Soil quality — Test for estimating organic matter decomposition in contaminated soil

This document specifies a test procedure for the evaluation of the habitat function of soils by determining effects of soil contaminants and substances on organic matter decomposition. This test is applicable to natural soils and soil materials of unknown quality (e.g. contaminated sites, amended soils, soils after remediation, agricultural or other sites under concern). This document also specifies how to use this method for testing substances under temperate conditions. This document is not applicable to substances for which the air/soil partition coefficient is greater than 1. It is not applicable to substances with vapour pressure exceeding 300 Pa at 25 °C. NOTE The stability of the test substance cannot be ensured over the test period. No provision is made in the test method for monitoring the persistence of the substance under test.

Qualité du sol — Essai d'estimation de la décomposition de la matière organique dans un sol contaminé

Le présent document spécifie un mode opératoire d’essai pour l’évaluation de la fonction d’habitat des sols en déterminant les effets des contaminants et des substances du sol sur la décomposition de la matière organique. Cet essai est applicable aux sols naturels et aux matériaux du sol de qualité inconnue (par exemple, sites contaminés, sols amendés, sols après décontamination, sols agricoles ou autres sites préoccupants). Le présent document spécifie également la façon d’utiliser cette méthode pour analyser les substances d’essai dans des conditions tempérées. Le présent document n’est pas applicable aux substances pour lesquelles le coefficient de partage air/sol est supérieur à 1. Il ne s’applique pas non plus aux substances dont la pression de vapeur dépasse 300 Pa à 25 °C. NOTE La stabilité de la substance d’essai ne peut pas être garantie tout au long de la durée de l’essai. La méthode d’essai ne prévoit pas de contrôler la rémanence de la substance soumise à essai.

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Status
Published
Publication Date
10-Nov-2022
Current Stage
6060 - International Standard published
Due Date
01-Mar-2023
Completion Date
11-Nov-2022
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ISO 23265:2022 - Soil quality — Test for estimating organic matter decomposition in contaminated soil Released:11. 11. 2022
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 23265
First edition
2022-11
Soil quality — Test for estimating
organic matter decomposition in
contaminated soil
Qualité du sol — Essai d'estimation de la décomposition de la matière
organique dans un sol contaminé
Reference number
ISO 23265:2022(E)
© ISO 2022
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ISO 23265:2022(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
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Published in Switzerland
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ISO 23265:2022(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction .................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ..................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions .................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 3

5 Reagents and material ................................................................................................................................................................................... 3

5.1 Reagents ....................................................................................................................................................................................................... 3

5.2 Materials ...................................................................................................................................................................................................... 3

6 Soil ....................................................................................................................................................................................................................................... 4

6.1 Field-collected soil............................................................................................................................................................................... 4

6.2 Control soil ................................................................................................................................................................................................. 4

7 Apparatus .................................................................................................................................................................................................................... 4

8 Procedure ....................................................................................................................................................................................................................5

8.1 Experimental design ......................................................................................................................................................................... 5

8.1.1 General ........................................................................................................................................................................................ 5

8.1.2 Chemically-spiked soil test design ..................................................................................................................... 5

8.1.3 Field-contaminated soil test design .................................................................................................................. 6

8.2 Preparation of filter paper disks ............................................................................................................................................ 6

8.3 Preparation of soil ............................................................................................................................................................................... 6

8.3.1 Contaminated and reference soil ......................................................................................................................... 6

8.3.2 Chemical substances added to control soil ................................................................................................. 6

8.4 Test set-up ................................................................................................................................................................................................... 7

8.5 Test sampling ........................................................................................................................................................................................... 8

9 Validity of the test ...............................................................................................................................................................................................9

10 Calculation and expression of results ........................................................................................................................................... 9

10.1 Calculation .................................................................................................................................................................................................. 9

10.2 Expression of results ........................................................................................................................................... .............................. 9

11 Precision ....................................................................................................................................................................................................................10

12 Statistical analysis ..........................................................................................................................................................................................10

13 Test report ...............................................................................................................................................................................................................10

Annex A (normative) Determination of water holding capacity .........................................................................................11

Annex B (informative) Performance of the method .........................................................................................................................12

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................17

iii
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ISO 23265:2022(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to

the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see

www.iso.org/iso/foreword.html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,

Biological characterization.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
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ISO 23265:2022(E)
Introduction

Determining if the soil microbial community is healthy is a complex task and is influenced by the

[1]

community’s resistance and resilience to disturbances . In its simplest terms, a healthy soil is one that

functions in organic matter decomposition (OMD) and nutrient cycling. In fact, a suite of standardized

test methods are needed to better understand the ecology of the soil microbial community and its

[2]

role in soil function and structure . However, one key soil microbiological function is organic matter

decomposition. Unfortunately, there is a lack of standardized procedures for quantitatively measuring

this important process. As such, the ability of soil microorganisms to decompose lignin cellulosic

material provides evidence that the microbial population is active in OMD and carbon cycling. A

standard field method currently available for assessing soil OMD inhibition from environmental

[3]

contaminants involves using litter bags placed in experimental plots ; however, there is no standard

method available for a laboratory-based assessment of organic matter decomposition. A laboratory-

based method has been developed using the same principles as the litterbag method. In place of

indigenous organic matter (i.e. tree leaves, crop material, etc.), the laboratory-based method uses

[4]

readily accessible filter paper as a standard organic material for organic matter decomposition tests .

