ISO 16072:2002
(Main)Soil quality — Laboratory methods for determination of microbial soil respiration
Soil quality — Laboratory methods for determination of microbial soil respiration
ISO 16702:2002 describes methods for the determination of soil microbial respiration of aerobic, unsaturated soils. The methods are suitable for the determination of O2 uptake or CO2 release, either after addition of a substrate (substrate-induced respiration), or without substrate addition (basal respiration). ISO 16702:2002 is applicable to the measurement of soil respiration in order to: determine the microbial activity in soil (see [2]); establish the effect of additives (nutrients, pollutants, soil improvers, etc.) on the metabolic performance of microorganisms; determine the microbial biomass (see [3]); determine the metabolic quotient qCO2.
Qualité du sol — Méthodes de laboratoire pour la détermination de la respiration microbienne du sol
L'ISO 16072:2002 décrit des méthodes pour la détermination de la respiration microbienne des sols aérobies insaturés. Les méthodes sont appropriées à la détermination de la consommation d'O2 ou de la production de CO2, soit après ajout d'un substrat (respiration induite par le substrat), soit sans ajout de substrat (respiration basale). L'ISO 16072:2002 est applicable au mesurage de la respiration du sol pour: déterminer l'activité microbienne dans le sol; établir l'effet des additifs (nutriments, polluants, amendements du sol, etc.) sur la performance métabolique des micro-organismes; déterminer la biomasse microbienne; déterminer le quotient métabolique qCO2.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16072
First edition
2002-12-15
Soil quality — Laboratory methods for
determination of microbial soil
respiration
Qualité du sol — Méthodes de laboratoire pour la détermination de
la respiration microbienne du sol
Reference number
ISO 16072:2002(E)
©
ISO 2002
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ISO 16072:2002(E)
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Published in Switzerland
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ISO 16072:2002(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope. 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Procedure. 2
4.1 General conditions. 2
4.2 Choice of the measuring system. 3
5 Measuring systems. 3
5.1 Determination of O consumption by static incubation in a pressure-compensation
2
system. 3
5.2 Determination of CO release by titration in a static system . 4
2
5.3 Coulometric determination of CO release in a static system . 6
2
5.4 Determination of CO release using an infrared gas analyser in a flow-through system. 7
2
5.5 Determination of CO release using gas chromatography in a flow-through system and a
2
static system . 10
5.6 Determination of soil respiration by pressure measurement in a static system . 15
Bibliography . 19
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ISO 16072:2002(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 16072 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
methods.
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ISO 16072:2002(E)
Introduction
This International Standard is derived from the German standard DIN 19737 (see [1]). It describes methods
for the determination of microbial soil respiration in the laboratory.
Microbial soil respiration results from the mineralization of organic substances. In this process, organic
substances are oxidized to the end products carbon dioxide and water, with concurrent uptake of O for
2
aerobic microorganisms. The soil respiration is measured by the determination of O consumption and/or by
2
CO release. Respiration is a measure of the overall activity of soil microorganisms.
2
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16072:2002(E)
Soil quality — Laboratory methods for determination of
microbial soil respiration
1 Scope
This International Standard describes methods for the determination of soil microbial respiration of aerobic,
unsaturated soils. The methods are suitable for the determination of O uptake or CO release, either after
2 2
addition of a substrate (substrate-induced respiration), or without substrate addition (basal respiration).
This International Standard is applicable to the measurement of soil respiration in order to:
determine the microbial activity in soil (see [3]);
establish the effect of additives (nutrients, pollutants, soil improvers, etc.) on the metabolic performance
of microorganisms;
determine the microbial biomass (see [4]);
determine the metabolic quotient qCO .
2
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 10381-6:1993, Soil quality — Sampling — Guidance on the collection, handling and storage of soil for the
assessment of aerobic microbial processes in the laboratory
ISO 11274:1998, Soil quality — Determination of the water-retention characteristic — Laboratory methods
ISO 11465:1993, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric
method
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
basal respiration
microbial soil respiration without addition of nutrients
3.2
substrate-induced respiration
SIR
microbial soil respiration after addition of nutrients
NOTE Glucose is an example of an added nutrient.
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ISO 16072:2002(E)
3.3
microbial activity
metabolic performance of microorganisms
NOTE It can be measured, for example, as O uptake or CO release.
2 2
3.4
metabolic quotient
qCO
2
specific metabolic activity of soil microorganisms, which can be calculated as the quotient basal respiration:
microbial biomass
NOTE Metabolic quotient is usually expressed as milligrams of CO carbon released per hour per gram of microbial
2
biomass carbon.
3.5
rate of CO formation [O consumption]
2 2
R [R ]
CO O
2 2
amount of CO released [O consumed] per time unit from a mass unit of soil
2 2
NOTE 1 Soil respiration is usually measured as the rate of CO formation or O consumption.
2 2
–1 –1
NOTE 2 It is usually expressed as milligrams CO [or O ] per gram per hour (mg CO [or O ]·g ·h ).
