ISO 17512-2:2011
(Main)Soil quality — Avoidance test for determining the quality of soils and effects of chemicals on behaviour — Part 2: Test with collembolans (Folsomia candida)
Soil quality — Avoidance test for determining the quality of soils and effects of chemicals on behaviour — Part 2: Test with collembolans (Folsomia candida)
ISO 17512-2:2011 specifies a rapid screening method for evaluating the habitat function of soils based on the avoidance behaviour of springtails. The test is a rapid method that reflects the bioavailability of contaminants in natural soils and substances spiked into soils to Folsomia candida. In both cases, it is possible to establish a dose-response-relationship. The avoidance behaviour of the springtails is the measurement endpoint of the test. This test is not intended to replace the Collembola reproduction test.
Qualité du sol — Essai d'évitement pour contrôler la qualité des sols et les effets des produits chimiques sur le comportement — Partie 2: Essai avec des collemboles (Folsomia candida)
La présente partie de l'ISO 17512 spécifie une méthode de criblage rapide permettant d'évaluer la fonction d'habitat des sols sur la base du comportement d'évitement des collemboles. Cet essai correspond à une méthode rapide qui reflète la biodisponibilité des polluants dans les sols naturels et des substances introduites dans le sol vis-à-vis de Folsomia candida. Dans les deux cas, il est possible d'établir une relation dose-réponse. Le comportement d'évitement des collemboles constitue le critère d'effet de cet essai. Cet essai n'est pas destiné à remplacer l'essai de reproduction des collemboles.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 17512-2
First edition
2011-10-01
Soil quality — Avoidance test for
determining the quality of soils and
effects of chemicals on behaviour —
Part 2:
Test with collembolans (Folsomia candida)
Qualité du sol — Essai d’évitement pour contrôler la qualité des sols et
les effets des produits chimiques sur le comportement —
Partie 2: Essai avec des collemboles (Folsomia candida)
Reference number
ISO 17512-2:2011(E)
©
ISO 2011
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ISO 17512-2:2011(E)
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Published in Switzerland
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ISO 17512-2:2011(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents and materials . 2
6 Apparatus . 3
7 Procedure . 4
7.1 Appropriate concentration/dilution range . 4
7.2 Testing of soils . 4
7.3 Reference substance . 4
7.4 Validity criteria . 5
8 Calculation and expression of results . 5
8.1 General . 5
8.2 Calculation of the percentage of avoidance . 5
8.3 NOEC/LOEC calculation . 5
8.4 EC calculation . 6
x
9 Test report . 6
Annex A (informative) Techniques for rearing and breeding of Collembola . 7
Annex B (informative) Test chambers . 9
Annex C (normative) Testing of chemicals in the avoidance test .10
Annex D (normative) Determination of the water-holding capacity .12
Bibliography .13
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ISO 17512-2:2011(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International
Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 17512-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological methods.
ISO 17512 consists of the following parts, under the general title Soil quality — Avoidance test for determining
the quality of soils and effects of chemicals on behaviour:
— Part 1: Test with earthworms (Eisenia fetida and Eisenia andrei)
— Part 2: Test with collembolans (Folsomia candida)
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ISO 17512-2:2011(E)
Introduction
The use of the avoidance behaviour of soil invertebrates as an indicator of unfavourable conditions allows
a preliminary assessment of contaminated soils in a short period of time, with a high degree of sensitivity.
Being rapid, cost-effective and ecologically relevant, the avoidance tests with earthworms were proposed to
complement conventional chemical analysis. Supporting the results obtained in the chronic tests, the avoidance
bioassays can be used as a first screening tool in the assessment of the habitat function of soils. Considering
the fact that the avoidance response of soil invertebrates differs between species due to their distinct sensitivity
to contaminants and modes of exposure, it is recommended to standardize a second rapid cost-effective and
ecologically relevant avoidance bioassay.
Springtails have shown a distinct sensitivity towards several contaminants when compared with earthworms,
[1][2]
complementing the information obtained in the avoidance tests with earthworms . Until now, the species
Folsomia candida has been the most commonly used collembolan test species due to a great facility to keep
[3]
laboratory cultures and due to their high locomotor ability . Folsomia candida is considered to be a hemi-
edaphic species, meaning that it lives mainly in the soil. Furthermore, this species is already used in ISO 11267.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 17512-2:2011(E)
Soil quality — Avoidance test for determining the quality
of soils and effects of chemicals on behaviour —
Part 2:
Test with collembolans (Folsomia candida)
1 Scope
This part of ISO 17512 specifies a rapid screening method for evaluating the habitat function of soils based on
the avoidance behaviour of springtails.