The laboratory-based method has been used and described in several research studies as part of a

[5],[6]

greater soil microbial health (SMH) assessment suite of tests . The studies evaluated the impact

of contaminants in soil from brownfield sites or from testing of chemical-spiked control soil for risk

assessment research.

This document outlines a procedure for determining the effects of contaminated soils on the

decomposition of organic matter (lignin cellulosic filter paper) following a standardized methodology.

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INTERNATIONAL STANDARD ISO 23265:2022(E)
Soil quality — Test for estimating organic matter
decomposition in contaminated soil

WARNING — Contaminated soils may contain unknown mixtures of toxic, radiotoxic, genotoxic,

mutagenic, or otherwise harmful chemicals or infectious microorganisms. Occupational health

risks may arise from dust or evaporated chemicals during handling and incubation. Precautions

should be taken to avoid skin contact.

IMPORTANT — The electronic file of this document contains colours which are considered to be

useful for the correct understanding of the document. Users should therefore consider printing

this document using a colour printer.
1 Scope

This document specifies a test procedure for the evaluation of the habitat function of soils by

determining effects of soil contaminants and substances on organic matter decomposition. This test

is applicable to natural soils and soil materials of unknown quality (e.g. contaminated sites, amended

soils, soils after remediation, agricultural or other sites under concern). This document also specifies

how to use this method for testing substances under temperate conditions.

This document is not applicable to substances for which the air/soil partition coefficient is greater than

1. It is not applicable to substances with vapour pressure exceeding 300 Pa at 25 °C.

NOTE The stability of the test substance cannot be ensured over the test period. No provision is made in the

test method for monitoring the persistence of the substance under test.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 10390, Soil, treated biowaste and sludge – Determination of pH

ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary

analysis)
ISO 11265, Soil quality — Determination of the specific electrical conductivity

ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by

sieving and sedimentation

ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric

method
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
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ISO 23265:2022(E)
3.1
contaminant
substance or agent present in the soil as a result of human activity
3.2
ECx
effective concentration

concentration (mass fraction) of a test sample or test substance that causes x % of an effect on a given

endpoint within a given exposure period

Note 1 to entry: The ECx is expressed as a percentage of soil to be tested (dry mass) per soil mixture (dry mass).

When substances are tested, the ECx is expressed as mass of the test substance per dry mass of soil in milligrams

per kilogram. This can only be determined for chemically-spiked soil.
3.3
limit test
single concentration treatment consisting of at least five replicates for:

a) the test soil (3.8) or the highest concentration of test substance mixed into the control soil (3.7), and

b) the control soil
3.4
LOEC
lowest observed effect concentration

lowest test substance concentration that has a statistically significant effect (probability p < 0,05)

Note 1 to entry: In this test, the LOEC is expressed as a mass of test substance per dry mass of the soil to be

tested. All test concentrations above the LOEC should usually show an effect that is statistically different from

the control. This can only be determined for chemically-spiked soil.
3.5
NOEC
no observed effect concentration

highest test substance concentration immediately below the LOEC (3.4) at which no effect is observed

Note 1 to entry: In this test, the concentration corresponding to the NOEC, has no statistically significant

effect (probability p > 0,05) within a given exposure period when compared with the control. This can only be

determined for chemically-spiked soil.
3.6
reference soil

uncontaminated soil with comparable pedological properties (nutrient concentrations, pH, organic

carbon content and texture) to the test soil (3.8) being studied
3.7
control soil

reference soil (3.6) used as a control against chemically-spiked test soil (3.8), which fulfils the validity

criteria

Note 1 to entry: it is advisable that a control soil be proven to be suitable for use by demonstrating the ability of

this soil to meet the standard’s test validity criteria prior to definitive testing.

Note 2 to entry: Control soil cannot be artificial soil (AS) as it is known that this type of soil does not meet the

validity criteria of the test.
3.8
test soil

sample of field-collected soil or chemically-spiked soil to be evaluated for toxicity to the soil microbial

community
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ISO 23265:2022(E)
4 Principle

The ability of soil microorganisms to degrade cellulose filter paper (i.e. organic matter) in test soil (i.e.

contaminated soil) is compared to the same cellulose filter paper in control or reference soil over an

incubation period. In this method, the effects of individual substances can be assessed using standard

natural soil used in chemical-spiking testing. For contaminated soils, the effects are determined

in the test soil and in a control soil. This laboratory method uses sterilized filter paper disks as a

source of organic matter. Organic matter decomposition is estimated based on the mass loss of filter

paper disks placed between two layers of the test soil. If the contaminant in any way impairs the soil

microorganism’s ability to degrade cellulose filter paper through carbon cycle enzymes, a degradation

rate difference is observed between the test soil and control treatments. Filter paper was chosen as the

organic matter test material as it is universally available, is a more standardized media, allows for better

inter-laboratory reproducibility, can be sterilized (e.g. autoclaved) and can be easily distinguished from

[4],[9]
native organic matter in the soil .

