ISO 23265:2022
(Main)Soil quality — Test for estimating organic matter decomposition in contaminated soil
Soil quality — Test for estimating organic matter decomposition in contaminated soil
This document specifies a test procedure for the evaluation of the habitat function of soils by determining effects of soil contaminants and substances on organic matter decomposition. This test is applicable to natural soils and soil materials of unknown quality (e.g. contaminated sites, amended soils, soils after remediation, agricultural or other sites under concern). This document also specifies how to use this method for testing substances under temperate conditions. This document is not applicable to substances for which the air/soil partition coefficient is greater than 1. It is not applicable to substances with vapour pressure exceeding 300 Pa at 25 °C. NOTE The stability of the test substance cannot be ensured over the test period. No provision is made in the test method for monitoring the persistence of the substance under test.
Qualité du sol — Essai d'estimation de la décomposition de la matière organique dans un sol contaminé
Le présent document spécifie un mode opératoire d’essai pour l’évaluation de la fonction d’habitat des sols en déterminant les effets des contaminants et des substances du sol sur la décomposition de la matière organique. Cet essai est applicable aux sols naturels et aux matériaux du sol de qualité inconnue (par exemple, sites contaminés, sols amendés, sols après décontamination, sols agricoles ou autres sites préoccupants). Le présent document spécifie également la façon d’utiliser cette méthode pour analyser les substances d’essai dans des conditions tempérées. Le présent document n’est pas applicable aux substances pour lesquelles le coefficient de partage air/sol est supérieur à 1. Il ne s’applique pas non plus aux substances dont la pression de vapeur dépasse 300 Pa à 25 °C. NOTE La stabilité de la substance d’essai ne peut pas être garantie tout au long de la durée de l’essai. La méthode d’essai ne prévoit pas de contrôler la rémanence de la substance soumise à essai.
General Information
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 23265
First edition
2022-11
Soil quality — Test for estimating
organic matter decomposition in
contaminated soil
Qualité du sol — Essai d'estimation de la décomposition de la matière
organique dans un sol contaminé
Reference number
ISO 23265:2022(E)
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ISO 23265:2022(E)
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CH-1214 Vernier, Geneva
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Published in Switzerland
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Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
5 Reagents and material . 3
5.1 Reagents . 3
5.2 Materials . 3
6 Soil . 4
6.1 Field-collected soil. 4
6.2 Control soil . 4
7 Apparatus . 4
8 Procedure .5
8.1 Experimental design . 5
8.1.1 General . 5
8.1.2 Chemically-spiked soil test design . 5
8.1.3 Field-contaminated soil test design . 6
8.2 Preparation of filter paper disks . 6
8.3 Preparation of soil . 6
8.3.1 Contaminated and reference soil . 6
8.3.2 Chemical substances added to control soil . 6
8.4 Test set-up . 7
8.5 Test sampling . 8
9 Validity of the test .9
10 Calculation and expression of results . 9
10.1 Calculation . 9
10.2 Expression of results . . 9
11 Precision .10
12 Statistical analysis .10
13 Test report .10
Annex A (normative) Determination of water holding capacity .11
Annex B (informative) Performance of the method .12
Bibliography .17
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ISO 23265:2022(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological characterization.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
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ISO 23265:2022(E)
Introduction
Determining if the soil microbial community is healthy is a complex task and is influenced by the
[1]
community’s resistance and resilience to disturbances . In its simplest terms, a healthy soil is one that
functions in organic matter decomposition (OMD) and nutrient cycling. In fact, a suite of standardized
test methods are needed to better understand the ecology of the soil microbial community and its
[2]
role in soil function and structure . However, one key soil microbiological function is organic matter
decomposition. Unfortunately, there is a lack of standardized procedures for quantitatively measuring
this important process. As such, the ability of soil microorganisms to decompose lignin cellulosic
material provides evidence that the microbial population is active in OMD and carbon cycling. A
standard field method currently available for assessing soil OMD inhibition from environmental
[3]
contaminants involves using litter bags placed in experimental plots ; however, there is no standard
method available for a laboratory-based assessment of organic matter decomposition. A laboratory-
based method has been developed using the same principles as the litterbag method. In place of
indigenous organic matter (i.e. tree leaves, crop material, etc.), the laboratory-based method uses
[4]
readily accessible filter paper as a standard organic material for organic matter decomposition tests .
The laboratory-based method has been used and described in several research studies as part of a
[5],[6]
greater soil microbial health (SMH) assessment suite of tests . The studies evaluated the impact
of contaminants in soil from brownfield sites or from testing of chemical-spiked control soil for risk
assessment research.