The test is a rapid method that reflects the bioavailability of contaminants in natural soils and substances
spiked into soils to Folsomia candida. In both cases, it is possible to establish a dose-response-relationship.
The avoidance behaviour of the springtails is the measurement endpoint of the test. This test is not intended to
replace the Collembola reproduction test.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document
(including any amendments) applies.
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 11267:1999, Soil quality — Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants
ISO 11268-2:1998, Soil quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) — Part 2: Determination
of effects on reproduction
ISO 11269-2, Soil quality — Determination of the effects of pollutants on soil flora — Part 2: Effects of
contaminated soils on the emergence and early growth of higher plants
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric method
ISO 15799, Soil quality — Guidance on the ecotoxicological characterization of soils and soil materials
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
avoidance behaviour
tendency (of an organism) to avoid the test soil while preferring the control soil
[ISO 17512-1:2008]
3.2
test soil
either a natural or an artificial clean soil that is spiked with the test substance or a contaminated natural soil
(a site soil)
3.3
control soil
natural or artificial uncontaminated soil
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ISO 17512-2:2011(E)
See 5.3.
3.4
limited habitat function
habitat function is limited if, on average, > 70 % of springtails are found in the control soil (indication of an
impact on behaviour) after they were allowed to choose between the control soil and tested soil
3.5
effective concentration
EC
x
concentration at which a specific effect is detected [where x is a percentage (10, 25, 50) of this effect; e.g. avoidance]
NOTE In this part of ISO 17512-2, an EC means the concentration of a test substance, or dilution of a contaminated
50
test soil, that is estimated to cause an avoidance response of 50 %.
EXAMPLE An avoidance of 50 % occurs when the number of springtails in the test soil is 50 % of the number that
should be there in the case of no avoidance: no avoidance (control soil = 10 individuals; test soil = 10 individuals); 50 %
avoidance (control soil = 15 individuals; test soil = 5 individuals).
3.6
lowest observed effect concentration
LOEC
lowest tested concentration of a test substance, or dilution of a contaminated test soil, that is observed to cause
a statistically significant avoidance response (p ≤ 0,05)
NOTE 1 In the case of a test substance, the concentration is expressed as mass of the test substance per dry mass of test
substrate; in the case of a contaminated test soil, the concentration is expressed as the percentage dilution of the test soil.
NOTE 2 All tested concentrations/dilutions above the LOEC should have a harmful effect equal to or greater than those
observed at the LOEC. When this condition is not observed, a full explanation should be given for how the LOEC (and
hence the NOEC) has been selected.
3.7
no observed effect concentration
NOEC
test concentration/dilution tested immediately below the LOEC, which causes a not statistically significant
avoidance response (p > 0,05)
4 Principle
Springtails (Folsomia candida) are exposed at the same time to the control soil and the test soil. These soils are
filled into the two sections of the same vessel. After an incubation period of two days, the number of springtails
is determined in each section of the vessels.
5 Reagents and materials
5.1 Biological material, only springtails of the species Folsomia candida (Willem) (see A.2.6) coming from
synchronized cultures should be used.
NOTE Typically, in this test springtails can be used when they are 10 d to 12 d old (or alternatively adult, e.g. 20 d
to 22 d old).
5.2 Test substrate, in the case of a natural soil, the substrate to be tested should be sieved (2 mm) and
moisture-adjusted to about 40 % to 60 % of the maximum water-holding capacity. If standing water or free water
appears when the soil is compressed before achieving the desired percentage of maximum WHC, a lower
percentage might be used. The optimum water content is achieved if there is no standing water or free water
appearing when the soil is compressed.
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ISO 17512-2:2011(E)
NOTE For highly silty and loamy soils, it can be difficult to get the necessary amount of soil sieved to ≤ 2 mm with
an acceptable expenditure of work. The holes of the sieves might plug up within several minutes. Frequent cleaning is
necessary. In this case, it is acceptable to sieve the amount of soil needed for the test to ≤ 5 mm.
Determine the water content and the pH in the presence of 1 mol/l KCl, in accordance with ISO 11465 and
ISO 10390, respectively, immediately before the start of the test. In addition, the maximum water-holding
capacity shall be determined according to Annex D.
If testing a substance, a different procedure should be followed (see Annex C).
5.3 Control soil, two choices are possible (see also ISO 15799). Either a) a reference soil or b) a standard
soil that allows the presence of springtails.
a) If reference soils from uncontaminated areas near a contaminated site are available, they should be treated
and characterized like the test soils. If a toxic contamination or unusual soil properties cannot be ruled out,
standard control soils should be preferred.
b) For testing the effects of substances mixed into soil or making dilutions of the test soil, standard soils (e.g.