The test involves pre-weighing filter paper disks, adding 10 g of soil on a dry mass basis to a 50 ml

sterile centrifuge tube, placing the filter paper on top of the soil, adding an additional 10 g of soil (dry

mass) on top of the filter paper, loosely capping the tube and incubating it at a constant temperature

(e.g. 20 °C ± 2 °C).

For control versus contaminated soil design, the test is performed with a minimum of five replicates

for each treatment with a minimum of five sampling time points. The incubation period depends on the

degradation rate of filter paper, so the test length is tied to the extent of filter paper mass loss in the

control treatment. A minimum mass loss in the control of 30 % is the earliest point for consideration of

test completion but between 40 % and 70 % degradation is the ideal range. Beyond this range, it is more

likely that the decomposed filter paper be difficult to clean and recover for mass loss measurements.

The time interval between sampling time points is dependent on the degree of microbial activity in the

control or reference soil.

In the case where soil is spiked with a contaminant, initial range-finding testing is advisable using a

broad concentration range of the contaminant. For the definitive chemical dilution series, a minimum

of 5 test concentrations is recommended. The duration of the test is influenced by the control and the

time needed to observe a distinct concentration response. From experience, the test should not exceed

140 days.
5 Reagents and material
5.1 Reagents
5.1.1 Sterile deionized (or distilled) water.
5.2 Materials
5.2.1 50 ml plastic centrifuge tubes (sterile).

5.2.2 Cellulose filter paper; particle retention, ≥ 11 µm to 25 µm; thickness, ~180 µm; ash content,

~0,06 %; (sterile).
5.2.3 Hole punch (25 mm diameter).
5.2.4 Filter paper forceps (sterile).
5.2.5 Petri dishes (glass or plastic).
5.2.6 Small paint brushes (soft bristles).
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ISO 23265:2022(E)
5.2.7 Large plastic weigh-boats or alternate vessel.
5.2.8 Small aluminium weigh-boats or alternate vessel.
6 Soil
6.1 Field-collected soil

Field-collected soils, contaminated and control (i.e. reference), can be obtained from industrial,

agricultural, boreal forest or other contaminated sites of concern. In the case of undisturbed soil, the

organic horizon is used. The soil is shipped to the laboratory and stored at 4 °C.

All field-collected soils shall be passed through a 2 mm sieve. If required, soils may be slightly air-dried

just to enable sieving; however, where possible, air-drying should be avoided. After sieving, the soil is

homogenized and then stored again at 4 °C. Soil should be stored using containers that minimize losses

of soil contaminants by volatilization and sorption to the container walls. Variable storage periods are

possible for this test, so long as microbial activity is evident in the control or reference soil by meeting

the validity criteria of the test. Soil pH, conductivity, moisture content and water holding capacity

(WHC) are determined as per the methods below.

For interpretation of test results, the following characteristics shall be determined for each soil sampled

from a field site:
a) pH in accordance with ISO 10390;
b) texture (sand, loam, silt) in accordance with ISO 11277;
c) water content in accordance with ISO 11465;
d) organic carbon in accordance with ISO 10694;
e) specific electrical conductivity in accordance with ISO 11265;
f) water holding capacity in accordance with Annex A.
6.2 Control soil

The control soil can be the reference soil in the context of contaminated soil assessment. The reference

soils from an uncontaminated area near a contaminated soil site should be handled and shipped, and

characterized in a manner similar to the contaminated test soils. In the case of a chemically-spiked soil

study, a known control soil is used.
7 Apparatus
Use laboratory equipment and the following.
7.1 Top-loading balance.

7.2 Apparatus to determine the dry mass of the substrate, in accordance with ISO 11465 (drying

oven, desiccator, analytical balance).
7.3 Digital camera (optional).
7.4 Desiccant chamber.
7.5 pH meter.
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ISO 23265:2022(E)
7.6 Analytical balance, capable of weighing with an accuracy of ±0,000 1 g.
7.7 Drying oven, set to (105 ± 5) °C.
7.8 Test environment.

7.8.1 Area to maintain a sterile environment, work bench with Bunsen burner or biological safety

cabinet (optional).
7.8.2 Enclosure, capable of constant temperature control.
8 Procedure
8.1 Experimental design
8.1.1 General

A sample of field collected contaminated soil at a single concentration or a chemically-spiked soil at

multiple concentrations are compared to an appropriate reference or control soil. Various test designs

are described in 8.1.2 and 8.1.3. However, regardless of the test design chosen, each test concentration

and associated control soil is replicated five times to allow for the time-spaced sampling during the

duration of this testing standard. A filter paper disk (i.e. organic matter) is added to the test soil and the

mass loss of filter paper determined over an incubation period.
8.1.2 Chemically-spiked soil test design
8.1.2.1 Range-finding

A preliminary test is recommended to find the range of concentrations that brackets the effect level of

a new test substance (e.g. 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg and 1 000 mg/kg). A range-finding

test shall be performed using the same batch of soil as the planned definitive test. The testing can be

conducted with reduced replication (e.g. 2 or 3 replicates), relative to the definitive test. The duration

of the range-finding test is the same as for the definitive test. The concentration range in the definitive

test should preferably be chosen so that it includes concentrations that span a wide range, including a

low concentration that evokes no adverse effects (similar to the negative control treatment) and a high

concentration that results in severe effects. Ideally, the concentrations chosen also brackets the mid-

range effects to better estimate the EC50 effect concentration.