This document outlines a procedure for determining the effects of contaminated soils on the
decomposition of organic matter (lignin cellulosic filter paper) following a standardized methodology.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 23265:2022(E)
Soil quality — Test for estimating organic matter
decomposition in contaminated soil
WARNING — Contaminated soils may contain unknown mixtures of toxic, radiotoxic, genotoxic,
mutagenic, or otherwise harmful chemicals or infectious microorganisms. Occupational health
risks may arise from dust or evaporated chemicals during handling and incubation. Precautions
should be taken to avoid skin contact.
IMPORTANT — The electronic file of this document contains colours which are considered to be
useful for the correct understanding of the document. Users should therefore consider printing
this document using a colour printer.
1 Scope
This document specifies a test procedure for the evaluation of the habitat function of soils by
determining effects of soil contaminants and substances on organic matter decomposition. This test
is applicable to natural soils and soil materials of unknown quality (e.g. contaminated sites, amended
soils, soils after remediation, agricultural or other sites under concern). This document also specifies
how to use this method for testing substances under temperate conditions.
This document is not applicable to substances for which the air/soil partition coefficient is greater than
1. It is not applicable to substances with vapour pressure exceeding 300 Pa at 25 °C.
NOTE The stability of the test substance cannot be ensured over the test period. No provision is made in the
test method for monitoring the persistence of the substance under test.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 10390, Soil, treated biowaste and sludge – Determination of pH
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary
analysis)
ISO 11265, Soil quality — Determination of the specific electrical conductivity
ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by
sieving and sedimentation
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric
method
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
1
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3.1
contaminant
substance or agent present in the soil as a result of human activity
3.2
ECx
effective concentration
concentration (mass fraction) of a test sample or test substance that causes x % of an effect on a given
endpoint within a given exposure period
Note 1 to entry: The ECx is expressed as a percentage of soil to be tested (dry mass) per soil mixture (dry mass).
When substances are tested, the ECx is expressed as mass of the test substance per dry mass of soil in milligrams
per kilogram. This can only be determined for chemically-spiked soil.
3.3
limit test
single concentration treatment consisting of at least five replicates for:
a) the test soil (3.8) or the highest concentration of test substance mixed into the control soil (3.7), and
b) the control soil
3.4
LOEC
lowest observed effect concentration
lowest test substance concentration that has a statistically significant effect (probability p < 0,05)
Note 1 to entry: In this test, the LOEC is expressed as a mass of test substance per dry mass of the soil to be
tested. All test concentrations above the LOEC should usually show an effect that is statistically different from
the control. This can only be determined for chemically-spiked soil.
3.5
NOEC
no observed effect concentration
highest test substance concentration immediately below the LOEC (3.4) at which no effect is observed
Note 1 to entry: In this test, the concentration corresponding to the NOEC, has no statistically significant
effect (probability p > 0,05) within a given exposure period when compared with the control. This can only be
determined for chemically-spiked soil.
3.6
reference soil
uncontaminated soil with comparable pedological properties (nutrient concentrations, pH, organic
carbon content and texture) to the test soil (3.8) being studied
3.7
control soil
reference soil (3.6) used as a control against chemically-spiked test soil (3.8), which fulfils the validity
criteria
Note 1 to entry: it is advisable that a control soil be proven to be suitable for use by demonstrating the ability of
this soil to meet the standard’s test validity criteria prior to definitive testing.
Note 2 to entry: Control soil cannot be artificial soil (AS) as it is known that this type of soil does not meet the
validity criteria of the test.
3.8
test soil
sample of field-collected soil or chemically-spiked soil to be evaluated for toxicity to the soil microbial
community
2
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4 Principle
The ability of soil microorganisms to degrade cellulose filter paper (i.e. organic matter) in test soil (i.e.
contaminated soil) is compared to the same cellulose filter paper in control or reference soil over an
incubation period. In this method, the effects of individual substances can be assessed using standard
natural soil used in chemical-spiking testing. For contaminated soils, the effects are determined
in the test soil and in a control soil. This laboratory method uses sterilized filter paper disks as a
source of organic matter. Organic matter decomposition is estimated based on the mass loss of filter
paper disks placed between two layers of the test soil. If the contaminant in any way impairs the soil
microorganism’s ability to degrade cellulose filter paper through carbon cycle enzymes, a degradation
rate difference is observed between the test soil and control treatments. Filter paper was chosen as the
organic matter test material as it is universally available, is a more standardized media, allows for better
inter-laboratory reproducibility, can be sterilized (e.g. autoclaved) and can be easily distinguished from
[4],[9]
native organic matter in the soil .
The test involves pre-weighing filter paper disks, adding 10 g of soil on a dry mass basis to a 50 ml
sterile centrifuge tube, placing the filter paper on top of the soil, adding an additional 10 g of soil (dry
mass) on top of the filter paper, loosely capping the tube and incubating it at a constant temperature
(e.g. 20 °C ± 2 °C).