2 2 2 2
3.6
microbial biomass
mass of intact microbial cells in a given soil
NOTE This is usually estimated from the measurement of carbon or nitrogen content of these cells.
4 Procedure
4.1 General conditions
4.1.1 Soil sampling and storage
Sample, store and pre-incubate soils in accordance with ISO 10381-6, independently of the choice of the
procedure and the respiration parameter to be measured (basal respiration, SIR).
4.1.2 Measuring and incubation conditions
Soil respiration is strongly influenced by water content and temperature. Therefore these parameters should
be recorded in the final report. At suction pressures > 0,03 MPa, the soil respiration will decrease considerably.
The water content of the test soil is optimal when it corresponds with a pore water pressure of – 0,01 MPa to
– 0,03 MPa (measured with an accuracy of 5 %, in accordance with ISO 11274) or 40 % to 60 % of the
maximum water-holding capacity, respectively. A stable temperature should be used. Incubation temperatures
between 20 °C and 30 °C are generally recommended, but other temperatures may be used if required. In the
description of the methods, examples of incubation temperatures are given as well as the accuracy of
temperature maintenance and measurement.
If a method is used for the determination of soil microbial biomass, a temperature of 22 °C is recommended
because biomass calculations have been calibrated to this temperature.
When soil samples are compared with respect to soil respiration, they should have the same moisture status
(pore water pressure or percentage of maximum water-holding capacity).
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4.2 Choice of the measuring system
Each measurement method has its own advantages and disadvantages. Care is needed, because the results
obtained by O uptake and by CO release are not strictly compatible. It is the responsibility of the investigator
2 2
to decide which of these methods is to be used.
One of the systems described in Clause 5 should be used.
Systems for measuring CO do not distinguish between CO released from microbial activities and CO
2 2 2
resulting from abiotic processes. For alkaline soils and soils with a high organic matter content, which can
release considerable amounts of abiotically released CO , methods using O uptake are recommended.
2 2
NOTE The advantages and disadvantages are described in the individual descriptions of the methods.
5 Measuring systems
5.1 Determination of O consumption by static incubation in a pressure-compensation
2
system
5.1.1 Principle
The determination is based on the measurement of O consumption during incubation of a soil sample in a
2
closed system. The O in the system is replenished electrochemically. The CO released is absorbed by
2 2
calcium hydroxide [Ca(OH) ].
2
Key
A reaction vessel 1 soil sample 4 electrolyte
B oxygen generator 2 CO absorbent 5 electrodes
2
C pressure indicator 3 pressure cell 6 recorder with display
Figure 1 — Determination of O consumption (showing connection of a measuring unit)
2
5.1.2 Apparatus
A detailed description of the apparatus can be found in [4]; the essential features are as follows.
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ISO 16072:2002(E)
The measuring system (see Figure 1) consists of a water bath with temperature control containing measuring
units each comprising a reaction vessel (A) in which a CO absorption device (2) is suspended from the
2
stopper, an O generator (B) and a pressure indicator (C). The vessels (A, B, C) of the measuring unit form
2
together a closed system, connected to each other by tubing. In this way fluctuations in atmospheric pressure
will not influence the results. The CO released is absorbed by the calcium hydroxide (2). The consumption of
2
O due to respiration results in a negative pressure which activates the pressure indicator (C). This drives the
2
electrolytic O formation as well as the display and graphical registration of measuring values on a recorder
2
(6). The O consumption is shown directly, in milligrams of oxygen (mg O ) on a digital display.
2 2
1)
The system can be obtained commercially and detailed instructions should be given in the supplier's manual.
5.1.3 Procedure
Use 50 g to 100 g of field-moist, sieved (2 mm) soil for the measurements. The O consumption should not be
2
measured during the first 2 h, the time needed to reach equilibrium in the system.
5.2 Determination of CO release by titration in a static system
2
5.2.1 Principle
The soil is incubated in a closed vessel and the released CO is absorbed in a solution of sodium hydroxide.
2
After back-titration of the non-consumed sodium hydroxide, the amount of CO released is calculated. The
2
method is suitable for large numbers of samples, and up to 80 respiration measurements per working day are
possible.
5.2.2 Reagents
5.2.2.1 CO -free water
2
Boil distilled water and after cooling store it in flasks closed with stoppers provided with absorption tubes
containing calcium hydroxide.
–1
5.2.2.2 Sodium hydroxide (NaOH) solution, c = 0,05 mol·l .
–1
5.2.2.3 Hydrochloric acid (HCl) solution, c = 0,1 mol·l .
The concentrations of NaOH solution (5.2.2.2) and HCl (5.2.2.3) should be chosen so that less than 20 % of
the NaOH is neutralized by CO . Higher percentages of neutralization will result in less reliable results (see
2
[5]). If other concentrations are used, Equation (1) should be changed accordingly.