When no effects are observed in a range-finding test, either with a 100 % contaminated soil sample or a

spiked chemical test, the definitive test can be designed as a limit test (e.g. undiluted contaminated field

soil) or a specific high chemical concentration (e.g. 1 000 milligrams of test substance per kilogram of

test soil).
8.1.2.2 Chemically-spiked soil

In the case where chemical substances are spiked into the soil at different concentrations, the test can

be designed for the following two scenarios:

a) For the ECx approach, a minimum of 5 concentrations plus the control treatment(s) shall be used,

and more (i.e. ≥ 10 concentrations plus controls) are recommended to improve the likelihood of

bracketing each end point sought according to ISO 10694. The dilution factor can be variable;

smaller at lower concentrations, larger at high concentrations. A minimum of five replicates for

each treatment plus the controls are recommended.

b) For the NOEC hypothesis approach, at least five concentrations in a geometric series shall be used

according to ISO 10694. Five replicates for each treatment plus eight controls are recommended.

© ISO 2022 – All rights reserved
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ISO 23265:2022(E)

Regardless of the test design chosen, the test concentrations shall be spaced by a dilution factor not

exceeding 2.

A limit test can be sufficient if the results from a range-finding test show no toxic effect. This involves a

single test concentration (e.g. 1 000 mg/kg) and the control with a minimum of five replicates for each

treatment.
8.1.3 Field-contaminated soil test design

In the case where a field-collected contaminated soil is to be tested, the reference soil should match the

test soil as closely as possible. A preliminary performance test is recommended to ensure the reference

soil meets the validity criteria. There shall be a minimum of five replicates for both the reference and

test soil, however more replicates are recommended. For soils collected as distinct horizons (e.g. boreal

or taiga soils), each horizon shall be tested separately in independent definitive tests.

8.2 Preparation of filter paper disks

Filter paper disks are cut from commercially available filter paper using a 25 mm diameter hole punch

[i.e. sized to fit into the sterile centrifuge tubes (5.2.1)] or they may be purchased already in this size.

Make sure the cut is clean with no frayed edges. Individual filter paper disks are then weighed on an

analytical balance to the nearest 0,001 g, and the masses recorded. It is also recommended to record

the mass directly on the filter papers using a pencil. The filter papers, normally 10 at a time, are then

wrapped in aluminium foil and autoclaved (sterilized) on a dry cycle for 20 min (121 °C and 100 kPa)

or heated in an oven at 160 °C for 2 h. Filter forceps used in the test procedure are also wrapped in

aluminium foil and sterilized in the same manner.
8.3 Preparation of soil
8.3.1 Contaminated and reference soil

The test and reference soils shall be treated the same. The total mass of the test and reference soils

shall be the dry mass equivalent to 20 g in each test container. The test soil shall be wetted with sterile

deionized water to reach 40 % to 60 % of the total water holding capacity (i.e. desired water holding

capacity), or that which results in a crumbly texture (i.e. 2 mm to 3 mm clumps) that is optimal for

testing, determined according to Annex A. In some cases, for example when testing forest soils, higher

or lower percentages can be required. The optimal percentage water holding capacity should be

determined before the test set-up.

Determine the pH for each test and reference soil (one container per concentration) according to

ISO 10390 at the beginning and end of the test (when acid or basic substances are tested, do not adjust

the pH).
8.3.2 Chemical substances added to control soil

Control soil is used to prepare the test soil. Prepare enough test soil and control soil by summing the

mass required for all replicate and sampling times (minimum of 500 g dry mass). Substances are added

to the test substrate and mixed thoroughly.

For the introduction of test substances, use either method a), b) or c), as appropriate:

a) Water-soluble substances

Immediately before hydrating the soil to the desired water holding capacity for the test (refer to

8.3.1), dissolve the quantity of test substance in an amount of sterile water below that which is

...