For control versus contaminated soil design, the test is performed with a minimum of five replicates
for each treatment with a minimum of five sampling time points. The incubation period depends on the
degradation rate of filter paper, so the test length is tied to the extent of filter paper mass loss in the
control treatment. A minimum mass loss in the control of 30 % is the earliest point for consideration of
test completion but between 40 % and 70 % degradation is the ideal range. Beyond this range, it is more
likely that the decomposed filter paper be difficult to clean and recover for mass loss measurements.
The time interval between sampling time points is dependent on the degree of microbial activity in the
control or reference soil.
In the case where soil is spiked with a contaminant, initial range-finding testing is advisable using a
broad concentration range of the contaminant. For the definitive chemical dilution series, a minimum
of 5 test concentrations is recommended. The duration of the test is influenced by the control and the
time needed to observe a distinct concentration response. From experience, the test should not exceed
140 days.
5 Reagents and material
5.1 Reagents
5.1.1 Sterile deionized (or distilled) water.
5.2 Materials
5.2.1 50 ml plastic centrifuge tubes (sterile).
5.2.2 Cellulose filter paper; particle retention, ≥ 11 µm to 25 µm; thickness, ~180 µm; ash content,
~0,06 %; (sterile).
5.2.3 Hole punch (25 mm diameter).
5.2.4 Filter paper forceps (sterile).
5.2.5 Petri dishes (glass or plastic).
5.2.6 Small paint brushes (soft bristles).
3
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5.2.7 Large plastic weigh-boats or alternate vessel.
5.2.8 Small aluminium weigh-boats or alternate vessel.
6 Soil
6.1 Field-collected soil
Field-collected soils, contaminated and control (i.e. reference), can be obtained from industrial,
agricultural, boreal forest or other contaminated sites of concern. In the case of undisturbed soil, the
organic horizon is used. The soil is shipped to the laboratory and stored at 4 °C.
All field-collected soils shall be passed through a 2 mm sieve. If required, soils may be slightly air-dried
just to enable sieving; however, where possible, air-drying should be avoided. After sieving, the soil is
homogenized and then stored again at 4 °C. Soil should be stored using containers that minimize losses
of soil contaminants by volatilization and sorption to the container walls. Variable storage periods are
possible for this test, so long as microbial activity is evident in the control or reference soil by meeting
the validity criteria of the test. Soil pH, conductivity, moisture content and water holding capacity
(WHC) are determined as per the methods below.
For interpretation of test results, the following characteristics shall be determined for each soil sampled
from a field site:
a) pH in accordance with ISO 10390;
b) texture (sand, loam, silt) in accordance with ISO 11277;
c) water content in accordance with ISO 11465;
d) organic carbon in accordance with ISO 10694;
e) specific electrical conductivity in accordance with ISO 11265;
f) water holding capacity in accordance with Annex A.
6.2 Control soil
The control soil can be the reference soil in the context of contaminated soil assessment. The reference
soils from an uncontaminated area near a contaminated soil site should be handled and shipped, and
characterized in a manner similar to the contaminated test soils. In the case of a chemically-spiked soil
study, a known control soil is used.
7 Apparatus
Use laboratory equipment and the following.
7.1 Top-loading balance.
7.2 Apparatus to determine the dry mass of the substrate, in accordance with ISO 11465 (drying
oven, desiccator, analytical balance).
7.3 Digital camera (optional).
7.4 Desiccant chamber.
7.5 pH meter.
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7.6 Analytical balance, capable of weighing with an accuracy of ±0,000 1 g.
7.7 Drying oven, set to (105 ± 5) °C.
7.8 Test environment.
7.8.1 Area to maintain a sterile environment, work bench with Bunsen burner or biological safety
cabinet (optional).
7.8.2 Enclosure, capable of constant temperature control.
8 Procedure
8.1 Experimental design
8.1.1 General
A sample of field collected contaminated soil at a single concentration or a chemically-spiked soil at
multiple concentrations are compared to an appropriate reference or control soil. Various test designs
are described in 8.1.2 and 8.1.3. However, regardless of the test design chosen, each test concentration
and associated control soil is replicated five times to allow for the time-spaced sampling during the
duration of this testing standard. A filter paper disk (i.e. organic matter) is added to the test soil and the
mass loss of filter paper determined over an incubation period.
8.1.2 Chemically-spiked soil test design
8.1.2.1 Range-finding
A preliminary test is recommended to find the range of concentrations that brackets the effect level of
a new test substance (e.g. 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg and 1 000 mg/kg). A range-finding
test shall be performed using the same batch of soil as the planned definitive test. The testing can be
conducted with reduced replication (e.g. 2 or 3 replicates), relative to the definitive test. The duration
of the range-finding test is the same as for the definitive test. The concentration range in the definitive
test should preferably be chosen so that it includes concentrations that span a wide range, including a
low concentration that evokes no adverse effects (similar to the negative control treatment) and a high
concentration that results in severe effects. Ideally, the concentrations chosen also brackets the mid-
range effects to better estimate the EC50 effect concentration.
