ISO 15914-2:2024

Animal feeding stuffs — Enzymatic determination of total starch content — Part 2: Method by enzymatic determination with a hexokinase system and potassium hydroxide dispersion

This document specifies an enzymatic method for determining starch in animal feeding stuffs containing starchy ingredients (cereals, tubers, etc.). The method is also applicable to beans and to the animal digestive contents because it involves the hexokinase system for the final glucose determination.

Alimentation animale — Dosage enzymatique de la teneur totale en amidon — Partie 2: Méthode par dosage enzymatique avec un système hexokinase et dispersion à l’hydroxyde de potassium

Le présent document spécifie une méthode enzymatique de dosage de l’amidon dans l’alimentation animale contenant des ingrédients amylacés (céréales, tubercules, etc.). La méthode s’applique également aux fèves et aux contenus digestifs des animaux, car elle fait intervenir le système hexokinase pour le dosage final du glucose.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 23-May-2024
• ICS: 65.120 - Animal feeding stuffs
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 10 - Animal feeding stuffs
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 10 - Animal feeding stuffs
• Current Stage: 6060 - International Standard published
• Start Date: 24-May-2024
• Due Date: 16-Sep-2025
• Completion Date: 24-May-2024

Standards Content (Sample)

International
Standard
ISO 15914-2
First edition
Animal feeding stuffs — Enzymatic
2024-05
determination of total starch
content —
Part 2:
Method by enzymatic determination
with a hexokinase system and
potassium hydroxide dispersion
Alimentation animale — Dosage enzymatique de la teneur totale
en amidon —
Partie 2: Méthode par dosage enzymatique avec un système
hexokinase et dispersion à l’hydroxyde de potassium
Reference number
© ISO 2024
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CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 1
6 Equipment . 2
7 Sampling . 3
8 Preparation of the sample for testing . 3
9 Operating procedure . 3
9.1 Test sample .3
9.2 Washing, dispersion and hydrolysis .3
9.3 Determination of glucose .3
9.4 Control of the efficiency of the enzyme .4
10 Expression of the results . 4
11 Precision . 5
11.1 Interlaboratory test . .5
11.2 Repeatability .5
11.3 Reproducibility .5
12 Test report . 5
Annex A (normative) Check on amyloglucosidase activity . 6
Annex B (informative) Result of the interlaboratory test . 8
Annex C (informative) Result of the washing test . 9
Bibliography .10

iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 10, Animal
feeding stuffs.
A list of all parts in the ISO 15914 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.

iv
International Standard ISO 15914-2:2024(en)
Animal feeding stuffs — Enzymatic determination of total
starch content —
Part 2:
Method by enzymatic determination with a hexokinase
system and potassium hydroxide dispersion
1 Scope
This document specifies an enzymatic method for determining starch in animal feeding stuffs containing
starchy ingredients (cereals, tubers, etc.). The method is also applicable to beans and to the animal digestive
contents because it involves the hexokinase system for the final glucose determination.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content constitutes
requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 6498, Animal feeding stuffs — Guidelines for sample preparation
3 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
4 Principle
Washing of the sample with a volume fraction of 40 % ethanol to eliminate the soluble sugars and soluble
starch degradation products. Dispersion of the residue by means of potassium hydroxide, hydrolysis of starch
into glucose units with amyloglucosidase, determination of the glucose obtained with a hexokinase system.
5 Reagents
Unless otherwise specified, use only reagents of recognized analytical grade and distilled water or water of
equivalent purity.
NOTE Reagents 5.7 to 5.10 are also marketed in the form of a ready-to-use kits.
5.1 Water, conforming to at least grade 3 in accordance with ISO 3696.

