Animal feeding stuffs — Determination of tryptophan content

ISO 13904:2016 specifies a method for determination of the total and free tryptophan (Trp) content in feeding stuffs (e.g. complete and complementary feeds, supplementary feeds, raw materials, ingredients, and concentrates) and determination of free tryptophan in commercial pure substances and premixtures containing more than 2 % of tryptophan. It does not distinguish between D- and L-forms.

Aliments des animaux — Dosage du tryptophane

ISO 13904:2016 décrit une méthode de dosage du tryptophane total et libre (Trp) dans les aliments pour animaux (par exemple aliments complets et complémentaires, compléments alimentaires, matières premières, ingrédients et concentrés) et une méthode de dosage du tryptophane libre dans les substances pures du commerce et les prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane. Elle ne fait pas la distinction entre les formes D et L.

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Publication Date
10-Feb-2016
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05-Jun-2021
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ISO 13904:2016 - Animal feeding stuffs -- Determination of tryptophan content
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ISO 13904:2016 - Aliments des animaux -- Dosage du tryptophane
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 13904
Second edition
2016-02-15
Animal feeding stuffs —
Determination of tryptophan content
Aliments des animaux — Dosage du tryptophane
Reference number
ISO 13904:2016(E)
ISO 2016
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 13904:2016(E)
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written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

the requester.
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www.iso.org
ii © ISO 2016 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 13904:2016(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 1

3 Reagents and materials ................................................................................................................................................................................. 1

4 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 3

5 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 4

5.1 Preparation of samples .................................................................................................................................................................... 4

5.1.1 Feeding stuffs ...................................................................................................................................................................... 4

5.1.2 Commercial pure substances and premixtures containing more than 2 %

of tryptophan ...................................................................................................................................................................... 4

5.2 Determination of free tryptophan (extract) .................................................................................................................. 4

5.2.1 Feeding stuffs ...................................................................................................................................................................... 4

5.2.2 Commercial pure substances and premixtures containing more than 2 %

of tryptophan ...................................................................................................................................................................... 4

5.3 Determination of total tryptophan (hydrolysates) .................................................................................................. 5

5.4 HPLC determination ........................................................................................................................................................................... 5

6 Calculation of results ....................................................................................................................................................................................... 6

6.1 Feeding stuffs ........................................................................................................................................................................................... 6

6.2 Commercial pure products and premixtures containing more than 2 % of tryptophan ........ 6

6.2.1 Control of the calibration.......................................................................................................................................... 6

6.2.2 Calculation ............................................................................................................................................................................. 6

7 Precision ....................................................................................................................................................................................................................... 7

7.1 Interlaboratory test............................................................................................................................................................................. 7

7.1.1 Feeding stuffs ...................................................................................................................................................................... 7

7.1.2 Commercial pure substances and premixtures containing more than 2 %

of tryptophan ...................................................................................................................................................................... 7

7.2 Repeatability ............................................................................................................................................................................................. 7

7.2.1 Feeding stuffs ...................................................................................................................................................................... 7

7.2.2 Commercial pure substances and premixtures containing more than 2 %

of tryptophan ...................................................................................................................................................................... 7

7.3 Reproducibility ....................................................................................................................................................................................... 7

7.3.1 Feeding stuffs ...................................................................................................................................................................... 7

7.3.2 Pure products and premixtures containing more than 2 % of tryptophan .................. 8

8 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 8

Annex A (informative) Results of an interlaboratory test .............................................................................................................. 9

Annex B (informative) Observations on the method ........................................................................................................................11

Annex C (informative) Sample preparation: Example for analyses in pure products

and premixtures ................................................................................................................................................................................................12

Annex D (informative) Results of an interlaboratory test for tryptophan in pure products

and premixtures containing more than 2 % of tryptophan .................................................................................13

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................14

© ISO 2016 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 13904:2016(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity

assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical

Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information

The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 10, Animal

feeding stuffs.

This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 13904:2005), which has been

technically revised.
iv © ISO 2016 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 13904:2016(E)
Animal feeding stuffs — Determination of tryptophan
content
1 Scope

This International Standard specifies a method for determination of the total and free tryptophan (Trp)

content in feeding stuffs (e.g. complete and complementary feeds, supplementary feeds, raw materials,

ingredients, and concentrates) and determination of free tryptophan in commercial pure substances

and premixtures containing more than 2 % of tryptophan.
It does not distinguish between D- and L-forms.
2 Principle

For the determination of the total tryptophan, the sample is hydrolysed under alkaline conditions

with saturated barium hydroxide solution and heated to 110 °C for 20 h. After hydrolysis, an internal

standard is added.

For the determination of free tryptophan, the sample is extracted under mild acidic conditions in the

presence of an internal standard. For commercial pure substances and premixtures containing more

than 2 % of tryptophan, it is possible to add the internal standard after the extraction.

The tryptophan and the internal standard in the hydrolysate or in the extract are determined by

reversed phase C HPLC with fluorescence detection.
3 Reagents and materials
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.

3.1 Double-distilled water, or water of equivalent purity (conductivity <10 μS/cm).

3.2 Standard substance and control substance: tryptophan (purity ≥99 %) dried under vacuum

over phosphorus pentoxide.

The two products are considered as 100 % pure. Control substance shall come from another

manufacturer than the standard substance (see 3.17.2).

NOTE The control of the purity of the standard substance can be performed by measuring the absorbance

of a solution of tryptophan at 280 nm. Prepare a solution of about 5 mg/l in HCl 10 N from a stock solution and

measure the Optical Density (OD) at 280 nm versus HCl 10 N. Then, the concentration of tryptophan is:

+06
C = OD/5 630 * 10
where
5 630 is the molar extinction coefficient of tryptophan in water at 280 nm;
C is expressed in μmole/l.

The standard substance purity is then (C/C )*100 where C is the theoretical concentration of the diluted

0 0
solution, expressed in μmole/l (about 25 μmole/l).
The control of the purity is performed every 6 months of use; it shall be ≥99 %.
© ISO 2016 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 13904:2016(E)

3.3 Internal standard substance: α-methyltryptophan (purity ≥99 %), dried under vacuum over

phosphorus pentoxide.
3.4 Barium hydroxide octahydrate.

Care should be taken not to expose the Ba(OH) 8H O excessively to air in order to avoid formation of

2 2
BaCO , which could disturb the determination (see observation in B.3).
3.5 Sodium hydroxide.
3.6 Orthophosphoric acid, w = 85 %.
3.7 Concentrated hydrochloric acid, ρ = 1,19 g/ml.
3.8 Methanol, HPLC grade.
3.9 Light petroleum, boiling range 40 °C to 60 °C.
3.10 Sodium hydroxide solution, c = 1 mol/l.

