Horizontal methods for molecular biomarker analysis -- Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products

ISO/TS 21569-3:2015 describes a procedure for the detection of the DNA transition sequence between the 35S promotor (P35S) from Cauliflower mosaic virus and a modified phoshinothricin-acetyltransferase gene (pat) from Streptomyces viridochromogenes. ISO/TS 21569-3:2015 is applicable for the analysis of DNA extracted from foodstuffs. It may also be suitable for the analysis of DNA extracted from other products such as feedstuffs and seeds.

Méthodes horizontales d'analyse moléculaire de biomarqueurs -- Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés

L'ISO/TS 21569-3:2015 décrit un mode opératoire permettant la détection d'une séquence d'ADN de transition entre le promoteur 35S (P35S) du virus de la mosaďque du chou-fleur et un gčne modifié codant pour l'enzyme phosphinothricine-acétyltransférase (pat) et provenant de Streptomyces viridochromogenes. L'ISO/TS 21569-3:2015 est applicable ŕ l'analyse de l'ADN extrait de produits alimentaires. Elle peut ętre également utilisée pour analyser l'ADN extrait d'autres produits tels que des aliments pour animaux et des semences. L'application de cette méthode exige qu'une quantité adéquate d'ADN amplifiable de qualité appropriée soit extraite de la matrice étudiée.

General Information

Status
Replaced
Publication Date
06-Jan-2015
Withdrawal Date
06-Jan-2015
Current Stage
9599 - Withdrawal of International Standard
Completion Date
07-Jan-2015
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ISO/TS 21569-3:2015 - Horizontal methods for molecular biomarker analysis -- Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products
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ISO/TS 21569-3:2015 - Méthodes horizontales d'analyse moléculaire de biomarqueurs -- Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés
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TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 21569-3
First edition
2015-02-01
Horizontal methods for molecular
biomarker analysis — Methods
of analysis for the detection of
genetically modified organisms and
derived products —
Part 3:
Construct-specific real-time PCR
method for detection of P35S-pat-
sequence for screening genetically
modified organisms
Méthodes horizontales d’analyse moléculaire de biomarqueurs —
Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés —
Partie 3: Méthode PCR en temps réel spécifique de la construction
pour la détection de la séquence P35S-pat pour criblage des
organismes génétiquement modifiés
Reference number
ISO/TS 21569-3:2015(E)
ISO 2015
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ISO/TS 21569-3:2015(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2015

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form

or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior

written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

the requester.
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Published in Switzerland
ii © ISO 2015 – All rights reserved
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ISO/TS 21569-3:2015(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 1

5 Reagents and materials ................................................................................................................................................................................. 2

5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 2

5.2 PCR reagents ............................................................................................................................................................................................. 2

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 3

7 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 3

7.1 Test sample preparation ................................................................................................................................................................. 3

7.2 Preparation of the DNA extracts .............................................................................................................................................. 3

7.3 PCR setup ..................................................................................................................................................................................................... 3

7.4 Temperature-time programme ................................................................................................................................................. 4

8 Accept/reject criteria ...................................................................................................................................................................................... 4

8.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 4

8.2 Identification ............................................................................................................................................................................................ 4

8.3 Calculation of P35S-pat copy numbers ............................................................................................................................. 4

9 Validation status and performance criteria ............................................................................................................................. 5

9.1 Robustness of the method ............................................................................................................................................................. 5

9.2 Collaborative trial for determination of LOD ................................................................................................................ 5

9.3 Collaborative trial for quantification of the P35S-pat construct in rapeseed .................................. 6

9.4 Sensitivity .................................................................................................................................................................................................... 7

9.5 Specificity .................................................................................................................................................................................................... 7

10 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 8

Bibliography ................................................................................................................................................................................................................................ 9

© ISO 2015 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/TS 21569-3:2015(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of any

patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or on

the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity

assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers

to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information

The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,

Horizontal methods for molecular biomarker analysis.

