Soil quality — Sampling of soil invertebrates — Part 2: Sampling and extraction of micro-arthropods (Collembola and Acarina)

ISO 23611-2:2006 specifies a method for sampling, extracting and preserving collembolans and mites from field soils as a prerequisite for using these animals as bio-indicators (e.g. to assess the quality of a soil as a habitat for organisms). The sampling and extraction methods of ISO 23611-2:2006 are applicable to almost all types of soils. Exceptions may be soils from extreme climatic conditions (hard, frozen or flooded soils) and other matrices than soil, e.g. tree trunks, plants or lichens.

Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol — Partie 2: Prélèvement et extraction des micro-arthropodes (Collembola et Acarina)

L'ISO 23611-2:2006 spécifie une méthode pour le prélèvement, l'extraction et la conservation des collemboles et des acariens du sol prélevés sur le terrain comme prérequis à l'utilisation de ces animaux en tant que bio-indicateurs (par exemple pour évaluer la qualité d'un sol en tant qu'habitat pour des organismes). Les méthodes de prélèvement et d'extraction de l'ISO 23611-2:2006 s'appliquent à la quasi-totalité des sols. Les sols présents sous des conditions climatiques extrêmes (sols durs, gelés ou inondés) et les matrices autres que le sol, à l'instar des troncs d'arbres, des plantes ou des lichens, peuvent être considérés comme des exceptions.

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02-Feb-2006
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ISO 23611-2:2006 - Soil quality -- Sampling of soil invertebrates
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ISO 23611-2:2006 - Qualité du sol -- Prélevement des invertébrés du sol
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 23611-2
First edition
2006-02-01
Soil quality — Sampling of soil
invertebrates —
Part 2:
Sampling and extraction of
micro-arthropods (Collembola
and Acarina)
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol —
Partie 2: Prélèvement et extraction des micro-arthropodes (Collembola
et Acarina)
Reference number
ISO 23611-2:2006(E)
ISO 2006
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 23611-2:2006(E)
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Published in Switzerland
ii © ISO 2006 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 23611-2:2006(E)
Contents Page

Foreword............................................................................................................................................................ iv

Introduction ........................................................................................................................................................ v

1 Scope..................................................................................................................................................... 1

2 Terms and definitions........................................................................................................................... 1

3 Principle................................................................................................................................................. 1

4 Test materials........................................................................................................................................ 2

4.1 Biological material................................................................................................................................ 2

4.2 Reagents................................................................................................................................................ 2

5 Apparatus.............................................................................................................................................. 3

6 Procedure.............................................................................................................................................. 4

6.1 Collecting the soil samples ................................................................................................................. 4

6.2 Extracting Collembola and Acarina from soil samples .................................................................... 4

6.3 Sorting, preserving and identifying Collembola and Acarina.......................................................... 5

7 Assessment of results.......................................................................................................................... 6

8 Study report........................................................................................................................................... 6

Annex A (informative) Species determination in collembolans and mites .................................................. 7

Annex B (informative) Alternative methods for sampling of micro-arthropods .......................................... 9

Bibliography ..................................................................................................................................................... 10

© ISO 2006 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 23611-2:2006(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies

(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO

technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been

established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and

non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the

International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards

adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an

International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

ISO 23611-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological

methods.

ISO 23611 consists of the following parts, under the general title Soil quality — Sampling of soil invertebrates:

⎯ Part 1: Hand-sorting and formalin extraction of earthworms
⎯ Part 2: Sampling and extraction of micro-arthropods (Collembola and Acarina)
⎯ Part 3: Sampling and soil extraction of enchytraeids

⎯ Part 4: Sampling, extraction and identification of free-living stages of terrestrial nematodes

iv © ISO 2006 – All rights reserved
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ISO 23611-2:2006(E)
Introduction

This part of ISO 23611 has been drawn up since there is a growing need for the standardization of sampling

and extraction methods of soil micro-arthropods. These methods are needed for the following purposes:

⎯ biological classification of soils including soil quality assessment (e.g. References [31], [32], [35], [41],

[45], [46]);

⎯ terrestrial bioindication and long-term monitoring (e.g. References [1], [7], [17], [40], [42]).

Data collected by standardized methods can be more accurately evaluated allowing more reliable

comparisons between sites (e.g. polluted versus non-polluted sites, changes in land-use practices).

From the several micro-arthropod groups, Collembola and Acarina are the most studied in soil ecology. Their

relevance for the soil system comes from their high abundance and diversity, and also from their role in key

biological processes. Collembola and Oribatid mites act mainly as catalysts in organic matter decomposition

[4], [20] [9]

, whereas predacious mites may act as webmasters in soil food webs . These characteristics, allied to

a widespread taxonomic knowledge, allowed their use as study organisms in several research programmes

dealing with the impacts of forest practices (e.g. References [12], [13], [14], [15], [18], [19], [21], [22], [23], [25],

[26], [27], [28], [29], [30], [31], [33], [34], [37], [38], [39]) or crop management practices (e.g. [6], [11], [16], [24]).

These features make them suitable organisms to be used as bio-indicators of changes in soil quality,

[43]
especially due to land-use practices and pollution .
© ISO 2006 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 23611-2:2006(E)
Soil quality — Sampling of soil invertebrates —
Part 2:
Sampling and extraction of micro-arthropods (Collembola and
Acarina)
1 Scope

This part of ISO 23611 specifies a method for sampling, extracting and preserving collembolans and mites

from field soils as a prerequisite for using these animals as bio-indicators (e.g. to assess the quality of a soil

as a habitat for organisms).

