ISO 21871:2006
(Main)Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the determination of low numbers of presumptive Bacillus cereus — Most probable number technique and detection method
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the determination of low numbers of presumptive Bacillus cereus — Most probable number technique and detection method
ISO 21871:2006 specifies a horizontal method for the detection or the enumeration of low numbers of viable presumptive Bacillus cereus by means of the most probable number technique. ISO 21871:2006 is applicable to products intended for human consumption and the feeding of animals, and environmental samples in the area of food production and food handling.
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement de Bacillus cereus présumés en petit nombre — Technique du nombre le plus probable et méthode de recherche
L'ISO 21871:2006 spécifie une méthode horizontale pour la recherche ou le dénombrement de Bacillus cereus présumés viables en petit nombre par la technique du nombre le plus probable. L'ISO 21871:2006 s'applique aux produits destinés à la consommation humaine ou animale et aux échantillons environnementaux du secteur agroalimentaire.
General Information
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21871
First edition
2006-01-15
Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Horizontal method for the
determination of low numbers of
presumptive Bacillus cereus —
Most probable number technique and
detection method
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le
dénombrement de Bacillus cereus présumés en petit nombre —
Technique du nombre le plus probable et méthode de recherche
Reference number
ISO 21871:2006(E)
©
ISO 2006
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ISO 21871:2006(E)
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Published in Switzerland
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ISO 21871:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle. 2
4.1 Enumeration method. 2
4.2 Detection method. 2
5 Diluent, culture media and reagents. 2
5.1 General. 2
5.2 Diluent. 2
5.3 Liquid selective enrichment medium: Tryptone soya polymyxin broth (TSPB) . 3
5.4 Solid selective medium: Polymyxin pyruvate egg yolk mannitol bromothymol blue agar
(PEMBA). 4
5.5 Solid selective medium: Mannitol egg yolk polymyxin agar (MYP) . 6
5.6 Staining solutions for microscopic identification . 7
5.7 Sheep blood agar. 8
6 Apparatus and glassware . 8
7 Sampling. 9
8 Preparation of test sample. 9
9 Procedure . 9
9.1 Enumeration method. 9
9.2 Detection method. 11
10 Calculation and expression of results. 12
10.1 Enumeration method for the determination of the most probable number (MPN) . 12
10.2 Detection method. 12
11 Test report . 12
Annex A (normative) Diagram of enumeration procedure. 13
Bibliography . 14
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ISO 21871:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 21871 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology.
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ISO 21871:2006(E)
Introduction
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not be appropriate in every
detail for certain products. In this case, different methods, which are specific to these products, may be used if
absolutely necessary for justified technical reasons. Nevertheless, every attempt should be made to apply this
horizontal method as far as possible.
When this International Standard is next reviewed, account will be taken of all information then available
regarding the extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from
this method in the case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate, and for certain groups of products International
Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this horizontal method. It is
hoped that when such standards are reviewed they will be changed to comply with this International Standard
so that eventually the only remaining departures from this horizontal method will be those necessary for
well-established technical reasons.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21871:2006(E)
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal
method for the determination of low numbers of presumptive
Bacillus cereus — Most probable number technique and
detection method
1 Scope
This International Standard specifies a horizontal method for the detection or the enumeration of low numbers
of viable presumptive Bacillus cereus by means of the most probable number technique. This International
Standard is applicable to
⎯ products intended for human consumption and the feeding of animals, and
⎯ environmental samples in the area of food production and food handling.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial
suspension and decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General rules for microbiological examinations
ISO 8261, Milk and milk products — General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions
and decimal dilutions for microbiological examination
ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production
of culture media — Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the
laboratory
ISO/TS 11133-2, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production
of culture media — Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
presumptive Bacillus cereus
microorganism that forms typical or atypical colonies on the surface of selective culture media and which gives
positive confirmation reactions under the conditions specified in this International Standard
NOTE For the purpose of a practical test method, this definition of presumptive Bacillus cereus, used as a basis for
the procedure, does not exclusively describe strains of Bacillus cereus. In particular, the confirmatory test is inadequate to
distinguish between Bacillus cereus and other closely related but less commonly encountered Bacillus species such as
Bacillus weihenstephanensis, Bacillus anthracis, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides and Bacillus pseudomycoides.