Dissolve 40,0 g of NaOH (3.5) in water (3.1) and make up to 1 l with water (3.1).

3.11 Hydrochloric acid, c = 6 mol/l.
Take 492 ml of HCl (3.7) and make up to 1 l with water (3.1).
3.12 Hydrochloric acid, c = 1 mol/l.
Take 82 ml of HCl (3.7) and make up to 1 l with water (3.1).
3.13 Hydrochloric acid, c = 0,1 mol/l.
Take 8,2 ml of HCl (3.7) and make up to 1 l with water (3.1).
3.14 Orthophosphoric acid, c = 0,5 mol/l.
Take 34 ml of orthophosphoric acid (3.6) and make up to 1 l with water (3.1).

3.15 Concentrated tryptophan standard solution and control solution (3.2), c = 0,50 g/l.

In a 500 ml volumetric flask, dissolve 0,25 g of tryptophan (3.2) (weighed to the nearest 0,1 mg) in

hydrochloric acid (3.13) and make up to the mark with hydrochloric acid (3.13). Store at approximately

-18 °C for a maximum of four weeks.
3.16 Concentrated internal standard solution, c = 0,54 g/l.

In a 500 ml volumetric flask, dissolve 0,27 g of α-methyltryptophan (3.3) (weighed to the nearest

0,1 mg) in hydrochloric acid (3.13) and make up to the mark with hydrochloric acid (3.13). Store at

approximately -18 °C for a maximum of four weeks.
3.17 Calibration standard solutions of tryptophan and internal standard.

3.17.1 Calibration standard solution for the analysis of tryptophan in feeding stuffs, (c = 0,010 g/l).

Take 2,00 ml of the concentrated tryptophan solution (3.15) and 2,00 ml of concentrated internal

standard solution (α-methyltryptophan) (3.16). Dilute with water (3.1) and methanol (3.8)

2 © ISO 2016 – All rights reserved
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ISO 13904:2016(E)

to approximately the same volume and to approximately the same concentration of methanol

(10 % to 30 %) as the finished hydrolysate.
This solution shall be prepared freshly before use.
Protect from direct sunlight during preparation.

3.17.2 Calibration standard solution of tryptophan for the analysis of tryptophan in commercial

pure substances and premixtures containing more than 2 % of tryptophan, (c = 0,010 g/l).

Take 2,00 ml of the concentrated tryptophan solution (3.15) and 2,00 ml of concentrated internal

standard solution (α-methyltryptophan) (3.16).

Dilute it with hydrochloric acid 0,1 mol/l (3.13) in a 100 ml volumetric flask. Fill up to the mark.

This solution shall be prepared freshly before use.
Protect from direct sunlight during preparation.

For verification of the calibration standard solution, it is possible to use a control solution of tryptophan.

This control solution is prepared and analyzed as it is described for the calibration standard solution,

but shall come from another manufacturer than the standard substance (3.2). The recovery of

tryptophan in the control solution sample shall be between 99 % and 101 %.
3.18 Ethanolamine >98 %.
3.19 1,1,1-Trichloro-2-methyl-2-propanol solution.
Add 1 g of 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol to 100 ml of methanol (3.8).

NOTE 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol solution (3.19) could be considered critical for environmental

reasons and may require special disposal.
3.20 Mobile phase for HPLC.

Dissolve 3,00 g of acetic acid in 900 ml of water (3.1) and add 50,0 ml of 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol

solution (3.19). Adjust the pH to 5,00 using ethanolamine (3.18). Make up to 1 000 ml with water (3.1).

Shelf life of the mobile phase (especially stability of the mixture of acetic acid and ethanolamine) has to

be checked by the retention times.

See also Annex B for an alternative mobile phase: The mixture of phosphate buffer and methanol is

cheaper and harmless; pH adjustment is not necessary. The mixture is very stable.

4 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
4.1 HPLC equipment with a spectrofluorimetric detector.

4.2 Liquid chromatographic column, 125 mm × 4 mm, with C , 3 μm packing, or equivalent.

4.3 pH-meter.
4.4 Polypropylene flask, of capacity 125 ml, with wide neck and screw cap.

4.5 Membrane filter consisting of cellulose acetate (0,45 μm or 0,22 μm pore size).

© ISO 2016 – All rights reserved 3
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ISO 13904:2016(E)

4.6 Autoclave, capable of being maintained at (110 ± 2) °C, [(140 ± 10) kPa (1,4 ± 0,1) bar].

A pressure-tight covered dish that may be put into a drying oven adjustable to (110 ± 2) °C can be used.

4.7 Mechanical shaker or magnetic stirrer.
4.8 Vortex mixer.
4.9 Glassware – filters.
4.10 Graduated Erlen meyers flasks: 200 ml, 250 ml, 600 ml.
4.11 Volumetric: 100 ml, 500 ml, 1 000 ml (all class A).
5 Procedure
5.1 Preparation of samples
5.1.1 Feeding stuffs

Grind the sample to pass through a 0,5 mm sieve. Samples high in moisture shall be either air-dried at a

temperature not exceeding 50 °C or freeze-dried prior to grinding. Samples with high fat content shall

be extracted with light petroleum (3.9) prior to grinding.

5.1.2 Commercial pure substances and premixtures containing more than 2 % of tryptophan

Grind the sample to pass through to a 0,25 mm sieve and homogenize it well.
5.2 Determination of free tryptophan (extract)
5.2.1 Feeding stuffs

Weigh, to the nearest 1 mg, an appropriate amount (1 g to 5 g) of the prepared sample (5.1.1) into a

conical flask. Add 100,0 ml of hydrochloric acid, (3.13) and 5,00 ml of concentrated internal standard

solution (3.16). Shake or mix for 60 min using a mechanical shaker or a magnetic stirrer (4.7).

Allo
...

DRAFT INTERNATIONAL STANDARD
ISO/DIS 13904
ISO/TC 34/SC 10 Secretariat: ISIRI
Voting begins on: Voting terminates on:
2014-12-04 2015-05-04
Animal feeding stuffs — Determination of tryptophan
content
Aliments des animaux — Détermination de la teneur en tryptophane
ICS: 65.120
ISO/CEN PARALLEL PROCESSING
This draft has been developed within the International Organization for
Standardization (ISO), and processed under the ISO lead mode of collaboration
as defined in the Vienna Agreement.
This draft is hereby submitted to the ISO member bodies and to the CEN member
bodies for a parallel five month enquiry.