When no effects are observed in a range-finding test, either with a 100 % contaminated soil sample or a
spiked chemical test, the definitive test can be designed as a limit test (e.g. undiluted contaminated field
soil) or a specific high chemical concentration (e.g. 1 000 milligrams of test substance per kilogram of
test soil).
8.1.2.2 Chemically-spiked soil
In the case where chemical substances are spiked into the soil at different concentrations, the test can
be designed for the following two scenarios:
a) For the ECx approach, a minimum of 5 concentrations plus the control treatment(s) shall be used,
and more (i.e. ≥ 10 concentrations plus controls) are recommended to improve the likelihood of
bracketing each end point sought according to ISO 10694. The dilution factor can be variable;
smaller at lower concentrations, larger at high concentrations. A minimum of five replicates for
each treatment plus the controls are recommended.
b) For the NOEC hypothesis approach, at least five concentrations in a geometric series shall be used
according to ISO 10694. Five replicates for each treatment plus eight controls are recommended.
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Regardless of the test design chosen, the test concentrations shall be spaced by a dilution factor not
exceeding 2.
A limit test can be sufficient if the results from a range-finding test show no toxic effect. This involves a
single test concentration (e.g. 1 000 mg/kg) and the control with a minimum of five replicates for each
treatment.
8.1.3 Field-contaminated soil test design
In the case where a field-collected contaminated soil is to be tested, the reference soil should match the
test soil as closely as possible. A preliminary performance test is recommended to ensure the reference
soil meets the validity criteria. There shall be a minimum of five replicates for both the reference and
test soil, however more replicates are recommended. For soils collected as distinct horizons (e.g. boreal
or taiga soils), each horizon shall be tested separately in independent definitive tests.
8.2 Preparation of filter paper disks
Filter paper disks are cut from commercially available filter paper using a 25 mm diameter hole punch
[i.e. sized to fit into the sterile centrifuge tubes (5.2.1)] or they may be purchased already in this size.
Make sure the cut is clean with no frayed edges. Individual filter paper disks are then weighed on an
analytical balance to the nearest 0,001 g, and the masses recorded. It is also recommended to record
the mass directly on the filter papers using a pencil. The filter papers, normally 10 at a time, are then
wrapped in aluminium foil and autoclaved (sterilized) on a dry cycle for 20 min (121 °C and 100 kPa)
or heated in an oven at 160 °C for 2 h. Filter forceps used in the test procedure are also wrapped in
aluminium foil and sterilized in the same manner.
8.3 Preparation of soil
8.3.1 Contaminated and reference soil
The test and reference soils shall be treated the same. The total mass of the test and reference soils
shall be the dry mass equivalent to 20 g in each test container. The test soil shall be wetted with sterile
deionized water to reach 40 % to 60 % of the total water holding capacity (i.e. desired water holding
capacity), or that which results in a crumbly texture (i.e. 2 mm to 3 mm clumps) that is optimal for
testing, determined according to Annex A. In some cases, for example when testing forest soils, higher
or lower percentages can be required. The optimal percentage water holding capacity should be
determined before the test set-up.
Determine the pH for each test and reference soil (one container per concentration) according to
ISO 10390 at the beginning and end of the test (when acid or basic substances are tested, do not adjust
the pH).
8.3.2 Chemical substances added to control soil
Control soil is used to prepare the test soil. Prepare enough test soil and control soil by summing the
mass required for all replicate and sampling times (minimum of 500 g dry mass). Substances are added
to the test substrate and mixed thoroughly.