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ISO 21871:2006(E)
4 Principle
4.1 Enumeration method
4.1.1 Inoculation of three tubes of double-strength liquid selective enrichment medium [5.3.1.1 a)] with a
specified quantity of the primary dilution (initial suspension).
4.1.2 Inoculation of three tubes of single-strength liquid selective enrichment medium [5.3.1.1 b)] with a
specified quantity of the primary dilution (initial suspension). Then, under the same conditions, inoculation of
single-strength liquid selective enrichment medium [5.3.1.1 b)] with specified quantities of decimal dilutions of
the primary dilution (initial suspension).
4.1.3 Incubation of the tubes of double and single-strength liquid selective enrichment medium (5.3) for 48 h
at 30 °C.
4.1.4 Inoculation of the solid selective medium (5.4 or 5.5) from the liquid selective enrichment medium
(5.3).
4.1.5 Incubation of the solid selective medium (5.4 or 5.5) for 18 h to 48 h at 37 °C (5.4) or 30 °C (5.5) and
examination of the plates to check for the presence of colonies which, from their characteristics, are
considered to be presumptive Bacillus cereus.
4.1.6 Confirmation of suspected colonies by means of haemolysis (9.1.5.3) or by microscopic examination
(9.1.5.4).
4.1.7 Calculation of the most probable number of presumptive Bacillus cereus per gram or per millilitre of
sample from selected dilutions by reference to most probable number tables.
4.2 Detection method
4.2.1 Inoculation of a liquid selective enrichment medium (5.3) with a specified quantity of the initial
suspension of the test sample.
4.2.2 Incubation of the tube for 48 h at 30 °C.
4.2.3 Inoculation of a solid selective medium (5.4 or 5.5) from the liquid selective enrichment medium (5.3).
4.2.4 Incubation of the solid selective medium (5.4 or 5.5) for 18 h to 48 h at 37 °C (5.4) or 30 °C (5.5) and
examination of the plates to check for the presence of colonies which, from their characteristics, are
considered to be presumptive Bacillus cereus.
4.2.5 Confirmation of suspected colonies by means of haemolysis (9.1.5.3) or by microscopic examination
(9.1.5.4).
4.2.6 The results are given as the “presence” or “absence” of presumptive Bacillus cereus in grams or
millilitres of product.
5 Diluent, culture media and reagents
5.1 General
For current laboratory practice, see ISO 7218, ISO/TS 11133-1 and ISO/TS 11133-2.
5.2 Diluent
See ISO 6887 (all parts), ISO 8261 and any specific standard dealing with the product to be examined.
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ISO 21871:2006(E)
5.3 Liquid selective enrichment medium: Tryptone soya polymyxin broth (TSPB)
(see Reference [1])
5.3.1 Base medium
5.3.1.1 Composition
a) b)
Double-strength Single-strength
medium medium
Enzymatic digest of casein 34,0 g 17,0 g
Enzymatic digest of soya 6,0 g 3,0 g
Sodium chloride (NaCl) 10,0 g 5,0 g
Glucose 5,0 g 2,5 g
Dipotassium hydrogen phosphate (K HPO ) 5,0 g 2,5 g
2 4
Water 1 000 ml 1 000 ml
5.3.1.2 Preparation
Dissolve the ingredients or the complete base medium in the water by heating and shaking. Adjust the pH, if
necessary, so that after sterilization it is 7,3 ± 0,2 at 25 °C.
Dispense the media in quantities of 10 ml [double-strength medium (5.3.1.1 a)] and 9 ml [single-strength
medium (5.3.1.1 b)] into tubes of appropriate capacity [e.g. 16 mm × 160 mm (6.7)].
Sterilize in an autoclave (6.1) at 121 °C for 15 min.
5.3.2 Polymyxin B sulfate solution
5.3.2.1 Composition
Polymyxin B sulfate 500 000 units (equivalent to about 0,05 g)
Water 50 ml
5.3.2.2 Preparation
Dissolve the polymyxin B sulfate in the water. Sterilize by filtration.