–1
5.2.2.4 Barium chloride solution, c = 0,5 mol·l .
Dissolve 10,4 g of BaCl in 100 ml of CO -free distilled water (5.2.2.1).
2 2
5.2.2.5 Indicator.
Dissolve 0,1 g of phenolphthalein in 100 ml of aqueous ethanol (volume fraction ethanol 0,6).
5.2.3 Apparatus
5.2.3.1 Wide-mouth flasks (250 ml content) with screw-caps and pour rim, or preserve flasks (1 l
content) with rubber rings, covers and 2 universal clips.
1) Sapromat is the trade name of a product supplied by H+P Labortechnik AG. This information is given for the
convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
4 © ISO 2002 — All rights reserved
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ISO 16072:2002(E)
5.2.3.2 Centrifuge tubes or reaction tubes with a rim (e.g. polypropylene, external diameter 29 mm,
length 120 mm). Small holes should be drilled in the tubes for gas exchange. Instead of tubes, fine-mesh
nylon bags can also be suspended from the neck in the wide-mouth flasks.
5.2.4 Procedure
Weigh 20 g to 25 g of field-moist soil into the centrifuge tubes (5.2.3.2). Suspend the tubes in the wide-mouth
flasks (5.2.3.1) (see Figure 2), in which 20 ml solution of sodium hydroxide (5.2.2.2) has been previously
pipetted. Close the flasks tightly and incubate for 24 h in a temperature-controlled room at the temperature of
choice, e.g. 22 °C ± 1 °C. Before closing the flasks, they should be flushed with clean air with low CO content
2
(e.g. from outdoors). Then remove the tubes. The CO absorbed will precipitate as barium carbonate upon
2
addition of 2 ml of barium chloride solution (5.2.2.4). Titrate the unused sodium hydroxide with hydrochloric
acid (5.2.2.3) after addition of 3 or 4 drops of indicator solution (5.2.2.5).
Key
1 wide-mouth flask (250 ml) 6 openings for gas exchange
2 screw-cap 7 soil sample
3 pour rim 8 sodium hydroxide solution
4 closing pad 9 plastic thread
5 suspended centrifuge tubes 10 fine-mesh woven plastic bag
Figure 2 — Incubation flasks for the determination of soil respiration
The determination should be carried out at least in triplicate. Controls (triplicate flasks without soil) should be
included.
If the soil respiration is measured in a long-term experiment (> 3 days), then the soil samples should be
incubated in flasks in which the sodium hydroxide solution is renewed every 3 days. Also the water content of
the soil has to be adjusted every 3 days.
Also suitable for incubation are preserve flasks (1 l content) with rubber rings, covers and 2 universal clips.
Weigh the soil samples (up to 200 g) into crystallization disks, which are placed on the bottom of the preserver
flasks. Place sodium hydroxide solution in a beaker. On the bottom of the flasks, place 4 ml of CO -free water
2
(5.2.2.1) to maintain air moisture.
NOTE When determining basal respiration in the laboratory, an increase in CO release is often observed in the first
2
hours. This can be caused by an increased availability of nutrients due to the moving and mixing of soil particles during
sample preparation, but also by the short-term establishment of an equilibrium between gaseous and dissolved CO . The
2
incubation time necessary for reaching a steady basal respiration depends in the first instance on the soil's content of
easily available carbon compounds. This applies to all methods measuring CO release.
2
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ISO 16072:2002(E)
5.2.5 Calculation of results
Calculate the rate of CO evolution using equation (1).
2
2,2VV−
()
bp
R = (1)
CO
2
24⋅⋅mw
sm sd
where
–1 –1
R is the rate of CO evolution a on soil dry mass basis (mg CO ·g ·h );
CO 2 2
2
V is the average volume of HCl consumed in the control, in millilitres;
b
V is the average volume of HCl consumed in the test sample, in millilitres;
p
m is the mass of the moist soil sample, in grams;
sm
–1 –1
2,2 is a factor (1 ml of 0,1 molar HCl corresponds to 2,2 mg of CO per day) (mg·ml ·day );
2
–1
24 is a factor to convert daily evolution to hourly evolution (h⋅day );
w is the dry mass fraction of the moist soil.
sd
NOTE The dry mass fraction (w ) of the moist soil equals the percent dry mass divided by 100.
sd
–1 –1
This calculation is only valid if the specified reagent concentrations (0,05 mol·l NaOH and 0,1 mol·l HCl)
are used.
5.3 Coulometric determination of CO release in a static system
2
5.3.1 Principle
The soil sample is incubated (e.g. in triplicate) in containers at constant temperature, and the CO evolved is
2
absorbed in sodium hydroxide solution. In the reaction:
2 NaOH + CO → Na CO + H O
2 2 3 2
hydroxyl ions are replaced by carbonate ions, which have a different electrical conductivity. The change in
conductivity is registered electronically by the apparatus. A CO content of 0,000 1 % (volume fraction) can be
2
detected with certainty. With the apparatus, basal respiration can be measured as well as substrate-induced
soil respiration after addition of glucose to determine biomass carbon. Depending on the type of apparatus, up
to 90 samples can be measured simultaneously.
