ISO 23611-3:2019
(Main)Soil quality — Sampling of soil invertebrates — Part 3: Sampling and extraction of enchytraeids
Soil quality — Sampling of soil invertebrates — Part 3: Sampling and extraction of enchytraeids
This document specifies a method for sampling, handling and extracting enchytraeids from terrestrial field soils as a prerequisite for using these animals as bioindicators (e.g. to assess the quality of a soil as a habitat for organisms). Basic information on the ecology of enchytraeids and their use as bioindicators in the terrestrial environment is included in the Bibliography. This document applies to all terrestrial biotopes in which enchytraeids occur. The sampling design of field studies in general is given in ISO 18400-101. These details can vary according to the climatic/regional conditions of the site to be sampled and an overview on the determination of effects of pollutants on enchytraeids in field situations is given in Reference [6]. Methods for some other soil organism groups such as earthworms or arthropods are given in ISO 23611-1, ISO 23611-2, ISO 23611-4 and ISO 23611-5. This document is not applicable for very wet or flooded soils and might be difficult to use under extreme climatic or geographical conditions (e.g. in high mountains). When sampling soil invertebrates, it is highly recommendable to characterize the site (e.g. concerning soil properties, climate and land use). However, such a characterization is not covered by this document. ISO 10390, ISO 10694, ISO 11272, ISO 11274, ISO 11277, ISO 11461 and ISO 11465 are more suitable for measuring pH, particle size distribution, C/N ratio, organic carbon content and water-holding capacity.
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol — Partie 3: Prélèvement et extraction des enchytréides
Le présent document spécifie une méthode pour le prélèvement, la manipulation et l'extraction des enchytréides du sol prélevés sur le terrain, comme prérequis à l'utilisation de ces animaux en tant que bio-indicateurs (par exemple, pour évaluer la qualité d'un sol en tant qu'habitat pour des organismes). Les informations de base concernant l'écologie des enchytréides et leur utilisation en tant que bio-indicateurs dans l'environnement terrestre sont disponibles dans la Bibliographie. Le présent document s'applique à tous les biotopes terrestres dans lesquels des enchytréides sont présents. La conception de l'échantillonnage pour les études sur le terrain est, de manière générale, décrite dans l'ISO 18400‑101. Ces détails peuvent varier en fonction des conditions climatiques/régionales du site sur lequel l'échantillon doit être prélevé et un aperçu de la détermination des effets sur site des polluants vis-à-vis des enchytréides est fourni dans la Référence [6]. Des méthodes applicables à d'autres groupes d'organismes du sol, comme les vers de terre ou les arthropodes, sont données dans les normes ISO 23611‑1, ISO 23611‑2, ISO 23611‑4 et ISO 23611‑5. Le présent document n'est pas applicable aux sols très humides ou inondés et peut s'avérer difficile à mettre en œuvre dans des conditions climatiques ou géographiques extrêmes (en haute montagne, par exemple). Lors du prélèvement d'invertébrés du sol, il est vivement recommandé de caractériser le site (par exemple, du point de vue des propriétés du sol, du climat et de l'utilisation du terrain). Cependant, cette caractérisation n'est pas traitée dans le présent document. Les normes ISO 10390, ISO 10694, ISO 11272, ISO 11274, ISO 11277, ISO 11461 et ISO 11465 sont plus appropriées pour le mesurage du pH, de la répartition granulométrique, du rapport C/N, de la teneur en carbone organique et de la capacité de rétention d'eau.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 23611-3
Second edition
2019-08
Soil quality — Sampling of soil
invertebrates —
Part 3:
Sampling and extraction of
enchytraeids
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol —
Partie 3: Prélèvement et extraction des enchytréides
Reference number
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Published in Switzerland
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ISO 23611-3:2019(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents . 2
6 Apparatus . 2
7 Procedure. 3
7.1 Soil sampling . 3
7.2 Extraction of the enchytraeids . 3
7.3 Microscopic identification . 4
7.4 Preservation of Enchytraeidae . 5
7.5 Validity of the extraction process. 5
7.6 Determination of biomass . 5
8 Data assessment. 5
9 Test report . 6
Annex A (informative) Quick extraction of enchytraeids . 7
Annex B (informative) Examples of the use of soil invertebrates in soil monitoring
programmes (including presentation of their results) . 9
Bibliography .11
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ISO 23611-3:2019(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www .iso
.org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological characterization.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 23611-3:2007), which has been technically
revised. The main changes to the previous edition are as follows:
— addition of examples of enchytraeid monitoring programmes (including presentation of their
results) as an informative annex.
A list of all parts in the ISO 23611 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
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ISO 23611-3:2019(E)
Introduction
This document has been developed to address a growing need for the standardization of terrestrial
zoological field methods. Such methods, mainly covering the sampling, extraction and handling of soil
invertebrates, are needed for the following purposes:
— biological classification of soils including soil quality assessment (e.g. References [4], [25], [27],
[31], [36]);
— terrestrial bioindication and long-term monitoring (e.g. References [4], [30]);
— evaluation of the effects of chemicals on soil animals (References [18], [26], [28]).
Data for these purposes are gained by standardized methods since they can form the basis for far-
reaching decisions (e.g. whether a given site should be remediated or not). In fact, the lack of such
standardized methods is one of the most important reasons why biological classification concepts in
terrestrial (i.e. soil) habitats have so far been relatively rarely used in comparison with aquatic sites.
