as a starting point). The containers are
covered according to 6.1.1 and placed in the environmental chamber or in the test enclosure (6.4.1).
No feeding of the animals is required during the test.
The test is run with five replicates per treatment (test soils, controls or reference substance). To obtain a more
precise quantification of the behavioural effect, a dilution series may be prepared. For dilution of the
contaminated soil, the control soil should be used.
At the end of the test period (48 h) the control and test soils in each vessel are separated by inserting the
dividers. The dividers shall be inserted before the test units are moved from the environmental chamber. The
number of worms is determined for both sections of the vessels. Worms divided due to the introduction of the
divider are counted as 0,5 independent of the length of the remaining body. Missing worms are considered to
have either escaped from the test chamber or to have died and disintegrated during the test (see 7.1).
7.2.2 Six section chamber
The test soil and control soils are prepared (sieved, hydrated and mixed) and placed to a depth of 50 mm to
60 mm (350 ml soil) in each of three compartments in an alternating pattern (e.g. compartments 1, 3, and 5
have test soil and compartments 2, 4, and 6 have control soil) (see also Annex E). There is no soil in the
central chamber. Ten earthworms are added to the central chamber, one at a time, and the compartment
entered by each individual is recorded. The containers are covered (6.1.2) and placed in an environmental
chamber (6.4.1).
No feeding of the animals is performed during the test.
The test is run with five replicates for a single concentration test and at least with duplicates for a multi-
concentration test. For multi-concentration tests, the test soil consists of the site soil diluted with the
appropriate control soil.
At the end of the test period (48 h) the dividers are positioned to prevent further movement of the earthworms
between compartments. The dividers shall be inserted before the test units are moved from the environmental
chamber. The number of worms in each compartment is recorded and the total number in each treatment
within a test unit determined. Individual earthworms sliced inadvertently by the dividers are to be recorded as
0,5 independent of the length of the remaining body. Missing worms are considered to have either escaped
from the test chamber or to have died and disintegrated during the test (see 7.1).
NOTE The hypothesis tested is that at the beginning of the test the worms are randomly distributed among sections
and at the end of the test for a true avoidance response the earthworms are not distributed randomly among the sections
in a vessel. If, at the beginning of the test, the worms are non-randomly distributed, then there might not be an avoidance
response. Alternatively, there might be an avoidance response at the beginning of the test by worms refusing to enter
sections with contaminated soil that they instantly avoid. This rarely happens when the levels in soil are sublethal.
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ISO 17512-1:2008(E)
7.3 Testing of chemical
While the main use of avoidance tests is testing of potentially contaminated soils, it is also possible to use this
test for the assessment of the effects of single chemicals after they have spiked into a soil (examples of
chemicals detected by earthworms are given Annex D). Modifications to test single chemicals (including
statistical procedures) are specified in Annex E.
7.4 Reference substance
Boric acid is recommended as the reference toxicant. An avoidance behaviour response should be obtained
at a concentration of 750 mg H BO per kilogram of soil measured on the dry mass basis when artificial soil or
2 3
another control soil is used. Testing by the soil toxicology laboratory of Environment Canada generated a
boric acid EC of 618 mg/kg in a six section chamber test for avoidance behaviour using a chernozem clay
50
loam control soil spiked with boric acid (Reference [8]). When reporting EC values, also state the main soil
50
properties (i.e. pH, texture and organic matter content).
7.5 Validity criteria
The test is invalid if the number of dead or missing worms is > 10 % per treatment.
To validate the test set, check the homogeneity of distribution of the worms. For this purpose, fill the whole
test vessel with the same soil and ensure that the orientation of the test vessels in the room is the same. On
average, the ratio of worms should be within the range 60 % : 40 % for a two section chamber. More
information concerning the distribution of worms in such dual tests using different soils is provided in Annex I.
8 Calculation and expression of results
The mean plus or minus standard deviation of live individuals in the test soil is determined for each treatment
at the end of the test. For tests using the two section vessel, as well as for the six section vessel, the results
are presented as the number of individuals in the test soil per test vessel.