5.3.3 Complete medium
Immediately before use, add 200 µl (double-strength medium) or 100 µl (single-strength medium) of the
polymyxin B sulfate solution (5.3.2) to each of the tubes containing base medium (5.3.1).
5.3.4 Performance testing for the quality assurance of the culture medium
For the definition of selectivity and productivity refer to ISO/TS 11133-2. Table 1 introduces the performance
testing relating to tryptone soya polymyxin broth (TSPB):
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ISO 21871:2006(E)
Table 1 — Performance testing of Tryptone soya polymyxin broth (TSPB)
Function Incubation Strains of control Method of Criteria Characteristic
control reactions
Productivity 48 h at B. cereus ATCC 11778 Semi- W 10 cfu Characteristic colonies
30 °C or same strain registered quantitative on PEMBA on PEMBA or MYP
in other collections or MYP (see 5.4.5 or 5.5.6)
Selectivity 48 h at E. coli ATCC 25922 or 8739 Semi- Total —
30 °C or same strain registered in quantitative inhibition
other collections
5.4 Solid selective medium: Polymyxin pyruvate egg yolk mannitol bromothymol blue agar
(PEMBA) (see Reference [2])
5.4.1 Base medium
5.4.1.1 Composition
Enzymatic digest of casein 1,0 g
D-Mannitol 10,0 g
Sodium pyruvate 10,0 g
Magnesium sulfate, MgSO⋅7 H O 0,1 g
4 2
Sodium chloride 2,0 g
Disodium hydrogen phosphate (Na HPO ) 2,5 g
2 4
Potassium dihydrogen phosphate (KH PO ) 0,25 g
2 4
Bromothymol blue 0,12 g
a
Agar
9 g to 18 g
Water 940 ml
a
Depending on the gel strength of the agar.
5.4.1.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete base medium in the water by heating and shaking.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization it is 7,2 ± 0,2 at 25 °C.
Sterilize in an autoclave (6.1) at 121 °C for 15 min.
5.4.2 Polymyxin B sulfate solution
Prepare as described in 5.3.2.
5.4.3 Egg yolk emulsion
Use fresh clean hen's eggs with their shells intact. Wash the eggs, using a brush, in liquid detergent. Rinse
under running water, dip in 70 % volume fraction of ethanol for 30 s and dry. Using aseptic procedures, break
each egg and separate the yolk from the white by repeatedly transferring the yolk from one half of the egg
shell to the other. Put the yolks into a sterile measuring cylinder and add four parts by volume of sterile water.
Transfer aseptically into a sterile flask (6.7) and mix vigorously.
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Heat the mixture for 2 h in a water bath (6.4) set at 47 °C. Then leave for 18 h to 24 h at 3 °C ± 2 °C to allow a
precipitate to form.
Collect the supernatant emulsion aseptically.
The emulsion may be stored
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21871
Première édition
2006-01-15
Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour le dénombrement de
Bacillus cereus présumés en petit
nombre — Technique du nombre le plus
probable et méthode de recherche
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for
the determination of low numbers of presumptive Bacillus cereus —
Most probable number technique and detection method
Numéro de référence
ISO 21871:2006(F)
©
ISO 2006
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ISO 21871:2006(F)
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Publié en Suisse
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ISO 21871:2006(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principe. 2
4.1 Méthode de dénombrement. 2
4.2 Méthode de recherche. 2
5 Diluant, milieu de culture et réactifs. 2
5.1 Généralités . 2
5.2 Diluant. 2
5.3 Milieu d'enrichissement sélectif liquide: bouillon de tryptone, soja et polymyxine (TSPB) . 3
5.4 Milieu sélectif solide: gélose à la polymyxine, au pyruvate, au jaune d'œuf et au bleu de
bromothymol (PEMBA). 4
5.5 Milieu sélectif solide: gélose au mannitol, au jaune d'œuf et à la polymyxine (MYP). 6
5.6 Solutions de coloration pour l'identification au microscope. 7
5.7 Gélose au sang de mouton. 8
6 Appareillage et verrerie. 9
7 Échantillonnage . 9
8 Préparation de l'échantillon pour essai. 10
9 Mode opératoire . 10
9.1 Méthode de dénombrement. 10
9.2 Méthode de recherche. 12
10 Calcul et expression des résultats. 12
10.1 Méthode de dénombrement pour la détermination du nombre le plus probable (MPN). 12
10.2 Méthode de recherche. 13
11 Rapport d'essai . 13
Annexe A (normative) Représentation schématique du mode opératoire de dénombrement . 14
Bibliographie . 15
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ISO 21871:2006(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 21871 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie.