Should this draft be accepted, a final draft, established on the basis of comments

received, will be submitted to a parallel two-month approval vote in ISO and
THIS DOCUMENT IS A DRAFT CIRCULATED
formal vote in CEN.
FOR COMMENT AND APPROVAL. IT IS
THEREFORE SUBJECT TO CHANGE AND MAY
NOT BE REFERRED TO AS AN INTERNATIONAL
STANDARD UNTIL PUBLISHED AS SUCH.
To expedite distribution, this document is circulated as received from the
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
committee secretariat. ISO Central Secretariat work of editing and text
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL,
composition will be undertaken at publication stage.
TECHNOLOGICAL, COMMERCIAL AND
USER PURPOSES, DRAFT INTERNATIONAL
STANDARDS MAY ON OCCASION HAVE TO
BE CONSIDERED IN THE LIGHT OF THEIR
POTENTIAL TO BECOME STANDARDS TO
WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
Reference number
NATIONAL REGULATIONS.
ISO/DIS 13904:2014(E)
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED
TO SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS,
NOTIFICATION OF ANY RELEVANT PATENT
RIGHTS OF WHICH THEY ARE AWARE AND TO
PROVIDE SUPPORTING DOCUMENTATION. ISO 2014
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/DIS 13904:2014(E)
Copyright notice

This ISO document is a Draft International Standard and is copyright-protected by ISO. Except as

permitted under the applicable laws of the user’s country, neither this ISO draft nor any extract

from it may be reproduced, stored in a retrieval system or transmitted in any form or by any means,

electronic, photocopying, recording or otherwise, without prior written permission being secured.

Requests for permission to reproduce should be addressed to either ISO at the address below or ISO’s

member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
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Reproduction may be subject to royalty payments or a licensing agreement.
Violators may be prosecuted.
ii © ISO 2014 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/DIS 13904
Contents Page

Foreword ............................................................................................................................................................ iv

1 Scope ...................................................................................................................................................... 1

2 Principle.................................................................................................................................................. 1

3 Reagents and materials ........................................................................................................................ 1

4 Apparatus ............................................................................................................................................... 3

5 Procedure ............................................................................................................................................... 4

5.1 Preparation of samples ......................................................................................................................... 4

5.2 Determination of free tryptophan (extract) ......................................................................................... 4

5.3 Determination of total tryptophan (hydrolysates) .............................................................................. 5

5.4 HPLC determination .............................................................................................................................. 6

6 Calculation of results ............................................................................................................................ 6

6.1 Feeding stuffs ........................................................................................................................................ 6

6.2 Commercial pure products and premixtures containing more than 2 % of tryptophan ................ 7

7 Precision................................................................................................................................................. 7

7.1 Interlaboratory test ................................................................................................................................ 7

7.2 Repeatability .......................................................................................................................................... 8

7.3 Reproducibility ...................................................................................................................................... 8

8 Test report .............................................................................................................................................. 8

Annex A (informative) Results of an interlaboratory test ............................................................................. 9

Annex B (informative) Observations on the method ................................................................................... 11

Annex C (informative) Table of sample preparation : example for analyses in pure products and

premixtures .......................................................................................................................................... 12

Annex D Results of an interlaboratory test for tryptophan in pure products and premixtures

containing more than 2 % of tryptophan .......................................................................................... 13

Bibliography ...................................................................................................................................................... 14

© ISO 2014 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/DIS 13904
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies

(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO

technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been

established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and

non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the

International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards

adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an

International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

ISO 13904 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 10, Animal

feeding stuffs.

This second/third/... edition cancels and replaces the first/second/... edition (), [clause(s) / subclause(s) /

table(s) / figure(s) / annex(es)] of which [has / have] been technically revised.

iv © ISO 2014 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/DIS 13904
Animal feeding stuffs — Determination of tryptophan content
1 Scope

This International Standard describes a method for determination of the total and free tryptophan (Trp) content

in feeding stuffs (e.g. complete and complementary feeds, supplementary feeds, raw materials, ingredients,

and concentrates) and determination of free tryptophan in commercial pure substances and premixtures

containing more than 2 % of tryptophan.
It does not distinguish between D- and L-forms.
2 Principle

For the determination of the total tryptophan, the sample is hydrolysed under alkaline conditions with

saturated barium hydroxide solution and heated to 110 C for 20 h. After hydrolysis, an internal standard is

added.

For the determination of free tryptophan, the sample is extracted under mild acidic conditions in the presence

of an internal standard. For commercial pure substances and premixtures containing more than 2 % of

tryptophan, it is possible to add the internal standard after the extraction because if it is added before, a large

volume of a large is necessary.

The tryptophan and the internal standard in the hydrolysate or in the extract are determined by reversed

phase C HPLC with fluorescence detection.
3 Reagents and materials
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.

3.1 Double-distilled water, or water of equivalent purity (conductivity < 10 S/cm).

3.2 Standard substance and control substance: tryptophan (purity/content w  99 %) dried under

vacuum over phosphorus pentoxide. The product is considered as 100 % pure.

NOTE The control of the purity of the standard substance can be performed by measuring the absorbance of a

solution of tryptophan at 280 nm. Prepare a solution of about 5 mg/l in HCl 10-3 N from a stock solution and measure the

OD at 280 nm versus HCl 10-3 N. Then, the concentration of tryptophan is: C = OD/5630 * 10exp06 where:

 5630 is the molar extinction coefficient of tryptophan in water à 280 nm;
 C is expressed in mole/ l.

The standard substance purity is then: (C/C )*100 where C is the theoretical concentration of the diluted, expressed in

0 0
mole/l, about 25 mole/l.

The control of the purity is performed every 6 months of use; it shall be  99 %.

3.3 Internal standard substance: -methyltryptophan (purity/content w  99 %), dried under vacuum

over phosphorus pentoxide.
© ISO 2014 – All rights reserved
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO/DIS 13904
3.4 Barium hydroxide octahydrate.

Care should be taken not to expose the Ba(OH) 8H O excessively to air in order to avoid formation of

2 2
BaCO , which could disturb the determination (see observation in B.3).
3.5 Sodium hydroxide.
3.6 Orthophosphoric acid, w = 85 %.
3.7 Concentrated hydrochloric acid,  = 1,19 g/ml.
3.8 Methanol, HPLC grade.
3.9 Light petroleum, boiling range 40 C to 60 C.
3.10 Sodium hydroxide solution, c = 1 mol/l.

Dissolve 40,0 g of NaOH (3.5) in water (3.1) and make up to 1 l with water (3.1).