NORME ISO
INTERNATIONALE 23265
Première édition
2022-11
Qualité du sol — Essai d'estimation
de la décomposition de la matière
organique dans un sol contaminé
Soil quality — Test for estimating organic matter decomposition in
contaminated soil
Numéro de référence
ISO 23265:2022(F)
© ISO 2022
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ISO 23265:2022(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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ISO 23265:2022(F)
Sommaire Page

Avant‑propos .............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction .................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ..................................................................................................................................................................................1

3 Termes et définitions ...................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe.......................................................................................................................................................................................................................... 3

5 Réactifs et matériel ........................................................................................................................................................................................... 4

5.1 Réactifs .......................................................................................................................................................................................................... 4

5.2 Matériel ......................................................................................................................................................................................................... 4

6 Sol ......................................................................................................................................................................................................................................... 4

6.1 Sol prélevé sur le terrain ............................................................................................................................................................... 4

6.2 Sol témoin ...................................................................... .............................................................................................................................. 5

7 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 5

8 Mode opératoire ................................................................................................................................................................................................... 5

8.1 Plan d’expérience .................................................................................................................................................................................. 5

8.1.1 Généralités ............................................................................................................................................................................... 5

8.1.2 Plan d’expérience pour un sol dopé avec un produit chimique................................................. 6

8.1.3 Plan d’expérience pour un sol contaminé prélevé sur le terrain ............................................. 6

8.2 Préparation des disques de papier‑filtre......................................................................................................................... 6

8.3 Préparation du sol ............................................................................................................................................................................... 7

8.3.1 Sol contaminé et sol de référence ........................................................................................................................ 7

8.3.2 Substances chimiques ajoutées au sol témoin ................................... ....................................................... 7

8.4 Mise en place de l’essai .................................................................................................................................................................... 8

8.5 Échantillonnage d’essai................................................................................................................................................................... 9

9 Validité de l’essai ..............................................................................................................................................................................................10

10 Calcul et expression des résultats ..................................................................................................................................................10

10.1 Calcul ............................................................................................................................................................................................................ 10

10.2 Expression des résultats ........................................................................................................................................... .................. 10

11 Fidélité .........................................................................................................................................................................................................................11

12 Analyse statistique .........................................................................................................................................................................................11

13 Rapport d’essai ...................................................................................................................................................................................................11

Annexe A (normative) Détermination de la capacité de rétention d’eau ...................................................................13

Annexe B (informative) Performance de la méthode .....................................................................................................................14

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................20

iii
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ISO 23265:2022(F)
Avant‑propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.

L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a

été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir

www.iso.org/directives).

L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion

de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,

Caractérisation biologique.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
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ISO 23265:2022(F)
Introduction

En raison de l’influence de la résistance et de la résilience de la communauté microbienne du sol aux

[1]

perturbations, il est difficile de déterminer si la communauté est en bonne santé. Pour simplifier,

un sol sain est un sol qui permet la décomposition de la matière organique (DMO) et le cycle des

éléments nutritifs. De fait, il est nécessaire de mettre en œuvre un ensemble de méthodes normalisées

d’essai pour mieux comprendre l’écologie des communautés microbiennes du sol et leur rôle dans les

[2]

fonctions et la structure du sol. Or la décomposition de la matière organique est l’une des principales

fonctions microbiologiques du sol. Il n’existe malheureusement pas de modes opératoires normalisés

pour quantifier ce processus essentiel. Ainsi, la capacité des micro‑organismes du sol à décomposer

la matière lignocellulosique prouve que la population microbienne joue un rôle actif dans la DMO et

le cycle du carbone. Une méthode normalisée d’analyse sur le terrain actuellement disponible pour

évaluer l’inhibition de la DMO du sol par des contaminants environnementaux consiste à placer des

[3]

sacs de litière dans des parcelles expérimentales. Cependant, il n’existe pas de méthode normalisée

de laboratoire pour évaluer la décomposition de la matière organique. Une méthode de laboratoire,

utilisant les mêmes principes que la méthode des sacs de litière, a été mise au point. Au lieu d’employer

de la matière organique indigène (c’est-à-dire des feuilles d’arbres, des résidus de récolte, etc.),

la méthode de laboratoire utilise un papier‑filtre courant comme matière organique normalisée pour

[4]

les essais de décomposition de la matière organique. La méthode de laboratoire a été mise en œuvre

et décrite dans plusieurs études de recherche dans le cadre d’une plus grande série d’essais portant

[5],[6]

sur l’évaluation de la santé microbienne du sol (SMS) Ces études visaient à estimer l’impact

des contaminants dans le sol de friches industrielles ou dans un sol témoin dopé avec des produits

chimiques à des fins d’évaluation des risques.

Le présent document décrit un mode opératoire pour déterminer les effets de la contamination des

sols sur la décomposition de la matière organique (papier‑filtre lignocellulosique) en suivant une

méthodologie normalisée.
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NORME INTERNATIONALE ISO 23265:2022(F)
Qualité du sol — Essai d'estimation de la décomposition de
la matière organique dans un sol contaminé

AVERTISSEMENT — Les sols contaminés peuvent contenir des mélanges inconnus de substances

chimiques toxiques, radiotoxiques, génotoxiques, mutagènes ou présentant d’autres nocivités,

ou des micro‑organismes infectieux. Les poussières ou l’évaporation de substances chimiques

pendant la manipulation et l’exposition peuvent présenter un risque pour la santé au travail.

Il convient de prendre des précautions pour éviter tout contact avec la peau.