If the test soil and the control soil differ only regarding the contamination, statistical calculations may be
performed as follows.
For a single concentration test, the mean number of individuals at the end of the test in the test soil is
compared to the mean of the control soil treatment using Fisher's exact test or another statistic appropriate for
pairwise comparisons (Reference [15]). Results showing a significantly lower mean number of surviving
worms in the test soil, relative to those in the control soil, indicate an avoidance response (or preference for
the control soil) to the test soil. This result suggests that the habitat function of the test soil is limited.
For calculation of the percentage effect of a substance concentration, the mean number of worms in the test
soil is compared with the mean number of worms in the control soil [negative responses (= the worms prefer
the test soil) are considered as 0 % of avoidance]) in accordance with Equation (1).
nn−
⎛⎞
ct
x=×100 (1)
⎜⎟
N
⎝⎠
where
x is avoidance, expressed as a percentage;
n is the number of worms in the control soil (either per vessel or in the control soil of all replicates);
c
n is the number of worms in the test soil (either per vessel or in the test soil of all replicates);
t
N is the total number of worms (usually 10; either per vessel or in the control soil of all replicates).
6 © ISO 2008 – All rights reserved
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ISO 17512-1:2008(E)
Using these data, any median effective concentration, EC , for a specified percentage effect (EC or EC )
x 50 20
and its associated confidence limits can be calculated.
For statistical analysis of ecotoxicity data see Reference [15].
A comparison of results obtained in two and six chamber systems is given in Annex G.
If control soil and test soil differ in mor
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 17512-1
Première édition
2008-12-15
Qualité du sol — Essai d'évitement pour
contrôler la qualité des sols et les effets
des produits chimiques sur le
comportement —
Partie 1:
Essai avec des vers de terre (Eisenia
fetida et Eisenia andrei)
Soil quality — Avoidance test for determining the quality of soils and
effects of chemicals on behaviour —
Part 1: Test with earthworms (Eisenia fetida and Eisenia andrei)
Numéro de référence
ISO 17512-1:2008(F)
©
ISO 2008
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ISO 17512-1:2008(F)
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ISO 17512-1:2008(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction.v
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives.1
3 Termes et définitions .2
4 Principe .2
5 Réactifs et matériaux .3
6 Appareillage .4
7 Mode opératoire.5
7.1 Gamme de concentrations adaptée.5
7.2 Essai sur sols .5
7.3 Essai de produit chimique.6
7.4 Substance de référence.6
7.5 Critères de validité .6
8 Calcul et expression des résultats .6
9 Rapport d'essai.7
Annexe A (informative) Récipients d'essai.9
Annexe B (informative) Exemple de technique d'élevage des espèces Eisenia fetida et Eisenia
andrei.12
Annexe C (informative) Autres organismes d'essai .13
Annexe D (informative) Contaminants pouvant être détectés et évités par les vers de terre lors de
l'essai d'évitement.14
Annexe E (normative) Application des essais d'évitement aux produits chimiques .15
Annexe F (normative) Détermination de la capacité de rétention d'eau.17
Annexe G (informative) Comparaison des résultats obtenus avec les récipients à deux et à six
compartiments.18
Annexe H (informative) Influence des propriétés du sol sur le comportement d'évitement — Base
pour la valeur seuil de 20 % .21
Annexe I (informative) Données obtenues lors d'essais «en double» avec le même sol témoin
(non traité) dans les deux compartiments des récipients d'essai .23
Bibliographie.25
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ISO 17512-1:2008(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 17512-1 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Méthodes biologiques.
