ISO 20837:2006
(Main)Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens — Requirements for sample preparation for qualitative detection
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens — Requirements for sample preparation for qualitative detection
ISO 20837:2006 provides criteria and examples for sample preparation in order to obtain PCR-compatible samples or nucleic acids of suitable quality and quantity for PCR. It provides a description of the general principles involved. References to standards concerning the enrichment of microorganisms are given in Annex A, and a detailed method for DNA extraction is given in Annex B. ISO 20837:2006 has been established for food matrices, but could also be applied to feed and agricultural/environmental matrices with some adaptations, if necessary.
Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection des micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences relatives à la préparation des échantillons pour la détection qualitative
L'ISO 20837:2006 fournit des critères et des exemples de préparation d'échantillons permettant d'obtenir des échantillons compatibles avec la méthode PCR ou des acides nucléiques de qualité appropriée et en quantité suffisante pour la méthode PCR. Elle contient une description des principes généraux mis en oeuvre. Les références de normes relatives à l'enrichissement de micro-organismes sont données dans l'Annexe A et une méthode détaillée d'extraction de l'ADN est donnée dans l'Annexe B. L'ISO 20837:2006 a été élaborée pour des matrices alimentaires mais pourrait également être appliquée à des aliments pour animaux et à des matrices agricoles/environnementales avec quelques adaptations, si nécessaire.
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
NORME ISO
INTERNATIONALE 20837
Première édition
2006-04-15
Microbiologie des aliments — Réaction
de polymérisation en chaîne (PCR) pour
la détection des micro-organismes
pathogènes dans les aliments —
Exigences relatives à la préparation des
échantillons pour la détection qualitative
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain
reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens —
Requirements for sample preparation for qualitative detection
Numéro de référence
©
ISO 2006
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées
acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute
responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info
du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir
l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,
veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.
© ISO 2006
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax. + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2006 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives. 1
3 Principe. 1
4 Exigences générales de laboratoire . 2
5 Réactifs, appareillage et matériel. 2
6 Mode opératoire. 2
Annexe A (informative) Normes relatives à l'enrichissement des micro-organismes (bactéries). 5
Annexe B (informative) Méthode pour l'extraction d'ADN à partir de bactéries Gram-négatives . 6
Bibliographie . 8
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'ISO 20837 a été élaborée par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits alimentaires —
Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à l'Accord de
coopération technique entre l'ISO et le CEN (Accord de Vienne).
iv © ISO 2006 – Tous droits réservés
Introduction
La recherche de micro-organismes pathogènes présents dans les aliments par PCR est généralement
réalisée au moyen des étapes successives (ou simultanées) suivantes:
⎯ l'homogénéisation de l'échantillon;
⎯ l'enrichissement (en culture) du micro-organisme pathogène étudié et le traitement de l'échantillon;
⎯ l'extraction des acides nucléiques (facultative);
⎯ l'amplification des acides nucléiques du micro-organisme pathogène étudié;
⎯ la détection de l'ADN amplifié dans le micro-organisme pathogène étudié.
L'Annexe A indique les références de Normes internationales relatives à l'enrichissement de certaines
bactéries dans des matrices alimentaires. L'Annexe B fournit un exemple d'une méthode spécifique de
préparation des échantillons.
La présente Norme internationale fait partie d'une série de normes et d'une Spécification technique réunies
sous le titre générique Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la
détection de micro-organismes pathogènes dans les aliments:
⎯ Exigences générales et définitions (ISO 22174);
⎯ Exigences relatives à la préparation des échantillons pour la détection qualitative (ISO 20837);
⎯ Critères de performances pour les thermocycleurs (ISO/TS 20836);
⎯ Exigences relatives à l'amplification et à la détection pour des méthodes qualitatives (ISO 20838).
L'Organisation internationale de normalisation (ISO) attire l'attention sur le fait qu'il est déclaré que la
conformité avec les dispositions du présent document peut impliquer l'utilisation d'un ou plusieurs brevets
intéressant la technologie PCR.
L'ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à la portée de ces droits de propriété.