LUFA 2.2) shall be used as the test substrate. The properties of the field-collected standard soil shall be reported.
The substrate called artificial soil can be used as a standard soil and has the following composition:
Percentage expressed
on dry-mass basis
— Sphagnum peat finely ground and with no visible plant remains 10 %
— Kaolinite clay containing not less than 30 % Kaolinite 20 %
— Industrial quartz sand (dominant fine sand with more than 50 % of particle 69 %
size 0,05 mm to 0,2 mm)
Approximately 0,3 % to 1,0 % calcium carbonate (CaCO, pulverized, analytical grade) are necessary to get a
3
pH of 6,0 ± 0,5.
Natural soil should be sieved and the water content should be adjusted according to 5.2.
5.4 Reference substance, having Phenmedipham as the only active ingredient.
6 Apparatus
Usual laboratory equipment and the following.
6.1 Containers (see Annex B).
2
Cylindrical containers of capacity 200 ml to 300 ml with a cross-sectional area of about 50 cm, such that a
depth of 3 cm to 4 cm of soil is achieved.
Test containers shall permit gaseous exchange between the medium and the atmosphere and access of
light (e.g. by means of a perforated transparent cover), and shall have provisions to prevent springtails from
escaping (e.g. by using a tape to fix the cover). To avoid lateral effects of light, test vessels should be made of
opaque material, otherwise they should be wrapped with aluminium foil.
NOTE Due to the short test period and the proportionally large volume of soil in the vessels (considering the small
amount of soil needed by the springtails), a reduction of the chemical concentration in the soil resulting from sorption to
the vessel walls is negligible. Therefore, plastic vessels can be used, although, when available, the use of inert material
(e.g. glass or stainless steel) is preferred.
6.2 Divider, made of plastic or thin sheets of metal. It shall divide the test containers vertically into two
identical sections.
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ISO 17512-2:2011(E)
6.3 Equipment for measuring the water content of a substrate (in accordance with ISO 11465).
6.4 Apparatus, for measuring the pH of the substrate.
6.5 Exhaustor, to transfer the springtails (see A.3).
6.6 Test environment.
6.6.1 Enclosure or environmental chamber, capable of being maintained at (20 ± 2) °C.
6.6.2 Light source, capable of delivering a constant light intensity of 400 lx to 800 lx on the containers at a
controlled light/dark cycle of between 12 h:12 h and 16 h:8 h.
7 Procedure
7.1 Appropriate concentration/dilution range
The avoidance test is designed to detect sublethal effects. Therefore, the test is invalid if more than 20 % of
the total number of springtails are dead or missing at the end of the test (see 7.4). In order to avoid mortality,
a range-finding test should be performed in those cases when testing a substance or a dilution gradient of
contaminated natural soil.
7.2 Testing of soils
At the beginning of the test, the containers (6.1) are divided into two equal sections by means of a vertically
introduced divider (6.2). Vessels are filled with sieved soil up to a height of 3 cm to 4 cm (±30 g wet mass per
side; the soil is freshly moistened and should not be pressed). One half of the vessel is filled with test soil
(section A), the other half is filled with control soil (section B). Then the divider is removed and 20 springtails
are placed on top of the line separating the two soils on each test vessel. The containers are covered according
to 6.1 and placed into the environmental chamber or in the enclosure (6.6.1).
No feeding of the animals is required during the test.
The test runs with five replicates. To facilitate checking of the pH and humidity of the test substrates at the end of
the test period, the use of an additional container without animals for each tested combination is recommended.
To obtain a more precise quantification of the behavioural effect, a dilution series may be prepared. For dilution
of the contaminated soil, the control soil should be used.
At the end of the test period (48 h) the control and test soils in each vessel are separated by inserting the
divider. It shall be inserted before the test units are moved from the environmental chamber. One section of the
test container is emptied (alternately the control and the treated soil sections to avoid systematic errors) into a
small vessel followed by the removal of the divider. Once separated, both soils are flooded with water and, after
the addition of a few drops of ink and gentle stirring with a spatula, the animals floating on the water surface
are counted. Missing springtails are considered as dead organisms.
NOTE Although some studies had shown that Folsomia candida can have an avoidance reaction before 48 h of exposure
[4][5][6]
for some substances , the use of 48 h as the test period for avoidance tests with springtails is still recommended.
7.3 Reference substance
Substances having Phenmedipham as the only active ingredient (5.4) are recommended as reference toxicants
for this test to be used in a positive control treatment. Springtails can detect and avoid sublethal concentrations
[4][7]
that adversely affect reproduction . A significant avoidance behaviour response (see Clause 8) should be
obtained in a range of 5 mg to 20 mg reference toxicant (5.4) per kilogram of soil measured on the dry-mass
[2]
basis when artificial soil is used .