ISO 21569 consists of the following parts, under the general title Horizontal methods for molecular

biomarker analysis — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived

products:

— Part 2: Construct-specific real-time PCR method for detection of event FP967 in linseed and linseed

products [Technical Specification]

— Part 3: Construct-specific real-time PCR method for the detection of the P35S-pat–sequence for screening

for compounds of genetically modified organisms [Technical Specification]
ISO 21569:2005 is to be revised to become the future Part 1.
iv © ISO 2015 – All rights reserved
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TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 21569-3:2015(E)
Horizontal methods for molecular biomarker analysis —
Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products —
Part 3:
Construct-specific real-time PCR method for detection
of P35S-pat-sequence for screening genetically modified
organisms
1 Scope

This Technical Specification describes a procedure for the detection of the DNA transition sequence

between the 35S promotor (P35S) from Cauliflower mosaic virus and a modified phoshinothricin-

acetyltransferase gene (pat) from Streptomyces viridochromogenes. The P35S-pat construct is frequently

found in genetically modified plants with tolerance for phosphinothricin-containing herbicides. The

P35S-pat construct specific method is based on a real-time PCR and can be used for qualitative and

quantitative screening purposes. For identification and quantification of a specific event, a follow-up

analysis has to be carried out.

This Technical Specification is applicable for the analysis of DNA extracted from foodstuffs. It may also

be suitable for the analysis of DNA extracted from other products such as feedstuffs and seeds. The

application of this method requires the extraction of an adequate quantity and quality of amplifiable

DNA from the relevant matrix.
2 Normative references

The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are

indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated

references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 21569, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived

products — Qualitative nucleic acid based methods

ISO 21571, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived

products — Nucleic acid extraction

ISO 24276, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived

products — General requirements and definitions
3 Terms and definitions

For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 24276 apply.

4 Principle

DNA is extracted from the test portion applying a suitable method. The DNA analysis consists of two

parts, namely,

1) verification of the amount and amplifiability of the extracted DNA, e.g. by means of a target taxon

[10]
specific real-time PCR (see ISO 21570 ), and
© ISO 2015 – All rights reserved 1
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ISO/TS 21569-3:2015(E)
[1,2]
2) detection of the P35S-pat construct in a real-time PCR.
5 Reagents and materials
5.1 General

Chemicals of recognized analytical grade, appropriate for molecular biology shall be used, as a rule.

The water used shall be double distilled or PCR grade water (i.e. nuclease and nucleic acid free). For all

operations in which gloves are used, it should be ensured that these are powder-free. The use of aerosol-

protected pipette tips as protection against cross contamination is recommended.
5.2 PCR reagents
5.2.1 Thermostable DNA polymerase, for hot-start PCR.

5.2.2 PCR buffer solution, containing magnesium chloride and deoxyribonucleoside triphosphates

(dATP, dCTP, dGTP and dUTP).

Ready-to-use reagent mixtures or mixes of individual components can be used. Reagents and polymerases

which lead to equal or better results may also be used.
5.2.3 Oligonucleotides (see Table 1).
Table 1 — Oligonucleotides
Final concentration
Name DNA sequence of the oligonucleotide
in the PCR
[1,2]
P35S-pat construct as the target sequence:
Primer 35SP03.f 5’-AAg TTC ATT TCA TTT ggA gAg gAC A-3’ 200 nmol/l
Primer pat-7.r 5’-Cgg CCA TAT CAg CTg CTg TAg-3’ 200 nmol/l
5’-(FAM)-CCg gAg Agg AgA CCA gTT gAg ATT Agg
Probe GSS01.s 100 nmol/l
C-(TAMRA)-3’
FAM: 6-Carboxyfluorescein, TAMRA: 6-Carboxytetramethylrhodamine

NOTE Equivalent reporter dyes and/or quencher dyes can be used for the probe if they can be shown to yield

similar or better results.
5.2.4 Standard DNA for calibration

A standard DNA solution of a known concentration (ng/µl) can be used to calculate the copy number of

the P35S-pat target sequence.