L'ISO a été informé que les sociétés Applied Biosystems, Roche Molecular Systems Inc., et F. Hoffmann-La
Roche Ltd., détiennent des droits de propriété concernant la technologie PCR. Les sociétés précitées ont
donné l'assurance à l'ISO qu'ils consentent à négocier des licences avec des demandeurs du monde entier, à
des termes et conditions raisonnables et non discriminatoires. À ce propos, la déclaration des détenteurs de
ces droits de propriété est enregistrée à l'ISO. Des informations peuvent être demandées à:
Licensing Department
Applied Biosystems
850 Lincoln Centre Drive
Foster City, CA 94404
États-Unis
et
Roche Molecular Systems, Inc.
Licensing Department
1145 Atlantic Avenue
Alameda, CA 94501
États-Unis
L'attention est d'autre part attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire
l'objet de droits de propriété autres que ceux qui ont été mentionnés ci-dessus. L'ISO ne saurait être tenue
pour responsable de l'identification de ces droits de propriété en tout ou partie.
vi © ISO 2006 – Tous droits réservés
NORME INTERNATIONALE ISO 20837:2006(F)
Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en
chaîne (PCR) pour la détection des micro-organismes
pathogènes dans les aliments — Exigences relatives à la
préparation des échantillons pour la détection qualitative
AVERTISSEMENT — L'utilisation de la présente Norme internationale peut impliquer l'intervention de
produits, d'opérations et d'équipements à caractère dangereux. La présente norme n'a pas la
prétention d'aborder tous les problèmes de sécurité concernés par son usage. Il est de la
responsabilité de l'utilisateur de la présente norme d'établir des règles de sécurité et d'hygiène
appropriées et de déterminer l'application des restrictions réglementaires avant utilisation.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale fournit des critères et des exemples de préparation d'échantillons
permettant d'obtenir des échantillons compatibles avec la méthode PCR ou des acides nucléiques de qualité
appropriée et en quantité suffisante pour la méthode PCR.
Elle contient une description des principes généraux mis en œuvre. Les références de normes relatives à
l'enrichissement de micro-organismes sont données dans l'Annexe A et une méthode détaillée d'extraction de
l'ADN est donnée dans l'Annexe B.
La présente Norme internationale a été élaborée pour des matrices alimentaires mais pourrait également être
appliquée à des aliments pour animaux et à des matrices agricoles/environnementales avec quelques
adaptations, si nécessaire.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 22174:2005, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la
recherche de micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
3 Principe
3.1 Généralités
Les méthodes de préparation des échantillons visent à obtenir des échantillons compatibles avec la méthode
PCR ou des acides nucléiques de qualité appropriée et en quantité suffisante pour la méthode PCR.
NOTE La qualité des acides nucléiques dépend, par exemple, de la pureté chimique, de la longueur moyenne des
molécules et de l'intégrité structurale des molécules d'acide nucléique extraites.
Il convient que l'enrichissement et le traitement de l'échantillon permettent de détecter les faibles
concentrations en micro-organismes cibles et de réduire les substances inhibant la PCR. Il convient
d'employer les modes opératoires physiques, chimiques ou biochimiques les moins destructifs possible pour
l'intégrité de l'acide nucléique permettant ainsi de rendre l'échantillon ou la solution d'acides nucléiques
compatible avec une amplification par PCR.
3.2 Enrichissement et traitement de l'échantillon
Le traitement de l'échantillon peut être effectué directement sur l'échantillon ou après enrichissement de la
manière décrite dans les normes répertoriées dans l'Annexe A ou dans d'autres normes appropriées.
3.3 Extraction de l'acide nucléique
L'extraction de l'acide nucléique repose essentiellement sur la libération de l'ADN présent dans les bactéries
et sur l'élimination ultérieure ou simultanée des inhibiteurs de PCR.
L'Annexe B fournit un exemple d'une méthode d'extraction/purification de l'ADN. Cette méthode est donnée
uniquement à titre d'exemple et il convient que les utilisateurs la modifient afin de l'adapter aux besoins de
chaque laboratoire.
4 Exigences générales de laboratoire
Il convient que le traitement de l'échantillon soit réalisé dans des zones/pièces de travail séparées,
conformément au 6.3 de l'ISO 22174:2005.
5 Réactifs, appareillage et matériel
Voir les Annexes A et B de la présente Norme internationale ainsi que l'ISO 22174.
