ISO 4831:1978
(Main)Microbiology — General guidance for the enumeration of coliforms — Most probable number technique at 30 degrees C
Microbiology — General guidance for the enumeration of coliforms — Most probable number technique at 30 degrees C
Microbiologie — Directives générales pour le dénombrement des coliformes — Technique du nombre le plus probable après incubation à 30 degrés C
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Relations
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INTERNATIONAL STANDARD 4831
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION*MEW(OYHAPO&HAR OPTAHHJAUMR i'iO CTAHLIAPTIA3A~HH*ORGANlSATlON INTERNATIONALE DE NORMALISATION
Microbiology - General guidance for the enumeration of
coliforms - Most probable number technique at 30 "C
Microbiologie - Directives générales pour le dénombrement des coliformes - Technique du nombre
le plus probable après incubation à 30 OC
First edition - 1978-08-15
-
w
-
UDC 663.1 Ref. No. IS0 4831 -1978 (E)
2
Q)
Descriptors : food products, animal products, microbiological analysis, counting, coliform bacteria.
-
m
%
O
5
Price based on 8 pages
---------------------- Page: 1 ----------------------
FOREWORD
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation
of national standards institutes (IS0 member bodies). The work of developing
International Standards is carried out through IS0 technical committees. Every
member body interested in a subject for which a technical committee has been set
up has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with 60, also take part in the work.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated
to the member bodies for approval before their acceptance as International
Standards by the IS0 Council.
international Standard IS0 4831 was developed by Technical Committee
ISO/TC 34, Agricultural food products, and was circulated to the member bodies
1976.
in July
It has been approved by the member bodies of the following countries
Australia Hungary Portugal
India
Austria Romania
South Africa, Rep. of
Bulgaria Iran
Canada Ireland
Spain
Czechoslovakia Israel Turkey
France Mexico United Kingdom
Germany Netherlands U.S.A.
Ghana Poland Yugoslavia
The member bodies of the following countries expressed disapproval of the
document on technical grounds :
Chile
New Zealand
Thailand
Q International Organization for Standardization, 1978
Printed in Switzerland
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INTERNATIONAL STANDARD IS0 4831 - 1978 (E)/ERRATUM
Published 1979-03-01
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATlON*MEm4YHAPOfiHAR OPTAHMJAUMR Il0 CTAHfiAPTM3AUMM*ORGANlSATlON INTERNATIONALE DE NORMALISATION
Microbiology - General guidance for the enumeration of coliforms - Most probable number technique at
30 "C
ERRATUM
Page 2
Sub-clause 6.4, line 2 : Substitute "20 mm x 200 mm" for "200 mm x 200 mm".
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1
I NTE RNATl ON AL STAN DARD IS0 4831-1978 (E)
Microbiology - General guidance for the enumeration of
coliforms - Most probable number technique at 30 "C
O INTRODUCTION 0.3 For the purposes of a practicable test method, the defi-
nition of "coliforms" given in clause 3 and used as the basis
0.1 This International Standard is intended to provide
for the procedure is not necessarily identical with corres-
general guidance for the examination of products not dealt
ponding definitions given in other published texts. A pro-
with by existing International Standards and for the
portion of strains of the micro-organisms described in other
consideration of bodies preparing reference microbiological
published texts as "coliforms" (including Escherichia coli)
methods of test for application to foods or to animal
fail to produce enough gas to be detectable by use of a
feeding stuffs. Because of the large variety of products
Durham tube (i.e. "anaerogenic strains"). Therefore, the
within this field of application, these guidelines may not
method described by this International Standard will not
be appropriate for some products in every detail, and for
detect all strains of the micro-organisms referred to in
some other products it may be necessary to use different
other publications as "(presumptive) coliforms" (for
methods. Nevertheless, it is hoped that in all cases every
example Citrobacter, Enterobacter, Klebsiel1a)l).
attempt will be made to apply the guidelines provided as
far as possible and that deviations from them will only
be made if absolutely necessary for technical reasons.