L'ISO 17512 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité du sol — Essai
d'évitement pour contrôler la qualité des sols et les effets des produits chimiques sur le comportement:
⎯ Partie 1: Essai avec des vers de terre (Eisenia fetida et Eisenia andrei)
La partie suivante est en cours de préparation:
⎯ Partie 2: Essai avec Collembolans (Follomia candida)
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ISO 17512-1:2008(F)
Introduction
Les méthodes d'essai d'écotoxicité servent à obtenir des informations sur les effets des contaminants dans le
sol et sont proposées en complément des analyses chimiques traditionnelles (voir l'ISO 15799). L'ISO 15799
présente une liste et une brève caractérisation des systèmes d'essais recommandés et normalisés. Les
systèmes d'essais aquatiques mis en œuvre sur éluat de sol servent à recueillir des informations sur la
fraction de contaminants susceptible d'atteindre les eaux souterraines du fait de la circulation de l'eau
(fonction de rétention des sols) tandis que les systèmes d'essais terrestres servent à évaluer la fonction
d'habitat des sols. En tant que systèmes d'essais normalisés, un essai de mortalité (ISO 11268-1) et un essai
de reproduction (ISO 11268-2) sont disponibles pour évaluer la fonction d'habitat d'un sol en ce qui concerne
les vers de terre considérés comme représentant de la biocénose du sol.
L'essai de reproduction des vers de terre (ISO 11268-2) sert à déterminer les effets de concentrations
sublétales. De tels critères d'effet sont utilisés de préférence pour obtenir des informations sur les effets
environnementaux. Cependant, l'essai de reproduction implique un travail important et un temps considérable,
nécessitant de longues périodes d'exposition qui ne permettent d'obtenir les résultats qu'au bout de 56 jours.
La durée d'un essai et la charge de travail déterminant le coût d'un essai donné, il est préférable d'obtenir des
résultats rapidement et avec une sensibilité élevée. Ceci est particulièrement le cas pour l'évaluation des sols
décontaminés. L'essai d'évitement avec les espèces Eisenia fetida et Eisenia andrei répond à ce critère.
L'expérience acquise lors d'un essai interlaboratoires réalisé sur huit sols contaminés dans trois laboratoires
montre que la sensibilité de l'essai d'évitement est quasi identique à celle de l'essai de reproduction
(Référence [5]). Toutefois, cet essai n'est pas destiné à remplacer l'essai de reproduction des vers de terre.
NOTE Les résultats ont été comparés à ceux des essais aigus et de reproduction des vers de terre réalisés avec les
mêmes sols. Les résultats ont montré qu'avec un critère correspondant à une réaction d'évitement > 80 %, une
concordance des résultats de 72 % a été obtenue.
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NORME INTERNATIONALE ISO 17512-1:2008(F)
Qualité du sol — Essai d'évitement pour contrôler la qualité des
sols et les effets des produits chimiques sur le
comportement —
Partie 1:
Essai avec des vers de terre (Eisenia fetida et Eisenia andrei)
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO 17512 spécifie une méthode d'essai biologique de dépistage rapide permettant
d'évaluer la fonction d'habitat des sols ainsi que l'influence des contaminants et des produits chimiques sur le
comportement des vers de terre.
Cet essai sublétal constitue une méthode rapide qui reflète la biodisponibilité pour les espèces Eisenia fetida
et Eisenia andrei des mélanges de contaminants dans les sols naturels et des sols dopés en substances. Le
comportement d'évitement des vers constitue le critère d'effet de cet essai. Ce dernier n'est pas destiné à
remplacer l'essai de reproduction des vers de terre.
Deux modèles de conception différente (récipient d'essai à deux compartiments et récipient d'essai à six
compartiments) ont été mis au point et mis en œuvre avec succès. Les deux modèles conviennent soit aux
essais à une seule concentration (par exemple pour évaluer la qualité d'un sol naturel), soit aux essais à
plusieurs concentrations (par exemple pour évaluer la toxicité d'un sol dopé par un produit chimique). Dans
les deux cas, le choix initial du compartiment où pénétrer est laissé aux vers de terre: sol témoin et un
traitement [dans le récipient d'essai à deux compartiments, choix entre le côté droit ou gauche; dans le
récipient d'essai à six compartiments, choix entre les compartiments disposés de façon alternée (3 + 3)].