5.2 40 % ethanol (volume fraction) prepared as follows: Pour 400 ml of absolute ethanol into a 1 l
volumetric flask and make up the volume with water.
5.3 Potassium hydroxide solution, at 1 mol/l.
5.4 Acetic acid, minimum purity of 96 %.
5.5 Amyloglucosidase of Aspergillus niger, glucose-free. The activity shall be checked when opening a
new batch using the method described in Annex A.
5.6 Aqueous solution of amyloglucosidase (5.5) with an activity of (1 500 ± 100) units/ml and prepared
extemporaneously.
A unit is defined as being a µmole of glucose released/min/gram of enzyme.
5.7 Triethanolamine buffer solution, prepared as follows:
In a 250 ml beaker, weigh 14 g of triethanolamine hydrochloride and 0,25 g of magnesium sulfate
heptahydrate, add 80 ml of water and dissolve. Then, add 5 ml of 5 N aqueous soda, homogenize and bring to
pH 7,6 ± 0,1 using the potassium hydroxide solution (5.3). Transfer to a 100 ml volumetric flask and make up
the volume with water. Agitate and keep in the refrigerator.
5.8 NADPH solution, prepared as follows:
Dissolve 60 mg of NADPH disodium salt in 6 ml of water. This solution can be kept in the refrigerator for at
least four weeks.
5.9 ATP solution, prepared as follows:
In 6 ml of water, dissolve 300 mg of sodium bicarbonate and 300 mg of ATP disodium salt. This solution can
be kept in the refrigerator for four weeks.
5.10 Suspension of HK/G6P-DH, prepared as follows:
Mix 1 ml of ammonium sulfate solution (3,2 mol/l), 280 U of hexokinase (EC 2.7.1.1) and 140 U of glucose-
6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.49). This solution can be kept in the refrigerator for at least one year.
6 Equipment
The usual laboratory equipment and, in particular, the following shall be used.
6.1 Thermostatic bath, with magnetic or mechanical agitation, set to (60 ± 2) °C.
6.2 Centrifuge tubes, of 100 ml made of glass.
6.3 Centrifuge, for centrifuging the tubes (6.2) at about 2,000g.
6.4 Grinder, suitable for final crushing to a particle size of ≤ 0,5 mm. The percentage of particles passing
through a 0,5 mm screen shall be 95 % or more.
6.5 Spectrophotometer, ultraviolet (UV)/visible set to 340 nm or 365 nm.
6.6 pH-meter, for measurement to within 0,1 units pH.
6.7 Ultrasonic tank.
6.8 Micropipettes, for sampling volumes of 0,020 ml and 0,100 ml, verified beforehand.
6.9 Analytical balance, allowing weighing to the nearest 1 mg.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document. A sampling method is given in ISO 6497. It
is important for the laboratory to receive a truly representative sample that is not damaged or modified
during transport or storage.
8 Preparation of the sample for testing
Prepare the test sample in accordance with ISO 6498.
Prior degreasing is also recommended for products with a fat content higher than 5 % (for cold degreasing,
for example, fill the crucible containing the sample with acetone or petroleum ether, disperse the sample by
stirring, filter and let dry).
9 Operating procedure
9.1 Test sample
To the nearest 1 mg, weigh out a test sample prepared as in Clause 8, the mass of which will be calculated so
that it contains (100 ± 20) mg of starch.
9.2 Washing, dispersion and hydrolysis
In a centrifuge tube (6.2) containing the test sample (see 9.1) and a magnetized bar, if necessary, add 50 ml
of ethanol (5.2). Agitate for 20 min at ambient temperature and then place in and activate the centrifuge
(6.3) for 10 min. With a Pasteur pipette or other appropriate system, caref
...

Norme
internationale
ISO 15914-2
Première édition
Alimentation animale — Dosage
2024-05
enzymatique de la teneur totale en
amidon —
Partie 2:
Méthode par dosage enzymatique
avec un système hexokinase
et dispersion à l’hydroxyde de
potassium
Animal feeding stuffs — Enzymatic determination of total starch
content —
Part 2: Method by enzymatic determination with a hexokinase
system and potassium hydroxide dispersion
Numéro de référence
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2024
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: [phone]
E-mail: [e-mail]
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 1
5 Réactifs . 1
6 Équipement . 2
7 Échantillonnage . 3
8 Préparation de l’échantillon en vue des essais. 3
9 Mode opératoire . 3
9.1 Échantillon pour essai .3
9.2 Lavage, dispersion et hydrolyse .3
9.3 Dosage du glucose .4
9.4 Contrôle de l’efficacité de l’enzyme .4
10 Expression des résultats . 5
11 Fidélité . 5
11.1 Essai interlaboratoires .5
11.2 Répétabilité .5
11.3 Reproductibilité . .5
12 Rapport d’essai . 5
Annexe A (normative) Contrôle de l’activité amyloglucosidase . 6
Annexe B (informative) Résultats de l’essai interlaboratoires . 8
Annexe C (informative) Résultat de l’essai de lavage . 9
Bibliographie .11

iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse
www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou partie de
tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 10, Aliments des animaux.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 15914 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.