When this International Standard is next reviewed, account 1 SCOPE AND FIELD OF APPLICATION
will be taken of all information then available regarding the
This International Standard gives general guidelines for the
extent to which the guidelines have been followed and the
enumeration of coliforms present in products intended for
reasons for deviation from them in the case of particular
human consumption or feeding of animals, by means of the
products.
culture technique involving a liquid medium, and
calculation of the most probable number (MPN) after
The harmonization of ;test methods cannot be immediate,
incubation at 30 OC.
and for certain groups of products International Standards
and/or national standards may already exist that do not
A limitation on the applicability of this International
comply with the guidelines. In cases where International
Standard is imposed by the method's susceptibility to a
Standards already exist for the product to be tested, they
large degree of variability. The method should be applied
should be followed, but it is hoped that when such stan-
and the results interpreted in the light of the information
dards are reviewed they will be changed to comply with this
given in 10.4.
so that eventually the only remain-
International Standard
ing departures from these guidelines will be those necessary
for well established technical reasons.
0.2 The technique described in this International Standard 2 REFERENCES
is less precise than that described in IS0 4832, but allows
IS0 2293, Meat and meat products - Aerobic count at
a microbiological examination to be carried out on a larger
30 "C (Reference method).
test portion, thus permitting a lower number of coliforms
per gram or per millilitre of product to be detected. More-
ISO3565, Meat and meat products - Detection of
over, since the definition of "coliforms" adopted in the two
salmonellae (Reference method).
documents is different, the micro-organisms enumerated
IS0 4832, Microbiology - General guidance for enumer-
are not necessarily the same.
ation of coliforms - Colony count technique at 30 "C.
For any particular product, the method to be chosen will
IS0 . . ., Microbiology - General guidance for preparation
be specified in the International Standard dealing with that
of dilutions. 2,
product,
1) See Edwards, P. R., and Ewing, W. H. (1972) : "ldentification of Enterobacteriaceae", 3rd edition, Burgess Publishing Company,
Minneapolis, Minnesota, U.S.A.
2) In preparation.
1
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IS0 4831 -1978 (E)
3 DEFINITION medium, the dilution fluid or the sample, except for
apparatus that is supplied sterile (particularly plastics
For the purpose of this International Standard, the follow-
apparatus), shall be sterilized either
ing definition applies :
- by being kept at 170 to 175 OC for not less than 1 h
"coliforms" : Bacteria which, at 30 OC, cause fermentation
in an oven, or
of lactose with the production of gas under the operational
- by being kept at 121 f 1 OC for not less than 20 min
conditions described.
in an autoclave.
4 PRINCIPLE
6.2 Incubator, capable of being controlled at 30 f 1 OC.
4.1 Inoculation of three tubes of double-strength liquid
selective culture medium (all ) with a specified quantity of
the test sample if the initial product is liquid, or with a
specified quantity of an initial suspension in the case of 6.3 Loop, of platinum-iridium or nickel-chromium,
other products. diameter approximately 3 mm.
4.2 Inoculation of three tubes of single-strength liquid
6.4 Test tubes, approximately 16 mm X 160 mm and
selective culture medium (b)l) with a specified quantity of
200 mm x 200 mm, or bottles of equivalent capacity.
the test sample if the initial product is liquid, or with a
specified quantity of an initial suspension in the case of
other products; then, under the same conditions, inocu-
lation of further tubes of medium (b) with decimal dilutions
6.5 Durham tubes, of a size suitable for use in
of the test sample or of the initial suspension.
16 mm x 160 mm test tubes.
4.3 Incubation of the tubes containing medium (a) at
30 OC for 24 h.
6.6 Total delivery pipettes (blow-out pipettes), having
nominal capacities of 1 mi and 10 mi.
4.4 Incubation of the tubes containing medium (b) at
30 OC for 24 h or 48 h, and examination of these tubes.
6.7 pH meter.
4.5 Inoculation of a new series of tubes of medium (b),
with the cultures from the tubes of medium (a) and with
7 CULTURE MEDIUM AND DILUTION FLUID
those cultures from the first series of tubes of medium (b)
in which opacity or gas formation has been noted.