For the introduction of test substances, use either method a), b) or c), as appropriate:
a) Water-soluble substances
Immediately before hydrating the soil to the desired water holding capacity for the test (refer to
8.3.1), dissolve the quantity of test substance in an amount of sterile water below that which is
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 23265
Première édition
2022-11
Qualité du sol — Essai d'estimation
de la décomposition de la matière
organique dans un sol contaminé
Soil quality — Test for estimating organic matter decomposition in
contaminated soil
Numéro de référence
ISO 23265:2022(F)
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ISO 23265:2022(F)
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
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ISO 23265:2022(F)
Sommaire Page
Avant‑propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 3
5 Réactifs et matériel . 4
5.1 Réactifs . 4
5.2 Matériel . 4
6 Sol . 4
6.1 Sol prélevé sur le terrain . 4
6.2 Sol témoin . . 5
7 Appareillage . 5
8 Mode opératoire . 5
8.1 Plan d’expérience . 5
8.1.1 Généralités . 5
8.1.2 Plan d’expérience pour un sol dopé avec un produit chimique. 6
8.1.3 Plan d’expérience pour un sol contaminé prélevé sur le terrain . 6
8.2 Préparation des disques de papier‑filtre. 6
8.3 Préparation du sol . 7
8.3.1 Sol contaminé et sol de référence . 7
8.3.2 Substances chimiques ajoutées au sol témoin . . 7
8.4 Mise en place de l’essai . 8
8.5 Échantillonnage d’essai. 9
9 Validité de l’essai .10
10 Calcul et expression des résultats .10
10.1 Calcul . 10
10.2 Expression des résultats . . 10
11 Fidélité .11
12 Analyse statistique .11
13 Rapport d’essai .11
Annexe A (normative) Détermination de la capacité de rétention d’eau .13
Annexe B (informative) Performance de la méthode .14
Bibliographie .20
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ISO 23265:2022(F)
Avant‑propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
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ISO 23265:2022(F)
Introduction
En raison de l’influence de la résistance et de la résilience de la communauté microbienne du sol aux
[1]
perturbations, il est difficile de déterminer si la communauté est en bonne santé. Pour simplifier,
un sol sain est un sol qui permet la décomposition de la matière organique (DMO) et le cycle des
éléments nutritifs. De fait, il est nécessaire de mettre en œuvre un ensemble de méthodes normalisées
d’essai pour mieux comprendre l’écologie des communautés microbiennes du sol et leur rôle dans les
[2]
fonctions et la structure du sol. Or la décomposition de la matière organique est l’une des principales
fonctions microbiologiques du sol. Il n’existe malheureusement pas de modes opératoires normalisés
pour quantifier ce processus essentiel. Ainsi, la capacité des micro‑organismes du sol à décomposer
la matière lignocellulosique prouve que la population microbienne joue un rôle actif dans la DMO et
le cycle du carbone. Une méthode normalisée d’analyse sur le terrain actuellement disponible pour
évaluer l’inhibition de la DMO du sol par des contaminants environnementaux consiste à placer des
[3]
sacs de litière dans des parcelles expérimentales. Cependant, il n’existe pas de méthode normalisée
de laboratoire pour évaluer la décomposition de la matière organique. Une méthode de laboratoire,
utilisant les mêmes principes que la méthode des sacs de litière, a été mise au point. Au lieu d’employer
de la matière organique indigène (c’est-à-dire des feuilles d’arbres, des résidus de récolte, etc.),
la méthode de laboratoire utilise un papier‑filtre courant comme matière organique normalisée pour
[4]
les essais de décomposition de la matière organique. La méthode de laboratoire a été mise en œuvre
et décrite dans plusieurs études de recherche dans le cadre d’une plus grande série d’essais portant
[5],[6]
sur l’évaluation de la santé microbienne du sol (SMS) Ces études visaient à estimer l’impact
des contaminants dans le sol de friches industrielles ou dans un sol témoin dopé avec des produits
chimiques à des fins d’évaluation des risques.
Le présent document décrit un mode opératoire pour déterminer les effets de la contamination des
sols sur la décomposition de la matière organique (papier‑filtre lignocellulosique) en suivant une
méthodologie normalisée.
v
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NORME INTERNATIONALE ISO 23265:2022(F)
Qualité du sol — Essai d'estimation de la décomposition de
la matière organique dans un sol contaminé
AVERTISSEMENT — Les sols contaminés peuvent contenir des mélanges inconnus de substances
chimiques toxiques, radiotoxiques, génotoxiques, mutagènes ou présentant d’autres nocivités,
ou des micro‑organismes infectieux. Les poussières ou l’évaporation de substances chimiques
pendant la manipulation et l’exposition peuvent présenter un risque pour la santé au travail.
Il convient de prendre des précautions pour éviter tout contact avec la peau.
IMPORTANT — Le fichier électronique du présent document contient des couleurs jugées utiles
à sa compréhension. Il convient, par conséquent, que les utilisateurs pensent à imprimer le
présent document en couleur.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie un mode opératoire d’essai pour l’évaluation de la fonction d’habitat des
sols en déterminant les effets des contaminants et des substances du sol sur la décomposition de la
matière organique. Cet essai est applicable aux sols naturels et aux matériaux du sol de qualité inconnue
(par exemple, sites contaminés, sols amendés, sols après décontamination, sols agricoles ou autres sites
préoccupants). Le présent document spécifie également la façon d’utiliser cette méthode pour analyser
les substances d’essai dans des conditions tempérées.
Le présent document n’est pas applicable aux substances pour lesquelles le coefficient de partage air/
sol est supérieur à 1. Il ne s’applique pas non plus aux substances dont la pression de vapeur dépasse
300 Pa à 25 °C.
NOTE La stabilité de la substance d’essai ne peut pas être garantie tout au long de la durée de l’essai.