3.11 Hydrochloric acid, c = 6 mol/l.
Take 492 ml of HCl (3.7) and make up to 1 l with water (3.1).
3.12 Hydrochloric acid, c = 1 mol/l.
Take 82 ml of HCl (3.7) and make up to 1 l with water (3.1).
3.13 Hydrochloric acid, c = 0,1 mol/l.
Take 8,2 ml of HCl (3.7) and make up to 1 l with water (3.1).
3.14 Orthophosphoric acid, c = 0,5 mol/l.
Take 34 ml of orthophosphoric acid (3.6) and make up to 1 l with water (3.1).
3.15 Concentrated tryptophan solutions (3.2), c = 0,50 g/l.

In a 500 ml volumetric flask, dissolve 0,25 g of tryptophan (3.2) (weighed to the nearest 0,1 mg) in

hydrochloric acid (3.13) and make up to the mark with hydrochloric acid (3.13). Store at approximately - 18 C

for a maximum of four weeks.
3.16 Concentrated internal standard solution, c = 0,54 g/l.

In a 500 ml volumetric flask, dissolve 0,27 g of -methyltryptophan (3.3) (weighed to the nearest 0,1 mg) in

hydrochloric acid (3.13) and make up to the mark with hydrochloric acid (3.13). Store at approximately - 18 C

for a maximum of four weeks.
3.17 Calibration standard solutions of tryptophan and internal standard.

3.17.1 Calibration standard solution for the analysis of tryptophan in feeding stuffs (c = 0,010 g/l)

Take 2,00 ml of the concentrated tryptophan solution (3.15) and 2,00 ml of concentrated internal standard

solution (-methyltryptophan) (3.16). Dilute with water (3.1) and methanol (3.8) to approximately the same

volume and to approximately the same concentration of methanol (10 % to 30 %) as the finished hydrolysate.

© ISO 2014 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/DIS 13904
This solution shall be prepared freshly before use.
Protect from direct sunlight during preparation.

3.17.2 Calibration standard solution of tryptophan for the analysis of tryptophan in commercial pure

substances and premixtures containing more than 2 % of tryptophan (c = 0,010 g/l)

Take 2,00 ml of the concentrated tryptophan solution (3.15) and 2,00 ml of concentrated internal standard

solution (-methyltryptophan) (3.16).

Dilute it with hydrochloric acid 0,1 mol/l (3.13) in a 100 ml volumetric flask. Fill up to the mark.

This solution shall be prepared freshly before use
Protect from direct sunlight during preparation

NOTE For verification of the calibration standard solution it is possible to use a control solution of tryptophan. This

control solution is prepared and analysed as it is described for the calibration standard solution but shall come from

another manufacturer than the standard substance (3.2). The recovery of tryptophan in the control solution sample shall

between 99 % to 101 %.
3.18 Ethanolamine  98 %.
3.19 1,1,1-Trichloro-2-methyl-2-propanol solution.
Add 1 g of 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol to 100 ml of methanol (3.8).
3.20 Mobile phase for HPLC.

Dissolve 3,00 g of acetic acid in 900 ml of water (3.1) and add 50,0 ml of 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol

solution (3.19). Adjust the pH to 5,00 using ethanolamine (3.18). Make up to 1 000 ml with water (3.1).

4 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
4.1 HPLC equipment with a spectrofluorimetric detector.

4.2 Liquid chromatographic column, 125 mm  4 mm, with C , 3 m packing, or equivalent.

4.3 pH-meter.
4.4 Polypropylene flask, of capacity 125 ml, with wide neck and screw cap.

4.5 Membrane filter consisting of cellulose acetate (0,45 m or 0,22 m pore size).

4.6 Autoclave, capable of being maintained at (110  2) C, [(140  10) kPa (1,4  0,1) bar].

A pressure-tight covered dish that may be put into a drying oven adjustable to (110  2) C may be used.

4.7 Mechanical shaker or magnetic stirrer.
4.8 Vortex mixer
4.9 Glassware – filters
4.10 Graduated Erlen meyers flasks: 200 ml, 250 ml, 600ml
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ISO/DIS 13904
4.11 Volumetric : 100 ml, 500 ml, 1000 ml (all class A).
5 Procedure
5.1 Preparation of samples
5.1.1 Feeding stuffs

Grind the sample to pass through a 0,5 mm sieve. Samples high in moisture shall be either air-dried at a

temperature not exceeding 50 °C or freeze-dried prior to grinding. Samples with high fat content shall be

extracted with light petroleum (3.9) prior to grinding.

5.1.2 Commercial pure substances and premixtures containing more than 2 % of tryptophan

Grind the sample to pass through to a 0,25 mm sieve and homogenize it well.
5.2 Determination of free tryptophan (extract)
5.2.1 Feeding stuffs

Weigh, to the nearest 1 mg, an appropriate amount (1 g to 5 g) of the prepared sample (5.1.1) into a conical

flask. Add 100,0 ml of hydrochloric acid, (3.13) and 5,00 ml of concentrated internal standard solution (3.16).

Shake or mix for 60 min using a mechanical shaker or a magnetic stirrer (4.7). Allow the sediment to settle

and pipette 10,0 ml of the supernatant solution into a beaker. Add 5 ml of orthophosphoric acid (3.14). Adjust

the pH to 3,0 using sodium hydroxide (3.10). Add sufficient methanol (3.8) to give a concentration of between

10 % and 30 % of methanol in the final volume. Transfer to a volumetric flask of appropriate volume and dilute

with water (3.1) to a volume necessary for the chromatography [approximately the same volume as the

calibration standard solution (3.17.1)].

Filter a few millilitres of the solution through a 0,45 m membrane filter (4.5) before injection on the HPLC

column. Proceed to the chromatography step according to 5.4.

Protect the standard solution and extracts against direct sunlight. If it is not possible to analyse the

hydrolysates the same day, they may be stored at 5 C for a maximum of three days

5.2.2 Commercial pure substances and premixtures containing more than 2 % of tryptophan

Weigh to the nearest of 0,1 mg, 0,5 g to 5 g of well homogenized sample (5.1.2), depending on the expected

concentration of tryptophan in the sample (in accordance with Table 1) into a 1000 ml volumetric flask.