iv © ISO 2006 – Tous droits réservés
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ISO 21871:2006(F)
Introduction
En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il est possible que la présente méthode horizontale
ne convienne pas exactement, dans tous ses détails, à certains produits. Dans ce cas, d'autres méthodes
spécifiques des produits concernés peuvent être employées, si cela est absolument nécessaire pour des
raisons techniques. Dans la mesure du possible, il convient néanmoins de s'efforcer d'appliquer la méthode
horizontale.
À la prochaine révision de la présente Norme internationale, il sera tenu compte de tous les renseignements
disponibles à ce moment-là sur l'ampleur avec laquelle la présente méthode horizontale aura été suivie et sur
les raisons pour lesquelles il aura été nécessaire d'y déroger dans le cas de produits particuliers.
L'harmonisation des méthodes d'essai ne peut pas être instantanée et, pour certains groupes de produits, des
Normes internationales et/ou nationales ne concordant pas avec la présente méthode horizontale existent
peut-être déjà. Lors de la révision de telles normes, il serait souhaitable de les aligner sur la présente Norme
internationale de sorte qu'à terme, les seules divergences restantes se limitent à celles qui sont nécessaires
pour des raisons techniques bien établies.
© ISO 2006 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 21871:2006(F)
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le
dénombrement de Bacillus cereus présumés en petit nombre —
Technique du nombre le plus probable et méthode de
recherche
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode horizontale pour la recherche ou le dénombrement de
Bacillus cereus présumés viables en petit nombre par la technique du nombre le plus probable. La présente
Norme internationale s'applique
⎯ aux produits destinés à la consommation humaine ou animale, et
⎯ aux échantillons d'environnement du secteur agroalimentaire.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension
mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Règles générales pour les examens microbiologiques
ISO 8261, Lait et produits laitiers — Lignes directrices générales pour la préparation des échantillons pour
essai, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique
ISO/TS 11133-1, Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de
culture — Partie 1: Guide général pour l'assurance de la qualité pour la préparation des milieux de culture en
laboratoire
ISO/TS 11133-2, Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de
culture — Partie 2: Guide général pour les essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
Bacillus cereus présumé
microorganisme formant à la surface d'un milieu de culture sélectif des colonies, caractéristiques ou non, et
qui donne des réactions de confirmation positives quand les essais sont effectués selon la méthode spécifiée
dans la présente Norme internationale
NOTE Pour les besoins d'une méthode d'essai pratique, cette définition des Bacillus cereus présumés, sur laquelle
repose le mode opératoire, ne couvre pas uniquement les souches de Bacillus cereus. L'essai de confirmation ne permet
notamment pas de distinguer les Bacillus cereus des autres espèces de Bacillus étroitement apparentées mais moins
communément rencontrées comme les Bacillus weihenstephanensis, Bacillus anthracis, Bacillus thuringiensis, Bacillus
mycoides et Bacillus pseudomycoides.
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ISO 21871:2006(F)
4 Principe
4.1 Méthode de dénombrement
4.1.1 Ensemencement de trois tubes de milieu d'enrichissement sélectif liquide double concentration
[5.3.1.1 a)] avec une quantité déterminée de la dilution primaire (suspension mère).
4.1.2 Ensemencement de trois tubes de milieu d'enrichissement sélectif liquide simple concentration
[5.3.1.1 b)] avec une quantité déterminée de la dilution primaire (suspension mère). Puis, dans les même
conditions, ensemencement du milieu d'enrichissement sélectif liquide simple concentration [5.3.1.1 b)] avec
des quantités déterminées des différentes dilutions décimales de la dilution primaire (suspension mère).