4 © ISO 2011 – All rights reserved
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ISO 17512-2:2011(E)
Alternatively, boric acid can be used as a reference substance. A significant avoidance-behaviour response
(see Clause 8) should be obtained in a range of 700 mg to 2 800 mg of boric acid per kilogram of soil measu
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 17512-2
Première édition
2011-10-01
Qualité du sol — Essai d'évitement
pour contrôler la qualité des sols et
les effets des produits chimiques sur
le comportement —
Partie 2:
Essai avec des collemboles (Folsomia
candida)
Soil quality — Avoidance test for determining the quality of soils and
effects of chemicals on behaviour —
Part 2: Test with collembolans (Folsomia candida)
Numéro de référence
ISO 17512-2:2011(F)
©
ISO 2011
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ISO 17512-2:2011(F)
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y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
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CH-1214 Vernier, Genève
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Publié en Suisse
ii © ISO 2011 – Tous droits réservés
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ISO 17512-2:2011(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs et matériels . 3
6 Appareillage . 4
7 Mode opératoire. 5
7.1 Gamme de concentrations/dilutions adaptée . 5
7.2 Essais sur sols . 5
7.3 Substance de référence . 5
7.4 Critères de validité . 6
8 Calcul et expression des résultats . 6
8.1 Généralités . 6
8.2 Calcul du pourcentage d’évitement . 6
8.3 Calcul de la CSEO/CMEO. 6
8.4 Calcul de CE .
x 7
9 Rapport d’essai . 7
Annexe A (informative) Techniques d’élevage des collemboles . 8
Annexe B (informative) Chambres d’essai .10
Annexe C (normative) Application des essais d’évitement aux produits chimiques .11
Annexe D (normative) Détermination de la capacité de rétention d’eau .14
Bibliographie .15
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ISO 17512-2:2011(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO, participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/
IEC, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques consiste à élaborer les Normes internationales. Les projets
de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres
pour vote. Leur publication comme Norme internationale requiert l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 17512-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique.
L’ISO 17512 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité du sol — Essai
d’évitement pour contrôler la qualité des sols et les effets des produits chimiques sur le comportement:
— Partie 1: Essai avec des vers de terre (Eisenia fetida et Eisenia andrei)
— Partie 2: Essai avec des collemboles (Folsomia candida)
iv © ISO 2011 – Tous droits réservés
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ISO 17512-2:2011(F)
Introduction
L’utilisation du comportement d’évitement des invertébrés du sol comme indicateur de conditions
défavorables permet une évaluation préliminaire des sols pollués sur une courte période, avec
un haut niveau de sensibilité. Rapides, économiques et pertinents du point de vue écologique, les
essais d’évitement avec des vers de terre ont été proposés en complément d’une analyse chimique
conventionnelle. Les essais biologiques d’évitement peuvent être utilisés à l’appui des résultats obtenus
lors des essais chroniques et servir de premier outil de criblage pour l’évaluation de la fonction d’habitat
des sols. Compte tenu du fait que la réaction d’évitement des invertébrés du sol diffère entre les espèces
en raison de leur sensibilité distincte aux polluants et aux modes d’exposition, il est recommandé de
normaliser un second essai biologique d’évitement rapide, économique et écologiquement pertinent.
Comparés aux vers de terre, les collemboles présentent une sensibilité distincte vis-à-vis de plusieurs
polluants, et permettent de compléter les informations obtenues lors des essais d’évitement avec des
[1][2]
vers de terre . Jusqu’à présent, Folsomia candida a été l’espèce d’essai de collembole la plus souvent
utilisée en raison de la grande facilité de conservation des cultures en laboratoire et de leur haute
[3]
capacité locomotrice . Folsomia candida est considérée comme une espèce hémi-édaphique, ce qui
signifie qu’elle vit principalement dans le sol. Par ailleurs, cette espèce est déjà utilisée dans l’ISO 11267.
© ISO 2011 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 17512-2:2011(F)
Qualité du sol — Essai d'évitement pour contrôler la
qualité des sols et les effets des produits chimiques sur le
comportement —
Partie 2:
Essai avec des collemboles (Folsomia candida)
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 17512 spécifie une méthode de criblage rapide permettant d’évaluer la
fonction d’habitat des sols sur la base du comportement d’évitement des collemboles.