7.1 Basic materials
4.6 Incubation at 30 OC for 24 h or 48 h, and examination
In order to improve the precision of the results, it is
of the new series of tubes.
recommended that, for the preparation of the culture
medium, dehydrated basic components or a complete
4.7 Calculation of the number of coliforms per millilitre dehydrated medium should be used. The manufacturer's
or per gram of sample (i.e. the MPN), from the number of instructions shall be rigorously followed.
tubes in the new series in which gas formation has been
The chemicals used shall be of analytical quality.
noted, using a table for determination of most probable
numbers.
The water used shall be distilled or deionized, and shall be
free from substances that might inhibit growth of coliforms
under the test conditions.
5 SAMPLING
If the medium and dilution fluid are not used immediately,
Carry out sampling in conformity with the International
they shall be kept in the dark at a temperature between
Standard dealing with the product concerned.
O and -I- 5 OC, and in conditions that prevent any change
in their composition. They shall not be kept for longer than
1 month.
6 APPARATUS AND GLASSWARE
Usual microbiological laboratory equipment, and in
particular :
7.2 Dilution fluid
Use a peptone-based dilution fluid containing sodium
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet steriliz-
chloride, buffered or not; for example, peptone-saline
ation (autoclave).
dilution fluid (see 5.3 of IS0 2293) or buffered peptone
Apparatus which will enter into contact with the culture water (see 6.2.1 of IS0 3565).
1) Where appropriate, a liquid enrichment medium may be used prior to the inoculation of the selective medium.
%
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IS0 4831 -1978 (E)
7.3 Lactose bile brilliant green broth (selective medium) Prepare the initial suspension and the dilutions using a
dilution fluid meeting the requirements given in 7.2.
Composition
Make a sufficient number of dilutions to ensure that ail
a) b)
the tubes corresponding to the final dilution will yield a
Double- Single-
negative result.
strength strength
medium medium
peptone 20 g 10 9
9.2 MPN technique
lactose 20 9 10 9
9.2.1 Inoculation
dehydrated ox bile 40 9 20 9
92.1.1 Take three tubes of double-strength selective
brilliant green corre-
medium r7.3 a)]. Transfer to each of these tubes, using a
sponding to the
pipette (6.61, 10 ml of the test sample, if liquid, or 10 ml
specifications in
of the initial suspension.
the annex of
IS0 3565 0,026
a 0,01339
9.2.1.2 Then take three tubes of single-strength selective
water 1000ml 1000ml
medium [7.3 b)]. Transfer to each of these tubes, using a
Preparation
pipette (6.61, 1 ml of the test sample, if liquid, or 1 ml of
the initial suspension.
Dissolve the components or the dehydrated complete
medium in the water by boiling.
92.1.3 For each of the following dilutions (from 1/10 or
If necessary, adjust the pH (checking with the pH meter)
1/100, according to the circumstances), take three tubes of
so that after sterilization it is 7,2 f 0,l at 25 OC.
single-strength selective medium [7.3. b)]. Transfer 1 ml
of the respective dilution into each of these tubes. Change
Dispense the medium, in quantities of IOml, in
-
the pipette for each dilution. Carefully mix the inoculum
16 mm x 160 mm
...
NOR ME INTERNAT10 NALE 4831
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION~MElKAYHAPOflHAR OPTAHHJAUHR fl0 CTAHaAPrH3AUHH.oRGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION
\
Microbiologie - Directives générales pour le dénombrement
des coliformes - Technique du nombre le plus probable
après incubation à 30 "C
Microbiology - General guidance for the enumeration of coliforms - Most probable number
technique at 30 OC
Première édition - 1978-08-15
Réf. no : IS0 4831-1978 (FI
CDU 663.1
Descripteurs : produit alimentaire, produit animal, analyse microbiologique, comptage, bactérie coliforme.
Prix basé sur 8 pages
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AVANT-PROPOS
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale
d'organismes nationaux de normalisation (comités membresde I'ISO). L'élaboration
des Normes internationales est confiée aux comités techniques de I'ISO. Chaque
comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique
correspondant. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I'ISO, participent également aux travaux.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont
soumis aux comités membres pour approbation, avant leur acceptation comme
Normes internationales par le Conseil de I'ISO.