4.1.3 Incubation des tubes de milieu d'enrichissement sélectif liquide double et simple concentration (5.3)
pendant 48 h à 30 °C.
4.1.4 Ensemencement du milieu sélectif solide (5.4 ou 5.5) à partir de milieu d'enrichissement sélectif
liquide (5.3).
4.1.5 Incubation du milieu sélectif solide (5.4 ou 5.5) pendant 18 h à 48 h à 37 °C (5.4) ou à 30 °C (5.5) et
examen des boîtes pour s'assurer de la présence de colonies qui sont considérées, du point de vue de leurs
caractéristiques, comme devant être des Bacillus cereus présumés.
4.1.6 Confirmation des colonies suspectes au moyen d'un test à l'hémolyse (9.1.5.3) ou par un examen
microscopique (9.1.5.4).
4.1.7 Calcul du nombre le plus probable de Bacillus cereus présumés par gramme ou par millilitre
d'échantillon en fonction des tables des nombres les plus probables (NPP).
4.2 Méthode de recherche
4.2.1 Ensemencement du milieu d'enrichissement sélectif (5.3) avec une quantité spécifiée de la
suspension initiale de l'échantillon à soumettre à l'essai.
4.2.2 Incubation du tube pendant 48 h à 30 °C.
4.2.3 Inoculation du milieu sélectif solide (5.4 ou 5.5) à partir du milieu liquide d'enrichissement sélectif (5.3).
4.2.4 Incubation du milieu sélectif solide (5.4 ou 5.5) pendant 18 h à 48 h à 37 °C (5.4) ou à 30 °C (5.5) et
examen des boîtes pour s'assurer de la présence de colonies qui sont considérées, du point de vue de leurs
caractéristiques, comme devant être des Bacillus cereus présumés.
4.2.5 Confirmation des colonies suspectes au moyen d'un test à l'hémolyse (9.1.5.3) ou par un examen
microscopique (9.1.5.4).
4.2.6 Les résultats sont donnés par «présence» ou «absence» de Bacillus cereus présumés dans des
grammes ou des millilitres de produit.
5 Diluant, milieu de culture et réactifs
5.1 Généralités
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir l'ISO 7218, l'ISO/TS 11133-1 et l'ISO/TS 11133-2.
5.2 Diluant
Voir l'ISO 6887 (toutes les parties), l'ISO 8261 et toute norme spécifique du produit à examiner.
2 © ISO 2006 – Tous droits réservés
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ISO 21871:2006(F)
5.3 Milieu d'enrichissement sélectif liquide: bouillon de tryptone, soja et polymyxine
(TSPB) (voir Référence [1])
5.3.1 Milieu de base
5.3.1.1 Composition
a) b)
Milieu double Milieu simple
concentration concentration
Extrait enzymatique de caséine 34,0 g 17,0 g
Extrait enzymatique de soja 6,0 g 3,0 g
Chlorure de sodium (NaCl) 10,0 g 5,0 g
Glucose 5,0 g 2,5 g
Hydrogénophosphate dipotassique (K HPO ) 5,0 g 2,5 g
2 4
Eau 1 000 ml 1 000 ml
5.3.1.2 Préparation
Dissoudre les ingrédients ou le milieu de base complet dans de l'eau en chauffant et en agitant. Si nécessaire,
ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 7,3 ± 0,2 à 25 °C.
Répartir le milieu par quantités de 10 ml [milieu double concentration (5.3.1.1 a)] et 9 ml [milieu simple
concentration (5.3.1.1 b)] dans des tubes à essai d'approximativement [par exemple 16 mm × 160 mm (6.7)].
Stériliser à l'autoclave (6.1) à 121 °C pendant 15 min.
5.3.2 Solution de sulfate de polymyxine B
5.3.2.1 Composition
Sulfate de polymyxine B 500 000 unités (l'équivalent d'environ 0,05 g)
Eau 50 ml
5.3.2.2 Préparation
Dissoudre le sulfate de polymyxine B dans l'eau. Stériliser par filtration.