La méthode d’essai ne prévoit pas de contrôler la rémanence de la substance soumise à essai.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 10390, Sols, biodéchets traités et boues — Détermination du pH
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 11265, Qualité du sol — Détermination de la conductivité électrique spécifique
ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des
sols — Méthode par tamisage et sédimentation
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
1
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ISO 23265:2022(F)
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
contaminant
substance ou agent présent(e) dans le sol du fait de l’activité humaine
3.2
CEx
concentration efficace
concentration (fraction massique) d’un échantillon pour essai ou d’une substance d’essai qui engendre
un effet de x % sur un critère d’effet donné durant une période d’exposition déterminée
Note 1 à l'article: La CEx est exprimée en pourcentage de sol d’essai (masse sèche) par mélange de sols
(masse sèche). Lorsque des substances sont soumises à essai, la CEx est exprimée en masse de substance d’essai
par masse sèche de sol en milligrammes par kilogramme. Elle ne peut être déterminée que pour un sol dopé avec
des produits chimiques.
3.3
essai limite
traitement à une seule concentration comprenant au moins cinq réplicats pour :
a) le sol d’essai (3.8) ou la concentration la plus élevée de substance d’essai mélangée dans le sol témoin
(3.7) ; et
b) le sol témoin
3.4
CMEO
concentration minimale avec effet observé
concentration la plus faible d’une substance d’essai ayant un effet statistiquement significatif
(probabilité p < 0,05)
Note 1 à l'article: Dans cet essai, la CMEO est exprimée en masse de substance d’essai par masse sèche du sol à
soumettre à essai. Il convient, en général, que toutes les concentrations d’essai supérieures à la CMEO présentent
un effet statistiquement différent du témoin. Elle ne peut être déterminée que pour un sol dopé avec des produits
chimiques.
3.5
CSEO
concentration maximale sans effet observé
concentration la plus élevée d’une substance d’essai, immédiatement inférieure à la CMEO (3.4),
à laquelle aucun effet n’est observé
Note 1 à l'article: Dans cet essai, la concentration correspondant à la CSEO n’a aucun effet statistiquement
significatif (probabilité p > 0,05) durant une période d’exposition déterminée, en comparaison avec le témoin.
Elle ne peut être déterminée que pour un sol dopé avec des produits chimiques.
3.6
sol de référence
sol non contaminé ayant des propriétés pédologiques comparables (concentrations en éléments
nutritifs, pH, teneur en carbone organique et texture) à celles du sol d’essai (3.8) étudié
2
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ISO 23265:2022(F)
3.7
sol témoin
sol de référence (3.6) utilisé comme témoin par rapport au sol d’essai (3.8) dopé avec des substances
chimiques, qui satisfait aux critères de validité
Note 1 à l'article: Dans le cas d’un sol témoin, il est recommandé de prouver son adéquation à l’utilisation prévue
en démontrant sa capacité à répondre aux critères de validité de l’essai avant l’essai définitif.
Note 2 à l'article: Le sol témoin ne peut pas être un sol artificiel (SA), car il est connu que ce type de sol ne remplit
pas les critères de validité de l’essai.
3.8
sol d’essai
échantillon de sol prélevé sur le terrain ou de sol dopé avec des produits chimiques, dont la toxicité doit
être évaluée vis-à-vis des communautés microbiennes du sol
4 Principe
La capacité de micro‑organismes du sol à dégrader un papier‑filtre en cellulose (c’est‑à‑dire la matière
organique) dans le sol d’essai (c’est‑à‑dire le sol contaminé) est comparée à celle de ce même papier‑filtre
en cellulose dans un sol témoin ou de référence au cours d’une période d’exposition. Grâce à cette
méthode, les effets des substances individuelles peuvent être évalués à l’aide d’un sol naturel normalisé
dans le cadre d’essais de dopage avec des produits chimiques. Dans le cas de sols contaminés, les effets
sont déterminés dans le sol d’essai et dans un sol témoin. Cette méthode de laboratoire utilise des
disques de papier‑filtre stérilisés comme source de matière organique. La décomposition de la matière
organique est estimée en s’appuyant sur la perte de masse des disques de papier‑filtre disposés entre
deux couches de sol d’essai. Si le contaminant altère de quelque manière que ce soit la capacité des
micro‑organismes du sol à dégrader le papier‑filtre en cellulose par les enzymes du cycle du carbone,
une différence de taux de dégradation est observée entre le sol d’essai et les traitements témoins. Le
papier‑filtre a été choisi comme matière organique d’essai, car il est disponible partout, qu’il constitue
un milieu plus normalisé, qu’il permet d’obtenir une meilleure reproductibilité interlaboratoires, qu’il
peut être stérilisé (par exemple, à l’autoclave) et peut être facilement différencié de la matière organique
[4],[9]
native du sol .