La Norme internationale IS04831 a été élaborée par le comité technique
ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, et a été soumise aux comités membres
en juillet 1976.
Les comités membres des pays suivants l'ont approuvée :
Afrique du Sud, Rép. d' Ghana Pologne
Allemagne Hongrie Portugal
Australie Inde Roumanie
Autriche
Iran Royaume-Uni
Bulgarie
Irlande Tchécoslovaquie
Canada Israël Turquie
Espagne
Mexique U.S.A.
France
Pays-Bas Yougoslavie
Les comités membres des pays suivants l'ont désapprouvée pour des raisons
techniques :
Chili
Nouvelle-Zélande
Thaïlande
1
O Orflanirarien internationale de normalisation, 1978 O
Imprimé en Suisse
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IS0 4831-1978 (F)
NORME INTERNATIONALE
Microbiologie - Directives générales pour le dénombrement
des coliformes - Technique du nombre le plus probable
à 30 "C
après incubation
O INTRODUCTION Pour chaque produit particulier, le choix de la technique
sera précisé dans la Norme internationale concernant ce
0.1 La présente Norme internationale se propose de four-
produit.
nir des directives générales pour l'examen de produits non
traités dans les Normes internationales existant actuelle-
0.3 Pour les besoins d'une méthode d'essai efficace, la
ment, et pour être étudiées par les organismes élaborant des
définition des moliformes)), donnée dans le chapitre 3 et
méthodes d'essais microbiologiques destinées à être appli-
servant de base à la technique, n'est pas nécessairement
0
quées à des produits alimentaires ou à des aliments pour
identique aux définitions correspondantes données dans
animaux. En raison de la grande diversité des produits
d'autres textes publiés. Une certaine proportion de souches
entrant dans ce domaine d'application, il est possible que
des micro-organismes désignés sous le nom de «col iformes))
ces directives, dans tous leurs détails, ne conviennent pas
(y compris les €scherichia coli) dans d'autres textes publiés,
exactement à certains produits et que, pour certains autres
ne produisent pas suffisamment de gaz pour pouvoir être
produits, il puisse être nécessaire d'employer des méthodes
décelées au moyen des cloches de Durham (ce sont des
différentes. Néanmoins, il est à espérer que, dans tous les
souches anaérogènes). C'est pourquoi la technique décrite
cas, tous les efforts seront faits pour appliquer, chaque fois
dans la présente Norme internationale ne détectera pas la
qu'il sera possible, les directives données, et qu'on n'aura
totalité des souches des micro-organismes désignés, dans
recours à des dérogations que si cela est absolument néces-
d'autres publications, sous le nom de ((col iformes (présu-
saire pour des raisons techniques.
més)# (par exemple Citrobacter, Enterobacter, Klebsie//a)l).
la présente Norme internationale sera réexaminée,
Lorsque
il sera tenu compte de tous les renseignements disponibles
à ce moment-là, à savoir dans quelle mesure les directives
auront été suivies et les raisons pour lesquelles il aura été
1 OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION
nécessaire d'y déroger dans le cas de produits particuliers.
La présente Norme internationale donne des directives
L'harmonisation des méthodes d'essai ne peut pas être
générales pour le dénombrement des coliformes dans les
immédiate et, pour certains groupes de produits, des normes
produits destinés à la consommation humaine ou à I'alimen-
nationales et/ou des Normes internationales existent peut-
tation animale, au moyen de la technique de culture en
être déjà, qui ne concordent pas avec ces directives. Dans le
milieu liquide avec calcul du nombre le plus probable
*
cas où des Normes internationales existent déjà pour le
(NPP) après incubation à 30 OC.
produit à contrôler, elles devront être appliquées, mais il
Des limites sont imposées aux possibilités d'application de
serait souhaitable que, lorsqu'elles viendront en révision,
la présente Norme internationale, du fait que cette méthode
elles soient modifiées de façon à se conformer à la présente
est sujette à de grandes variations. II est recommandé
Norme internationale, si bien que finalement les seules
d'appliquer cette méthode et d'interpréter les résultats à la
divergences restantes seront celles qui sont nécessaires pour
lumière des renseignements donnés en 10.4.
des raisons techniques bien établies.