Basic information on the ecology of micro-arthropods and their use can be found in the references listed in the

Bibliography.

The sampling and extraction methods of this part of ISO 23611 are applicable to almost all types of soils.

Exceptions may be soils from extreme climatic conditions (hard, frozen or flooded soils) and other matrices

than soil, e.g. tree trunks, plants or lichens. For the sampling design of field studies in general, see

ISO 10381-1.

Methods for some other soil organism groups such as earthworms are covered in other parts of ISO 23611.

This part of ISO 23611 does not cover the pedological characterization of the site which is highly

recommendable when sampling soil invertebrates. ISO 10390, ISO 10694, ISO 11272, ISO 11274, ISO 11277,

ISO 11461 and ISO 11465 are more suitable for measuring pH, particle size distribution, C/N ratio, organic

carbon content and water-holding capacity.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
micro-arthropods

group which is defined by its small size (range size from 100 µm to a few millimetres) making up a significant

part of the below-ground food web in many terrestrial ecosystems

NOTE This group is mainly composed by mites (Acarina), springtails (Collembola), Protura, Diplura, garden

centipedes (Symphyla), Pauropoda, small centipedes and millipedes, and insects and their larvae from several orders

(Diptera, Coleoptera, etc.).
3 Principle

Soil samples are collected in the field using a split corer. Soil cores are placed in plastic tubes (or plastic bags)

and transported to the laboratory. Afterwards, Collembola and Acarida are rapidly (within a few days)

[7], [40]

extracted by behavioural methods, using a MacFadyen apparatus, and preserved for future identifications .

In addition, preparation techniques are also described. Finally, abundance values can be recalculated related

to area (usually 1 m ), volume or weight (usually 1 kg).
© ISO 2006 – All rights reserved 1
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ISO 23611-2:2006(E)

NOTE Alternative methods for extraction can be used under special circumstances. Flotation methods (e.g. the

heptane flotation method) can be used in clay or loamy soils and a Kempson extractor is advisable in the case litter is

[40]
sampled .
4 Test materials
4.1 Biological material

Collembola (springtails) are small wingless hexapods (from 150 µm up to 9 mm length), having a distinctive

head with a pair of antennae, without true compound eyes, with six abdominal segments and three pre-genital

appendages in the abdomen. In the first segment, there is the ventral tube (or collophore) that is used for

adhering to smooth surfaces. The name Collembola comes from this structure (from Greek colla = glue and

embolon = bar). In the third segment, there is the tenaculum, that holds the jumping apparatus on its normal

position. This jumping appendage, the furcula (or spring), when it exists, is located in the fourth segment.

Springtails live in litter and soil, and have very distinctive life forms. They belong to the class Collembola, and

[17]
can be separated into 18 families .

Soil mites are small chelicerate arthropods related to spiders (length from 150 µm up to < 5 mm), living in soil

and litter, and also presenting very distinctive life forms. They belong to the class Arachnida, subclass Acarida,

and can be separated into four groups: Cryptostigmata (Oribatida), Mesostigmata (Gamasida), Prostigmata

(Trombidiformes) and Astigmata.
NOTE Some hints for the taxonomy of springtails and mites are given in Annex A.
4.2 Reagents

Unless otherwise specified, use only reagents of good quality and distilled water.

4.2.1 Propan-2-ol, 80 % (volume fraction).
4.2.2 Formalin [formaldehyde solution 40 % (volume fraction)].
4.2.3 Acetic acid.
4.2.4 Phenol, C H OH, crystalline (carbolic acid).
6 5
4.2.5 Hydrogen chloride, c(HCl) from 8 mol/l to 10 mol/l.
4.2.6 2,2,2-Trichloro-1,1-ethanediol (chloral hydrate).
4.2.7 1,2,3-Trihydroxypropane (glycerine).

4.2.8 von Törne fixative, used to preserve the extracted animals and composed by Propan-2-ol (80 %),

formalin (40 %) and glacial acetic acid (a volume fraction 10:0,3:0,03).

4.2.9 Nesbitt clearing medium, used to clear mite specimens composed of chloral hydrate (80 g), distilled

water (50 ml) and concentrated hydrogen chloride (5 ml).

4.2.10 Lactophenol solution, used to clear mite specimens composed of lactic acid (10 ml), crystals of

phenol (3,6 g) and distilled water (5 ml).

4.2.11 2-Hydroxypropanoic acid (lactic acid), to clear and observe micro-arthropod specimens, especially

oribatid mites under the microscope.