5.3.3 Milieu complet
Juste avant l'emploi, ajouter 200 µl (de milieu double concentration) ou 100 µl (de milieu simple concentration)
de la solution de sulfate de polymyxine B (5.3.2) dans chacun des tubes contenant le milieu de base (5.3.1).
5.3.4 Essais de performance pour l'assurance qualité du milieu de culture
Se reporter à l'ISO/TS 11133-2 pour les définitions de la sélectivité et de la productivité. Le Tableau 1
présente les essais de performance applicables au bouillon de tryptone, soja et polymyxine (TSPB).
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ISO 21871:2006(F)
Tableau 1 — Essais de performance sur le bouillon de tryptone, soja et polymyxine (TSPB)
Fonction Incubation Souches de contrôle Méthode de Critères Réactions
contrôle caractéristiques
Productivité 48 h à 30 °C B. cereus ATCC 11778 ou la Semi- W 10 ufc sur Colonies
même souche, enregistrée quantitative PEMBA ou caractéristiques
dans d'autres collections MYP sur PEMBA ou
MYP (voir en
5.4.5 ou 5.5.6)
Sélectivité 48 h à 30 °C E. coli ATCC 25922 ou 8739 Semi- Inhibition —
ou la même souche, quantitative totale
enregistrée dans d'autres
collections
5.4 Milieu sélectif solide: gélose à la polymyxine, au pyruvate, au jaune d'œuf et au bleu de
bromothymol (PEMBA) (voir Référence [2])
5.4.1 Milieu de base
5.4.1.1 Composition
Extrait enzymatique de caséine 1,0 g
D-Mannitol 10,0 g
Pyruvate de sodium 10,0 g
Sulfate de magnésium, MgSO , 7 HO 0,1 g
4 2
Chlorure de sodium 2,0 g
Hydrogénophosphate disodique (Na HPO) 2,5 g
2 4
Dihydrogénophosphate de potassium (KH PO) 0,25 g
2 4
Bleu de bromothymol 0,12 g
a
Agar-agar 9 g à 18 g
Eau 940 ml
a
En fonction du pouvoir gélifiant de l'agar-agar.
5.4.1.2 Préparation
Dissoudre les constituants ou le milieu de base complet déshydraté dans de l'eau en chauffant et en agitant.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 7,2 ± 0,2 à 25 °C.
Stériliser à l'autoclave (6.1) à 121 °C pendant 15 min.
5.4.2 Solution de sulfate de polymyxine B
Préparer comme décrit en 5.3.2.
5.4.3 Émulsion de jaune d'œuf
Utiliser des œufs de poule frais et propres, à la coquille intacte. Nettoyer les œufs dans du détergent liquide
au moyen d'une brosse. Les rincer à l'eau courante, les plonger dans de l'éthanol à 70 % (fraction volumique)
pendant 30 s et les sécher. En travaillant en asepsie, casser chaque œuf et séparer le jaune du blanc par
transferts répétés du jaune d'une demi-coquille à l'autre. Placer les jaunes dans une éprouvette graduée
stérile et ajouter quatre parties, en volume, d'eau stérile. Transférer de façon aseptique dans un flacon stérile
(6.7) et mélanger vigoureusement.
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Réchauffer le mélange à l'aide d'un bain d'eau (6.4) réglé à 47 °C pendant 2 h. Entreposer ensuite pendant
18 h à 24 h à 3 °C ± 2 °C pour permettre au précipité de se former.
Recueillir aseptiquement l'émulsion surnageante.
L'émulsion peut être conservée à 3 °C ± 2 °C au maximum pendant 72 h.
Les deux milieux sélectifs solides décrits dans la présente Norme internationale ont d'abord été préparés à
partir d'une émulsion de jaune d'œuf à 20 % préparée selon la Référence [3]. Des émulsions de jaune d'œuf
prêtes à l'emploi sont aujourd'hui disponibles dans le commerce, parfois à d'autres concentrations. Elles
peuvent être utilisées. Toutefois, les instructions du fabricant, en particulier celles concernant la durée de
conservation, doivent être suivies. De plus, des dispositions doivent être prises pour s'assurer que les
émulsions en
...
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