Originally, the methods described here were developed for taxonomical and ecological studies,
investigating the role of enchytraeids in various soil ecosystems. These animals without doubt belong
[7]
to the most important soil invertebrates in temperate regions (mainly in acidic soils ). Their influence
[17][23]
on soil functions like litter decomposition and nutrient cycling is well known . Due to their often
very high numbers, and their population biomass, they are also important in many terrestrial food-
[6]
webs . Some species have unintentionally been distributed by humans in many soils of the world.
Since it is neither possible nor useful to standardize methods for all soil organisms, the most important
ones have been selected. Microbiological parameters are already covered by existing ISO standards
(e.g. ISO 14240-1, ISO 14240-2, ISO 17601, ISO/TS 29843-1 and ISO/TS 29843-2.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 23611-3:2019(E)
Soil quality — Sampling of soil invertebrates —
Part 3:
Sampling and extraction of enchytraeids
1 Scope
This document specifies a method for sampling, handling and extracting enchytraeids from terrestrial
field soils as a prerequisite for using these animals as bioindicators (e.g. to assess the quality of a soil as
a habitat for organisms).
Basic information on the ecology of enchytraeids and their use as bioindicators in the terrestrial
environment is included in the Bibliography.
This document applies to all terrestrial biotopes in which enchytraeids occur. The sampling design of
field studies in general is given in ISO 18400-101. These details can vary according to the climatic/
regional conditions of the site to be sampled and an overview on the determination of effects of
pollutants on enchytraeids in field situations is given in Reference [6].
Methods for some other soil organism groups such as earthworms or arthropods are given in
ISO 23611-1, ISO 23611-2, ISO 23611-4 and ISO 23611-5.
This document is not applicable for very wet or flooded soils and might be difficult to use under extreme
climatic or geographical conditions (e.g. in high mountains).
When sampling soil invertebrates, it is highly recommendable to characterize the site (e.g. concerning
soil properties, climate and land use). However, such a characterization is not covered by this document.
ISO 10390, ISO 10694, ISO 11272, ISO 11274, ISO 11277, ISO 11461 and ISO 11465 are more suitable for
measuring pH, particle size distribution, C/N ratio, organic carbon content and water-holding capacity.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp/
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
enchytraeid
small soil-inhabiting worm (a few millimetres to several centimetres in length) belonging to the family
Enchytraeidae, class Oligochaeta, superclass Clitellata, phylum Annelida
[35]
Note 1 to entry: The common name for enchytraeid is potworm .
EXAMPLE Species of the genera Enchytraeus, Fridericia or Cognettia.
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4 Principle
Enchytraeids at a certain site are sampled from the soil by using a split soil corer (diameter usually
3 cm to 6 cm) (6.1). After sampling, the soil samples containing the enchytraeids are transported to
the laboratory. Then the enchytraeids are extracted from soil by means of a wet extraction method.
[12][20][24]
(This approach has been well known for a long time ) After extraction, the enchytraeids
are identified alive and, if required, preserved in such a way that they can be stored in a collection
indefinitely (e.g. for taxonomical purposes).
The determination of the biomass of enchytraeids is also described in this document. The abundance
and biomass values can be recalculated to the area of the soil corer or, more rarely, volume parameters.
NOTE 1 The sampling of enchytraeids is often included in much broader monitoring programmes which try to
cover the whole soil fauna or parts of it (e.g. the mesofauna). Examples of the use of soil invertebrates are given in
Annex B. The design of such programmes is not included in this document (but see e.g. Reference [3]).
NOTE 2 Some hints for the taxonomy of enchytraeids are given in the Bibliography.
5 Reagents
5.1 Tap water (without toxic properties, e.g. due to copper contamination).
5.2 Ethanol, 70 % (volume fraction).
5.3 Bengalred, 4,5,6,7-Tetrachloro-2',4',5',7'-tetraiodofluorescein formulated as a staining agent.
5.4 Bouin’s fixative, buffered solution of formaldehyde, acetic acid and picric acid.
5.5 Paracarmin, staining agent, prepared as a mixture of carmine acid, aluminium chloride and
calcium chloride solved in ethanol.
5.6 Canada-balm, natural yellowish viscous fluid containing 13 % to 14 % (volume fraction) Canadin
acid (C H O ), 48 % to 50 % (volume fraction) α- and β-Canadinol acid (C H O ) and 5 % (volume
20 38 2 19 30 2
fraction) Canadoesen (C H O).
21 40
6 Apparatus
6.1 Split soil corer (e.g. diameter 3 cm to 6 cm; extracted core length 10 cm to 30 cm); length in total
variable (depending whether or not a handle is used) and a plastic or wooden impact-absorbing hammer.
6.2 Plastic bags (e.g. 1-l freezer bags); general store.
6.3 Temperature recorder or a minimum/maximum-thermometer.
6.4 Plastic bowls, diameter approximately 20 cm, height approximately 10 cm; general store.
6.5 Plastic sieves, diameter approximately 15 cm, mesh width approximately 1,0 mm; general store.
6.6 60 W bulbs as a heating device; general store.
6.7 Glassware, for example petri dishes (square format) with a size of 8 cm × 8 cm or small glass
vessels (e.g. 50 ml).
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6.8 Large, sharp knife.
6.9 Refrigerator.
6.10 Dissecting microscope with low magnification (10 times to 40 times).
6.11 Microscope with high magnification (60 times to 400 times) and equipped with an interference
lighting device.