The mass of the soil samples used and the temperature setting should be established according to the
manufacturer's instructions.
For more details see [6] and [
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16072
Première édition
2002-12-15
Qualité du sol — Méthodes de laboratoire
pour la détermination de la respiration
microbienne du sol
Soil quality — Laboratory methods for determination of microbial soil
respiration
Numéro de référence
ISO 16072:2002(F)
©
ISO 2002
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ISO 16072:2002(F)
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E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Version française parue en 2011
Publié en Suisse
ii © ISO 2002 – Tous droits réservés
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ISO 16072:2002(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction.v
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives.1
3 Termes et définitions .1
4 Mode opératoire.2
4.1 Conditions générales.2
4.2 Choix du système de mesurage .3
5 Systèmes de mesurage.3
5.1 Détermination de la consommation d'O par incubation statique dans un système de
2
compensation de pression.3
5.2 Détermination de la production de CO par titrage dans un système statique.5
2
5.3 Détermination coulométrique de la production de CO dans un système statique.7
2
5.4 Détermination de la production de CO en utilisant un analyseur de gaz infrarouge dans
2
un système à flux continu .8
5.5 Détermination de la production de CO par chromatographie en phase gazeuse dans un
2
système à flux continu et dans un système statique .11
5.6 Détermination de la respiration du sol par mesurage de la pression dans un système
statique.16
Bibliographie.20
© ISO 2002 – Tous droits réservés iii
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ISO 16072:2002(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 16072 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4, Méthodes
biologiques.
iv © ISO 2002 – Tous droits réservés
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ISO 16072:2002(F)
Introduction
La présente Norme internationale est dérivée de la Norme allemande DIN 19737 (voir Référence [1]). Elle
décrit des méthodes de laboratoire pour la détermination de la respiration microbienne du sol.
La respiration microbienne du sol est le résultat de la minéralisation de substances organiques. Au cours de
ce processus, les substances organiques sont oxydées en dioxyde de carbone et eau, alors que les
micro-organismes aérobies consomment l'O . La respiration du sol est mesurée par la détermination de la
2
consommation d'O et/ou de la production de CO . La respiration est une mesure de l'activité globale des
2 2
micro-organismes du sol.
© ISO 2002 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 16072:2002(F)
Qualité du sol — Méthodes de laboratoire pour la détermination
de la respiration microbienne du sol
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale décrit des méthodes pour la détermination de la respiration microbienne
des sols aérobies insaturés. Les méthodes sont appropriées à la détermination de la consommation d'O ou
2
de la production de CO , soit après ajout d'un substrat (respiration induite par le substrat), soit sans ajout de
2
substrat (respiration basale).
La présente Norme internationale est applicable au mesurage de la respiration du sol pour:
⎯ déterminer l'activité microbienne dans le sol (voir Référence [3]);
⎯ établir l'effet des additifs (nutriments, polluants, amendements du sol, etc.) sur la performance
métabolique des micro-organismes;
⎯ déterminer la biomasse microbienne (voir Référence [4]);
⎯ déterminer le quotient métabolique qCO .
2
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 10381-6:1993, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la
manipulation et la conservation de sols destinés à une étude en laboratoire des processus microbiens
aérobies
ISO 11274:1998, Qualité du sol — Détermination de la caractéristique de la rétention en eau — Méthodes de
laboratoire
ISO 11465:1993, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau —
Méthode gravimétrique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
respiration basale
respiration microbienne du sol sans ajout de nutriments
© ISO 2002 – Tous droits réservés 1
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ISO 16072:2002(F)
3.2
respiration induite par le substrat
SIR
respiration microbienne du sol après ajout de nutriments
NOTE Le glucose est un exemple de nutriment ajouté.
3.3
activité microbienne
performance métabolique des micro-organismes
NOTE Elle peut être mesurée, par exemple, en termes de consommation d'O ou de production de CO .
2 2
3.4
quotient métabolique
qCO
2
activité métabolique spécifique des micro-organismes du sol, qui peut être calculée sous forme de quotient
respiration basale/biomasse microbienne
NOTE Le quotient métabolique est généralement exprimé en milligrammes de carbone de CO produit par heure par
2
gramme de carbone de biomasse microbienne.
3.5
taux de production de CO [consommation d'O ]
2 2
R [R ]
CO O
2 2
quantité de CO produit [O consommé] par unité de temps à partir d'une unité de masse de sol
2 2
NOTE 1 La respiration du sol est généralement mesurée sous forme de taux de production de CO ou de
2
consommation d'O .
2
NOTE 2 Il est généralement exprimé en milligrammes de CO [ou d'O ] par gramme par heure (mg de CO
2 2 2
−1 −1
[ou d'O ]⋅g ⋅h ).