When using genomic plant DNA as the standard DNA, the number of haploid genome equivalents should

be calculated on the basis of the molecular mass of the plant haploid genome by applying the Formula (1):

DNA concentration[ng/lμ⋅] 1000
Number of genome equivalents per µl = (1)
haploidgenomemass[pg]

On the basis of the genome equivalents, the respective copy number for the P35S-pat sequence can be

calculated. In doing so, the number of integrations into the plant genome as well as the degree of zygosity

of the plant material used shall be taken into consideration.
2 © ISO 2015 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/TS 21569-3:2015(E)
6 Apparatus

Regarding the apparatus and materials, see ISO 21569. In addition to the usual laboratory equipment,

the following equipment is required.

6.1 Real-time PCR device, suitable for the excitation of fluorescent molecules and the detection of

fluorescence signals generated during PCR.
7 Procedure
7.1 Test sample preparation

It should be ensured that the test sample used for DNA extraction is representative of the laboratory

sample, e.g. by grinding or homogenizing of the samples. Measures and operational steps to be taken

into consideration shall be as described in ISO 21571 and ISO 24276.
7.2 Preparation of the DNA extracts

Concerning the preparation of DNA from the test portion, the general instructions and measures

described in ISO 21571 should be followed. It is recommended to choose one of the DNA extraction

methods described in ISO 21571, Annex A.
7.3 PCR setup

The method is described for a total volume of 25 μl per PCR. The reaction set-up is given in Table 2.

Completely thaw reagents at room temperature. Each reagent should be carefully mixed and briefly

centrifuged immediately before pipetting. Prepare a PCR reagent mixture which contains all components

except for the sample DNA. The required amount of the PCR reagent mixture depends on the number of

reactions to be performed, including at least one additional reaction as a pipetting reserve. Add 5 µl of

sample DNA to each reaction.
Table 2 — Reaction set-up for the amplificiation
Overall reaction volume 25 µl
Sample DNA (up to 200 ng) or controls 5 µl

PCR buffer solution (including MgCl , dNTPs and hot-start DNA polymerase) 12,5 µl

Primer 35SP03.f and pat-7.r see Table 1
Probe GSS01.s see Table 1
Water To 25 µl

In the collaborative study, depending on the real-time PCR devices, different PCR buffer solutions were used [TaqMan

Universal PCR Mastermix (Life Technologies, Darmstadt), QuantiTect Multiplex PCR NoROX or QuantiTect Probe PCR

Mastermix (Qiagen GmbH, Hilden)]. This information is given for the convenience of users of this document and does not

constitute an endorsement by ISO. Equivalent products from other manufacturers may be used if they yield similar or better

results. If necessary, adapt the amounts of the reag
...

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 21569-3
Première édition
2015-02-01
Méthodes horizontales d’analyse
moléculaire de biomarqueurs —
Méthodes d’analyse pour la détection
des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés —
Partie 3:
Méthode PCR en temps réel construit-
spécifique pour la détection de la
séquence P35S-pat pour criblage des
organismes génétiquement modifiés
Horizontal methods for molecular biomarker analysis — Methods
of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products —
Part 3: Construct-specific real-time PCR method for detection of P35S-
pat-sequence for screening genetically modified organisms
Numéro de référence
ISO/TS 21569-3:2015(F)
ISO 2015
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/TS 21569-3:2015(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2015

Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée

sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur

l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
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Publié en Suisse
ii © ISO 2015 – Tous droits réservés
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ISO/TS 21569-3:2015(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Réactifs et matériaux ....................................................................................................................................................................................... 2

5.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 2

5.2 Réactifs PCR ............................................................................................................................................................................................... 2

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 3

7 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 3

7.1 Préparation de l’échantillon pour essai ............................................................................................................................. 3

7.2 Préparation des extraits d’ADN ................................................................................................................................................. 3

7.3 Réaction PCR ............................................................................................................................................................................................. 3

7.4 Programme d’amplification ......................................................................................................................................................... 4

8 Critères d’acceptation/rejet ..................................................................................................................................................................... 4

8.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 4

8.2 Identification ............................................................................................................................................................................................ 5