6.12 Spring steel pincers (flat).
6.13 Transfer tool, pasteur pipette, soft steel forceps or a hooked needle.
7 Procedure
7.1 Soil sampling
The soil samples to be used for the investigation of the enchytraeid community are taken destructively
by means of a split soil corer (6.1). The corer is carefully pressed into the soil. The depth depends on
the land use and soil type, but usually varies from 10 cm (e.g. forests) up to 30 cm (e.g. crop sites), i.e.
those layers in which the bulk of the enchytraeids are living. In rare cases, for example if thick roots are
present, a plastic or wooden impact-absorbing hammer can be used to take the samples. After removing
the soil corer, its valve is opened and the soil core is carefully taken out by hand. The core is divided
into cylinders (e.g. 3 cm to 4 cm in height) with a knife (6.8). These soil cylinders may be stored in
small plastic bags (6.2) in a refrigerator (6.9) at approximately 4 °C to 6 °C for a period of preferably not
[9]
longer than one week to two weeks (storage should not exceed one month in any case ). The soil corer
is cleaned with water afterwards.
7.2 Extraction of the enchytraeids
In principle, the extraction of the worms from the soil is caused by their active movement through the
water-saturated sample into the water-filled bowl (6.4).
The extraction should commence as soon as possible after the sampling (see 7.1). The bowls (6.4) are
carefully filled up with tap water (5.1). The samples (i.e. soil cylinders) are put in the sieves, and are, if
necessary (e.g. in cases of heavy loam soils), carefully broken apart by hand (see Figure 1). The samples
in the sieve shall be completely submerged and the bottoms of the sieves should not reach the bottom
of the bowls. To ensure an extraction efficiency of Enchytraeidae from the samples of more than 90 %,
the extraction of soil should last for 2 d to 7 d and extraction of litter for 0,5 d to 2 d at (12 ± 2) °C
(water temperature). The duration depends mainly on the organic content of the sample. These times
can be modified according to organizational requirements and the number of individuals in a sample.
However, the worms quickly die if an oxygen deficiency occurs. In order to avoid this problem, the
water should be changed after 18 h to 24 h, and again after 48 h (if extraction period exceeds 2 d). For
that purpose the sieve with the sample should be carefully transferred to a bowl with fresh water. An
acceleration of the extraction using a heat source [e.g. a 60 W bulb (6.6)] placed above the sample can be
helpful, but should be carefully used (i.e. slow temperature increase over at least 3 h), since otherwise
— species-specifically — many animals, especially juveniles and fragmentation stages, remain in the
soil (see Annex A).
NOTE 1 In order to reduce the amount of debris at the bottom of the extraction bowls, a fine wiping cloth
(mesh size 1 mm) can be put in the sieve before the soil sample is put in.
At the end of the extraction procedure, the sieves are removed. The requirements for the disposal of the
soil are given in the appropriate national regulations. The water is slowly and carefully decanted from
the bowl. The finest fraction of soil at the bottom of the bowls should not be disturbed (see Figure 2). A
small amount of water (up to a height of 5 mm to 10 mm) shall remain in the bowls. Subsequently, the
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finest fraction of soil is suspended in the overlying water, placed in a petri dish (6.7) and briefly stored
until soil particles have settled and the water becomes clear. Since the whitish worms are heavier than
water, but are rarely able to hide themselves in the narrow soil layer, they can easily be collected out
of the petri dish under a dissecting microscope (6.10). For this transfer, a soft steel forceps, a Pasteur
pipette or a hooked needle (6.13) can be used, but in any case, damaging of the worms shall be avoided.
The most convenient way of counting the total number is to divide the surface of the petri dish into
parallel rows which are checked one after another. Due to their white colour, the worms are clearly
visible against the usually brownish soil particles. The animals are transferred to small plastic or glass
vessels (e.g. 20 ml).
The number of samples which can be extracted simultaneously is theoretically unlimited. However, due
to the size of the water bowls, space limitations can occur. Since they (i.e. at least the water) shall be
cooled, usually only up to 40 to 50 samples can be processed at one time. These limitations can be
overcome by carrying out the procedure in a cool room, for example a cellar.
NOTE 2 In rare cases, the enchytraeids can be confused with Diptera larvae (which very often possess
brownish or black head capsules) or nematodes (non-peristaltic movement; usually smaller and faster moving
than oligochaetes). Additionally, fungal hyphae or fine root material can be mistaken for enchytraeids, since they
can possess the same length and colour. However, they always lack the segmentation of oligochaete worms.
Figure 1 — Extraction bowl with soil sample
Figure 2 — Sediment layer (including enchytraeids)
7.3 Microscopic identification
The microscopic identification should be done as soon as possible, because the animals die in water
after some days, even if stored in a refrigerator (6.9). A soft steel forceps, a Pasteur pipette or a hooked
needle (6.13) can be used carefully to transfer the animals with a drop of water to a slide. If the worms
are moving too fast on the slide, they can be anaesthetised with CO (e.g. by using a drop of mineral
2
water with gas, but it should be used with care, otherwise the worms are killed).
NOTE Identification of the enchytraeids is difficult. Therefore, in many cases only the number of animals
[20] [32]
is determined. Otherwise, keys for European enchytraeid species and for species of the genus Fridericia ,
as well as other publications, are available. A compromise can be the use of a site-specific key, since usually
only three to 25 species occur at any given site (in this case, often worms fixed in ethanol can be identified to
the species level). An overview of the information (e.g. parameters, drawings) needed for the identification of a
certain species is given in Reference [11].
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In the case of high individual numbers (>100) a sample partitioning can be carried out. Partitioning
shall guarantee that all species (whether big or small) are parted to a known degree. Therefore, this
process shall be described in detail.