2
3.6
biomasse microbienne
masse de cellules microbiennes intactes dans un sol donné
NOTE Elle est généralement estimée à partir du mesurage de la teneur en carbone ou en azote de ces cellules.
4 Mode opératoire
4.1 Conditions générales
4.1.1 Échantillonnage et conservation des sols
Prélever, conserver et pré-incuber les sols conformément à l'ISO 10381-6, indépendamment du choix du
mode opératoire et du paramètre de respiration à mesurer (respiration basale, SIR).
4.1.2 Conditions de mesurage et d'incubation
La respiration du sol est fortement influencée par la teneur en eau et par la température. Par conséquent, il
convient de consigner ces paramètres dans le rapport final. À des pressions d'aspiration > 0,03 MPa, la
respiration du sol diminue considérablement. La teneur en eau du sol soumis à essai est optimale lorsqu'elle
correspond à une pression d'eau interstitielle de −0,01 MPa à −0,03 MPa (mesurée avec une précision de 5 %,
conformément à l'ISO 11274) ou à 40 % à 60 % de la capacité maximale de rétention d'eau, respectivement.
Il convient d'utiliser une température stable. Des températures d'incubation comprises entre 20 °C et 30 °C
sont généralement recommandées, mais d'autres températures peuvent être utilisées si nécessaire. Dans la
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description des méthodes, des exemples de températures d'incubation sont donnés, ainsi que la précision du
maintien et du mesurage de la température.
Si une méthode est utilisée pour la détermination de la biomasse microbienne du sol, une température de
22 °C est recommandée car les calculs de biomasse ont été étalonnés en fonction de cette température.
Lorsque la mesure de la respiration microbienne est utilisée pour comparer les échantillons de sols, il convient
que ces derniers présentent le même état d'humidité (pression d'eau interstitielle ou pourcentage de capacité
maximale de rétention d'eau).
4.2 Choix du système de mesurage
Chaque méthode de mesurage a ses propres avantages et inconvénients. Procéder avec soin car les
résultats obtenus par consommation d'O et par production de CO ne sont pas strictement compatibles.
2 2
L'investigateur est responsable du choix de la méthode.
Il convient d'utiliser l'un des systèmes décrits à l'Article 5.
Les systèmes de mesurage du CO ne différencient pas le CO produit en raison d'activités microbiennes du
2 2
CO résultant de processus abiotiques. Pour les sols alcalins et les sols ayant une haute teneur en matière
2
organique, pour lesquels des facteurs abiotiques peuvent être à l'origine d'une production considérable de
CO , les méthodes utilisant la consommation d'O sont recommandées.
2 2
NOTE Les avantages et les inconvénients sont décrits dans les descriptions individuelles des méthodes.
5 Systèmes de mesurage
5.1 Détermination de la consommation d'O par incubation statique dans un système de
2
compensation de pression
5.1.1 Principe
La détermination est basée sur le mesurage de la consommation d'O pendant l'incubation d'un échantillon de
2
présent dans le système est régénéré par voie électrochimique. Le CO
sol dans un système fermé. L'O
2 2
produit est absorbé par de l'hydroxyde de calcium [Ca(OH) ].
2
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Légende
A récipient de réaction 1 échantillon de sol 4 électrolyte
B générateur d'oxygène 2 absorbant de CO 5 électrodes
2
C indicateur de pression 3 cellule de pression 6 enregistreur à écran
Figure 1 — Détermination de la consommation d'O (illustrant la connexion d'une unité de mesurage)
2
5.1.2 Appareillage
Une description détaillée de l'appareillage est donnée en Référence [4]; les principales caractéristiques sont
les suivantes.
Le système de mesurage (voir la Figure 1) est constitué d'un bain-marie thermostaté contenant des unités de
mesurage comprenant chacune un récipient de réaction (A) dans lequel un dispositif d'absorption du CO (2)
2
est suspendu par le bouchon, un générateur d'O (B) et un indicateur de pression (C). Les récipients (A, B, C)
2
de l'unité de mesurage forment un système fermé et sont connectés les uns aux autres par des tubes. De
cette manière, les fluctuations de pression atmosphérique ne risquent pas d'influencer les résultats. Le CO
2
produit est absorbé par l'hydroxyde de calcium (2). La consommation d'O due à la respiration génère une
2
pression négative qui active l'indicateur de pression (C). Cela entraîne la production d'O électrolytique ainsi
2
que l'affichage et l'enregistrement graphique des valeurs mesurées sur un enregistreur (6). La consommation
d'O s'affiche directement, en milligrammes d'oxygène (mg d'O ), sur un écran numérique.
2 2
1)
Le système peut être acheté dans le commerce et il convient que le manuel du fournisseur donne des
instructions détaillées.
5.1.3 Mode opératoire
Utiliser 50 g à 100 g de sol brut tamisé (2 mm) pour les mesurages. Il convient de ne pas mesurer la
consommation d'O au cours des deux premières heures, pour laisser au système le temps de s'équilibrer.