6 Mode opératoire
6.1 Enrichissement et traitement de l'échantillon relatif aux bactéries
Il convient que les échantillons d'aliments soient enrichis conformément aux Normes internationales
correspondantes ou à d'autres normes appropriées. Il est possible d'utiliser d'autres milieux d'enrichissement
estimés plus adaptés à la méthode PCR, dans la mesure où il a été prouvé, par le biais d'une validation, que
leurs performances sont au moins comparables à celles décrites dans des Normes internationales.
Certains milieux d'enrichissement recommandés dans les Normes internationales contiennent moins de
substances inhibant la PCR que les autres, ce à quoi il convient d'attacher une attention particulière lors du
choix de la méthode de préparation de l'échantillon.
Pour certains produits, il convient de veiller au blocage de la croissance de micro-organismes de fond
concurrents, par exemple en ajoutant des produits chimiques ou des antibiotiques sélectifs.
Il est possible d'essayer des méthodes moins destructives, telles que la dilution, la centrifugation, la digestion
protéique, la filtration, la centrifugation en gradient de densité, la séparation immunomagnétique, etc. En cas
d'absence de réponse de la PCR, il est possible d'essayer des méthodes plus sévères, telles que l'ébullition,
l'utilisation de chélateurs ou de produits chimiques corrosifs comme le chloroforme et l'éthanol ou encore des
kits ayant des effets similaires. Des traitements physiques simples peuvent être utilisés pour réduire la teneur
en matières grasses des échantillons dans lesquels cette teneur est élevée. Les chélateurs peuvent être
utilisés pour réduire la forte teneur en calcium des produits laitiers, qui peut avoir un effet inhibiteur.
2 © ISO 2006 – Tous droits réservés
6.2 Extraction de l'acide nucléique
6.2.1 Extraction de l'ADN
6.2.1.1 Libération et purification de l'ADN
Plusieurs principes d'extraction de l'ADN peuvent être combinés. Il est possible par exemple d'effectuer les
opérations suivantes:
a) dégrader les protéines présentes dans les cellules extraites avec des protéases (par exe
...
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 20837
Первое издание
2006-04-15
Микробиология пищевых продуктов и
кормов для животных. Полимеразная
цепная реакция для обнаружения
патогенных пищевых
микроорганизмов. Требования к
подготовке образцов для
качественного обнаружения
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain
reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens —
Requirements for sample preparation for qualitative detection
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
©
ISO 2006
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или смотреть на экране, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на интегрированные шрифты и они не будут установлены на компьютере, на котором ведется редактирование. В
случае загрузки настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение
лицензионных условий фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe - торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованным для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General Info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже.
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO, которое должно быть получено после запроса о разрешении, направленного по
адресу, приведенному ниже, или в комитет-член ISO в стране запрашивающей стороны.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright @ iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2006 – Все права сохраняются
Содержание Страница
Предисловие .iv
Введение .v
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Принцип.1
4 Общие требования к лаборатории.2
5 Реактивы, аппаратура и оборудование .2
6 Методика .2
Приложение А (информативное) Стандарты по обогащению микроорганизмов (бактерий) .4
Приложение B (информативное) Метод выделения ДНК из грамотрицательных бактерий.5
Библиография.7
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в
деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные организации, правительственные и неправительственные, имеющие связи
с ISO, также принимают участие в работах. Что касается стандартизации в области электротехники, то
ISO работает в тесном сотрудничестве с Международной электротехнической комиссией (IEC).
Проекты международных стандартов разрабатываются в соответствии с правилами Директив ISO/IEC,
Часть 2.
Основной задачей технических комитетов является разработка международных стандартов. Проекты
международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам на
голосование. Для опубликования их в качестве международного стандарта требуется одобрение не
менее 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Необходимо учитывать возможность, что некоторые элементы настоящего документа могут быть
объектом патентных прав. ISO не несет ответственность за определение каких-либо или всех таких
патентных прав.