Cet essai correspond à une méthode rapide qui reflète la biodisponibilité des polluants dans les sols
naturels et des substances introduites dans le sol vis-à-vis de Folsomia candida. Dans les deux cas, il est
possible d’établir une relation dose-réponse. Le comportement d’évitement des collemboles constitue le
critère d’effet de cet essai. Cet essai n’est pas destiné à remplacer l’essai de reproduction des collemboles.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour
les références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition
du document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 11267:1999, Qualité du sol — Inhibition de la reproduction de Collembola (Folsomia candida) par des
contaminants du sol
ISO 11268-2:1998, Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre (Eisenia fetida) —
Partie 2: Détermination des effets sur la reproduction
ISO 11269-2, Qualité du sol — Détermination des effets des polluants sur la flore du sol — Partie 2: Effets
des sols contaminés sur l'émergence et la croissance des végétaux supérieurs
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
ISO 15799, Qualité du sol — Lignes directrices relatives à la caractérisation écotoxicologique des sols et des
matériaux du sol
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
comportement d’évitement
tendance (d’un organisme) à éviter le sol soumis à essai en faveur du sol témoin
[SOURCE: ISO 17512-1:2008]
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ISO 17512-2:2011(F)
3.2
sol soumis à essai
sol propre, naturel ou artificiel, dans lequel la substance d’essai ou un sol naturel pollué (sol du site) est
introduit
3.3
sol témoin
sol non pollué, naturel ou artificiel
3.4
fonction d’habitat limitée
la fonction d’habitat est limitée si, en moyenne,> 70 % des collemboles sont trouvés dans le sol témoin
(indication d’un effet sur le comportement) après que le choix entre le sol témoin et le sol soumis à essai
leur ait été laissé
3.5
concentration efficace
CE
x
concentration à laquelle est décelé un effet spécifique [où x est un pourcentage (10, 25, 50) de cet effet;
par exemple, évitement]
Note 1 à l'article: Dans la présente partie de l’ISO 17512-2, CE désigne la concentration d’une substance
50
d’essai, ou une dilution d’un sol pollué soumis à essai, qui est considérée comme étant à l’origine d’une réaction
d’évitement de 50 %.
EXEMPLE Un évitement de 50 % se produit lorsque le nombre de collemboles dans le sol soumis à
essai représente 50 % du nombre qu’il convient d’avoir en cas d’absence d’évitement: aucun évitement
(sol témoin =10 individus; sol soumis à essai = 10 individus); 50 % d’évitement (sol témoin = 15 individus;
sol soumis à essai = 5 individus).
3.6
concentration minimale avec effet observé
CMEO
plus faible concentration soumise à essai d’une substance d’essai, ou dilution d’un sol pollué soumis à
essai, à laquelle est observée une réaction d’évitement statistiquement significative (p ≤ 0,05)
Note 1 à l'article: Dans le cas d’une substance d’essai, la concentration est exprimée en masse de substance d’essai
par masse sèche de substrat d’essai; dans le cas d’un sol pollué soumis à essai, elle est exprimée en pourcentage
de dilution du sol soumis à essai.
Note 2 à l'article: Il convient que toutes les concentrations/dilutions soumises à essai supérieures à la CMEO aient
un effet nocif supérieur ou égal à ceux observés à la CMEO. Lorsque cette condition n’est pas satisfaite, il est
recommandé d’expliquer dans le détail la façon dont la CMEO (et par conséquent la CSEO) a été sélectionnée.
3.7
concentration sans effet observé
CSEO
concentration d’essai/dilution soumise à essai juste au-dessous de la CMEO, qui entraîne une réaction
d’évitement statistiquement non significative (p > 0,05)
4 Principe
Des collemboles (Folsomia candida) sont exposés simultanément au sol témoin et au sol soumis à essai.
Ces sols sont placés dans les deux compartiments du même récipient. Après une période d’incubation de
deux jours, le nombre de collemboles présents dans chaque compartiment des récipients est déterminé.
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5 Réactifs et matériels
5.1 Matériel biologique. Il convient d’utiliser uniquement des collemboles de l’espèce
Folsomia candida (Willem) (voir A.2.6) issue de cultures synchronisées.
NOTE En général, des collemboles âgés de 10 jours à 12 jours peuvent être utilisés pour cet essai (ou sinon
des collemboles adultes, par exemple âgés de 20 jours à 22 jours).
5.2 Substrat d’essai. Dans le cas d’un sol naturel, il convient de tamiser (2 mm) le substrat à soumettre
à essai et d’ajuster le taux d’humidité pour atteindre environ 40 % à 60 % de la capacité maximale de
rétention d’eau. S’il n’y a plus d’eau visible ou d’eau qui apparaît lorsque le sol est comprimé avant
d’atteindre le pourcentage souhaité de CRE maximale, un pourcentage moins élevé peut être utilisé. La
teneur en eau optimale est obtenue lorsqu’il n’y a plus d’eau visible ou d’eau qui apparaît quand le sol est
comprimé.