4.2.12 Ethanol, 70 % to 75% (volume fraction), used for fixation and preservation (in this case, also in

combination with glycerine, 10:1).
2 © ISO 2006 – All rights reserved
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ISO 23611-2:2006(E)

4.2.13 Hoyer´s medium, used to mount Collembola specimens composed of distilled water (50 ml),

gum-arabic (30 g), chloral hydrate (200 g) and glycerine (20 ml).
5 Apparatus
Use standard laboratory equipment and the following.
5.1 Measuring tape.
5.2 Collecting flasks.
5.3 Wash bottle.
5.4 Forceps, pipette, fine painting brush, fine needles.
5.5 Petri dishes.
5.6 Stereomicroscope.
5.7 Microscope, with phase or interference contrast is preferable.
5.8 Microscopic slides, with excavated area in the centre, and lamellae.
5.9 Electrical heating plate.
5.10 Plastic vials.
5.11 Ceramic heating elements.
5.12 Pencil, notebook, water resistant marker, labels.
5.13 Split corer

Sampling device made of stainless steel or aluminium (40 cm long and e.g. 5,6 cm diameter may be used; the

size and diameter should not differ considerably from these numbers in order to maintain comparable

conditions), used to collect soil cores (samples). It can be composed of two independent parts that fit together

along the corer main axis or it can consist of one tube. On the top, it has a handle and on the bottom, a cutting

edge.
5.14 MacFadyen apparatus

High-gradient (multiple) device used to extract micro-arthropods from soil samples. The principle is to create

an artificial temperature gradient between the canister where the sample is placed (hot) and the collecting

device below (cold), inducing a negative thermotactic (at the same time a positive hygrotactic, negative

phototactic and positive skototactic) behaviour on the animals that, by this way, leave the soil sample.

5.15 Plastic tubes, with caps (5 cm diameter, 5 cm long), or plastic bags, for storing the soil samples.

5.16 Kempson extractor, in the case litter is sampled.

5.17 Sample frame, 25 cm × 25 cm × 15 cm, made of stainless steel and with sharpened edges, to sample

animals from the litter layer.

NOTE For details concerning the equipment in 5.13 to 5.17, see References [7] and [40].

© ISO 2006 – All rights reserved 3
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ISO 23611-2:2006(E)
6 Procedure
6.1 Collecting the soil samples

At each sampling point (previously defined according to sampling design rules), a soil sample is collected

using a split corer (5.13); for flooded soils the same corer may be employed, but an auger tip should be

present to retain the soil after extraction.

NOTE In addition to the general characterization of the site (see Clause 1), it is useful to determine the actual

moisture of the soil to be sampled.

After the sample is taken, the corer is opened and the soil core is separated into litter layer (including the

humus horizon) and the upper 10 cm of the mineral soil. Generally 5 cm layers are used for the upper part of

the mineral horizon, but if a finer analysis is required, thinner layers can be defined. The depth of the litter

layer should be registered. After this procedure, each layer is conditioned in plastic tubes; these are sealed

with caps, labelled, and stored for transportation to the laboratory. Plastic bags can be used as substitutes of

the plastic tubes (5.15), but special care shall be taken during conditioning to avoid disturbing the core

structure and compaction of the soil material, that may lead to the death of animals. The time lapse between

sampling and extraction should not exceed a few days, in order to avoid undesirable side effects due to

confinement and shifts in micro populations.

If sampling of animals is restricted to the litter layer, a sample frame (5.17) is used instead. The frame is

pressed into the litter by hand. Directly afterwards, the litter inside the frame is collected and the litter samples

are placed in plastic bags (5.15), labelled and stored.
6.2 Extracting Collembola and Acarina from soil samples

In the laboratory, animals are extracted by behavioural methods, e.g. using a MacFadyen high-gradient

extractor (5.14). Each sample core is placed inverted into the canister having a plastic or metal net (2 mm

mesh size) on the bottom. This is connected to a funnel attached to a collecting flask (5.2) with 25 ml of “von

Törne-fixative” (4.2.8).

Alternatively, a saturated solution of picric acid, a 50 % ethylene glycol solution (plus some drops of a

detergent) or even 75 % ethanol (4.2.12) may be used as fixative.

A temperature gradient is created between the upper part (where the samples are) and the lower part of the

system (where the collecting flasks are placed). Heat can be provided by ceramic heating elements (5.11),

giving approximately 10 W per sample. The collecting flasks are immersed in a cooling water bath. In some

commercial apparatus, the temperature gradient is obtained by circulating heated air in the canister area and

cooled air on the collecting area.

The temperature difference between the upper and lower parts should be around 30 °C to 35 °C, with the

upper part being heated at 45 °C to 50 °C and the lower part being cooled usually at 10 °C (maximum field

temperature). Special care shall be taken in order to avoid a fast increase in temperature in the upper part,

which may cause the rapid desiccation of the sample and the death of the animals. Therefore, it is

recommended to have a gradual increase of the temperature of the upper part, starting with approximately

5 °C above field temperature during the first three days, and intensifying the gradient for the next six to seven

days.

The extraction procedure takes nine to ten days. Afterwards, animal samples are labelled and ready to be

stored until processing (sorting and identification). Extraction should preferably start as soon as possible (i.e.

the day of sampling). In case storage is necessary, the soil samples should be kept at 4 °C.

NOTE 1 The method described here is only efficient for active live stages, with an average extraction efficiency of 75 %

[3], [41]

to 80 % . Eggs, other quiescent stages and animals enclosed in plant debris are not extracted by this method;

[44]
alternatively, the heptane flotation method can be used (see Annex B).
4 © ISO 2006 – All rights reserved
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ISO 23611-2:2006(E)

NOTE 2 The size of canisters can vary according to the type of apparatus. Commonly, plastic or metal canisters of

200 cm (2,5 cm radius and 10 cm high) are used. Some commercial MacFadyen apparatus however use larger canisters

of about 800 cm .

NOTE 3 Other types of apparatus using the same principle (e.g. Berlese-Tullgren funnel) can be used to extract the

animals.