2
1) Sapromat est l'appellation commerciale d'un produit fourni par H+P Labortechnik AG. Cette information est donnée à
l'intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi
exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent aux
mêmes résultats.
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5.2 Détermination de la production de CO par titrage dans un système statique
2
5.2.1 Principe
Le sol est incubé dans un récipient fermé et le CO produit est absorbé dans une solution d'hydroxyde de
2
sodium. Après titrage en retour de l'hydroxyde de sodium non consommé, la quantité de CO produit est
2
calculée. La méthode convient pour analyser un grand nombre d'échantillons et il est possible d'effectuer
jusqu'à 80 mesurages de respiration par jour ouvré.
5.2.2 Réactifs
5.2.2.1 Eau exempte de CO
2
Faire bouillir de l'eau distillée et, après refroidissement, la conserver dans des flacons fermés à l'aide de
bouchons équipés de tubes d'absorption contenant de l'hydroxyde de calcium.
−1
5.2.2.2 Solution d'hydroxyde de sodium (NaOH), c = 0,05 mol⋅l .
−1
5.2.2.3 Solution d'acide chlorhydrique (HCl), c = 0,1 mol⋅l .
Il convient de choisir les concentrations de la solution de NaOH (5.2.2.2) et de la solution de HCl (5.2.2.3) de
manière que moins de 20 % du NaOH soient neutralisés par le CO . Des pourcentages de neutralisation plus
2
élevés donnent des résultats moins fiables (voir Référence [5]). Si d'autres concentrations sont utilisées, il
convient de modifier l'Équation (1) en conséquence.
−1
5.2.2.4 Solution de chlorure de baryum, c = 0,5 mol⋅l .
Dissoudre 10,4 g de BaCl dans 100 ml d'eau distillée exempte de CO (5.2.2.1).
2 2
5.2.2.5 Indicateur
Dissoudre 0,1 g de phénolphtaléine dans 100 ml d'éthanol aqueux (fraction volumique en éthanol de 0,6).
5.2.3 Appareillage
5.2.3.1 Flacons à col large (contenance de 250 ml) avec bouchons à vis et bague anti-goutte, ou
flacons de conservation (contenance de 1 l) avec rondelles de caoutchouc, couvercles et 2 pinces
universelles.
5.2.3.2 Tubes à centrifuger ou tubes de réaction avec bague (par exemple polypropylène, diamètre
extérieur de 29 mm, longueur de 120 mm). Il convient de percer de petits trous dans les tubes pour les
échanges gazeux. À la place des tubes, des sacs en nylon à mailles fines peuvent également être suspendus
par le col des flacons à col large.
5.2.4 Mode opératoire
Peser 20 g à 25 g de sol brut dans les tubes à centrifuger (5.2.3.2). Suspendre les tubes dans les flacons à
col large (5.2.3.1) (voir la Figure 2), dans lesquels 20 ml de solution d'hydroxyde de sodium (5.2.2.2) ont été
préalablement pipetés. Fermer les flacons de manière étanche et les incuber pendant 24 h dans une pièce
thermostatée à la température choisie, par exemple 22 °C ± 1 °C. Avant de fermer les flacons, il convient de
les rincer avec de l'air propre ayant une faible teneur en CO (par exemple de l'air provenant de l'extérieur).
2
absorbé précipite sous forme de carbonate de baryum lors de l'ajout de 2 ml
Retirer ensuite les tubes. Le CO
2
de solution de chlorure de baryum (5.2.2.4). Titrer l'hydroxyde de sodium inutilisé avec de l'acide
chlorhydrique (5.2.2.3) après avoir ajouté 3 ou 4 gouttes de solution d'indicateur (5.2.2.5).
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Légende
1 flacon à col large (250 ml) 6 ouvertures pour les échanges gazeux
2 bouchon à vis 7 échantillon de sol
3 bague anti-goutte 8 solution d'hydroxyde de sodium
4 joint d'étanchéité 9 filetage en plastique
5 tubes à centrifuger suspendus 10 sac en plastique tissé à mailles fines
Figure 2 — Flacons d'incubation pour la détermination de la respiration du sol
Il convient d'effectuer la détermination au moins en triple. Il convient d'inclure des contrôles (flacons en trois
exemplaires sans sol).
Si la respiration du sol est mesurée au cours d'une expérience à long terme (> 3 jours), alors il convient
d'incuber les échantillons de sol dans des flacons dans lesquels la solution d'hydroxyde de sodium est
renouvelée tous les 3 jours. Par ailleurs, la teneur en eau du sol doit être ajustée tous les 3 jours.
Il est également possible d'utiliser pour l'incubation des flacons de conservation (contenance de 1 l) équipés
de rondelles de caoutchouc, de couvercles et de 2 pinces universelles. Peser les échantillons de sol (jusqu'à
200 g) dans des disques de cristallisation placés au fond des flacons de conservation. Verser la solution
d'hydroxyde de sodium dans un bécher. Au fond des flacons, placer 4 ml d'eau exempte de CO (5.2.2.1)
2
pour préserver l'humidité de l'air.