8.3 Calcul du nombre de copies pour la séquence P35S-pat ...................................................................................5

9 État de validation et critères de performance ....................................................................................................................... 5

9.1 Robustesse de la méthode ............................................................................................................................................................. 5

9.2 Essai interlaboratoires pour la détermination de la limite de détection (LOD) ............................. 5

9.3 Essai interlaboratoires pour la quantification du construit P35S-pat dans le colza ................. 6

9.4 Sensibilité .................................................................................................................................................................................................... 8

9.5 Spécificité ..................................................................................................................................................................................................... 8

10 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 9

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................10

© ISO 2015 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/TS 21569-3:2015(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne

la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.

iso.org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les

références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration

du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par

l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de

la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’OMC concernant

les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos — Informations

supplémentaires.

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.

L’ISO 21569 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général, Méthodes horizontales

d’analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes

génétiquement modifiés et des produits dérivés:

— Partie 2: Méthode PCR en temps réel spécifique de la construction pour la détection d’un événement

FP967 dans les graines de lin et les produits à base de graines de lin [Spécification technique]

— Partie 3: Méthode PCR en temps réel construit-spécifique pour la détection de la séquence P35S-pat

pour criblage des organismes génétiquement modifiés [Spécification technique]
L’ISO 21569:2005 est destinée à être révisée pour devenir la future Partie 1.
iv © ISO 2015 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 21569-3:2015(F)
Méthodes horizontales d’analyse moléculaire de
biomarqueurs — Méthodes d’analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés et des produits
dérivés —
Partie 3:
Méthode PCR en temps réel construit-spécifique pour
la détection de la séquence P35S-pat pour criblage des
organismes génétiquement modifiés
1 Domaine d’application

La présente Spécification technique décrit un mode opératoire permettant la détection d’une séquence

d’ADN de transition entre le promoteur 35S (P35S) du virus de la mosaïque du chou-fleur et un gène

modifié codant pour l’enzyme phosphinothricine-acétyltransférase (pat) et provenant de Streptomyces

viridochromogenes. Le construit P35S-pat est fréquemment observé dans les plantes génétiquement

modifiées présentant une tolérance aux herbicides contenant de la phosphinothricine. La méthode

spécifique du construit P35S-pat est basée sur une méthode par PCR en temps réel et peut être utilisée

à des fins de criblage qualitatif et quantitatif. Pour l’identification et la quantification d’un événement

spécifique, une analyse complémentaire doit être effectuée.

La présente Spécification technique est applicable à l’analyse de l’ADN extrait de produits alimentaires.

Elle peut être également utilisée pour analyser l’ADN extrait d’autres produits tels que des aliments

pour animaux et des semences. L’application de cette méthode exige qu’une quantité adéquate d’ADN

amplifiable de qualité appropriée soit extraite de la matrice étudiée.
2 Références normatives

Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à

l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 21569, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques

ISO 21571, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques

ISO 24276, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 24276 s’appliquent.

© ISO 2015 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO/TS 21569-3:2015(F)
4 Principe

L’ADN est extrait de la prise d’essai en appliquant une méthode appropriée. L’analyse de l’ADN comprend

deux parties, à savoir:

1) vérification de la quantité et de l’amplificabilité de l’ADN extrait, par exemple au moyen d’une PCR

[10]
en temps réel spécifique pour le taxon cible (voir l’ISO 21570 ) et
[1,2]
2) détection du construit P35S-pat par une PCR en temps réel.
5 Réactifs et matériaux
5.1 Généralités

En règle générale, des substances chimiques de qualité analytique reconnue, appropriées pour la

biologie moléculaire, doivent être utilisées. L’eau utilisée doit être bidistillée ou de qualité PCR (c’est-

à-dire exempte de nucléases et d’acides nucléiques). Pour toutes les opérations nécessitant le port de

gants, il convient de s’assurer que ceux-ci ne sont pas poudrés. Pour éviter toute contamination croisée,

il est recommandé d’utiliser des embouts de pipette protégés contre les aérosols.