NOTE Dans le cas de sols très limoneux ou argileux, il est parfois difficile d’obtenir une quantité suffisante
de sol tamisé à une valeur ≤ 2 mm pour un temps de travail acceptable. Les mailles du tamis peuvent se boucher
en quelques minutes. Un nettoyage fréquent est nécessaire. Dans ce cas, il est acceptable de tamiser la quantité
de sol requise pour l’essai à une valeur ≤ 5 mm.
Immédiatement avant le début de l’essai, déterminer la teneur en eau et le pH en présence de KCl
à 1 mol/l, conformément respectivement à l’ISO 11465 et à l’ISO 10390. De plus, la capacité maximale de
rétention d’eau doit être déterminée conformément à l’Annexe D.
Si l’essai porte sur une substance, il convient d’appliquer un autre mode opératoire (voir l’Annexe C).
5.3 Sol témoin. Deux choix sont possibles (voir également l’ISO 15799): a) soit un sol de référence, b)
soit un sol standard qui permet la présence de collemboles.
a) Si des sols de référence issus de zones non polluées proches d’un site pollué sont disponibles,
il convient de les traiter et de les caractériser comme les sols soumis à essai. S’il est impossible
d’exclure une pollution toxique ou des propriétés inhabituelles du sol, il est recommandé de
privilégier des sols témoins standards.
b) Pour les essais portant sur les effets de substances mélangées dans le sol ou pour les dilutions du
sol soumis à essai, des sols standards (LUFA 2.2, par exemple) doivent être utilisés en tant que
substrat d’essai. Les propriétés d’un sol standard prélevé sur le terrain doivent être consignées
dans le rapport d’essai.
Le substrat qualifié de sol artificiel peut être utilisé en tant que sol standard et présente la composition
suivante:
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Pourcentage exprimé sur
la base de la masse sèche
— Tourbe de sphaigne finement broyée et sans résidus végétaux apparents 10 %
— Argile kaolinique contenant au moins 30 % de kaolinite 20 %
— Sable de quartz industriel (principalement du sable fin dont plus de 50 % 69 %
des particules ont une taille comprise entre 0,05 mm et 0,2 mm)
Ajouter environ 0,3 % à 1,0 % de carbonate de calcium (CaCO , pulvérisé, de qualité analytique) pour
3
obtenir un pH de 6,0 ± 0,5.
Il convient de tamiser le sol naturel et d’ajuster la teneur en eau conformément à 5.2.
5.4 Substance de référence, dont le seul ingrédient actif est le phenmédiphame.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire, et ce qui suit.
6.1 Récipients (voir l’Annexe B).
Récipients cylindriques de 200 ml à 300 ml de contenance, dont la section représente une surface
2
d’environ 50 cm , permettant ainsi d’atteindre une profondeur de sol de 3 cm à 4 cm.
Les récipients d’essai doivent permettre l’échange gazeux entre le milieu et l’atmosphère ainsi que le
passage de la lumière (par exemple, au moyen d’un couvercle transparent perforé) et doivent être munis
de dispositifs empêchant les collemboles de s’échapper (par exemple, en fixant le couvercle à l’aide de
ruban adhésif). Pour éviter les effets latéraux de la lumière, il convient que les récipients d’essai soient
constitués d’un matériau opaque; sinon, il est recommandé de les envelopper dans un film d’aluminium.
NOTE En raison de la courte durée de l’essai et, proportionnellement, du volume important de sol dans les
récipients (compte tenu de la faible quantité de sol requise par les collemboles), la diminution de la concentration
en produit chimique dans le sol due à la sorption par les parois du récipient est négligeable. Par conséquent, des
récipients en plastique peuvent être utilisés, bien que l’emploi d’un matériau inerte (verre ou acier inoxydable,
par exemple) soit préféré lorsque ce type de matériau est disponible.
6.2 Cloison, en plastique ou en fine tôle métallique. Elle doit diviser verticalement les récipients
d’essai en deux compartiments identiques.
6.3 Appareil de mesure de la teneur en eau d’un substrat (conformément à l’ISO 11465).
6.4 Appareil de mesure du pH du substrat.
6.5 Appareil d’aspiration, pour transférer les collemboles (voir A.3).
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6.6 Environnement d’essai.
6.6.1 Enceinte ou chambre climatique, dont la température peut être maintenue à (20 ± 2) °C.
6.6.2 Source lumineuse, pouvant fournir une intensité lumineuse constante de 400 lx à 800 lx au
niveau des récipients avec un cycle de lumière/obscurité contrôlé compris entre 12 h:12 h et 16 h:8 h.