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ISO/DIS 13904
Table 1 — Sample weight according to the expected value of free Tryptop
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 13904
Deuxième édition
2016-02-15
Aliments des animaux — Dosage du
tryptophane
Animal feeding stuffs — Determination of tryptophan content
Numéro de référence
ISO 13904:2016(F)
ISO 2016
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ISO 13904:2016(F)
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ISO 13904:2016(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 1

3 Réactifs et matériaux ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 3

5 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 4

5.1 Préparation des échantillons ...................................................................................................................................................... 4

5.1.1 Aliments .................................................................................................................................................................................. 4

5.1.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 %

de tryptophane .................................................................................................................................................................. 4

5.2 Dosage du tryptophane libre (extrait) ................................................................................................................................ 4

5.2.1 Aliments .................................................................................................................................................................................. 4

5.2.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 %

de tryptophane .................................................................................................................................................................. 4

5.3 Dosage du tryptophane total (hydrolysats) ................................................................................................................... 5

5.4 Dosage par CLHP ................................................................................................................................................................................... 5

6 Calcul des résultats ............................................................................................................................................................................................ 6

6.1 Aliments ........................................................................................................................................................................................................ 6

6.2 Produits purs du commerce et prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane .............. 6

6.2.1 Contrôle de l’étalonnage ........................................................................................................................................... 6

6.2.2 Calcul .......................................................................................................................................................................................... 7

7 Fidélité ............................................................................................................................................................................................................................ 7

7.1 Essai interlaboratoires ..................................................................................................................................................................... 7

7.1.1 Aliments .................................................................................................................................................................................. 7

7.1.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 %

de tryptophane .................................................................................................................................................................. 7

7.2 Répétabilité ................................................................................................................................................................................................ 7

7.2.1 Aliments .................................................................................................................................................................................. 7

7.2.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 %

de tryptophane .................................................................................................................................................................. 7

7.3 Reproductibilité ..................................................................................................................................................................................... 8

7.3.1 Aliments .................................................................................................................................................................................. 8

7.3.2 Substances pures et prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane .................. 8

8 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 8

Annexe A (informative) Résultats d’un essai interlaboratoires ............................................................................................... 9

Annexe B (informative) Observations sur la méthode ....................................................................................................................11

Annexe C (informative) Préparation des échantillons: Exemples portant sur des analyses

dans des produits purs et des prémélanges .........................................................................................................................12

Annexe D (informative) Résultats d’un essai interlaboratoires portant sur le tryptophane

dans les produits purs et les prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane ...................13

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................15

© ISO 2016 – Tous droits réservés iii
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ISO 13904:2016(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.

iso.org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer

un engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à

l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes

de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —

Informations supplémentaires.

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires,

sous-comité SC 10, Aliments des animaux.

Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 13904:2005), qui a fait l’objet d’une

révision technique.
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NORME INTERNATIONALE ISO 13904:2016(F)
Aliments des animaux — Dosage du tryptophane
1 Domaine d’application

La présente Norme internationale décrit une méthode de dosage du tryptophane total et libre (Trp)

dans les aliments pour animaux (par exemple aliments complets et complémentaires, compléments

alimentaires, matières premières, ingrédients et concentrés) et une méthode de dosage du tryptophane

libre dans les substances pures du commerce et les prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane.

Elle ne fait pas la distinction entre les formes D et L.
2 Principe

Pour le dosage du tryptophane total, l’échantillon est hydrolysé en milieu alcalin avec une solution

d’hydroxyde de baryum saturé et il est chauffé à 110 °C pendant 20 h. Après l’hydrolyse, un étalon

interne est ajouté.

Pour le dosage du tryptophane libre, l’échantillon est extrait en milieu légèrement acide en présence

d’un étalon interne. Pour les substances pures du commerce et les prémélanges contenant plus de 2 %

de tryptophane, il est possible d’ajouter l’étalon interne après l’extraction.

Le tryptophane et l’étalon interne dans l’hydrolysat ou l’extrait sont déterminés par CLHP avec une

séparation en phase inverse sur colonne C et détection fluorimétrique.
3 Réactifs et matériaux

Sauf spécification contraire, n’utiliser que des réactifs de qualité analytique reconnue.

3.1 Eau bidistillée, ou de pureté équivalente (conductivité < 10 µS/cm).

3.2 Substance étalon et substance de contrôle: tryptophane (pureté/teneur w ≥ 99 %) séché sous

vide sur du pentoxyde de phosphore. Le produit est considéré comme pur à 100 %.

Les deux produits sont considérés comme purs à 100 %. La substance de contrôle doit provenir d’un

autre fabricant que celui de la substance étalon (voir 3.17.2).

NOTE Le contrôle de pureté de la substance étalon peut être réalisé en mesurant l’absorbance d’une solution de

tryptophane à 280 nm. Préparer une solution d’environ 5 mg/l dans de l’HCl à 10 N à partir d’une solution mère et

mesurer l’absorbance OD à 280 nm par rapport à de l’HCl à 10 N. La concentration du tryptophane est alors:

+06
C = OD/5 630 * 10

5 630 est le coefficient d’extinction molaire du tryptophane dans l’eau à 280 nm;

C est exprimée en μmol/l.

La pureté de la substance étalon est alors (C/C )*100 où C est la concentration théorique de la solution diluée,

0 0
exprimée en μmol/l, égale à environ 25 μmol/l.
Le contrôle de pureté est réalisé tous les six mois; la pureté doit être ≥ 99 %.

3.3 Substance étalon interne: α-méthyl-tryptophane (pureté ≥ 99 %), séché sous vide sur du

pentoxyde de phosphore.
© ISO 2016 – Tous droits réservés 1
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ISO 13904:2016(F)
3.4 Hydroxyde de baryum octahydraté.

Il convient de veiller à ne pas exposer excessivement le Ba(OH) ⋅8H O à l’air afin d’éviter la formation de

2 2
BaCO , qui peut perturber le dosage (voir l’observation en B.3).
3.5 Hydroxyde de sodium.
3.6 Acide orthophosphorique, w = 85 %.
3.7 Acide chlorhydrique concentré, ρ = 1,19 g/ml.
3.8 Méthanol, qualité CLHP.
3.9 Éther de pétrole, plage d’ébullition entre 40 °C et 60 °C.
3.10 Solution d’hydroxyde de sodium, c = 1 mol/l.

Dissoudre 40,0 g de NaOH (3.5) dans de l’eau (3.1) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).

3.11 Acide chlorhydrique, c = 6 mol/l.
Prélever 492 ml de HCl (3.7) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).
3.12 Acide chlorhydrique, c = 1 mol/l.
Prélever 82 ml de HCl (3.7) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).
3.13 Acide chlorhydrique, c = 0,1 mol/l.
Prélever 8,2 ml de HCl (3.7) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).
3.14 Acide orthophosphorique, c = 0,5 mol/l.

Prélever 34 ml d’acide orthophosphorique (3.6) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).

3.15 Solution mère étalon de tryptophane et solution de contrôle (3.2), c = 0,50 g/l.

Dans une fiole jaugée de 500 ml, dissoudre 0,25 g de tryptophane (3.2) (pesé à 0,1 mg près) dans de

l’acide chlorhydrique (3.13) et compléter jusqu’au trait avec de l’acide chlorhydrique (3.13). Conserver à

environ -18 °C pendant quatre semaines maximum.
3.16 Solution mère d’étalon interne, c = 0,54 g/l.