7.4 Preservation of Enchytraeidae
Enchytraeidae can be preserved for further investigations (e.g. species descriptions) in 70 % (volume
[33]
fraction) ethanol (5.2) . However, the preservation is accompanied by a loss of visible morphological
details. Animals difficult to identify or those selected as reference specimen may also be identified
after a fixing in Bouin (5.4), respective colouring in Paracarmin (5.5) and storing in Canada-balm (5.6)
(which can be relatively elaborate). For species identification, the use of a microscope (6.11) equipped
with differential interference contrast (DIC) is strongly recommended.
7.5 Validity of the extraction process
Extraction efficiency can be checked by fixing soil samples with ethanol (96 %), which are taken in
parallel to other field samples. The soil is spread in a thin layer on the bottom of a flat plastic vessel
1)
(e.g. Bellaplast 16 cm × 11 cm) and then the ethanol is added. Afterwards, some drops of Bengalred
(5.3) are applied to the ethanol. After one day, the bright-red coloured worms can easily be counted.
However, this procedure is only necessary when using samples from an unknown site for the first time.
Additionally, this check shall be done with six to eight replicates since the variability of enchytraeid
numbers can be quite high.
7.6 Determination of biomass
For an estimation of the ecological role (e.g. in the soil food-web) of enchytraeids at a certain site, the
determination of their biomass is necessary. Since direct weighing is difficult due to the low individual
mass of most species, potential corruption from changing gut content and, in particular, quick
desiccation, the biomass may also be indirectly estimated by the following methods:
[1][2]
— creation of specific species calibration curves to the ratio of length and mass then measurement
of the length of the animals in a sample;
— automatic calculation of the mass by computer-assisted measuring of the length-mass-ratio
of embedded individuals and following computation with the largely constant density of
[23]
enchytraeids .
8 Data assessment
The following measurement end points may be used for the bio-classification of a soil, including bio-
indication or bio-monitoring (e.g. anthropogenic stress-like chemicals or land-use changes):
— abundance (number of individuals per area);
— biomass (fresh or dry mass of the population per area);
— number of species or other taxonomically or ecologically defined groups;
— dominance ratio (in percentage of the population);
— age structure of the population (e.g. adult/juvenile ratio), either all species together or individual
species;
— distribution in the soil (e.g. the vertical distribution within the soil core);
— morphological, physiological or biochemical alterations in individuals (e.g. open wounds).
1) Bellaplast is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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Usually, the total number of worms is counted and expressed as individuals per sample. This number is
then multiplied by a factor determined by the diameter of the soil corer (6.1) in order to get the number
of worms per square meter. Additionally, the age structure (juveniles and adults differentiated by the
presence of a clitellum) and the vertical distribution can be determined with the help of the dissecting
microscope (6.10) (i.e. no species determination is done). For the determination of all other end points,
a detailed microscopic examination is necessary, since then the species have to be identified.
9 Test report
The test report shall contain a summary of the results obtained along with the methods and variables
used during the study. It shall provide the following information:
a) a reference to this document, i.e. ISO 23611-3;
b) a full description of the study design and procedures;
c) characterization of the test site (especially soil properties);
d) sampling method;
e) description of the sampling conditions, including date and duration of sampling in the field and
climatic parameters like air temperature;
f) number of worms caught;
g) details of fixation and preservation of the biological material;
2
h) recalculated values to 1 m or another standard size, if necessary;
i) all information, including all measured raw data and all problems which might have occurred,
developed during the study;
j) discussion of the results.
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ISO 23611-3:2019(E)
Annex A
(informative)
Quick extraction of enchytraeids
In specific cases, the extraction method described in 7.2 may not be optimal. This is, for example, true
for samples which have been taken in organic-rich coniferous forest soils, in particular in northern
temperate regions like Scandinavia. In these soils (including the litter layer), often fragmenting species
[1][7]
like Cognettia sphagnetorum are highly dominant . During the proposed extraction period of several
days, asexual species could fragment or die. Thus, the number of individuals could change considerably.
For this reason, a modified extraction method as already described by Reference [21] can be used. The
performance of the method is summarized as follows.
The sampling is done by using a soil corer (6.1) in accordance with 7.1.
The extraction should commence as soon as possible after the sampling. Each extraction unit consists
of a plastic funnel (diameter of about 10 cm to 12 cm) fixed in a hole (e.g. a wooden board). A sieve
(mesh-size 1 mm) with a slightly smaller diameter than the funnel is put into it. The sample placed
on the sieve should be completely covered by water. The bottom of the funnel is closed by a screw clip
on a piece of rubber tubing. The lower end of this tube ends in a small vessel (e.g. 20 ml) in which the
enchytraeids are collected. Heat is supplied from a 60 W bulb (6.6) enclosed in a light metal cylinder
(e.g. 11 cm diameter and 18 cm height). The bottom of this cylinder is about 10 cm to 12 cm above
the funnel. The heating, preferably of several extraction units in parallel, is controlled by means of a
variable resistance. During the extraction process, the heat is increased gradually, so that the water
surface reaches a temperature of approximately 45 °C after 150 min to 250 min, when extraction is
complete. Then the worms are run out from the bottom of the funnel into the small vessel for counting
and identification.
Afterwards, the enchytraeids are handled in accordance with 7.3.
An example of an apparatus is given in Figure A.1.