iv
Norme internationale ISO 15914-2:2024(fr)
Alimentation animale — Dosage enzymatique de la teneur
totale en amidon —
Partie 2:
Méthode par dosage enzymatique avec un système
hexokinase et dispersion à l’hydroxyde de potassium
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode enzymatique de dosage de l’amidon dans l’alimentation animale
contenant des ingrédients amylacés (céréales, tubercules, etc.). La méthode s’applique également aux fèves
et aux contenus digestifs des animaux, car elle fait intervenir le système hexokinase pour le dosage final du
glucose.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
ISO 6498, Aliments des animaux — Lignes directrices pour la préparation des échantillons
3 Termes et définitions
Aucun terme n’est défini dans le présent document.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
4 Principe
Lavage de l’échantillon avec une fraction volumique d’éthanol à 40 % pour éliminer les sucres solubles et
les produits solubles de dégradation de l’amidon. Dispersion du résidu au moyen d’hydroxyde de potassium,
hydrolyse de l’amidon en unités de glucose avec de l’amyloglucosidase, dosage du glucose obtenu par un
système hexokinase.
5 Réactifs
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau
distillée ou de pureté équivalente.
NOTE Les réactifs 5.7 à 5.10 sont également commercialisés sous forme de kits prêts à l’emploi.

5.1 Eau, au moins de qualité 3 conformément à l’ISO 3696.
5.2 Éthanol à 40 % (fraction volumique) préparé de la manière suivante: Verser 400 ml d’éthanol absolu
dans une fiole jaugée d’un litre et compléter au volume avec de l’eau.
5.3 Solution d’hydroxyde de potassium, à 1 mol/l.
5.4 Acide acétique d’une pureté minimale de 96 %.
5.5 Amyloglucosidase d’Aspergillus niger, exempte de glucose. L’activité doit être vérifiée à l’ouverture
d’un nouveau lot en utilisant la méthode décrite à l’Annexe A.
5.6 Solution aqueuse d’amyloglucosidase (5.5) d’une activité de (1 500 ± 100) unités/ml et préparée
extemporanément.
Une unité est définie comme étant une µmole de glucose libérée/min/gramme d’enzyme.
5.7 Solution tampon de triéthanolamine, préparée comme suit:
Dans un bécher de 250 ml, peser 14 g de chlorhydrate de triéthanolamine et 0,25 g de sulfate de magnésium
heptahydraté, ajouter 80 ml d’eau et dissoudre. Ajouter ensuite 5 ml de soude aqueuse 5 N, homogénéiser et
amener à une valeur de pH de 7,6 ± 0,1 au moyen de la solution d’hydroxyde de potassium (5.3). Transvaser
dans une fiole jaugée de 100 ml et compléter au volume avec de l’eau. Agiter et conserver au réfrigérateur.
5.8 Solution de NADPH, préparée comme suit:
Dissoudre 60 mg de sel disodique NADPH dans 6 ml d’eau. Cette solution peut être conservée au moins
quatre semaines au réfrigérateur.
5.9 Solution d’ATP, préparée comme suit:
Dans 6 ml d’eau, dissoudre 300 mg de bicarbonate de sodium et 300 mg de sel disodique d’ATP. Cette solution
peut être conservée quatre semaines au réfrigérateur.
5.10 Suspension de HK/G6P-DH, préparée comme suit:
Mélanger 1 ml de solution de sulfate d’ammonium (3,2 mol/l), 280 U d’hexokinase (EC 2.7.1.1) et 140 U de
glucose-6-phosphate déshydrogénase (EC 1.1.1.49). Cette solution peut être conservée au moins un an au
réfrigérateur.
6 Équipement
Le matériel courant de laboratoire et, en particulier, les éléments suivants doivent être utilisés:
6.1 Bain thermostaté à agitation magnétique ou mécanique, réglé à (60 ± 2) °C.
6.2 Tubes à centrifuger de 100 ml en verre.
6.3 Centrifugeuse permettant de centrifuger les tubes (6.2) à environ 2 000 g.
6.4 Broyeur, adapté à un broyage final de granulométrie ≤ 0,5 mm. Le pourcentage de particules passant
à travers un tamis de 0,5 mm doit être d’au moins 95 %.
6.5 Spectrophotomètre ultraviolet (UV)/visible réglé à 340 nm ou 365 nm.

6.6 pH-mètre, capable de mesurer à 0,1 unité de pH près.
6.7 Cuve à ultrasons.
6.8 Micropipettes adaptées à des volumes d’échantillonnage de 0,020 ml et 0,100 ml, préalablement
vérifiées.
6.9 Balance analytique, permettant de peser à 1 mg près.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Une méthode
d’échantillonnage est donnée dans l’ISO 6497. Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon
réellement représentatif qui n’est ni endomma
...