NOTE Lors de la détermination en laboratoire de la respiration basale, une augmentation de la production de CO
2
est souvent observée au cours des premières heures. Cela peut être dû à une disponibilité accrue des nutriments en
raison du déplacement et du mélange des particules de sol pendant la préparation de l'échantillon, mais également à
l'établissement à court terme d'un équilibre entre le CO gazeux et le CO dissous. La durée d'incubation nécessaire pour
2 2
atteindre une respiration basale stable dépend en premier lieu de la teneur en composés carbonés facilement disponibles
du sol. Cela vaut pour toutes les méthodes mesurant la production de CO .
2
5.2.5 Calcul des résultats
Calculer le taux de production du CO à l'aide de l'Équation (1).
2
2,2VV−
()
bp
R = (1)
CO
2
24⋅⋅mw
sm sd
où
−1 −1
R est le taux de production du CO sur la base de la masse sèche de sol (mg de CO⋅g ⋅h );
CO
2 2 2
V est le volume moyen de HCl consommé dans le contrôle, en millilitres;
b
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V est le volume moyen de HCl consommé dans l'échantillon pour essai, en millilitres;
p
m est la masse de l'échantillon de sol brut, en grammes;
sm
−1 −1 −1
2,2 est un facteur (1 ml de HCl à 0,1 mol⋅l correspond à 2,2 mg de CO par jour) (mg⋅ml ⋅jour );
2
−1
24 est un facteur de conversion de la production quotidienne en production horaire (h⋅jour );
w est la fraction de masse sèche du sol brut.
sd
NOTE La fraction de masse sèche (w ) du sol brut est égale au pourcentage de masse sèche divisé par 100.
sd
−1 −1
Ce calcul n'est valide que si les concentrations de réactif spécifiées (NaOH à 0,05 mol⋅l et HCl à 0,1 mol⋅l )
sont utilisées.
5.3 Détermination coulométrique de la production de CO dans un système statique
2
5.3.1 Principe
L'échantillon de sol est incubé (par exemple en triple) dans des récipients à température constante et le CO
2
produit est absorbé dans la solution d'hydroxyde de sodium. Dans la réaction:
2 NaOH + CO → Na CO + H O
2 2 3 2
les ions hydroxydes sont remplacés par des ions carbonates qui ont une conductivité électrique différente. Le
changement de conductivité est enregistré électroniquement par l'appareil. Une teneur en CO de 0,000 1 %
2
(fraction volumique) peut être détectée avec certitude. L'appareillage permet de mesurer la respiration basale
ainsi que la respiration du sol induite par le substrat après ajout de glucose pour doser le carbone de la
biomasse. Selon le type d'appareillage, il est possible de mesurer simultanément jusqu'à 90 échantillons.
Il convient d'établir la masse des échantillons de sol utilisés et le réglage de la température conformément aux
instructions du fabricant.
Pour plus de détails, voir les Références [6] et [8].
5.3.2 Montage d'essai
Un type d'appareillage simple est illustré schématiquement à la Figure 3.
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Dimensions en millimètres
Légende
1 récipient avec échantillon de sol
2 cellule de conductivité (dans le couvercle)
3 électrodes en platine
Figure 3 — Appareillage pour le mesurage coulométrique de la respiration du sol
5.4 Détermination de la production de CO en utilisant un analyseur de gaz infrarouge dans
2
un système à flux continu
5.4.1 Principe
Les échantillons de sol sont rincés à l'air ambiant. La production de CO des échantillons de sol pendant la
2
période d'incubation est déterminée par un analyseur de gaz infrarouge en combinaison avec un débitmètre.
Cette méthode est fréquemment utilisée pour les mesurages de la biomasse microbienne, auquel cas une
température de 22 °C est recommandée. À une température autre que 22 °C, l'évaluation de routine des
mesurages de la biomasse ne peut pas être effectuée, mais doit être recalculée en utilisant des facteurs.
5.4.2 Réactif
−1 −1
5.4.2.1 Gaz d'étalonnage CO (air avec 350 µl de CO⋅l et 400 µl de CO⋅l ).
2 2 2
5.4.3 Appareillage
Matériel courant de laboratoire, ainsi qu'un analyseur de gaz infrarouge (voir la Figure 4) placé dans une
pièce thermostatée à la température choisie, par exemple 22 °C ± 1 °C.
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Légende
1 récipient d'échantillon de sol 5 vannes (3 voies) 9 réglage du débit et débitmètre
2 entrée d'air 6 orientation 10 analyseur infrarouge de CO
2
3 pompe à gaz 7 vanne de fermeture 11 unité de commande
4 humidificateur 8 air de référence 12 équipement de contrôle et d'évaluation
Figure 4 — Exemple de configuration d'un analyseur de gaz
infrarouge pour la détermination de la respiration du sol
5.4.4 Mode opératoire
Tamiser et peser 10 g à 200 g, selon l'activité prévue, de sol brut dans les cylindres d'échantillon de sol (par
exemple en triple). Pour que l'échantillon de sol remplisse entièrement le diamètre du cylindre, l'utilisation de
bouchons en mousse de polyuréthanne poreuse est recommandée, comme indiqué à la Figure 5. Pour
contrôler la ligne de base de l'appareillage, il convient qu'au moins deux cylindres d'échantillon restent vides.