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 11268-2:1998, Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre (Eisenia fetida) —
Partie 2: Détermination des effets sur la reproduction
ISO 11269-2, Qualité du sol — Détermination des effets des polluants sur la flore du sol — Partie 2: Effets
des substances chimiques sur l'émergence et la croissance des végétaux supérieurs
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
ISO 15799, Qualité du sol — Lignes directrices relatives à la caractérisation écotoxicologique des sols et des
matériaux du sol
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ISO 17512-1:2008(F)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
comportement d'évitement
tendance (d'un organisme) à éviter le sol soumis à essai en faveur du sol témoin
3.2
fonction d'habitat
aptitude des sols/matériaux du sol à assurer l’habitat des micro-organismes, des plantes, des animaux vivant
dans le sol, et leurs interactions
[ISO 15799:2003]
NOTE En tant qu'indicateurs de la fonction d'habitat, les essais d'écotoxicité fournissent des informations relatives
aux paramètres respectifs mesurés, par exemple l'essai de toxicité aiguë pour la survie ou les essais de toxicité chronique
pour la reproduction.
3.3
fonction d'habitat limitée
fonction d'habitat (3.2) considérée comme limitée si, en moyenne, plus de 80 % des vers sont trouvés dans
le sol témoin (indication d'un effet sur le comportement)
3.4
concentration efficace
CE
x
concentration à laquelle est décelé un effet spécifique [où x est un pourcentage (10, 25, 50) de cet effet; par
exemple, évitement]
EXEMPLE Dans la présente partie de l'ISO 17512, CE désigne la concentration d'une substance ou d'un mélange
50
de substances dans un sol qui est considérée comme étant à l'origine d'une réponse comportementale chez 50 % des
vers de terre soumis à essai.
4 Principe
Dix vers de terre adultes (de l'espèce Eisenia fetida ou Eisenia andrei) sont exposés simultanément au sol
témoin et à un sol contaminé ou à un sol contenant des substances pour essai. Le sol soumis à essai et le sol
témoin sont placés dans chaque récipient d'essai et les vers de terre ont ainsi le choix entre ces deux sols.
Deux types de récipients sont disponibles:
a) un récipient d'essai à deux compartiments; et
b) un récipient d'essai à six compartiments.
Après une période d'exposition de deux jours, le nombre de vers présents dans chacun des compartiments
des récipients est déterminé.
Des études individuelles (par exemple, l'essai avec l'acide borique dans l'un des deux modèles dans
différents laboratoires) ou des examens comparatifs (essai du même produit chimique ou sol dans le même
laboratoire, par exemple Référence [8]) ont dans certains cas montré des résultats différents. Récemment, les
deux modèles ont été validés dans des essais interlaboratoires conduits au Canada (Référence [2]) et en
France; toutefois, jusqu'à présent aucun essai interlaboratoires international utilisant simultanément les deux
modèles n'a été réalisé. Par conséquent, pour le moment, le choix du modèle est laissé à la discrétion de
l'opérateur. Lors du choix, il convient de prendre en compte des considérations pratiques telles que le coût
des récipients d'essai ainsi que la quantité de déchets produite.
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ISO 17512-1:2008(F)
5 Réactifs et matériaux
5.1 Substance de référence acide borique, recommandé. H BO est utilisé depuis longtemps comme
3 3
chimio-stérilisant des sols et constitue un biocide efficace, non sélectif (masse molaire: 61,81 g). Les vers de
terre sont capables de détecter et d'éviter des concentrations sublétales nocives pour la reproduction. L'acide
borique répond aux critères suivants, attestant de son aptitude en tant que substance de référence:
a) il est efficace à des concentrations relativement faibles, peu dépendantes de la nature du substrat;
b) il est relativement stable et persistant, de sorte que les concentrations ne varient pas rapidement au
cours de l'essai;
c) il est relativement hydrosoluble ou miscible dans l'eau, n'est pas facilement volatil et se mélange bien
avec les sols;
d) il existe une méthode normalisée de mesurage des concentrations d'acide borique dans le sol;
e) il représente un risque mineur pour les techniciens et ne présente aucun problème en terme
d'élimination.