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ISO 23611-3:2019(E)
Figure A.1 — Schematic overview of the method (from Reference [12])
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ISO 23611-3:2019(E)
Annex B
(informative)
Examples of the use of soil invertebrates in soil monitoring
programmes (including presentation of their results)
B.1 General
In order to improve the performance and, in particular, the presentation and interpretation of soil
invertebrate monitoring studies, some examples are given in this annex. It should be noted that the
information provided here is to be under
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 23611-3
Deuxième édition
2019-08
Qualité du sol — Prélèvement des
invertébrés du sol —
Partie 3:
Prélèvement et extraction des
enchytréides
Soil quality — Sampling of soil invertebrates —
Part 3: Sampling and extraction of enchytraeids
Numéro de référence
ISO 23611-3:2019(F)
©
ISO 2019
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 2
7 Mode opératoire. 3
7.1 Échantillonnage du sol . 3
7.2 Extraction des enchytréides . 3
7.3 Identification au microscope . 5
7.4 Conservation des Enchytraeidae . 5
7.5 Validité du procédé d’extraction . 5
7.6 Détermination de la biomasse . 6
8 Analyse des données. 6
9 Rapport d’essai . 6
Annexe A (informative) Extraction rapide des enchytréides . 8
Annexe B (informative) Exemples de l’utilisation des invertébrés du sol dans le cadre de
programmes de surveillance du sol (avec présentation des résultats correspondants) .10
Bibliographie .12
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 23611-3:2007), qui a fait l’objet
d’une révision technique. Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les
suivantes:
— ajout d’exemples de programmes de surveillance d’enchytréides (avec présentation des résultats
correspondants) sous forme d’annexe informative.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 23611 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
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ISO 23611-3:2019(F)
Introduction
Le présent document a été élaboré pour répondre à un besoin croissant de normalisation de méthodes
d’analyse sur le terrain de la faune terrestre. Ces méthodes, traitant principalement du prélèvement,
de l’extraction et de la manipulation des invertébrés du sol, sont nécessaires pour les applications
suivantes:
— la classification biologique des sols, y compris l’évaluation de la qualité des sols (par exemple,
Références [4], [25], [27], [31], [36]);
— la bio-indication terrestre et la surveillance à long terme (par exemple, Références [4], [30]);
— l’évaluation des effets de substances chimiques vis-à-vis des animaux du sol (Références [18],
[26], [28]).
Étant donné qu’elles peuvent être à la base de décisions importantes (par exemple, s’il convient
d’entreprendre ou non la dépollution d’un site particulier), les données relatives à ces applications sont
obtenues à l’aide de méthodes normalisées. En fait, l’absence de méthodes normalisées de ce type est
l’une des principales raisons pour lesquelles les concepts de classification biologique ont été utilisés
relativement rarement, jusqu’à présent, dans des habitats terrestres (c’est-à-dire le sol) par rapport aux
sites aquatiques.
À l’origine, les méthodes décrites dans le présent document ont été développées pour des études
taxonomiques ou écologiques, visant à élucider le rôle des enchytréides dans différents écosystèmes
terrestres. Ces animaux font indubitablement partie des invertébrés du sol les plus importants dans
[7]
les régions tempérées (principalement dans les sols acides ). Leur incidence sur les fonctions du sol,
[17][23]
comme la décomposition de la litière et le cycle des éléments nutritifs, est bien connue . En raison
de leur nombre souvent très élevé et de la biomasse de leur population, ils jouent également un rôle
[6]
majeur dans de nombreux réseaux trophiques terrestres . Certaines espèces ont été involontairement
disséminées par l’homme dans les sols du monde entier.
Étant donné qu’il n’est ni possible, ni utile de normaliser des méthodes pour tous les organismes du
sol, seuls les plus importants ont été sélectionnés. Les paramètres microbiologiques sont déjà traités
par des normes ISO existantes (par exemple, l’ISO 14240-1, l’ISO 14240-2, l’ISO 17601, l’ISO/TS 29843-1
et l’ISO/TS 29843-2).
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NORME INTERNATIONALE ISO 23611-3:2019(F)
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol —
Partie 3:
Prélèvement et extraction des enchytréides
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode pour le prélèvement, la manipulation et l’extraction des
enchytréides du sol prélevés sur le terrain, comme prérequis à l’utilisation de ces animaux en tant que
bio-indicateurs (par exemple, pour évaluer la qualité d’un sol en tant qu’habitat pour des organismes).
Les informations de base concernant l’écologie des enchytréides et leur utilisation en tant que bio-
indicateurs dans l’environnement terrestre sont disponibles dans la Bibliographie.
Le présent document s’applique à tous les biotopes terrestres dans lesquels des enchytréides sont
présents. La conception de l’échantillonnage pour les études sur le terrain est, de manière générale,
décrite dans l’ISO 18400-101. Ces détails peuvent varier en fonction des conditions climatiques/
régionales du site sur lequel l’échantillon doit être prélevé et un aperçu de la détermination des effets
sur site des polluants vis-à-vis des enchytréides est fourni dans la Référence [6].
Des méthodes applicables à d’autres groupes d’organismes du sol, comme les vers de terre ou les
arthropodes, sont données dans les normes ISO 23611-1, ISO 23611-2, ISO 23611-4 et ISO 23611-5.
Le présent document n’est pas applicable aux sols très humides ou inondés et peut s’avérer difficile à
mettre en œuvre dans des conditions climatiques ou géographiques extrêmes (en haute montagne, par
exemple).