IMPORTANT — Le fichier électronique du présent document contient des couleurs jugées utiles

à sa compréhension. Il convient, par conséquent, que les utilisateurs pensent à imprimer le

présent document en couleur.
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie un mode opératoire d’essai pour l’évaluation de la fonction d’habitat des

sols en déterminant les effets des contaminants et des substances du sol sur la décomposition de la

matière organique. Cet essai est applicable aux sols naturels et aux matériaux du sol de qualité inconnue

(par exemple, sites contaminés, sols amendés, sols après décontamination, sols agricoles ou autres sites

préoccupants). Le présent document spécifie également la façon d’utiliser cette méthode pour analyser

les substances d’essai dans des conditions tempérées.

Le présent document n’est pas applicable aux substances pour lesquelles le coefficient de partage air/

sol est supérieur à 1. Il ne s’applique pas non plus aux substances dont la pression de vapeur dépasse

300 Pa à 25 °C.

NOTE La stabilité de la substance d’essai ne peut pas être garantie tout au long de la durée de l’essai.

La méthode d’essai ne prévoit pas de contrôler la rémanence de la substance soumise à essai.

2 Références normatives

Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur

contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.

Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les

éventuels amendements).
ISO 10390, Sols, biodéchets traités et boues — Détermination du pH

ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche

(analyse élémentaire)

ISO 11265, Qualité du sol — Détermination de la conductivité électrique spécifique

ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des

sols — Méthode par tamisage et sédimentation

ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode

gravimétrique
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

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ISO 23265:2022(F)

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
contaminant
substance ou agent présent(e) dans le sol du fait de l’activité humaine
3.2
CEx
concentration efficace

concentration (fraction massique) d’un échantillon pour essai ou d’une substance d’essai qui engendre

un effet de x % sur un critère d’effet donné durant une période d’exposition déterminée

Note 1 à l'article: La CEx est exprimée en pourcentage de sol d’essai (masse sèche) par mélange de sols

(masse sèche). Lorsque des substances sont soumises à essai, la CEx est exprimée en masse de substance d’essai

par masse sèche de sol en milligrammes par kilogramme. Elle ne peut être déterminée que pour un sol dopé avec

des produits chimiques.
3.3
essai limite
traitement à une seule concentration comprenant au moins cinq réplicats pour :

a) le sol d’essai (3.8) ou la concentration la plus élevée de substance d’essai mélangée dans le sol témoin

(3.7) ; et
b) le sol témoin
3.4
CMEO
concentration minimale avec effet observé

concentration la plus faible d’une substance d’essai ayant un effet statistiquement significatif

(probabilité p < 0,05)

Note 1 à l'article: Dans cet essai, la CMEO est exprimée en masse de substance d’essai par masse sèche du sol à

soumettre à essai. Il convient, en général, que toutes les concentrations d’essai supérieures à la CMEO présentent

un effet statistiquement différent du témoin. Elle ne peut être déterminée que pour un sol dopé avec des produits

chimiques.
3.5
CSEO
concentration maximale sans effet observé

concentration la plus élevée d’une substance d’essai, immédiatement inférieure à la CMEO (3.4),

à laquelle aucun effet n’est observé

Note 1 à l'article: Dans cet essai, la concentration correspondant à la CSEO n’a aucun effet statistiquement

significatif (probabilité p > 0,05) durant une période d’exposition déterminée, en comparaison avec le témoin.

Elle ne peut être déterminée que pour un sol dopé avec des produits chimiques.
3.6
sol de référence

sol non contaminé ayant des propriétés pédologiques comparables (concentrations en éléments

nutritifs, pH, teneur en carbone organique et texture) à celles du sol d’essai (3.8) étudié

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ISO 23265:2022(F)
3.7
sol témoin

sol de référence (3.6) utilisé comme témoin par rapport au sol d’essai (3.8) dopé avec des substances

chimiques, qui satisfait aux critères de validité

Note 1 à l'article: Dans le cas d’un sol témoin, il est recommandé de prouver son adéquation à l’utilisation prévue

en démontrant sa capacité à répondre aux critères de validité de l’essai avant l’essai définitif.

Note 2 à l'article: Le sol témoin ne peut pas être un sol artificiel (SA), car il est connu que ce type de sol ne remplit

pas les critères de validité de l’essai.
3.8
sol d’essai

échantillon de sol prélevé sur le terrain ou de sol dopé avec des produits chimiques, dont la toxicité doit

être évaluée vis-à-vis des communautés microbiennes du sol
4 Principe

La capacité de micro‑organismes du sol à dégrader un papier‑filtre en cellulose (c’est‑à‑dire la matière

organique) dans le sol d’essai (c’est‑à‑dire le sol contaminé) est comparée à celle de ce même papier‑filtre

en cellulose dans un sol témoin ou de référence au cours d’une période d’exposition. Grâce à cette

méthode, les effets des substances individuelles peuvent être évalués à l’aide d’un sol naturel normalisé

dans le cadre d’essais de dopage avec des produits chimiques. Dans le cas de sols contaminés, les effets

sont déterminés dans le sol d’essai et dans un sol témoin. Cette méthode de laboratoire utilise des

disques de papier‑filtre stérilisés comme source de matière organique. La décomposition de la matière

organique est estimée en s’appuyant sur la perte de masse des disques de papier‑filtre disposés entre

deux couches de sol d’essai. Si le contaminant altère de quelque manière que ce soit la capacité des

micro‑organismes du sol à dégrader le papier‑filtre en cellulose par les enzymes du cycle du carbone,

une différence de taux de dégradation est observée entre le sol d’essai et les traitements témoins. Le

papier‑filtre a été choisi comme matière organique d’essai, car il est disponible partout, qu’il constitue

un milieu plus normalisé, qu’il permet d’obtenir une meilleure reproductibilité interlaboratoires, qu’il

peut être stérilisé (par exemple, à l’autoclave) et peut être facilement différencié de la matière organique