NOTE 4 Semi-permanent slide mounts can be obtained by mounting directly ethanol-fixed specimens (4.2.12) into a

mixture of phenol (4.2.4), chloral hydrate (4.2.6) and lactic acid (4.2.11), then preserving the preparation from desiccation

by successive deposits of nail varnish or similar resins.

WARNING — Appropriate precautions (i.e. gloves) shall be taken when dealing with formalin to avoid

danger from inhalation or skin exposure. According to the “Material Safety Data Sheet” for

Formaldehyde 37 % solution as published by producing companies, the compound is a skin sensitizer

and is considered to be carcinogen (humans: limited evidence; animals: sufficient evidence). It is

legally notified in industrialised countries for scientific use.
6.3 Sorting, preserving and identifying Collembola and Acarina
6.3.1 Sorting and preserving

After extraction, animals shall be sorted into groups. This procedure is done under a stereomicroscope (5.6)

using Petri dishes (5.5) to place the samples. Animals can be manipulated with a pipette or a fine brush (5.4),

and transferred to plastic vials (5.10) containing ethanol at 70 % to 75 % (4.2.12) for further identification.

6.3.2 Identification
6.3.2.1 Collembola

For taxonomic identification, specimens are mounted on a cavity slide (5.8) in lactic acid (4.2.11). After placing

the cover glass (covering half of the slide) and adjusting the specimens, the slide is heated in an electric plate

(5.9) until the body of the animal is totally cleared. After this, the specimen can be identified under a

microscope (5.6) and the size can be measured, if required. The slide mount done by this process is not

permanent, and allows a better observation of the animal in all angles
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 23611-2
Première édition
2006-02-01
Qualité du sol — Prélèvement
des invertébrés du sol —
Partie 2:
Prélèvement et extraction
des micro-arthropodes (Collembola
et Acarina)
Soil quality — Sampling of soil invertebrates —
Part 2: Sampling and extraction of micro-arthropods (Collembola and
Acarina)
Numéro de référence
ISO 23611-2:2006(F)
ISO 2006
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 23611-2:2006(F)
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Publié en Suisse
ii © ISO 2006 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 23611-2:2006(F)
Sommaire Page

Avant-propos..................................................................................................................................................... iv

Introduction ........................................................................................................................................................ v

1 Domaine d'application.......................................................................................................................... 1

2 Termes et définitions............................................................................................................................ 1

3 Principe.................................................................................................................................................. 2

4 Matériaux d'essai.................................................................................................................................. 2

4.1 Matériel biologique ............................................................................................................................... 2

4.2 Réactifs.................................................................................................................................................. 2

5 Appareillage.......................................................................................................................................... 3

6 Mode opératoire.................................................................................................................................... 4

6.1 Collecte des échantillons de sol ......................................................................................................... 4

6.2 Extraction des collemboles et des acariens des échantillons de sol ............................................. 4

6.3 Tri, conservation et identification des collemboles et des acariens............................................... 5

7 Évaluation des résultats...................................................................................................................... 6

8 Rapport d’étude .................................................................................................................................... 7

Annexe A (informative) Détermination des espèces de collemboles et d’acariens .................................... 8

Annexe B (informative) Méthodes alternatives pour le prélèvement des micro-arthropodes ................. 10

Bibliographie .................................................................................................................................................... 11

© ISO 2006 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 23611-2:2006(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de

normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée

aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du

comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non

gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec

la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,

Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes

internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur

publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres

votants.

L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne

pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L'ISO 23611-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,

Méthodes biologiques.

L'ISO 23611 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité du sol — Prélèvement

des invertébrés du sol:
⎯ Partie 1: Tri manuel et extraction au formol des vers de terre

⎯ Partie 2: Prélèvement et extraction des micro-arthropodes (Collembola et Acarina)

⎯ Partie 3: Prélèvement et extraction du sol des enchytraeides
⎯ Partie 4: Prélèvement, extraction et identification des nématodes du sol
iv © ISO 2006 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 23611-2:2006(F)
Introduction

La présente partie de l'ISO 23611 a été élaborée pour satisfaire le besoin croissant de normalisation des

méthodes de prélèvement et d’extraction des micro-arthropodes du sol. Ces méthodes sont nécessaires pour

les différentes applications suivantes:

⎯ la classification biologique des sols, y compris l’évaluation de la qualité des sols (par exemple

Références [31], [32], [35], [41], [45] et [46]);

⎯ la bio-indication terrestre et la surveillance à long terme (par exemple Références [1], [7], [17], [40], [42]).

Les données obtenues à l’aide de méthodes normalisées permettent des évaluations plus précises et donc

une comparaison plus fiable entre différents sites (par exemple des sites pollués face à des sites non pollués,

modifications des pratiques d’exploitation du sol).

Parmi les différents groupes de micro-arthropodes, les collemboles et les acariens sont les groupes les plus

étudiés en écologie des sols. Leur pertinence par rapport au sol est due à leur grande abondance et diversité,

mais aussi au rôle qu’ils jouent dans les principaux processus biologiques. Les collemboles et les acariens

[4], [20]

oribates agissent essentiellement en tant que catalyseurs de la décomposition de la matière organique ,

[9]

alors que les acariens prédateurs peuvent jouer un rôle en bout de chaîne trophique du sol . Ces

caractéristiques, ajoutées à la bonne connaissance de leur taxinomie, ont favorisé leur utilisation en tant

qu’organismes d’étude au sein de plusieurs programmes de recherche traitant des impacts de l’exploitation

forestière (par exemple Références [12], [13], [14], [15], [18], [19], [21], [22], [23], [25], [26], [27], [28], [29], [30],

[31], [33], [34], [37], [38] et [39]) ou des pratiques de gestion des cultures (par exemple [6], [11], [16], [24]).