Lors du prélèvement d’invertébrés du sol, il est vivement recommandé de caractériser le site (par
exemple, du point de vue des propriétés du sol, du climat et de l’utilisation du terrain). Cependant,
cette caractérisation n’est pas traitée dans le présent document. Les normes ISO 10390, ISO 10694,
ISO 11272, ISO 11274, ISO 11277, ISO 11461 et ISO 11465 sont plus appropriées pour le mesurage du pH,
de la répartition granulométrique, du rapport C/N, de la teneur en carbone organique et de la capacité
de rétention d’eau.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp/
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
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3.1
enchytréide
petit ver vivant dans le sol (de quelques millimètres à plusieurs centimètres de longueur) appartenant à
la famille des Enchytraeidae, ordre des Oligochaeta, classe Clitellata, phylum Annelida
[35]
Note 1 à l'article: Le nom commun des enchytréides est «potworm» en anglais .
EXEMPLE Espèces des genres Enchytraeus, Fridericia ou Cognettia.
4 Principe
Sur un site donné, les enchytréides sont prélevés dans le sol au moyen d’un carottier fendu pour
prélèvement de sol (d’un diamètre généralement compris entre 3 cm et 6 cm) (6.1). Après le prélèvement,
les échantillons de sol contenant les enchytréides sont transportés au laboratoire. Ensuite, les
enchytréides sont extraits du sol par une méthode d’extraction humide. (Cette approche est connue
[12][20][24]
de longue date .) Après l’extraction, les enchytréides sont identifiés vivants et, si nécessaire,
conservés de manière à pouvoir être stockés indéfiniment dans une collection (par exemple, à des fins
taxonomiques).
La détermination de la biomasse des enchytréides est également décrite dans le présent document. Les
valeurs d’abondance et de biomasse peuvent être recalculées et rapportées à la surface du carottier ou,
plus rarement, à des paramètres de volume.
NOTE 1 Le prélèvement d’enchytréides fait souvent partie de programmes de surveillance plus vastes visant
à couvrir la totalité ou une partie de la faune du sol (par exemple, la mésofaune). Des exemples d’utilisation des
invertébrés du sol sont donnés dans l’Annexe B. La conception de tels programmes n’est pas comprise dans le
présent document (voir toutefois la Référence [3], par exemple).
NOTE 2 Quelques indications relatives à la taxinomie des enchytréides sont fournies dans la Bibliographie.
5 Réactifs
5.1 Eau du robinet (dépourvue de propriétés toxiques, par exemple en raison d’une contamination
par le cuivre).
5.2 Éthanol, à 70 % (fraction volumique).
5.3 Rose de Bengale, 4,5,6,7-tétrachloro-2',4',5',7'-tétraiodofluorescéine formulée comme un
colorant.
5.4 Fixateur de Bouin, solution tamponnée de formaldéhyde, d’acide acétique et d’acide picrique.
5.5 Paracarmin, colorant préparé sous forme de mélange d’acide carminique, de chlorure d’aluminium
et de chlorure de calcium dissous dans l’éthanol.
5.6 Baume du Canada, fluide naturel visqueux et jaunâtre contenant de 13 % à 14 % (fraction
volumique) de Canadine acide (C H O ), de 48 % à 50 % (fraction volumique) de α- et β-Canadinol
20 38 2
acide (C H O ) et de 5 % (fraction volumique) de Canadoesen (C H O).
19 30 2 21 40
6 Appareillage
6.1 Carottier fendu pour prélèvement de sol (par exemple, ayant un diamètre compris entre 3 cm
et 6 cm et une longueur de carotte extraite de 10 cm à 30 cm); de longueur totale variable (selon qu’il est
muni d’une poignée ou non) et utilisé avec un marteau anti-vibration en bois ou en plastique.
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6.2 Sachets en plastique (par exemple, sachets pour congélation de 1 l); du commerce.
6.3 Enregistreur de température ou thermomètre minimum/maximum.
6.4 Bols en plastique, diamètre: 20 cm environ; hauteur: 10 cm environ; du commerce.
6.5 Tamis en plastique, diamètre: 15 cm environ, ouverture de mailles: 1,0 mm environ; du commerce.
6.6 Ampoules de 60 W en tant qu’élément chauffant; du commerce.
6.7 Verrerie, par exemple boîtes de Petri (de format carré) de 8 cm × 8 cm ou petits récipients en
verre (de 50 ml, par exemple).
6.8 Couteau de grande taille, affûté.
6.9 Réfrigérateur.
6.10 Microscope à dissection, à faible grossissement (de 10 fois à 40 fois).
6.11 Microscope à grossissement élevé (de 60 fois à 400 fois) et équipé d’un dispositif de contraste
interférentiel différentiel.
6.12 Pinces à ressort en acier (plates).
6.13 Outil de transfert, pipette Pasteur, pince en acier doux ou aiguille à crochet.
7 Mode opératoire
7.1 Échantillonnage du sol
Les échantillons de sol à utiliser pour étudier la communauté des enchytréides sont prélevés de manière
destructive au moyen d’un carottier fendu pour prélèvement de sol (6.1). Le carottier est pressé avec
soin contre le sol pour l’y faire pénétrer. La profondeur de pénétration est fonction de l’utilisation du
terrain et du type de sol mais, en règle générale, elle est comprise entre 10 cm (par exemple, en forêt)
et 30 cm (par exemple, dans les zones cultivées), ce qui correspond aux couches dans lesquelles vit la
majorité des enchytréides. Dans de rares cas (par exemple, si le sol comporte de grosses racines), il est
possible d’utiliser un marteau anti-vibration en plastique ou en bois pour prélever les échantillons. Une
fois le carottier retiré du sol, il est ouvert et la carotte de sol est recueillie à la main avec précaution.