[4],[9]
native du sol .

L’essai implique de peser au préalable les disques de papier‑filtre, d’ajouter 10 g de sol (masse sèche)

dans un tube à centrifuger stérile de 50 ml, de placer le papier‑filtre sur le sol, d’ajouter 10 g de sol

supplémentaires (masse sèche) sur le papier‑filtre, de fermer le tube sans serrer et de l’exposer à une

température constante [par exemple, à (20 ± 2) °C)].

Dans le cas d’un plan d’expérience visant à comparer le sol témoin au sol contaminé, l’essai est

effectué avec au moins cinq réplicats pour chaque traitement et au moins cinq points de prélèvement.

La période d’exposition dépend de la vitesse de dégradation du papier‑filtre, la durée de l’essai est donc

liée à la perte de masse du papier‑filtre dans le traitement témoin. Une perte de masse du témoin de

30 % correspond au moment le plus précoce auquel l’essai est considéré comme étant terminé, mais

une dégradation de 40 % à 70 % constitue la plage idéale. Au-delà de cette plage, la probabilité que

le papier‑filtre décomposé soit difficile à nettoyer et à récupérer en vue des mesurages de perte de

masse augmente. L’intervalle de temps entre les points d’échantillonnage dépend du degré d’activité

microbienne dans le sol témoin ou de référence.

Dans le cas d’un sol dopé avec un contaminant, il est conseillé d’effectuer un essai préliminaire en

utilisant une large gamme de concentrations de contaminant. Il est recommandé d’utiliser au moins

5 concentrations d’essai pour la gamme de dilutions définitive du produit chimique. La durée de l’essai

est influencée par le témoin et le temps nécessaire pour observer une relation concentration‑réponse

distincte. D’expérience, il convient que la durée de l’essai ne dépasse pas 140 jours.

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ISO 23265:2022(F)
5 Réactifs et matériel
5.1 Réactifs
5.1.1 Eau déminéralisée (ou distillée) stérile
5.2 Matériel
5.2.1 Tubes à centrifuger en plastique de 50 ml (stériles)

5.2.2 Papier‑filtre en cellulose (stérile) ; rétention des particules ≥ 11 µm jusqu’à 25 µm ;

épaisseur ~180 µm ; taux de cendres ~0,06 %
5.2.3 Perforateur (25 mm de diamètre)
5.2.4 Pinces pour papier‑filtre (stériles)
5.2.5 Boîtes de Petri (en verre ou en plastique)
5.2.6 Petits pinceaux (à poils souples)
5.2.7 Grandes coupelles de pesée en plastique ou autres récipients
5.2.8 Petites coupelles de pesée en aluminium ou autres récipients
6 Sol
6.1 Sol prélevé sur le terrain

Les sols prélevés sur le terrain, les sols contaminés et les sols témoins (c’est-à-dire, de référence) peuvent

être obtenus à partir de sites industriels ou agricoles, de forêts boréales ou d’autres sites contaminés

préoccupants. Dans le cas de sol non perturbé, l’horizon organique est utilisé. Le sol est expédié au

laboratoire et conservé à 4 °C.

Tous les sols prélevés sur le terrain doivent passer au travers d’un tamis de 2 mm. Si nécessaire, les

sols peuvent être légèrement séchés à l’air libre pour faciliter le tamisage ; cependant, il convient, dans

la mesure du possible, d’éviter le séchage à l’air libre. Après tamisage, le sol est homogénéisé, puis

de nouveau conservé à 4 °C. À cette fin, il convient d’utiliser des récipients qui limitent les pertes de

contaminants par volatilisation et sorption sur les parois. Pour cet essai, les durées de conservation

peuvent varier, tant que l’activité microbienne persiste de manière évidente dans le sol témoin ou de

référence en satisfaisant aux critères de validité de l’essai. Le pH du sol, la conductivité, la teneur en eau

et la capacité de rétention d’eau (CRE) sont déterminés conformément aux méthodes ci-dessous.