Стандарт ISO 20837 был подготовлен Европейским комитетом по стандартизации (CEN), Техническим
комитетом CEN/TC 275, Анализ пищевых продуктов Горизонтальные методы, совместно с
Техническим комитетом ISO/TC 34, Пищевые продукты, Подкомитетом SC 9, Микробиология, в
соответствии с Соглашением о техническом сотрудничестве между ISO и CEN (Венское соглашение).
iv © ISO 2006 – Все права сохраняются
Введение
Обнаружение патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах методом PCR обычно выполняется
путем указанной ниже последовательности этапов (или одновременного их выполнения):
гомогенизация образца;
(культуральное) обогащение исследуемого патогенного микроорганизма и обработка образца;
выделение нуклеиновых кислот (по выбору);
амплификация нуклеиновых кислот исследуемого патогенного микроорганизма;
обнаружение амплифицированной ДНК исследуемого патогенного микроорганизма.
Ссылки на международные стандарты, относящиеся к культуральному обогащению бактерий из
пищевых матриц, приведены в Приложении А. Пример специального метода подготовки образца описан
в Приложении В.
Настоящий международный стандарт относятся к серии стандартов и Технических условий под общим
названием Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная
реакция (PCR) для обнаружения патогенных пищевых микроорганизмов:
Общие требования и определения (ISO 22174)
Требования к подготовке образцов для качественного обнаружения (ISO 20837)
Определение рабочих характеристик амплификаторов (ISO/TS 20836)
Требования к амплификации и обнаружению качественными методами (ISO 20838).
Международная Организация по стандартизации (ISO) обращает внимание на тот факт, что заявление
о соответствии настоящему документу может включать использование одного или более патентов,
касающихся технологии PCR.
ISO не занимает какую-либо позицию относительно подтверждения, юридической силы и области
применения патентных прав.
ISO проинформирована, что компании Applied Biosystems, Roche Molecular Systems, Inc. и F. Hoffman-
La Roche Ltd. имеют патентные права на технологию PCR. Эти компании заверили ISO о своей
готовности предоставлять лицензии пользователям технологии во всем мире на разумных и
недискриминационных условиях. С учетом этой точки зрения заявления держателей вышеупомянутых
патентных прав зарегистрированы в ISO. Информация может быть получена по следующим адресам:
Отдел лицензирования
Applied Biosystems
850 Lincoln Centre Drive
Foster City, CA 94404
USA
и
Roche Molecular Systems, Inc.
Отдел лицензирования
1145 Atlantic Avenue
Alameda, CA 94501
USA
Следует обратить внимание на возможность того, что некоторые элементы настоящего документа
могут быть объектом и других, чем указанные выше, патентных прав. ISO не несет ответственность за
идентификацию каких-либо или всех таких патентных прав.
vi © ISO 2006 – Все права сохраняются
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 20837:2006(R)
Микробиология пищевых продуктов и кормов для
животных. Полимеразная цепная реакция для обнаружения
патогенных пищевых микроорганизмов. Требования к
подготовке проб для качественного обнаружения
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ — Использование настоящего стандарта может включать применение
опасных материалов, операций и оборудования. Данный стандарт не предназначен для
рассмотрения всех проблем безопасности, связанных с его использованием. Пользователь
настоящего стандарта несет ответственность за применение безопасных и не угрожающих
здоровью методов и определение необходимости регламентных ограничений перед
использованием стандарта.
1 Область применения
В настоящем международном стандарте приводятся критерии и примеры подготовки образцов для
получения PCR-совместимых образцов или нуклеиновых кислот, качество и количество которых
достаточны для использования в PCR.
В стандарте описаны общие принципы процесса подготовки образцов. Ссылки на стандарты,
касающиеся обогащения микроорганизмов, приведены в Приложении A, а подробное изложение
метода выделения ДНК - в Приложении B.
Настоящий международный стандарт предназначен для пищевых матриц, но в случае необходимости
при некоторой адаптации может также применяться к матрицам кормов и матрицам из
агрономической/окружающей среды.
2 Нормативные ссылки
Следующие ниже ссылочные документы обязательны при применении данного документа. При
жестких ссылках используются только цитированные издания. При плавающих ссылках применяется
последнее издание ссылочного документа (включая все изменения).
ISO 22174:2005, Микробиология пищевых продуктoв и кормов для животных. Полимеразная цепная
реакция для обнаружения патогенных пищевых микроорганизмов. Общие требования и определения
3 Принцип
3.1 Общие положения
Цель описанных методов подготовки образцов состоит в получении образцов или нуклеиновых кислот,
качество и количество которых достаточны для использования в PCR.