Dans une fiole jaugée de 500 ml, dissoudre 0,27 g de α-méthyl-tryptophane (3.3) (pesé à 0,1 mg près)

dans de l’acide chlorhydrique (3.13) et ajuster au trait avec de l’acide chlorhydrique (3.13). Conserver à

environ -18 °C pendant quatre semaines maximum.
3.17 Solutions d’étalonnage de tryptophane et étalon interne

3.17.1 Solution d’étalonnage pour l’analyse du tryptophane dans les aliments pour animaux,

(c = 0,010 g/l).

Prélever 2,00 ml de solution mère de tryptophane (3.15) et 2,00 ml de solution mère d’étalon interne (α

méthyl-tryptophane) (3.16). Diluer avec de l’eau (3.1) et du méthanol (3.8) approximativement au même

volume et approximativement à la même concentration de méthanol (10 % à 30 %) que l’hydrolysat final.

2 © ISO 2016 – Tous droits réservés
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ISO 13904:2016(F)
Cette solution doit être préparée avant chaque utilisation.
La protéger de l’exposition directe au soleil au cours de la préparation.

3.17.2 Solution d’étalonnage pour l’analyse du tryptophane dans les substances pures du

commerce et les prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane, (c = 0,010 g/l).

Prélever 2,00 ml de solution mère de tryptophane (3.15) et 2,00 ml de solution mère d’étalon interne

(α-méthyl-tryptophane) (3.16).

Diluer avec de l’acide chlorhydrique à 0,1 mol/l (3.13) dans une fiole jaugée de 100 ml. Compléter

jusqu’au trait.
Cette solution doit être préparée avant chaque utilisation.
La protéger de l’exposition directe au soleil au cours de la préparation.

Pour la vérification de la solution d’étalonnage, il est possible d’utiliser une solution de contrôle

de tryptophane. Cette solution de contrôle est préparée et analysée comme décrit pour la solution

d’étalonnage, mais elle doit provenir d’un autre fabricant que celui de la substance étalon (3.2). La

concentration en tryptophane dans l’échantillon de contrôle doit être comprise entre 99 % et101 %.

3.18 Éthanolamine > 98 %.
3.19 Solution de 1,1,1-trichloro-2-méthyl-2-propanol.
Ajouter 1 g de 1,1,1-trichloro-2-méthyl-2-propanol à 100 ml de méthanol (3.8).

NOTE La solution de 1,1,1-trichloro-2-méthyl-2-propanol (3.19) pourrait être considérée dangereuse pour

des raisons environnementales et peut nécessiter des dispositions particulières pour son élimination.

3.20 Phase mobile pour CLHP.

Dissoudre 3,00 g d’acide acétique dans 900 ml d’eau (3.1) puis ajouter 50,0 ml de solution de 1,1,1

trichloro-2-méthyl-2-propanol (3.19). Ajuster le pH à 5,00 à l’aide d’éthanolamine (3.18). Compléter à

1 000 ml avec de l’eau (3.1).

La durée de conservation de la phase mobile (en particulier la stabilité du mélange d’acide acétique et

d’éthanolamine) doit être contrôlée par les temps de rétention.

Voir également l’Annexe B pour une phase mobile alternative: le mélange de tampon phosphate et

de méthanol est moins onéreux et sans danger et il n’est pas nécessaire d’ajuster le pH. Le mélange

est très stable.
4 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
4.1 Équipement pour CLHP avec détecteur spectrofluorimétrique.

4.2 Colonne de chromatographie en phase liquide, 125 mm × 4 mm, avec C , particules de 3 μm,

ou équivalent.
4.3 pH-mètre.

4.4 Flacon en polypropylène, d’une capacité de 125 ml, à large col et bouchon à vis.

4.5 Membrane filtrante en acétate de cellulose (de 0,45 µm ou 0,22 µm de porosité).

© ISO 2016 – Tous droits réservés 3
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ISO 13904:2016(F)

4.6 Autoclave, pouvant être maintenu à (110 ± 2) °C, [(140 ± 10) kPa (1,4 ± 0,1) bar].

Un boîtier fermé étanche à la pression placé dans une étuve de séchage réglable à (110 ± 2) °C peut

être utilisé.
4.7 Agitateur mécanique ou magnétique.
4.8 Mélangeur vortex.
4.9 Verrerie – filtres.
4.10 Erlenmeyers gradués: 200 ml, 250 ml, 600 ml.
4.11 Fioles jaugées: 100 ml, 500 ml, 1 000 ml (toutes de classe A).
5 Mode opératoire
5.1 Préparation des échantillons
5.1.1 Aliments

Broyer l’échantillon pour le réduire à une granulométrie de 0,5 mm. Les échantillons à fort taux

d’humidité doivent être séchés à l’air à une température maximale de 50 °C ou par lyophilisation avant

broyage. Les échantillons à forte teneur en matières grasses doivent subir une extraction par de l’éther

de pétrole (3.9) avant broyage.

5.1.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane

Broyer l’échantillon pour le réduire à une granulométrie de 0,25 mm et bien l’homogénéiser.

5.2 Dosage du tryptophane libre (extrait)
5.2.1 Aliments

Peser, à 1 mg près, une quantité appropriée (de 1 g à 5 g) de l’échantillon préparé (5.1.1) dans un

erlenmeyer. Ajouter 100,0 ml d’acide chlorhydrique (3.13) et 5,00 ml de la solution mère d’étalon interne

(3.16). Agiter ou mélanger pendant 60 min avec un agitateur mécanique ou magnétique (4.7). Laisser

décanter le sédiment et prélever à la pipette 10,0 ml de surnageant dans un bécher. Ajouter 5 ml d’acide

orthophosphorique (3.14). Ajuster le pH à 3,0 avec l’hydroxyde de sodium (3.10). Ajouter assez de

méthanol (3.8) pour obtenir une concentration comprise entre 10 % et 30 % de méthanol dans le volume

final. Transférer dans une fiole jaugée de volume approprié et diluer avec de l’eau (3.1) j

...