Ces caractéristiques en font des organismes utiles comme bio-indicateurs pour mesurer des changements

[43]

dans la qualité du sol, en particulier en raison des pratiques d’exploitation du sol et de la pollution .

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NORME INTERNATIONALE ISO 23611-2:2006(F)
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol —
Partie 2:
Prélèvement et extraction des micro-arthropodes
(Collembola et Acarina)
1 Domaine d'application

La présente partie de l'ISO 23611 spécifie une méthode pour le prélèvement, l’extraction et la conservation

des collemboles et des acariens du sol prélevés sur le terrain comme prérequis à l’utilisation de ces animaux

en tant que bio-indicateurs (par exemple pour évaluer la qualité d’un sol en tant qu’habitat pour des

organismes).

Il est possible de trouver des informations de base sur l’écologie des micro-arthropodes et leur utilisation dans

les références citées dans la bibliographie.

Les méthodes de prélèvement et d’extraction de la présente partie de l'ISO 23611 s’appliquent à la quasi-

totalité des sols. Les sols présents sous des conditions climatiques extrêmes (sols durs, gelés ou inondés) et

les matrices autres que le sol, à l’instar des troncs d’arbres, des plantes ou des lichens, peuvent être

considérés comme des exceptions. En ce qui concerne les généralités de la conception de l’échantillonnage

pour les études de terrain, voir l’ISO 10381-1.

Les méthodes pour quelques autres groupes d’organismes du sol tels que les vers de terre sont traitées dans

d’autres parties de l'ISO 23611.

La présente partie de l'ISO 23611 ne traite pas de la caractérisation pédologique du site, qui est vivement

recommandée en cas de prélèvement des invertébrés du sol. L'ISO 10390, l'ISO 10694, l'ISO 11272,

l'ISO 11274, l'ISO 11277, l'ISO 11461 et l'ISO 11465 s'avèrent plus adéquates pour mesurer le pH, la

distribution granulométrique, le rapport carbone-azote, la teneur en carbone organique et la capacité de

rétention d'eau.
2 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.

2.1
micro-arthropodes

groupe défini par sa petite taille (de 100 µm à quelques millimètres) constituant une partie importante du

réseau trophique sous-terrain dans un grand nombre d’écosystèmes terrestres

NOTE Ce groupe est composé principalement des acariens (Acarina), des collemboles (Collembola), des Protura,

des Diplura, des scolopendres des jardins (Symphyla), des Paurapoda, de petits scolopendres et mille-pattes et d’insectes

et de leurs larves issus de plusieurs ordres (Diptères, Coléoptères, etc.).
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3 Principe

Les échantillons de sol sont prélevés sur le terrain à l’aide d’un carottier stratifié. Les carottes de sol sont

placées dans des tubes ou des sacs en plastique puis transportées vers le laboratoire. Ensuite, les

collemboles et les acariens sont rapidement extraits (en l’espace de quelques jours) à l’aide de méthodes

comportementales, au moyen du dispositif de MacFadyen et conservés à des fins ultérieures d’identification

[7], [40]

. De plus, les techniques de préparation sont aussi décrites. Pour finir, les valeurs d’abondance peuvent

être recalculées et rapportées à une surface (généralement 1 m ), un volume ou une masse (généralement

1 kg).

NOTE D’autres méthodes d’extraction peuvent se révéler utiles dans des cas particuliers. Il est possible d’utiliser les

méthodes de flottation (par exemple la méthode de flottation dans l’heptane) dans le cas de sols argileux ou limoneux et,

[40]

lorsque les échantillons sont prélevés sur de la litière, il est conseillé d’utiliser un extracteur de Kempson .

4 Matériaux d'essai
4.1 Matériel biologique

Les Collembola (collemboles) sont de petits hexapodes sans ailes (dont la longueur est comprise entre

150 µm et 9 mm), possédant une tête caractéristique avec une paire d’antennes, dépourvus de véritables

yeux composés, avec six segments abdominaux et trois appendices prégénitaux au niveau de l’abdomen. Le

premier segment présente un tube ventral (ou collophore) utilisé pour adhérer aux surfaces lisses. Le nom de

Collembola vient de sa structure (du grec colla = colle et embolon = barre). Le troisième segment présente le

rétinacle qui maintient l’appareil de saut dans sa position normale. L’appendice sauteur, la furcula (ou ressort),

lorsqu’il est présent, se situe sur le quatrième segment. Les collemboles vivent dans la litière et dans le sol et

présentent des formes de vie très variées. Ils appartiennent à la classe Collembola et peuvent être répartis en

[17]
18 familles .

Les acariens du sol sont de petits arthropodes Chélicérates apparentés aux araignées (longueur comprise

entre 150 µm et < 5 mm), vivant dans le sol et la litière et présentant aussi des formes de vie très variées. Ils

appartiennent à la classe Arachnida, sous-classe Acarida, qui comprend quatre groupes distincts:

Cryptostigmates (Oribates), Mésostigmates (Gamasides), Prostigmates (Trombidiformes) et Astigmates.