5.2 Matériel biologique, constitué de vers de terre adultes de l'espèce Eisenia fetida ou Eisenia andrei
(masse individuelle comprise entre 300 mg et 600 mg). La synchronisation de l'élevage des organismes est
inutile dans le cadre de cet essai. L'Annexe B donne un exemple de technique d'élevage des vers de
compost.
Conditionner les vers sélectionnés pendant au moins une journée dans le sol témoin choisi (5.4).
NOTE Les espèces Eisenia fetida et Eisenia andrei sont des vers de compost. D'un point de vue écologique, ces
espèces ne sont pas les plus importantes présentes dans les sols (Référence [7]). D'un point de vue pratique en
revanche, les vers de compost sont bien plus adaptés que toutes les autres espèces de lombricidés en raison de leur
rapidité et de leur facilité de reproduction en laboratoire (possibilité d'élevage de masse). De plus, la sensibilité de ces
espèces est plus ou moins du même ordre de grandeur que celle des autres espèces de vers de terre. Dans la plupart
des cas, les différences entre les espèces – selon le produit chimique ou le mélange de contaminant soumis à essai –
sont inférieures ou égales à un facteur 10 lors des essais de toxicité aiguë et chronique (Références [6], [7]). Malgré le fait
que d'autres espèces de vers de terre ont déjà été utilisées avec succès dans des essais d'évitement (voir l'Annexe C), un
facteur décrivant l'étendue de leur réaction d'évitement n'est pas encore connu.
5.3 Substrat d'essai. Il convient de tamiser (dimension nominale d'ouvertures, 2 mm) le sol soumis à
essai, puis d'ajuster sa teneur en eau pour atteindre environ 60 % de la capacité maximale de rétention d'eau.
La teneur en eau optimale est obtenue lorsqu'il n'y a plus d'eau visible ou d'eau qui apparaît quand le sol est
comprimé.
NOTE Dans le cas de sols très limoneux ou argileux, il est parfois difficile d'obtenir une quantité suffisante de sol
tamisé à une valeur u 2 mm pour un temps de travail acceptable. Les mailles du tamis peuvent se boucher en quelques
minutes. Un nettoyage fréquent est nécessaire. Dans ce cas, il est acceptable de tamiser la quantité de sol requise pour
l'essai à une valeur u 4 mm.
Immédiatement avant le début de l'essai, déterminer la teneur en eau et le pH en présence de KCl à 1 mol/l,
conformément respectivement à l'ISO 11465 et à l'ISO 10390. De plus, la capacité maximale de rétention
d'eau doit être déterminée conformément à l'Annexe F.
5.4 Sol témoin: il existe trois possibilités de choix (voir également l'ISO 15799). L'option a), est
recommandée mais, dans la mesure où un tel sol n'est que rarement disponible, soit un sol standard, b), soit
un sol artificiel, c), est acceptable (les influences possibles de ces sols sont couvertes par le critère
d'évaluation de 80 % (voir l'Article 8).
a) Sol témoin dont les caractéristiques sont identiques au sol soumis à essai, si ce n'est la présence de
contaminants;
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ISO 17512-1:2008(F)
b) Sol dont les caractéristiques sont conformes à l'ISO 11269-2 [C u 1,5 %, teneur en sable (0,063 mm à
org
2 mm) de 50 % à 75 %, teneur en particules inférieures à 0,02 mm < 20 %, pH de 5 à 7,5];
c) Sol artificiel conforme à l'ISO 11268-2.
Il convient de tamiser les sols naturels et d'ajuster la teneur en eau conformément à 5.3.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire, et en particulier ce qui suit.
6.1 Récipients (voir l'Annexe A).
6.1.1 Récipient à deux compartiments: récipients de 1 l à 2 l de contenance, dont la section représente
2
une surface d'environ 0,02 m , permettant ainsi d’atteindre une profondeur de sol de 50 mm à 60 mm.