L’essai implique de peser au préalable les disques de papier‑filtre, d’ajouter 10 g de sol (masse sèche)
dans un tube à centrifuger stérile de 50 ml, de placer le papier‑filtre sur le sol, d’ajouter 10 g de sol
supplémentaires (masse sèche) sur le papier‑filtre, de fermer le tube sans serrer et de l’exposer à une
température constante [par exemple, à (20 ± 2) °C)].
Dans le cas d’un plan d’expérience visant à comparer le sol témoin au sol contaminé, l’essai est
effectué avec au moins cinq réplicats pour chaque traitement et au moins cinq points de prélèvement.
La période d’exposition dépend de la vitesse de dégradation du papier‑filtre, la durée de l’essai est donc
liée à la perte de masse du papier‑filtre dans le traitement témoin. Une perte de masse du témoin de
30 % correspond au moment le plus précoce auquel l’essai est considéré comme étant terminé, mais
une dégradation de 40 % à 70 % constitue la plage idéale. Au-delà de cette plage, la probabilité que
le papier‑filtre décomposé soit difficile à nettoyer et à récupérer en vue des mesurages de perte de
masse augmente. L’intervalle de temps entre les points d’échantillonnage dépend du degré d’activité
microbienne dans le sol témoin ou de référence.
Dans le cas d’un sol dopé avec un contaminant, il est conseillé d’effectuer un essai préliminaire en
utilisant une large gamme de concentrations de contaminant. Il est recommandé d’utiliser au moins
5 concentrations d’essai pour la gamme de dilutions définitive du produit chimique. La durée de l’essai
est influencée par le témoin et le temps nécessaire pour observer une relation concentration‑réponse
distincte. D’expérience, il convient que la durée de l’essai ne dépasse pas 140 jours.
3
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ISO 23265:2022(F)
5 Réactifs et matériel
5.1 Réactifs
5.1.1 Eau déminéralisée (ou distillée) stérile
5.2 Matériel
5.2.1 Tubes à centrifuger en plastique de 50 ml (stériles)
5.2.2 Papier‑filtre en cellulose (stérile) ; rétention des particules ≥ 11 µm jusqu’à 25 µm ;
épaisseur ~180 µm ; taux de cendres ~0,06 %
5.2.3 Perforateur (25 mm de diamètre)
5.2.4 Pinces pour papier‑filtre (stériles)
5.2.5 Boîtes de Petri (en verre ou en plastique)
5.2.6 Petits pinceaux (à poils souples)
5.2.7 Grandes coupelles de pesée en plastique ou autres récipients
5.2.8 Petites coupelles de pesée en aluminium ou autres récipients
6 Sol
6.1 Sol prélevé sur le terrain
Les sols prélevés sur le terrain, les sols contaminés et les sols témoins (c’est-à-dire, de référence) peuvent
être obtenus à partir de sites industriels ou agricoles, de forêts boréales ou d’autres sites contaminés
préoccupants. Dans le cas de sol non perturbé, l’horizon organique est utilisé. Le sol est expédié au
laboratoire et conservé à 4 °C.
Tous les sols prélevés sur le terrain doivent passer au travers d’un tamis de 2 mm. Si nécessaire, les
sols peuvent être légèrement séchés à l’air libre pour faciliter le tamisage ; cependant, il convient, dans
la mesure du possible, d’éviter le séchage à l’air libre. Après tamisage, le sol est homogénéisé, puis
de nouveau conservé à 4 °C. À cette fin, il convient d’utiliser des récipients qui limitent les pertes de
contaminants par volatilisation et sorption sur les parois. Pour cet essai, les durées de conservation
peuvent varier, tant que l’activité microbienne persiste de manière évidente dans le sol témoin ou de
référence en satisfaisant aux critères de validité de l’essai. Le pH du sol, la conductivité, la teneur en eau
et la capacité de rétention d’eau (CRE) sont déterminés conformément aux méthodes ci-dessous.
Pour l’interprétation des résultats de l’essai, les caractéristiques suivantes doivent être déterminées
pour chaque échantillon de sol prélevé sur le terrain :
a) pH conformément à l’ISO 10390 ;
b) texture (sable, loam, limon) conformément à l’ISO 11277 ;
c) teneur en eau conformément à l’ISO 11465 ;
d) carbone organique conformément à l’ISO 10694 ;
e) conductivité électrique spécifique conformément à l’ISO 11265 ;
4
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ISO 23265:2022(F)
f) capacité de rétention d’eau conformément à l’Annexe A.