7 Mode opératoire
7.1 Gamme de concentrations/dilutions adaptée
L’essai d’évitement est destiné à déterminer les effets sublétaux. Par conséquent, l’essai est invalide si
plus de 20 % du nombre total de collemboles sont morts ou manquants à la fin de l’essai (voir 7.4).
Afin d’éviter la mortalité, il est recommandé de réaliser un essai préliminaire dans les cas où les essais
portent sur une substance ou un gradient de dilution d’un sol naturel pollué.
7.2 Essais sur sols
Au début de l’essai, les récipients (6.1) sont divisés en deux compartiments égaux au moyen d’une
cloison (6.2) introduite verticalement. Les récipients sont remplis de sol tamisé sur une hauteur de
3 cm à 4 cm (±30 g de masse humide par côté; le sol est fraîchement humidifié et il convient de ne pas le
comprimer). Une moitié du récipient est remplie avec le sol soumis à essai (compartiment A) et l’autre
moitié est remplie avec le sol témoin (compartiment B). La cloison est ensuite retirée et 20 collemboles
sont placés sur la ligne de séparation des deux sols de chaque récipient d’essai. Les récipients sont
couverts conformément à 6.1 et placés dans la chambre climatique ou dans l’enceinte (6.6.1).
Il est inutile de nourrir les animaux au cours de l’essai.
L’essai est réalisé avec cinq réplicats. Pour faciliter le contrôle du pH et de l’humidité des substrats d’essai
à la fin de l’essai, il est recommandé d’utiliser un récipient supplémentaire sans animaux pour chaque
combinaison soumise à essai. Pour obtenir une quantification plus précise de l’effet comportemental, il
est admis de préparer une gamme de dilutions. Il convient d’utiliser le sol témoin pour diluer le sol pollué.
À la fin de l’essai (48 h), le sol témoin est séparé du sol soumis à essai dans chaque récipient à l’aide
de la cloison. La cloison doit être introduite avant de retirer les récipients de la chambre climatique.
Un compartiment du récipient d’essai est vidé (tour à tour le compartiment du sol témoin et celui du
sol soumis à essai afin d’éviter les erreurs systématiques) dans un petit récipient, puis la cloison est
retirée. Une fois séparés, les deux sols sont inondés d’eau et, après l’ajout de quelques gouttes d’encre et
agitation en douceur à l’aide d’une spatule, les animaux flottant à la surface de l’eau sont comptés. Les
collemboles manquants sont considérés comme des organismes morts.
NOTE Bien que plusieurs études aient révélé que Folsomia candida puisse avoir une réaction d’évitement
[4][5][6]
avant 48 h d’exposition pour certaines substances , l’utilisation de la durée d’essai de 48 h pour les essais
d’évitement avec des collemboles est toujours recommandée.
7.3 Substance de référence
Il est recommandé d’utiliser les substances dont le seul ingrédient actif (5.4) est le phenmédiphame
comme substances toxiques de référence pour cet essai, dans le cadre d’un traitement témoin positif.
Les collemboles sont capables de détecter et d’éviter des concentrations sublétales nocives pour
[4][7] [2]
la reproduction . Lorsqu’un sol artificiel est utilisé , il convient d’obtenir un comportement
d’évitement significatif (voir l’Article 8) dans une plage de 5 mg à 20 mg de substances toxiques de
référence (5.4) par kilogramme de sol mesuré sur la base de la masse sèche.
L’acide borique peut également être utilisé en tant que substance de référence. Lorsqu’un sol artificiel
[10]
est utilisé , il convient d’obtenir un comportement d’évitement significatif (voir l’Article 8) dans une
plage de 700 mg à 2 800 mg d’acide borique par kilogramme de sol mesuré sur la base de la masse sèche.
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AVERTISSEMENT — Lors de la manipulation de ces produits chimiques, il convient de prendre
des mesures appropriées pour éviter toute ingestion ou tout contact avec la peau.
7.4 Critères de validité
L’essai est invalide si le nombre de collemboles morts ou manquants par traitement est > 20 %.
Afin de valider le dispositif expérimental, vérifier la répartition homogène des collemboles. À cet effet,
des récipients d’essai dont les deux compartiments contiennent le sol témoin doivent être préparés et il
y a lieu d’observer une répartition uniforme des collemboles dans les deux compartiments. En moyenne,
il convient que le nombre de collemboles dans un compartiment soit dans la plage de 40 % à 60 % du
nombre total d’animaux présents.
8 Calcul et expression des résultats
8.1 Généralités
La moyenne plus ou moins l’écart-type du nombre d’individus vivants dans le sol soumis à essai est
déterminée pour chaque traitement à la fin de l’essai. Les résultats sont présentés en nombre d’individus
dans le sol soumis à essai, par récipient d’essai.