NOTE Quelques indications sur la taxinomie des collemboles et des acariens sont fournies dans l’Annexe A.

4.2 Réactifs

Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité reconnue et de l'eau distillée.

4.2.1 Propan-2-ol, à 80 % (fraction volumique).
4.2.2 Formol [solution de formaldéhyde à 40 % (fraction volumique)].
4.2.3 Acide acétique.
4.2.4 Phénol, C H OH, cristallin (acide carbolique).
6 5
4.2.5 Acide chlorhydrique, c(HCl) de 8 mol/l à 10 mol/l.
4.2.6 2,2,2-Trichloro-1,1-éthanediol (hydrate de chloral).
4.2.7 1,2,3-Trihydroxy propane (glycérine).

4.2.8 Fixateur de von Törne: utilisé pour conserver les animaux extraits, composé de propan-2-ol (80 %),

de formol (40 %) et d’acide acétique glacial (fraction volumique 10:0,3:0,03).
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4.2.9 Milieu d'éclaircissement de Nesbitt, utilisé pour éclaircir les spécimens d’acariens, composé

d’hydrate de chloral (80 g), d’eau distillée (50 ml) et d’acide chlorhydrique concentré (5 ml).

4.2.10 Solution de lactophénol, utilisée pour éclaircir les spécimens d’acariens, composée d’acide lactique

(10 ml), de cristaux de phénol (3,6 g) et d’eau distillée (5 ml).

4.2.11 Acide hydroxy-2-propanoïque (acide lactique), utilisé pour éclaircir et observer les spécimens de

micro-arthropodes, en particulier les acariens oribates sous le microscope.

4.2.12 Éthanol, de 70 % à 75 % (fraction volumique), utilisé pour la fixation et la conservation (dans ce

dernier cas, il est aussi combiné avec de la glycérine 10:1).

4.2.13 Milieu de Hoyer, utilisé pour monter des spécimens de collemboles, composé d'eau distillée (50 ml),

de gomme arabique (30 g), d'hydrate de chloral (200 g) et de glycérine (20 ml).
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et ce qui suit.
5.1 Mètre ruban.
5.2 Flacons de collecte.
5.3 Pissette.
5.4 Pinces, pipette, pinceau fin, aiguilles fines.
5.5 Boîtes de Petri.
5.6 Microscope stéréoscopique.
5.7 Microscope, à contraste de phase ou interférentiel de préférence.
5.8 Lames, creuses en leur centre, et lamelles pour microscope.
5.9 Plaque chauffante électrique.
5.10 Flacons en plastique.
5.11 Éléments chauffants en céramique.
5.12 Crayon, carnet de notes, marqueur indélébile, étiquettes.
5.13 Carottier stratifié

Dispositif de prélèvement fabriqué en acier inoxydable ou aluminium (il peut être de 40 cm de long et, par

exemple, de 5,6 cm de diamètre; il convient que la taille et le diamètre ne s’écartent pas beaucoup de ces

valeurs afin de conserver des conditions comparables) utilisé pour recueillir des carottes de sol (échantillons).

Il peut être composé de deux parties indépendantes qui s’adaptent le long de l’axe principal du carottier ou

n'être constitué que d’un seul tube. Il est muni d’une poignée dans sa partie supérieure et d’un bord tranchant

dans sa partie inférieure.
5.14 Dispositif de MacFadyen

Dispositif d'extraction (multiple) à gradient élevé utilisé pour extraire les micro-arthropodes des échantillons de

sol. Le principe consiste à créer un gradient de température artificiel entre le bidon qui contient l’échantillon

(chaud) et le dispositif de collecte situé en dessous (froid), ce qui induit un comportement de thermotaxie

négative (et aussi d’hygrotaxie positive, de phototaxie négative et de scototaxie positive) chez les animaux qui,

par voie de conséquence, quittent l’échantillon de sol.
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5.15 Tubes en plastique, munis de bouchons (diamètre de 5 cm, longueur de 5 cm) ou sacs en plastique,

pour conserver les échantillons de sol.

5.16 Extracteur de Kempson, utilisé lorsque les échantillons concernent la litière.

5.17 Cadre de prélèvement (25 cm × 25 cm × 15 cm), fabriqué en acier inoxydable et présentant des bords

tranchants pour prélever les animaux de la couche de litière.

NOTE Pour plus d'informations sur le matériel cité de 5.13 à 5.17, voir les Références [7] et [40].

6 Mode opératoire
6.1 Collecte des échantillons de sol

Un échantillon de sol est prélevé à chaque point d’échantillonnage (défini au préalable selon les règles de

conception de l’échantillonnage) à l’aide d’un carottier stratifié (5.13); il est possible d’utiliser le même carottier

dans les sols inondés, mais il convient de se munir d’un embout pour retenir le sol après l’extraction.

NOTE En plus des caractéristiques générales du site (voir Article 1), il est utile de déterminer l'humidité réelle du sol

à échantillonner.