0.2 La technique décrite dans la présente Norme interna-
tionale est moins précise que celle décrite dans I'ISO 4832,
2 R~FÉRENCES
mais elle permet d'effectuer un examen microbiologique
sur une prise d'essai plus importante et, par conséquent, de
IS0 2293, Viandes et produits à base de viande - Dénom-
détecter un plus petit nombre de coliformes par gramme ou
brement des germes aérobies à 30 OC (Méthode de réfé-
par millilitre de produit. D'autre part, la définition des
rence).
(coliformes)) adoptée dans les deux documents étant diffé-
IS0 3565, Viandes et produits à base de viande - Recher-
rente, on ne dénombre pas nécessairement les mêmes micro-
che des salmonellae (Méthode de référence).
organismes.
1) Voir Edwards, P. R., et Ewing, W. H.( 1972) : «/dentificerion of Enterrobacteriaceaen, 3e édition, Burgess Publishing Company, Minneapolis,
Minnesota, U.S.A.
1
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IS0 4831-1978 (F)
IS0 4832, Microbiologie - Directives générales pour le 6 APPAREILLAGE ET VERRERIE
dénombrement des coliformes - Méthode par comptage
Matériel courant de laboratoire de microbiologie, et notam-
des colonies obtenues à 30 C.
ment :
IS0 . . ., Microbiologie - Directives générales pour la pré-
paration des dilutions. 1)
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche (four)
ou en chaleur humide (autoclave).
3 DÉFINITIOM
Le matériel en contact avec les milieux de culture, le
diluant et l'échantillon, sauf s'il est livré stérile (particulière-
Pour les besoins de la présente Norme internationale, la
ment celui en plastique), doit être stérilisé :
définition suivante s'applique :
- soit au four, en le maintenant à une température
de 170 à 175 OC durant au moins 1 h;
mentation du lactose avec production de gaz, dans les
conditions opératoires décrites.
- soit à l'autoclave, en le maintenant à une tempéra-
ture de 121 f 1 OC durant au moins 20 min.
4 PRINCIPE
6.2 Étuve, réglable à 30 rt 1 OC.
4.1 Ensemencement de trois tubes de milieu sélectif
liquide double concentration (a)2) avec une quantité déter-
minée de l'échantillon pour essai si le produit à examiner
6.3 Anse bouclée, en platine iridié ou en nickel-chrome,
est liquide, ou avec une quantité déterminée de suspension
de diamètre environ 3 mm.
mère dans le cas d'autres produits.
6.4 Tubes à essais, de 16 mm x 160 mm et 20 mm x
4.2 Ensemencement de trois tubes de milieu sélectif
200 mm environ, ou fioles de capacité analogue.
simple concentration (b)2) avec une quantité déterminée
de l'échantillon pour essai si le produit à examiner est
liquide, ou avec une quantité déterminée de suspension
6.5 Cloches de Durham, de dimensions appropriées en vue
mère dans le cas d'autres produits; puis, dans les mêmes
de leur utilisation dans des tubes de 16 mm x 160 mm.
conditions, ensemencement du milieu (b) avec les dilutions
décimales obtenues à partir de l'échantillon pour essai ou
de la suspension mère.
6.6 Pipettes à écoulement total, de capacité nominale 1 ml
et 10 ml.
4.3 Incubation à 3OoC durant 24 h pour les tubes de
milieu (a).
6.7 pH-mètre.
4.4 Incubation à 30 OC durant 24 ou 48 h pour les tubes
de milieu (b) et examen de ces tubes.
7 MILIEU DE CULTURE ET DILUANT
4.5 Repiquage à partir des tubes de milieu (a) et des tubes
7.1 Composants de base
de milieu (b) opaques ou ayant donné lieu à un dégagement
Pour améliorer la fidélité des résultats, il est recommandé
gazeux, dans une nouvelle série de tubes de milieu (b).
d'utiliser, pour la préparation du milieu de culture, des
composants de base déshydratés ou un milieu complet
4.6 Incubation à 30 OC durant 24 ou 48 h et examen de
déshydraté. Les prescriptions du fabricant doivent être
cette nouvelle série de tubes.
suivies scrupuleusement.