Si le sol soumis à essai et le sol témoin diffèrent uniquement en termes de pollution, les calculs
statistiques peuvent être effectués de la façon suivante.
8.2 Calcul du pourcentage d’évitement
Pour le calcul du pourcentage d’effet en fonction de la concentration de la substance soumise à essai
ou de la dilution dans le sol (dans le cas d’un sol naturel pollué), le nombre de collemboles dans le sol
soumis à essai est comparé au nombre de collemboles dans le sol témoin conformément à l’Équation (1):
nn−
ct
x = ×100 (1)
N
où
x est l’évitement, exprimé en pourcentage;
n est le nombre de collemboles dans le sol témoin (soit par récipient, soit dans le sol témoin de
c
tous les réplicats);
n est le nombre de collemboles dans le sol soumis à essai (soit par récipient, soit dans le sol sou-
t
mis à essai de tous les réplicats);
N est le nombre total de collemboles (généralement 20 par récipient, ou celui dans tous les réplicats).
La réponse est neutre (0 % d’évitement) lorsqu’un nombre égal d’individus est trouvé dans les deux sols.
Les réponses négatives (lorsque les collemboles préfèrent le sol soumis à essai) correspondent à un
évitement de 0 %.
8.3 Calcul de la CSEO/CMEO
Dans le cas d’un essai avec une concentration ou une dilution unique, la signification statistique de la
réaction d’évitement peut être évaluée à l’aide du test exact de Fisher ou d’une autre méthode statistique
[9]
adaptée pour comparer les répartitions observées et prédites . Cet essai permet de comparer la
répartition observée à une répartition théorique (en supposant une situation «sans évitement») des
organismes dans le sol soumis à essai. L’objet de l’essai est la réaction d’évitement vis-à-vis du sol soumis
à essai, et l’hypothèse nulle suppose une situation sans évitement. Les résultats présentant un nombre
statistiquement significatif (p < 0,05) de collemboles survivants dans le sol soumis à essai inférieur au
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nombre attendu dans le cas sans évitement, indiquent une réaction d’évitement vis-à-vis du sol soumis à
essai. Les valeurs CMEO et CSEO peuvent être évaluées ainsi qu’un gradient de dilutions d’un sol pollué
soumis à essai, ou bien un gradient de concentrations d’une substance d’essai peut être déterminé en
analysant la signification de chaque test exact de Fisher individuel.
8.4 Calcul de CE
x
La valeur CE souhaitée doit être obtenue par régression des probits, en tenant compte du pourcentage
x
de collemboles survivants trouvés dans un sol témoin ainsi que du gradient de dilutions d’un sol pollué
soumis à essai ou d’un gradient de concentrations d’une substance d’essai.
Si le sol témoin et le sol soumis à essai diffèrent en termes de propriétés principales et de présence de
polluants, les calculs statistiques uniquement destinés à évaluer les effets des polluants ne sont pas
adaptés car les propriétés du sol peuvent masquer un effet des polluants. Dans ce cas, pour l’évaluation
de la fonction d’habitat, il est recommandé d’appliquer une valeur de seuil fixe au lieu d’un écart
statistiquement significatif entre les nombres de collemboles dans le sol témoin et dans le sol soumis
à essai. Les sols soumis à essai pour lesquels le nombre total de collemboles survivants est inférieur
à 30 % (lorsque plus de 70 % de collemboles survivants sont trouvés dans le sol témoin) sont classés
comme des sols à fonction d’habitat limitée.
9 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit contenir au moins les informations suivantes:
a) une référence à la présente partie de l’ISO 17512;
b) les résultats exprimés conformément à l’Article 8;
c) la description détaillée des caractéristiques du sol témoin et du sol soumis à essai;
d) dans le cas d’essai de substances chimiques, la description détaillée de la substance d’essai et de la
méthode d’application ou d’incorporation;
e) la description complète du matériel biologique utilisé (espèce, âge, conditions d’élevage,
fournisseur);
f) la description complète du dispositif expérimental et du mode opératoire;
g) la description des conditions d’essai, y compris le taux d’humidité et le pH;
h) le nombre d’individus adultes dans le sol soumis à essai et dans le sol témoin au début et à la fin de
l’essai;
i) le taux de mortalité des individus adultes;
j) la description des symptômes morphologiques évidents observés chez les organismes d’essai;
k) l’évaluation de la fonction d’habitat, limitée ou non, les valeurs calculées ou déterminées
statistiquement (CMEO, CSEO et/ou CE respectivement), y compris les limites de confiance à 95 %,
x
la méthode de calcul, une représentation graphique de la courbe de concentration d’exposition-
réponse ou de dilution-réponse;
l) la discussion
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.