PROJET
NORME ISO/FDIS
FINAL
INTERNATIONALE 13904
ISO/TC 34/SC 10
Aliments des animaux — Dosage du
Secrétariat: ISIRI
tryptophane
Début de vote:
2015-10-29
Animal feeding stuffs — Determination of tryptophan content
Vote clos le:
2015-12-29
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT
INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSER-
Veuillez consulter les notes administratives en page iii
VATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT
CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMEN-
TATION EXPLICATIVE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS
INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET COM-
Numéro de référence
MERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
ISO/FDIS 13904:2015(F)
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR POSSI-
BILITÉ DE DEVENIR DES NORMES POUVANT
SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA RÉGLEMENTA-
TION NATIONALE. ISO 2015
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/FDIS 13904:2015(F)
TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN

Le présent projet final a été élaboré dans le cadre de l’Organisation internationale de normalisation (ISO) et

soumis selon le mode de collaboration sous la direction de l’ISO, tel que défini dans l’Accord de Vienne. Le

projet final a été établi sur la base des observations reçues lors de l’enquête parallèle sur le projet.

Le projet final est par conséquent soumis aux comités membres de l’ISO et aux comités membres du CEN en

parallèle à un vote d’approbation de deux mois au sein de l’ISO et à un vote formel au sein du CEN.

Les votes positifs ne doivent pas être accompagnés d’observations.
Les votes négatifs doivent être accompagnés des arguments techniques pertinents.
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Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 1

3 Réactifs et matériaux ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 3

5 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 4

5.1 Préparation des échantillons ...................................................................................................................................................... 4

5.1.1 Aliments .................................................................................................................................................................................. 4

5.1.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 %

de tryptophane .................................................................................................................................................................. 4

5.2 Dosage du tryptophane libre (extrait) ................................................................................................................................ 4

5.2.1 Aliments .................................................................................................................................................................................. 4

5.2.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 %

de tryptophane .................................................................................................................................................................. 4

5.3 Dosage du tryptophane total (hydrolysats) ................................................................................................................... 5

5.4 Dosage par CLHP ................................................................................................................................................................................... 5

6 Calcul des résultats ............................................................................................................................................................................................ 6

6.1 Aliments ........................................................................................................................................................................................................ 6

6.2 Produits purs du commerce et prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane .............. 6

6.2.1 Contrôle de l’étalonnage ........................................................................................................................................... 6

6.2.2 Calcul .......................................................................................................................................................................................... 7

7 Fidélité ............................................................................................................................................................................................................................ 7

7.1 Essai interlaboratoires ..................................................................................................................................................................... 7

7.1.1 Aliments .................................................................................................................................................................................. 7

7.1.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 %

de tryptophane .................................................................................................................................................................. 7

7.2 Répétabilité ................................................................................................................................................................................................ 7

7.2.1 Aliments .................................................................................................................................................................................. 7

7.2.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 %

de tryptophane .................................................................................................................................................................. 7

7.3 Reproductibilité ..................................................................................................................................................................................... 8

7.3.1 Aliments .................................................................................................................................................................................. 8

7.3.2 Substances pures et prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane .................. 8

8 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 8

Annexe A (informative) Résultats d’un essai interlaboratoires ............................................................................................... 9

Annexe B (informative) Observations sur la méthode ....................................................................................................................11

Annexe C (informative) Préparation des échantillons: Exemples portant sur des analyses

dans des produits purs et des prémélanges .........................................................................................................................12

Annexe D (informative) Résultats d’un essai interlaboratoires portant sur le tryptophane

dans les produits purs et les prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane ...................13

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................15

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ISO/FDIS 13904:2015(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.

iso.org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer

un engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à

l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes

de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —

Informations supplémentaires.

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires,

sous-comité SC 10, Aliments des animaux.

Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 13904:2005), qui a fait l’objet d’une

révision technique.
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PROJET FINAL DE NORME INTERNATIONALE ISO/FDIS 13904:2015(F)
Aliments des animaux — Dosage du tryptophane
1 Domaine d’application

La présente Norme internationale décrit une méthode de dosage du tryptophane total et libre (Trp)

dans les aliments pour animaux (par exemple aliments complets et complémentaires, compléments

alimentaires, matières premières, ingrédients et concentrés) et une méthode de dosage du tryptophane

libre dans les substances pures du commerce et les prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane.

Elle ne fait pas la distinction entre les formes D et L.
2 Principe

Pour le dosage du tryptophane total, l’échantillon est hydrolysé en milieu alcalin avec une solution

d’hydroxyde de baryum saturé et il est chauffé à 110 °C pendant 20 h. Après l’hydrolyse, un étalon

interne est ajouté.

Pour le dosage du tryptophane libre, l’échantillon est extrait en milieu légèrement acide en présence

d’un étalon interne. Pour les substances pures du commerce et les prémélanges contenant plus de 2 %

de tryptophane, il est possible d’ajouter l’étalon interne après l’extraction.

Le tryptophane et l’étalon interne dans l’hydrolysat ou l’extrait sont déterminés par CLHP avec une

séparation en phase inverse sur colonne C et détection fluorimétrique.
3 Réactifs et matériaux

Sauf spécification contraire, n’utiliser que des réactifs de qualité analytique reconnue.

3.1 Eau bidistillée, ou de pureté équivalente (conductivité < 10 µS/cm).

3.2 Substance étalon et substance de contrôle: tryptophane (pureté/teneur w ≥ 99 %) séché sous

vide sur du pentoxyde de phosphore. Le produit est considéré comme pur à 100 %.

Les deux produits sont considérés comme purs à 100 %. La substance de contrôle doit provenir d’un

autre fabricant que celui de la substance étalon (voir 3.17.2).

NOTE Le contrôle de pureté de la substance étalon peut être réalisé en mesurant l’absorbance d’une solution de

tryptophane à 280 nm. Préparer une solution d’environ 5 mg/l dans de l’HCl à 10 N à partir d’une solution mère et

mesurer l’absorbance OD à 280 nm par rapport à de l’HCl à 10 N. La concentration du tryptophane est alors:

+06
C = OD/5 630 * 10

5 630 est le coefficient d’extinction molaire du tryptophane dans l’eau à 280 nm;

C est exprimée en μmol/l.

La pureté de la substance étalon est alors (C/C )*100 où C est la concentration théorique de la solution diluée,

0 0
exprimée en μmol/l, égale à environ 25 μmol/l.
Le contrôle de pureté est réalisé tous les six mois; la pureté doit être ≥ 99 %.

3.3 Substance étalon interne: α-méthyl-tryptophane (pureté ≥ 99 %), séché sous vide sur du

pentoxyde de phosphore.
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ISO/FDIS 13904:2015(F)
3.4 Hydroxyde de baryum octahydraté.

Il convient de veiller à ne pas exposer excessivement le Ba(OH) ⋅8H O à l’air afin d’éviter la formation de

2 2
BaCO , qui peut perturber le dosage (voir l’observation en B.3).
3.5 Hydroxyde de sodium.
3.6 Acide orthophosphorique, w = 85 %.
3.7 Acide chlorhydrique concentré, ρ = 1,19 g/ml.
3.8 Méthanol, qualité CLHP.
3.9 Éther de pétrole, plage d’ébullition entre 40 °C et 60 °C.
3.10 Solution d’hydroxyde de sodium, c = 1 mol/l.