Après extraction de l’échantillon, le carottier est ouvert et la carotte de sol est séparée en une couche de

litière (y compris l’horizon humique) et en une couche correspondant aux 10 cm supérieurs du sol minéral. En

règle générale, des couches de 5 cm sont utilisées pour la partie superficielle de l’horizon minéral, mais s’il

est nécessaire d’affiner l’analyse, il est possible de définir des couches plus minces. Il convient de noter la

profondeur de la couche de litière. Ensuite, chaque couche est conditionnée dans des tubes en plastique

(5.15) fermés par des bouchons, étiquetés et stockés en vue de leur transport vers le laboratoire. Des sacs en

plastique (5.15) peuvent remplacer les tubes en plastique, mais des précautions particulières doivent être

prises lors du conditionnement afin d’éviter de perturber la structure de la carotte et de tasser le matériau de

sol, ce qui pourrait entraîner la mort des animaux. Il convient que le laps de temps écoulé entre le

prélèvement et l’extraction ne dépasse pas quelques jours, pour éviter des effets secondaires indésirables

dus au confinement et aux dérives des micro-populations.

Si le prélèvement des animaux se restreint à la couche de la litière, un cadre de prélèvement (5.17) est utilisé.

Le cadre est enfoncé dans la litière à la main. Immédiatement après, la litière se trouvant à l'intérieur du cadre

et les échantillons de litière sont placés dans des sacs en plastique (5.15), qui sont étiquetés puis stockés.

6.2 Extraction des collemboles et des acariens des échantillons de sol

Au laboratoire, les animaux sont extraits au moyen de méthodes comportementales, par exemple à l’aide d’un

extracteur de MacFadyen (5.14). Chaque carotte d’échantillon est placée à l’envers dans un bidon dont le

fond comporte un filet en plastique ou en métal. Celui-ci est raccordé à un entonnoir fixé sur un flacon de

collecte (5.2) contenant 25 ml de fixateur de von Törne (4.2.8).

Il est aussi possible d’utiliser une solution saturée d’acide picrique, une solution de 50 % d'éthylène glycol

(plus quelques gouttes de détergent) ou même de l’éthanol à 75 % (4.2.12) comme fixateur.

Un gradient de température est créé entre la partie supérieure (où sont placés les échantillons) et la partie

inférieure (où se trouvent les flacons de collecte) du système. La chaleur peut être produite par des éléments

chauffants en céramique (5.11) générant environ 10 W par échantillon. Les flacons de collecte sont immergés

dans un bain d’eau de refroidissement. Dans certains dispositifs du commerce, le gradient thermique est

obtenu en faisant circuler de l’air réchauffé dans la zone du bidon et de l’air refroidi dans la zone de collecte.

Il convient que la différence de température entre les parties supérieure et inférieure soit d’environ 30 °C à

35 °C, la partie supérieure étant chauffée entre 45 °C et 50 °C et la partie inférieure étant refroidie

généralement à 10 °C (température maximale sur le terrain). Des précautions doivent être prises pour éviter

une augmentation brutale de la température de la partie supérieure, ce qui peut entraîner un dessèchement

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rapide de l’échantillon et la mort des animaux. Par conséquent, il est recommandé d’augmenter

progressivement la température de la partie supérieure, en démarrant à 5 °C au-dessus de la température du

terrain pendant les trois premiers jours et en intensifiant le gradient pendant les six à sept jours suivants.

Le procédé d’extraction prend de neuf jours à dix jours. Ensuite, les échantillons d’animaux sont étiquetés et

prêts à être stockés jusqu’au traitement (tri et identification). Il est recommandé de commencer l'extraction le

plus tôt possible (c'est-à-dire le jour du prélèvement). Si le stockage est nécessaire, les échantillons de sols

sont conservés à 4 °C.

NOTE 1 La méthode décrite ici n’est efficace que pour les stades de vie actifs, avec une efficacité d’extraction

[3], [41]

moyenne de 75 % à 80 % . Les œufs, d’autres stades quiescents et les animaux inclus dans des débris végétaux ne

[44]

sont pas extraits par cette méthode. Il est aussi possible d’utiliser la méthode de flottation dans l’heptane (voir

Annexe B).

NOTE 2 La taille des bidons peut varier selon le type de dispositif. Généralement, on utilise des bidons de 200 cm

(2,5 cm de rayon et 10 cm de hauteur) en plastique ou en métal. Cependant, certains dispositifs de MacFadyen du

commerce utilisent des bidons plus grands, d’environ 800 cm .

NOTE 3 Il est possible d’utiliser d’autres types de dispositif reposant sur le même principe (par exemple entonnoir de

Berlese-Tullgren) pour extraire les animaux.

NOTE 4 Il est possible d’obtenir des lames semi-permanentes en montant directement des spécimens fixés à l’éthanol

(4.2.12) dans un mélange de phénol (4.2.4), d’hydrate de chloral (4.2.6) et d’acide lactique (4.2.11), puis en conservant la

préparation à l’abri de la dessiccation au moyen de plusieurs couches de vernis à ongles ou de résine similaire.

AVERTISSEMENT — Des précautions adéquates (le port de gants, par exemple) doivent être prises

lors de l’utilisation du formol pour éviter tout risque d’inhalation ou d’exposition cutanée. Selon la

fiche de données de sécurité concernant la solution de formaldéhyde à 37 %, telle qu’elle est éditée

par les fabricants, le composé est un sensibilisant cutané et est considéré comme cancérigène (chez

l’homme: symptômes limités; chez l’animal: éléments probants suffisants). Dans les pays

industrialisés, il est légalement indiqué pour une utilisation scientifique.
6.3 Tri, conservation et identification des collemboles et des acariens
6.3.1 Tri et conservation

Après extraction, les animaux doivent être triés par groupes. Cela est effectué au microscope stéréoscopique

(5.6), en plaçant les échantillons dans des boîtes de Petri (5.5). Il est possible de manipuler les animaux à

l’aide d’une pipette ou d’un pinceau fin (5.4) et de les transférer dans des flacons en plastique (5.10)

contenant de l’éthanol de 70 % à 75 % (4.2.12) pour une identification ultérieure.