Pour l’interprétation des résultats de l’essai, les caractéristiques suivantes doivent être déterminées

pour chaque échantillon de sol prélevé sur le terrain :
a) pH conformément à l’ISO 10390 ;
b) texture (sable, loam, limon) conformément à l’ISO 11277 ;
c) teneur en eau conformément à l’ISO 11465 ;
d) carbone organique conformément à l’ISO 10694 ;
e) conductivité électrique spécifique conformément à l’ISO 11265 ;
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f) capacité de rétention d’eau conformément à l’Annexe A.
6.2 Sol témoin

Le sol témoin peut être le sol de référence dans le cadre de l’évaluation d’un sol contaminé. Il convient de

manipuler, de transporter et de caractériser les sols de référence provenant d’une zone non contaminée

proche d’un site contaminé d’une façon analogue à celle des sols contaminés soumis à essai. Dans le cas

d’une étude de sols dopés avec des produits chimiques, un sol témoin connu est utilisé.

7 Appareillage
Utiliser du matériel de laboratoire et l’appareillage suivant.
7.1 Balance à chargement par le haut

7.2 Appareillage permettant de déterminer la masse sèche du substrat, conformément à

l’ISO 11465 (étuve de séchage, dessiccateur, balance analytique)
7.3 Appareil photo numérique (en option)
7.4 Chambre de dessiccation
7.5 pH‑mètre
7.6 Balance analytique, capable de peser avec une exactitude de ±0,000 1 g
7.7 Étuve de séchage, réglée à (105 ± 5) °C
7.8 Environnement d’essai

7.8.1 Pièce permettant de maintenir un environnement stérile, paillasse avec bec Bunsen ou

poste de sécurité biologique (facultatif)
7.8.2 Enceinte, capable de maintenir une température constante
8 Mode opératoire
8.1 Plan d’expérience
8.1.1 Généralités

Un échantillon d’un sol contaminé prélevé sur le terrain à une concentration unique ou un échantillon

de sol dopé avec un produit chimique à plusieurs concentrations est comparé avec un sol témoin ou de

référence approprié. Différents plans d’expérience sont décrits en 8.1.2 et en 8.1.3. Cependant, quel que

soit le plan d’expérience choisi, chaque concentration d’essai et chaque sol témoin associé sont répliqués

cinq fois pour permettre un échantillonnage échelonné dans le temps tout au long de l’étude. Un disque

de papier‑filtre (c’est‑à‑dire, la matière organique) est ajouté au sol d’essai en vue de déterminer la perte

de masse du papier‑filtre au cours d’une période d’exposition.
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8.1.2 Plan d’expérience pour un sol dopé avec un produit chimique
8.1.2.1 Essai préliminaire

Il est recommandé d’effectuer un essai préliminaire pour déterminer la gamme de concentrations qui

encadre le niveau d’effet d’une nouvelle substance d’essai (par exemple, 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/

kg, 100 mg/kg et 1 000 mg/kg). Un essai préliminaire doit être effectué en utilisant le même lot de

sol que pour l’essai définitif prévu. L’essai peut être effectué avec un nombre de réplicats réduit (par

exemple, 2 ou 3 réplicats) par rapport à l’essai définitif. La durée de l’essai préliminaire est identique

à celle de l’essai définitif. Lors de l’essai définitif, il convient de choisir de préférence la gamme de

concentrations de sorte à inclure des concentrations qui couvrent une large gamme d’effets, y compris

une faible concentration qui n’a aucun effet indésirable (semblable au traitement « témoin négatif ») et

une concentration élevée qui provoque des effets importants. Dans l’idéal, les concentrations choisies

englobent également les effets intermédiaires pour mieux estimer la concentration efficace CE50.

En l’absence d’effets observés pendant l’essai préliminaire sur un échantillon contenant exclusivement

du sol contaminé ou un sol dopé avec un produit chimique, l’essai définitif peut être conçu comme

un essai limite (par exemple, sol contaminé non dilué prélevé sur le terrain) ou une concentration

en produit chimique élevée spécifique (par exemple, 1 000 milligrammes de substance d’essai par

kilogramme de sol d’essai).
8.1.2.2 Sol dopé avec un produit chimique

Dans le cas où des substances chimiques sont incorporées dans le sol à différentes concentrations,

l’essai peut être conçu pour les deux scénarios suivants :

a) l’approche CEx doit utiliser au moins 5 concentrations en plus du ou des traitements témoins, mais il

est recommandé d’augmenter leur nombre (c’est‑à‑dire ≥ 10 concentrations en plus des témoins)

pour augmenter la probabilité d’encadrer chaque critère d’effet visé conformément à l’ISO 10694.

Le facteur de dilution peut être variable ; plus petit à des concentrations plus faibles, plus grand

à des concentrations élevées. Il est recommandé d’utiliser au moins cinq réplicats pour chaque

traitement en plus des témoins ;

b) l’approche CSEO, quant à elle, doit utiliser une série géométrique d’au moins cinq concentrations

conformément à l’ISO 10694. Il est recommandé d’utiliser cinq réplicats pour chaque traitement en

plus de huit témoins.

Quel que soit le plan d’expérience choisi, les concentrations d’essai doivent être espacées par un facteur

de dilution n’excédant pas 2.

Un essai limite peut suffire si les résultats de l’essai préliminaire ne révèlent aucun effet toxique.

Cela implique une seule
...

Questions, Comments and Discussion

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