Les récipients d'essai doivent permettre l'échange gazeux entre le milieu et l'atmosphère ainsi que le passage
de la lumière (par exemple, au moyen d'un couvercle transparent perforé) et doivent être munis de dispositifs
empêchant les vers de s'échapper (par exemple, en fixant le couvercle à l'aide de ruban adhésif). Afin d'éviter
les effets latéraux de la lumière, les récipients en verre doivent être recouverts.
1)
Des récipients à deux compartiments sont disponibles dans le commerce .
NOTE En raison de la courte durée de l'essai et, proportionnellement, du volume important de sol dans les
récipients, la diminution de la concentration en produit chimique dans le sol due à la sorption par les parois du récipient
est négligeable. Néanmoins, l'utilisation de matériaux inertes (comme le verre ou l'acier inoxydable) est préférable.
6.1.2 Récipient à six compartiments (récipients d'essai circulaires ou autres récipients):
a) acier inoxydable pour l'essai du sol contaminé par des composés organiques;
b) plastique (matériau inerte haute densité) pour l'essai du sol contaminé par des métaux ou des composés
métalliques.
Le récipient d'essai circulaire comporte une cavité centrale divisée en six compartiments disposés en
«camembert», dans lesquels le sol est placé. Des trous à la base des parois des compartiments (trois sur
chaque côté) et de la cavité centrale (deux sur chaque côté) permettent aux vers de se déplacer librement
d'un compartiment à l'autre. Il convient d'envelopper le récipient d'essai en plastique d'un matériau opaque
(papier d'aluminium) afin d'empêcher le passage de la lumière. Des dispositifs empêchant les vers de
s'échapper sont nécessaires.
Le récipient à six compartiments n'est pas disponible dans le commerce. De ce fait, tous les détails
nécessaires pour fabriquer de tels récipients sont présentés dans les figures et dans le corps du texte.
6.2 Cloison (par exemple, plastique ou fine tôle métallique):
a) pour le récipient à deux compartiments, afin de diviser le récipient verticalement en deux parties égales;
b) pour le récipient à six compartiments, à placer le long des parois des compartiments à la fin de l'essai,
afin d'isoler chaque section.
6.3 Appareil de mesure de la teneur en eau d'un substrat (conformément à l'ISO 11465).
1) Bellaplast N°507 est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à
l’intention des utilisateurs de la présente partie de l'ISO 17512 et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou
recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
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ISO 17512-1:2008(F)
6.4 Environnement de l'essai.
6.4.1 Enceinte ou chambre climatique, dont la température peut être maintenue à (20 ± 2) °C.
6.4.2 Source lumineuse, pouvant fournir une intensité lumineuse constante de 400 lx à 800 lx au niveau
des récipients avec un cycle de lumière/obscurité contrôlé compris entre 12 h/12 h et 16 h/8 h.
NOTE Un cycle jour/nuit a été choisi pour que les conditions soient comparables à l'essai aigu et à l'essai de
reproduction.
7 Mode opératoire
7.1 Gamme de concentrations adaptée
L'essai d'évitement est destiné à déterminer les effets sublétaux. C'est pourquoi, l'essai est invalide si un ou
plusieurs vers par récipient (c'est-à-dire 1 sur 10) sont morts ou manquants à la fin de l'essai (voir 7.5). Il est
recommandé de réaliser un essai préliminaire afin d'éviter la mortalité.
7.2 Essai sur sols
7.2.1 Récipient à deux compartiments
Au début de l'essai, les récipients (6.1.1) sont divisés en deux compartiments égaux au moyen d'une cloison
introduite verticalement. Les récipients sont remplis de sol tamisé sur une hauteur d'environ 50 mm à 60 mm.
Une moitié du récipient est remplie avec le sol pour essai (compartiment A) et l'autre moitié est remplie avec
le sol témoin (compartiment B). La cloison est ensuite retirée et 10 vers sont placés sur la ligne de séparation
de chaque récipient d'essai (à partir de là, ils ont la possibilité de s'enterrer rapidement dans le sol en passant
par la fente laissée par la cloison). Les récipients sont couverts conformément à 6.1.1 et placés dans
l'enceinte climatique ou dans l'enceinte d'essai (6.4.1).