4.7 Calcul du nombre de coliformes par millilitre ou par
Les produits chimiques utilisés doivent être de qualité
gramme d'échantillon (c'est-à-dire le NPP), au moyen d'une analytique.
table pour la détermination du nombre le plus probable, à
L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou déminéralisée,
partir du nombre de tubes de cette nouvelle série dans
exempte de substances pouvant inhiber la croissance des
lesquels on note une production de gaz.
coliformes dans les conditions de l'essai.
Si le milieu et le diluant ne sont pas utilisés extempo-
5 ÉCHANTILLONNAGE
ranément, ils doivent être conservés à l'obscurité entre O
Effectuer l'échantillonnage conformément à la Norme et 4- 5 OC pendant 1 mois au maximum, dans des conditions
évitant toute modification de leur composition.
internationale traitant du produit concerné.
1) En préparation.
2) S'il y a lieu, un milieu liquide d'enrichissement peut être utilisé avant l'ensemencement du milieu sélectif.
2
---------------------- Page: 4 ----------------------
IS0 4831-1978 (F)
9.1 Prise d'essai, suspension mère et dilutions
7.2 Diluant
Se reporter à I'ISO. . . (voir chapitre 2) et à la Norme
Utiliser un diluant tamponné ou non à base de peptone
internationale concernant le produit à examiner.
et contenant du chlorure de sodium, par exemple diluant
peptone-sel (voir 5.3 de I'ISO 2293) ou eau peptonée
Préparer la suspension mère et les dilutions au moyen d'un
tamponnée (voir 6.2.1 de I'ISO 3565).
diluant répondant aux conditions décrites en 7.2.
7.3 Bouillon lactosé bilié au vert brillant (milieu sélectif)
Effectuer un nombre de dilutions suffisant afin d'être sûr
que tous les tubes de la dernière dilution soient négatifs.
Composition
a) b)
9.2 Technique du NPP
Milieu double Milieu simple
concentration concentration
9.2.1 Ensemencement
peptone
9.2.1.1 Prendre trois tubes de milieu sélectif double
lactose
concentration 17.3 a)]. Transférer, dans chacun de ces
bile de bœuf
tubes, avec une pipette (6.6), 10 ml de l'échantillon pour
déshydratée 40 20 9
essai s'il est liquide, ou 1 O ml de la suspension mère.
e
vert brillant répon-
dant aux spécifi-
9.2.1.2 Prendre ensuite trois tubes de milieu sélectif
cations de l'annexe
simple concentration [7.3 b)]. Transférer, dans chacun
de I'ISO 3565 0,026 6 g 0,013 3 g
de ces tubes, avec une pipette (6.61, 1 ml de l'échantillon
pour essai s'il est liquide, ou 1 ml de la suspension mère.
eau 1000ml 1000ml
Préparation
9.2.1.3 Pour chacune des dilutions suivantes (à partir
de 1/10 ou 1/100, selon le cas), prendre trois tubes de
Dissoudre dans l'eau les composants ou le milieu
milieu sélectif simple concentration [7.3 b)]. Transférer,
complet déshydraté, en portant à l'ébullition.
dans chacun de ces tubes, 1 ml de dilution. Changer de
pipette à chaque dilution. Bien mélanger I'inoculum et le
Si nécessaire, ajuster le pH (en contrôlant au pH-mètre)
milieu.
de sorte qu'après stérilisation, il soit de 7,2 f 0,l
à 25 OC.
9.2.2 Incubation
Répartir le milieu, par quantités de 10 ml, dans des tubes
à essais de 16 mm x 160 mm (6.4) contenant des cloches
9.2.2.1 Faire incuber les tubes de milieu double concentra-
de Durham (6.5) dans le cas du milieu simple concentra-
tion (9.2.1.1) à l'étuve (6.2) à 30 f 1 OC durant 24 f 2 h.
tion, et dans des tubes de 20 mm x 200 mm (6.4) (sans
cloches) dans le cas du milieu double concentration.
9.2.2.2 Faire incuber les tubes de milieu simple concen
...
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