À l’aide d’un couteau (6.8), la carotte est ensuite divisée en cylindres (par exemple, de 3 cm à 4 cm
de hauteur). Ces cylindres de sol peuvent être conservés au réfrigérateur (6.9), dans de petits sachets
en plastique (6.2), à une température comprise entre 4 °C et 6 °C environ, pendant une période ne
dépassant pas une semaine à deux semaines de préférence (dans tous les cas, il convient que la durée de
[9]
stockage n’excède pas un mois ). Pour finir, le carottier est lavé à l’eau.
7.2 Extraction des enchytréides
En principe, l’extraction des vers hors du sol est engendrée par les mouvements actifs de ceux-ci dans
l’échantillon saturé en eau dans le bol rempli d’eau (6.4).
Il convient de commencer l’extraction dès que possible après l’échantillonnage (voir 7.1). Les bols (6.4)
sont remplis avec précaution d’eau du robinet (5.1). Les échantillons (c’est-à-dire les cylindres de sol)
sont déposés dans les tamis et sont, si nécessaire (par exemple, dans le cas de sols argileux lourds),
cassés à la main avec soin (voir Figure 1). Les échantillons placés dans le tamis doivent être entièrement
immergés et il convient que le fond des tamis n’atteigne pas le fond des bols. Pour garantir l’extraction de
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plus de 90 % des Enchytraeidae des échantillons, il convient que l’extraction du sol se prolonge pendant
une durée de 2 jours à 7 jours et que l’extraction de la litière dure de 0,5 jour à 2 jours, à (12 ± 2) °C
(température de l’eau). La durée dépend principalement de la teneur de l’échantillon en matière
organique. Ces durées peuvent être modifiées en fonction d’exigences liées à l’organisation et du nombre
d’individus contenus dans un échantillon. Toutefois, les vers meurent vite en cas de manque d’oxygène.
Pour éviter ce scénario, il convient de changer l’eau au bout de 18 h à 24 h, et de nouveau après 48 h (si la
période d’extraction dépasse 2 jours). Pour ce faire, il convient que le tamis contenant l’échantillon soit
transféré avec précaution dans un bol rempli d’eau fraîche. Une accélération de l’extraction au moyen
d’une source de chaleur [par exemple, une ampoule de 60 W (6.6)] placée au-dessus de l’échantillon
peut se révéler utile, mais il convient d’en faire usage avec précaution (prévoir une augmentation lente
de la température sur au moins 3 h). Sinon, selon l’espèce, de nombreux animaux, surtout ceux qui se
trouvent aux stades juvéniles et de fragmentation, restent dans le sol (voir Annexe A).
NOTE 1 Pour réduire la quantité de débris au fond des bols d’extraction, il est possible de placer un tissu fin
(maillage de 1 mm) dans le tamis avant d’y déposer l’échantillon de sol.
À la fin de l’extraction, les tamis sont enlevés. Les exigences relatives à l’élimination du sol sont données
dans les réglementations nationales appropriées. L’eau du bol est lentement décantée avec soin. Il
convient de ne pas perturber la fraction la plus fine du sol au fond du bol (voir Figure 2). Une petite
quantité d’eau (jusqu’à une hauteur de 5 mm à 10 mm) doit rester dans les bols. Ensuite, la fraction la plus
fine du sol est mise en suspension dans l’eau et l’ensemble est déposé dans une boîte de Petri (6.7), puis
stocké pendant une courte durée jusqu’à ce que les particules de sol se déposent et que l’eau devienne
limpide. Étant donné que les vers blanchâtres sont plus lourds que l’eau, mais qu’ils sont rarement
capables de se dissimuler dans la mince couche de sol, ils peuvent être facilement sortis de la boîte de
Petri sous un microscope à dissection (6.10). Pour effectuer ce transfert, il est possible d’utiliser une
pince en acier doux, une pipette Pasteur ou une aiguille à crochet (6.13), mais il faut, dans tous les cas,
éviter d’endommager les vers. Pour compter le nombre total de vers, le plus simple consiste à diviser la
surface de la boîte de Petri en rangées parallèles et de les vérifier les unes après les autres. Comme les
vers sont blancs, il est facile de les distinguer sur le fond habituellement brunâtre des particules de sol.
Les animaux sont transférés dans de petits récipients en plastique ou en verre (de 20 ml, par exemple).
Le nombre d’échantillons pouvant être extraits simultanément est théoriquement illimité. Cependant,
il est possible que la taille des bols d’eau induise des limites d’espace. Étant donné qu’ils doivent être
refroidis (l’eau doit en tout cas l’être), il n’est généralement possible de traiter simultanément que 40
à 50 échantillons au plus. Ces limites peuvent être surmontées en mettant en œuvre le mode opératoire
dans un local frais, comme une cave.
NOTE 2 Dans de rares cas, il est possible de confondre les enchytréides avec des larves diptères (qui possèdent
souvent des capsules céphaliques brunâtres ou noires) ou avec des nématodes (mouvement non péristaltique;
en général, plus petits et plus rapides que les oligochètes). De plus, les hyphes des champignons ou les filaments
radiculaires peuvent être pris pour des enchytréides, car ils peuvent être de longueurs et de couleurs identiques.
Toutefois, à l’inverse des vers oligochètes, ils sont toujours dépourvus de segmentation.