Après avoir raccordé les cylindres d'échantillon à l'équipement de mesurage, démarrer les pompes à gaz et
régler le débit de gaz de chaque canal de mesurage à la valeur requise. Normalement, les données mesurées
sont automatiquement enregistrées par le logiciel d'évaluation.
L'analyseur de gaz infrarouge requiert généralement un réétalonnage toutes les semaines à toutes les deux
semaines à l'aide d'un gaz d'étalonnage.
Le débit continu d'air environnant dans l'échantillon de sol restreint la perturbation de l'équilibre du carbonate
du sol (en particulier dans les sols calcaires) et réduit ainsi le risque de résultats erronés dus à la production
d'origine abiotique de CO .
2
Une bonne linéarité est observée sur une vaste gamme entre la masse des échantillons de sol (10 g à 100 g)
et la production de CO pour l'équipement de mesurage décrit.
2
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Si ce système est comparé aux systèmes à flux continu qui utilisent de l'air exempt de CO pour mesurer la
2
production de CO , aucune inhibition du cycle de l'acide citrique n'est observée dans les micro-organismes.
2
Légende
1 échantillon de sol
2 bouchon en mousse de polyuréthanne
3 bouchons en caoutchouc
4 cylindre en verre acrylique
Figure 5 — Récipient d'échantillon pour la détermination de
la respiration du sol à l'aide d'un analyseur de gaz infrarouge
5.4.5 Calcul et résultats
L'analyseur de gaz infrarouge mesure la fraction volumique de CO en mode différentiel, en microlitres par
2
litre. Le taux de production de CO (milligrammes de CO par gramme par heure) est calculé par le logiciel
2 2
d'évaluation, en tenant compte du débit de gaz réellement mesuré (millilitres d'air par minute) et de la masse
de l'échantillon de sol (grammes de masse sèche).
()ϕ−⋅ϕ q
g
se
R = 0,00183 (2)
CO
2
mw⋅
sm sd
où
−1 −1
R est le taux de production de CO sur la base de la masse sèche de sol (mg de CO⋅g ⋅h );
CO
2 2 2
ϕ est la valeur de la fraction volumique de CO dans le cylindre d'échantillon de sol (µl de
s
2
−1
CO⋅l );
2
ϕ est la valeur de la fraction volumique de CO dans le cylindre vide qui a été analysé en
e
2
−1
dernier avant ou après le cylindre d'échantillon de sol (µl de CO⋅l );
2
q est la valeur du débit de gaz, en litres par heure;
g
−1
0,001 83 est le facteur de conversion des µl de CO en mg de CO (mg⋅µl ), si un volume molaire de
2 2
−1
CO est de 24,057 l⋅mol à 22 °C et à une pression de 101,3 kPa;
2
m est la masse de l'échantillon de sol brut, en grammes;
sm
w est la fraction de masse sèche du sol brut (voir la Note en 5.2.5).
sd
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5.5 Détermination de la production de CO par chromatographie en phase gazeuse dans un
2
système à flux continu et dans un système statique
5.5.1 Principe
Les échantillons de sol sont incubés dans un incubateur ou une pièce d'incubation à température constante
(par exemple 22 °C ± 1 °C) à l'abri de la lumière. De l'air ambiant ou de l'air synthétique exempt de CO est
2
aspiré à travers les échantillons. Le CO produit par les échantillons pendant la période d'incubation est
2
quantifié à l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse avec détecteur à ionisation de flamme (FID) ou
avec détecteur à conductivité thermique (TCD) en combinaison avec un débitmètre de gaz. Pour empêcher
toute condensation d'eau dans les mesurages de gaz en ligne, il est recommandé d'utiliser un tuyau de gaz
pouvant être chauffé dans l'incubateur.
5.5.2 Réactifs
−1 −1
5.5.2.1 Si de l'air ambiant est utilisé: gaz d'étalonnage CO (300 µl⋅l à 500 µl⋅l ).
2
−1 −1
5.5.2.2 Si de l'air synthétique est utilisé: gaz d'étalonnage CO (20 µl⋅l à 200 µl⋅l ).
2
5.5.3 Appareillage
5.5.3.1 Incubateur ou pièce d'incubation thermostaté(e).
5.5.3.2 Débitmètre de gaz.
5.5.3.3 Manomètre de gaz.
5.5.3.4 Chromatographe en phase gazeuse avec FID ou TCD.
NOTE Le TCD est souvent utilisé pour les gaz inertes car il dét
...
Questions, Comments and Discussion
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