6.2 Sol témoin
Le sol témoin peut être le sol de référence dans le cadre de l’évaluation d’un sol contaminé. Il convient de
manipuler, de transporter et de caractériser les sols de référence provenant d’une zone non contaminée
proche d’un site contaminé d’une façon analogue à celle des sols contaminés soumis à essai. Dans le cas
d’une étude de sols dopés avec des produits chimiques, un sol témoin connu est utilisé.
7 Appareillage
Utiliser du matériel de laboratoire et l’appareillage suivant.
7.1 Balance à chargement par le haut
7.2 Appareillage permettant de déterminer la masse sèche du substrat, conformément à
l’ISO 11465 (étuve de séchage, dessiccateur, balance analytique)
7.3 Appareil photo numérique (en option)
7.4 Chambre de dessiccation
7.5 pH‑mètre
7.6 Balance analytique, capable de peser avec une exactitude de ±0,000 1 g
7.7 Étuve de séchage, réglée à (105 ± 5) °C
7.8 Environnement d’essai
7.8.1 Pièce permettant de maintenir un environnement stérile, paillasse avec bec Bunsen ou
poste de sécurité biologique (facultatif)
7.8.2 Enceinte, capable de maintenir une température constante
8 Mode opératoire
8.1 Plan d’expérience
8.1.1 Généralités
Un échantillon d’un sol contaminé prélevé sur le terrain à une concentration unique ou un échantillon
de sol dopé avec un produit chimique à plusieurs concentrations est comparé avec un sol témoin ou de
référence approprié. Différents plans d’expérience sont décrits en 8.1.2 et en 8.1.3. Cependant, quel que
soit le plan d’expérience choisi, chaque concentration d’essai et chaque sol témoin associé sont répliqués
cinq fois pour permettre un échantillonnage échelonné dans le temps tout au long de l’étude. Un disque
de papier‑filtre (c’est‑à‑dire, la matière organique) est ajouté au sol d’essai en vue de déterminer la perte
de masse du papier‑filtre au cours d’une période d’exposition.
5
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ISO 23265:2022(F)
8.1.2 Plan d’expérience pour un sol dopé avec un produit chimique
8.1.2.1 Essai préliminaire
Il est recommandé d’effectuer un essai préliminaire pour déterminer la gamme de concentrations qui
encadre le niveau d’effet d’une nouvelle substance d’essai (par exemple, 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/
kg, 100 mg/kg et 1 000 mg/kg). Un essai préliminaire doit être effectué en utilisant le même lot de
sol que pour l’essai définitif prévu. L’essai peut être effectué avec un nombre de réplicats réduit (par
exemple, 2 ou 3 réplicats) par rapport à l’essai définitif. La durée de l’essai préliminaire est identique
à celle de l’essai définitif. Lors de l’essai définitif, il convient de choisir de préférence la gamme de
concentrations de sorte à inclure des concentrations qui couvrent une large gamme d’effets, y compris
une faible concentration qui n’a aucun effet indésirable (semblable au traitement « témoin négatif ») et
une concentration élevée qui provoque des effets importants. Dans l’idéal, les concentrations choisies
englobent également les effets intermédiaires pour mieux estimer la concentration efficace CE50.
En l’absence d’effets observés pendant l’essai préliminaire sur un échantillon contenant exclusivement
du sol contaminé ou un sol dopé avec un produit chimique, l’essai définitif peut être conçu comme
un essai limite (par exemple, sol contaminé non dilué prélevé sur le terrain) ou une concentration
en produit chimique élevée spécifique (par exemple, 1 000 milligrammes de substance d’essai par
kilogramme de sol d’essai).
8.1.2.2 Sol dopé avec un produit chimique
Dans le cas où des substances chimiques sont incorporées dans le sol à différentes concentrations,
l’essai peut être conçu pour les deux scénarios suivants :
a) l’approche CEx doit utiliser au moins 5 concentrations en plus du ou des traitements témoins, mais il
est recommandé d’augmenter leur nombre (c’est‑à‑dire ≥ 10 concentrations en plus des témoins)
pour augmenter la probabilité d’encadrer chaque critère d’effet visé conformément à l’ISO 10694.
Le facteur de dilution peut être variable ; plus petit à des concentrations plus faibles, plus grand
à des concentrations élevées. Il est recommandé d’utiliser au moins cinq réplicats pour chaque
traitement en plus des témoins ;
b) l’approche CSEO, quant à elle, doit utiliser une série géométrique d’au moins cinq concentrations
conformément à l’ISO 10694. Il est recommandé d’utiliser cinq réplicats pour chaque traitement en
plus de huit témoins.
Quel que soit le plan d’expérience choisi, les concentrations d’essai doivent être espacées par un facteur
de dilution n’excédant pas 2.
Un essai limite peut suffire si les résultats de l’essai préliminaire ne révèlent aucun effet toxique.
Cela implique une seule
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.