Figure 1 — Bol d’extraction avec échantillon de sol
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Figure 2 — Couche de sédiments (comprenant des enchytréides)
7.3 Identification au microscope
Il convient d’effectuer l’identification au microscope le plus tôt possible, car les animaux meurent dans
l’eau au bout de quelques jours, même s’ils sont conservés au réfrigérateur (6.9). Utiliser avec précaution
une pince en acier doux, une pipette Pasteur ou une aiguille à crochet (6.13) pour transférer les animaux
avec une goutte d’eau sur une lame. Si les vers se déplacent trop vite sur la lame, il est possible de les
anesthésier avec du CO (par exemple, en utilisant une goutte d’eau minérale gazeuse, mais il convient
2
d’en faire usage avec précaution, sinon le ver meurt).
NOTE L’identification des enchytréides est difficile. Par conséquent, dans de nombreux cas, seul le nombre
[20]
d’animaux est déterminé. Autrement, des clés d’identification des espèces d’enchytréides européens et des
[32]
espèces du genre Fridericia sont disponibles, ainsi que d’autres publications. Un compromis peut consister à
utiliser une clé spécifique du site puisqu’en général, un site donné ne comporte qu’entre trois et vingt-cinq espèces
(dans ce cas, les vers fixés dans l’éthanol peuvent souvent être identifiés jusqu’au niveau de l’espèce). Un aperçu
des informations (par exemple paramètres, dessins) nécessaires pour identifier une espèce particulière est
donné dans la Référence [11].
Si le nombre d’individus est élevé (>100), il est possible de diviser l’échantillon. Cette division doit
garantir que toutes les espèces (grandes ou petites) sont réparties selon une distribution connue. Par
conséquent, ce procédé doit être décrit en détail.
7.4 Conservation des Enchytraeidae
Les Enchytraeidae peuvent être conservés dans de l’éthanol (5.2) à 70 % (fraction volumique) en vue
[33]
d’études ultérieures (description d’espèces, par exemple) . Cependant, la conservation s’accompagne
d’une perte de détails morphologiques visibles. Les animaux difficiles à identifier ou ceux sélectionnés
comme spécimen de référence peuvent également être identifiés après avoir été fixés dans du liquide
de Bouin (5.4) ou colorés par du paracarmin (5.5) et conservés dans du baume du Canada (5.6) (ce
qui peut être relativement compliqué). Pour l’identification des espèces, il est vivement recommandé
d’utiliser un microscope à contraste interférentiel différentiel (6.11).
7.5 Validité du procédé d’extraction
L’efficacité d’extraction peut être vérifiée en fixant avec de l’éthanol (à 96 %) des échantillons de sol
prélevés parallèlement à d’autres échantillons sur le terrain. Le sol est étalé en une mince couche au
1)
fond d’un récipient plat en plastique (par exemple, Bellaplast , 16 cm × 11 cm), puis l’éthanol est ajouté.
Ensuite, quelques gouttes de rose de Bengale (5.3) sont versées dans l’éthanol. Au bout d’une journée, les
vers devenus rouges brillants sont faciles à dénombrer. Cependant, ce mode opératoire n’est nécessaire
que lorsque l’on utilise pour la première fois des échantillons provenant d’un site inconnu. En outre,
cette vérification doit être répétée six à huit fois, car la variabilité des quantités d’enchytréides peut
être relativement élevée.
1) Bellaplast est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée
à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande
l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
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7.6 Détermination de la biomasse
Pour estimer le rôle écologique (par exemple, dans le réseau trophique du sol) des enchytréides en
un site donné, il est nécessaire de déterminer leur biomasse. Puisqu’une pesée directe est difficile
en raison de la faible masse des individus de la plupart des espèces, de l’erreur potentielle due à la
modification du contenu du tube digestif et, en particulier, à la dessiccation rapide, la biomasse peut
aussi être déterminée indirectement par les méthodes suivantes:
— établissement de courbes d’étalonnage spécifiques des espèces, sur la base du rapport de longueur-
[1][2]
masse ; puis mesurage de la longueur des animaux d’un échantillon;
— calcul automatique de la masse par mesurage assisté par ordinateur du rapport longueur-masse
d’individus placés entre lame et lamelle, suivi d’un calcul utilisant la densité généralement constante
[23]
des enchytréides .
8 Analyse des données
Il est possible d’utiliser les critères de mesure suivants pour la bioclassification d’un sol, y compris pour
la bio-indication ou la bio-surveillance (par exemple, une contrainte anthropique telle que l’usage de
produits chimiques ou le changement d’utilisation du terrain):
— l’abondance (nombre d’individus par unité de surface);
— la biomasse (masse fraîche ou sèche de la population par unité de surface);
— le nombre d’espèces ou d’autres groupes définis d’un point de vue taxonomique ou écologique;
— le rapport de dominance (en pourcentage de la population);
— la structure par âge de la population (par exemple, rapport adultes/juvéniles), soit toutes espèces
confondues, soit par espèce;
— la répartition dans le sol (par exemple, répartition verticale dans la carotte de sol);
— les altérations morphologiques, physiologiques ou biochimiques chez les individus (plaies ouvertes,
par exemple).
En général, le nombre total de vers est compté et exprimé sous forme d’individus par prélèvement. Ce
nombre est ensuite multiplié par un facteur déterminé par le diamètre du carottier (6.1) de façon à
obtenir le nombre de vers par mètre carré. Il est possible, en outre, de déterminer la structure par âge
(les juvéniles se différencient des adultes par la présence d’un clitellum) et la répartition verticale à l’aide
du microscope à dissection (6.10) (aucune détermination n’est faite par espèce). Pour la détermination
de
...
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