Dissoudre 40,0 g de NaOH (3.5) dans de l’eau (3.1) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).

3.11 Acide chlorhydrique, c = 6 mol/l.
Prélever 492 ml de HCl (3.7) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).
3.12 Acide chlorhydrique, c = 1 mol/l.
Prélever 82 ml de HCl (3.7) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).
3.13 Acide chlorhydrique, c = 0,1 mol/l.
Prélever 8,2 ml de HCl (3.7) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).
3.14 Acide orthophosphorique, c = 0,5 mol/l.

Prélever 34 ml d’acide orthophosphorique (3.6) et ajuster à 1 l avec de l’eau (3.1).

3.15 Solution mère étalon de tryptophane et solution de contrôle (3.2), c = 0,50 g/l.

Dans une fiole jaugée de 500 ml, dissoudre 0,25 g de tryptophane (3.2) (pesé à 0,1 mg près) dans de

l’acide chlorhydrique (3.13) et compléter jusqu’au trait avec de l’acide chlorhydrique (3.13). Conserver à

environ -18 °C pendant quatre semaines maximum.
3.16 Solution mère d’étalon interne, c = 0,54 g/l.

Dans une fiole jaugée de 500 ml, dissoudre 0,27 g de α-méthyl-tryptophane (3.3) (pesé à 0,1 mg près)

dans de l’acide chlorhydrique (3.13) et ajuster au trait avec de l’acide chlorhydrique (3.13). Conserver à

environ -18 °C pendant quatre semaines maximum.
3.17 Solutions d’étalonnage de tryptophane et étalon interne

3.17.1 Solution d’étalonnage pour l’analyse du tryptophane dans les aliments pour animaux,

(c = 0,010 g/l).

Prélever 2,00 ml de solution mère de tryptophane (3.15) et 2,00 ml de solution mère d’étalon interne (α

méthyl-tryptophane) (3.16). Diluer avec de l’eau (3.1) et du méthanol (3.8) approximativement au même

volume et approximativement à la même concentration de méthanol (10 % à 30 %) que l’hydrolysat final.

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ISO/FDIS 13904:2015(F)
Cette solution doit être préparée avant chaque utilisation.
La protéger de l’exposition directe au soleil au cours de la préparation.

3.17.2 Solution d’étalonnage pour l’analyse du tryptophane dans les substances pures du

commerce et les prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane, (c = 0,010 g/l).

Prélever 2,00 ml de solution mère de tryptophane (3.15) et 2,00 ml de solution mère d’étalon interne

(α-méthyl-tryptophane) (3.16).

Diluer avec de l’acide chlorhydrique à 0,1 mol/l (3.13) dans une fiole jaugée de 100 ml. Compléter

jusqu’au trait.
Cette solution doit être préparée avant chaque utilisation.
La protéger de l’exposition directe au soleil au cours de la préparation.

Pour la vérification de la solution d’étalonnage, il est possible d’utiliser une solution de contrôle

de tryptophane. Cette solution de contrôle est préparée et analysée comme décrit pour la solution

d’étalonnage, mais elle doit provenir d’un autre fabricant que celui de la substance étalon (3.2). La

concentration en tryptophane dans l’échantillon de contrôle doit être comprise entre 99 % et101 %.

3.18 Éthanolamine > 98 %.
3.19 Solution de 1,1,1-trichloro-2-méthyl-2-propanol.
Ajouter 1 g de 1,1,1-trichloro-2-méthyl-2-propanol à 100 ml de méthanol (3.8).

NOTE La solution de 1,1,1-trichloro-2-méthyl-2-propanol (3.19) pourrait être considérée dangereuse pour

des raisons environnementales et peut nécessiter des dispositions particulières pour son élimination.

3.20 Phase mobile pour CLHP.

Dissoudre 3,00 g d’acide acétique dans 900 ml d’eau (3.1) puis ajouter 50,0 ml de solution de 1,1,1

trichloro-2-méthyl-2-propanol (3.19). Ajuster le pH à 5,00 à l’aide d’éthanolamine (3.18). Compléter à

1 000 ml avec de l’eau (3.1).

La durée de conservation de la phase mobile (en particulier la stabilité du mélange d’acide acétique et

d’éthanolamine) doit être contrôlée par les temps de rétention.

Voir également l’Annexe B pour une phase mobile alternative: le mélange de tampon phosphate et

de méthanol est moins onéreux et sans danger et il n’est pas nécessaire d’ajuster le pH. Le mélange

est très stable.
4 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
4.1 Équipement pour CLHP avec détecteur spectrofluorimétrique.

4.2 Colonne de chromatographie en phase liquide, 125 mm × 4 mm, avec C , particules de 3 μm,

ou équivalent.
4.3 pH-mètre.

4.4 Flacon en polypropylène, d’une capacité de 125 ml, à large col et bouchon à vis.

4.5 Membrane filtrante en acétate de cellulose (de 0,45 µm ou 0,22 µm de porosité).

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ISO/FDIS 13904:2015(F)

4.6 Autoclave, pouvant être maintenu à (110 ± 2) °C, [(140 ± 10) kPa (1,4 ± 0,1) bar].

Un boîtier fermé étanche à la pression placé dans une étuve de séchage réglable à (110 ± 2) °C peut

être utilisé.
4.7 Agitateur mécanique ou magnétique.
4.8 Mélangeur vortex.
4.9 Verrerie – filtres.
4.10 Erlenmeyers gradués: 200 ml, 250 ml, 600 ml.
4.11 Fioles jaugées: 100 ml, 500 ml, 1 000 ml (toutes de classe A).
5 Mode opératoire
5.1 Préparation des échantillons
5.1.1 Aliments

Broyer l’échantillon pour le réduire à une granulométrie de 0,5 mm. Les échantillons à fort taux

d’humidité doivent être séchés à l’air à une température maximale de 50 °C ou par lyophilisation avant

broyage. Les échantillons à forte teneur en matières grasses doivent subir une extraction par de l’éther

de pétrole (3.9) avant broyage.

5.1.2 Substances pures du commerce et prémélanges contenant plus de 2 % de tryptophane

Broyer l’échantillon pour le réduire à une granulométrie de 0,25 mm et bien l’homogénéiser.

5.2 Dosage du tryptophane libre (extrait)
5.2.1 Aliments

Peser, à 1 mg près, une quantité appropriée (de 1 g à 5 g) de l’échantillon préparé (5.1.1) dans un

erlenmeyer. Ajouter 100,
...

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