ПРИМЕЧАНИЕ Качество нуклеиновых кислот зависит, например, от химической чистоты, средней длины
молекул и структурной целостности выделенных молекул нуклеиновых кислот.
Обогащение и обработка образцов должны обеспечивать обнаружение малого количества целевых
микроорганизмов и уменьшение количества веществ, ингибирующих PCR. Физические, химические или
биохимические процедуры, обладающие меньшим разрушающим эффектом на целостность
нуклеиновых кислот, должны обеспечивать получение совместимых с PCR-амплификацией образца
или раствора нуклеиновых кислот.
3.2 Обогащение и обработка образца
Обработка образцов может начинаться непосредственно с образца или после его обогащения,
согласно описанию в перечисленных в Приложении А стандартах или в других относящихся к данному
вопросу стандартах.
3.3 Выделение нуклеиновых кислот
Основные принципы выделения нуклеиновых кислот состоят в высвобождении ДНК, присутствующей в
бактериях, и одновременном или последующем удалении ингибиторов PCR.
Пример метода выделения/очистки ДНК приводится в Приложении B. Этот метод является только
примером, и должен быть в дальнейшем модифицирован пользователями для соответствия задачам,
стоящим перед каждой лабораторией.
4 Общие требования к лаборатории
Обработку образцов следует выполнять в раздельных рабочих зонах/помещениях согласно
требованиям стандарта ISO 22174:2005, 6.3.
5 Реактивы, аппаратура и оборудование
См. Приложения A и B данного международного стандарта, а также ISO 22174.
6 Методика
6.1 Обогащение и обработка образцов для бактерий
Обогащение образцов пищевых продуктов следует проводить согласно соответствующим международным
стандартам или другим подходящим стандартам. Для обогащения можно использовать другие, более
совместимые с PCR, среды, если было установлено путем валидации, что они имеют эффективность по
крайней мере сравнимую со средами, описанными в международных стандартах.
Некоторые среды культурального обогащения, рекомендуемые международными стандартами,
содержат меньшее количество ингибирующих PCR веществ, чем другие, что должно тщательно
учитываться при выборе метода подготовки образцов.
Для некоторых продуктов необходимо принять специальные меры по подавлению роста
конкурирующих сопутствующих фоновых микроорганизмов (например, путем добавления селективных
добавок или антибиотиков).
Могут быть опробованы менее разрушающие методы, например простое разведение,
центрифугирование, гидролиз белка, фильтрация, центрифугирование в градиенте плотности,
иммуномагнитная сепарация, и т.д. В случае отсутствия ответа в PCR возможно пробное
использование более жестких методов, например, кипячения, применения хелатирующих добавок или
более жестких химикатов, например, хлороформа и этанола, или наборов реагентов с аналогичными
функциями. Для снижения содержания жиров в веществах с высоким содержанием жиров могут быть
использованы простые физические методы. Для уменьшения эффектов ингибирования,
обусловленного высоким содержанием кальция в молочных продуктах, можно использовать
хелатирующие агенты.
6.2 Выделение нуклеиновых кислот
6.2.1 Выделение ДНК
6.2.1.1 Высвобождение и очистка ДНК
Допускается комбинация нескольких принципов выделения ДНК. Например, могут быть выполнены
следующие этапы:
2 © ISO 2006 – Все права сохраняются
a) разрушение белков в экстракте клеток с помощью протеаз (например, протеиназа К) и РНК с
помощью рибонуклеаз;
b) преципитация образовавшихся пептидов с органическими растворителями (например, со смесью
фенола и хлороформа), что позволяет оставить ДНК в водной фазе;
c) очистка раствора ДНК и дальнейшее концентрирование путем преципитации этанолом в
присутствии одновалентных катионов;
d) сбор преципитата ДНК с помощью центрифугирования;
e) промывка ДНК этанолом и ресуспендирование в буфере [например, буфер трис
(гидроксиметил)аминометан/ЭДTA (Трис-ЭДTA буфер) или Трис буфер].
Для увеличения выхода ДНК на этапах преципитации можно использовать соосадители ДНК, напри
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.