Il est inutile de nourrir les animaux au cours de l'essai.
L'essai est réalisé avec cinq réplicats par traitement (sols soumis à essai, sols témoins ou substance de
référence). Pour obtenir une quantification plus précise de l'effet comportemental, il est possible de préparer
une gamme de dilutions. Il convient d'utiliser le sol témoin pour diluer le sol contaminé.
À la fin de la période d'essai (48 h), le sol témoin est séparé du sol soumis à essai dans chaque récipient à
l'aide de cloisons. Les cloisons doivent être introduites avant de retirer les récipients d’essai de l'enceinte
climatique. Le nombre de vers est déterminé dans chacun des deux compartiments des récipients. Les vers
coupés en deux lors de l'introduction de la cloison comptent pour 0,5, indépendamment de la longueur de la
section restante du corps. Les vers manquants sont considérés soit comme s'étant échappés du récipient
d'essai, soit comme étant morts ou s'étant désintégrés au cours de l'essai (voir 7.1).
7.2.2 Récipient à six compartiments
Le sol soumis à essai et le sol témoin sont préparés (tamisés, hydratés et mélangés) et placés sur une
hauteur de 50 mm à 60 mm (350 ml de sol), alternativement, dans trois compartiments chacun (par exemple,
les compartiments 1, 3 et 5 contiennent le sol soumis à essai et les compartiments 2, 4 et 6 contiennent le sol
témoin) (voir également l'Annexe E). La cavité centrale reste vide. Placer 10 vers, un par un, dans la cavité
centrale et noter le compartiment dans lequel chacun d'entre eux pénètre. Les récipients sont couverts (6.1.2)
et placés dans une enceinte climatique (6.4.1).
Il est inutile de nourrir les animaux au cours de l'essai.
L'essai est réalisé avec cinq réplicats dans le cas d'un essai à une seule concentration et au moins avec des
duplicats dans le cas d'un essai à plusieurs concentrations. Pour les essais à plusieurs concentrations, le sol
soumis à essai est constitué du sol du site dilué avec le sol témoin approprié.
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ISO 17512-1:2008(F)
À la fin de la période d'essai (48 h), les cloisons sont positionnées afin d'empêcher tout déplacement des vers
de terre d'un compartiment à l'autre. Les cloisons doivent être introduites avant de retirer les récipients de
l'enceinte climatique. Le nombre de vers dans chaque compartiment est enregistré et le nombre total de vers
est déterminé pour chaque condition d’essai, dans chaque récipient d'essai. Les vers coupés en deux par
inadvertance lors de l'introduction des cloisons comptent pour 0,5, indépendamment de la longueur de la
section restante du corps. Les vers manquants sont considérés soit comme s'étant échappés du récipient
d'essai, soit comme étant morts ou s'étant désintégrés au cours de l'essai (voir 7.1).
NOTE L'essai est fondé sur l'hypothèse qu'au début de l'essai, la répartition des vers dans les différents
compartiments est aléatoire et qu'à la fin de l'essai, pour une réelle réaction d'évitement, la répartition des vers dans les
compartiments du récipient n'est plus aléatoire. Si, au début de l'essai, la répartition des vers n'est pas aléatoire, il est
possible de n'obtenir aucune réaction d'évitement. En revanche, il est également possible d'obtenir une réaction
d'évitement dès le début de l'essai si les vers refusent immédiatement de pénétrer dans les compartiments contenant du
sol contaminé. Cela se produit rarement dans le cas de concentrations sublétales.
7.3 Essai de produit chimique
Même si les essais d'évitement servent principalement à tester les sols potentiellement contaminés, le
présent essai peut être utilisé également pour évaluer les effets de produits chimiques seuls après ajout dans
le sol. (l'Annexe D donne des exemples de produits chimiques détectés par les vers de terre). L'Annexe E
spécifie les modifications requises pour tester des produits chimiques seuls (y
...
Questions, Comments and Discussion
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