6.3.2 Identification
6.3.2.1 Collemboles

Pour l’identification taxonomique, les spécimens sont montés sur une lame creuse (5.8) avec de l’acide

lactique (4.2.11). Après avoir placé la lamelle en verre (recouvrant la moitié de la lame) et avoir ajusté les

spécimens, la lame est chauffée sur une plaque électrique (5.9) jusqu’à ce que le corps de l’animal soit

complètement distendu. Le spécimen peut alors être identifié au microscope (5.6) et la taille mesurée, si

nécessaire. La préparation ainsi réalisée n’est pas permanente et permet une meilleure observation de

l’animal sous tous les angles. Une analyse globale du type de caractères utilisés pour l’identification des

collemboles est fournie dans la Référence [5].

NOTE 1 Il est possible de remplacer l’acide lactique (4.2.11) par un mélange d’acide lactique, de glycérine (4.2.7) et de

formol (4.2.2) (fraction volumique 5:1:5) pendant le réchauffement pour distendre le spécimen.

NOTE 2 Il est aussi possible de réaliser des préparations permanentes, à l’aide de milieu de Hoyer (4.2.13) en tant que

solution de montage, à des fins d’identification, après le réchauffement pour distendre le spécimen.

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6.3.2.2 Acariens

Il est nécessaire d’éclaircir les spécimens fortement sclérotisés ou âgés avant l’identification taxonomique.

Cela est possible par immersion des spécimens dans du milieu de Nesbitt (4.2.9) pendant un jour à sept jours,

selon le degré de sclérotisation. En ce qui concerne les Astigmates, aucun éclaircissement n’est nécessaire

dans la plupart des cas; cependant, si ce procédé doit être réalisé, un temps d’immersion plus court est requis.

En ce qui concerne les Oribates, l’éclaircissement est généralement obtenu par immersion des spécimens

dans de l’acide lactique (4.2.11). Si la sclérotisation est très prononcée, il peut être utile de chauffer

davantage les spécimens. Au cours de l’éclaircissement des Oribates, la durée de l’immersion dans de l’acide

lactique dépend du degré de sclérotisation. L’immersion dure de plusieurs heures à quelques jours.

Il est possible de procéder à l’identification avec des préparations temporaires réalisées avec de l’acide

lactique sur des lames creuses (5.8). Pour certains spécimens, il est nécessaire de recourir à la dissection au

moyen d'aiguilles fines (5.4) pour observer les structures fines.

Il est possible de remplacer le milieu de Nesbitt par une solution de lactophénol (4.2.10) ou de l’acide lactique

(4.2.11) pur. Cependant, il faut faire particulièrement attention afin d’éviter la rupture des animaux. Les

spécimens doivent être immergés dans une solution d’eau et d’alcool avant d’être transférés vers le milieu de

montage.

NOTE Il est possible d’utiliser le milieu de Hoyer (4.2.13) ou de la gomme arabique en tant que milieu de montage

pour des préparations permanentes.
7 Évaluation des résultats

Il est possible d’utiliser les critères d’effet de mesurage suivants pour la bioclassification d’un sol, y compris la

bio-indication ou la biosurveillance (d'une contrainte anthropique telle que les produits chimiques ou des

changements liés à l’exploitation du sol, par exemple):

⎯ l'abondance totale (nombre d’individus par unité de surface, de volume ou de masse);

⎯ le nombre d’espèces ou de groupes définis d'un point de vue taxonomique ou écologique;

⎯ l'indices de diversité (diversité alpha, bêta et gamma).

En premier lieu, le nombre d’individus (nombre total ou par espèce ou groupe) est compté et exprimé sous

forme d’individus par échantillon. Si la carotte de sol a été divisée en plusieurs fractions verticales, additionner

ces valeurs. En second lieu, l’abondance globale des individus est multipliée par un facteur (509 dans le cas

d’un carottier stratifié de 5 cm de diamètre) afin d’obtenir le nombre d’individus par mètre carré.

Pour convertir l’abondance par unité de surface en une abondance par unité de volume, il suffit de diviser

l’abondance de l’échantillon par le volume de la carotte et le résultat obtenu exprime le nombre d’individus par

centimètres cube. Si la carotte de sol a été divisée en plusieurs couches, la profondeur totale de la carotte

correspond à la somme de toutes les profondeurs.

Pour obtenir le nombre d’individus par unité de masse (généralement par kilogramme), l’abondance de

l’échantillon est divisée par la masse sèche de l’échantillon (obtenue en pesant l’échantillon après l’avoir

séché dans une étuve à 105 °C pendant 15 h à 20 h après l’extraction). Si la carotte de sol a été divisée en

plusieurs couches, la masse totale de la carotte correspond à la somme de toutes les masses individuelles.

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8 Rapport d’étude
Le rapport d’étude doit contenir les informations suivantes:
a) une référence à la pré
...

Questions, Comments and Discussion

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