5.2 Réactifs PCR
5.2.1 ADN polymérase thermostable, pour PCR à démarrage à chaud (hot start PCR).

5.2.2 Solution tampon pour PCR, contenant du chlorure de magnésium et les désoxyribonucléosides

triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dUTP).

Il est possible d’utiliser des mélanges de réactifs ou des préparations de composants individuels prêts

à l’emploi. Des réactifs et des polymérases conduisant à des résultats équivalents ou meilleurs peuvent

également être utilisés.
5.2.3 Oligonucléotides (voir Tableau 1).
Tableau 1 — Oligonucléotides
Concentration finale
Nom Séquence d’ADN de l’oligonucléotide
dans la PCR
[1],[2]
Construit P35S-pat comme séquence cible:
Amorce 35SP03.f 5’-AAg TTC ATT TCA TTT ggA gAg gAC A-3’ 200 nmol/l
Amorce pat-7.r 5’-Cgg CCA TAT CAg CTg CTg TAg-3’ 200 nmol/l
5’-(FAM)-CCg gAg Agg AgA CCA gTT gAg ATT Agg
Sonde GSS01.s 100 nmol/l
C-(TAMRA)-3’a
FAM: carboxy-6-fluorescéine, TAMRA: carboxy-6-tétraméthylrhodamine

NOTE Des colorants rapporteurs et/ou des colorants extincteurs équivalents peuvent être utilisés pour la

sonde s’il peut être démontré qu’ils donnent des résultats similaires ou meilleurs.

5.2.4 ADN étalon pour l’étalonnage

Une solution d’ADN étalon ayant une concentration connue (ng/µl) peut être utilisée pour calculer le

nombre de copies de la séquence cible P35S-pat.
2 © ISO 2015 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/TS 21569-3:2015(F)

Lorsque l’ADN génomique d’une plante est utilisé comme ADN étalon, il convient de calculer le nombre

d’équivalents génome haploïde sur la base de la masse moléculaire du génome haploïde de la plante, en

appliquant la Formule (1):
concentration d'ADN[ng/lμ⋅] 1000
Nombre d’équivalents génome par µl = (1)
masse du génome haploïde[pg]]

Sur la base des équivalents génome, il est possible de calculer le nombre de copies correspondant pour la

séquence P35S-pat. Pour ce faire, le nombre d’intégrations dans le génome de la plante ainsi que le degré

de zygosité de la plante utilisée doivent être pris en compte.
6 Appareillage

L’appareillage et les matériaux sont spécifiés dans l’ISO 21569. Outre le matériel courant de laboratoire,

les équipements suivants sont requis:

6.1 Appareil de PCR en temps réel, approprié pour l’excitation des molécules fluorescentes et pour la

détection des signaux de fluorescence générés pendant la PCR.
7 Mode opératoire
7.1 Préparation de l’échantillon pour essai

Il convient de s’assurer que l’échantillon pour essai utilisé pour l’extraction de l’ADN est représentatif de

l’échantillon pour laboratoire, par exemple en broyant ou homogénéisant les échantillons. Les mesures

et étapes opératoires à prendre en considération doivent être telles que décrites dans l’ISO 21571 et

l’ISO 24276.
7.2 Préparation des extraits d’ADN

Concernant la préparation d’ADN à partir de la prise d’essai, il convient de suivre les instructions

générales et les mesures spécifiées dans l’ISO 21571. Il est recommandé de choisir l’une des méthodes

d’extraction d’ADN décrites dans l’ISO 21571, Annexe A.
7.3 Réaction PCR

La méthode est décrite pour un volume total de 25 µl par réaction PCR. Le mélange réactionnel est

indiqué dans le Tableau 2.

Décongeler totalement les réactifs à température ambiante. Il convient de s’assurer que chaque réactif

est soigneusement mélangé et brièvement centrifugé juste avant d’être pipeté. Préparer un mélange

de réactifs pour PCR contenant tous les composants, sauf l’ADN échantillon. La quantité nécessaire

de mélange de réactifs pour PCR dépend du nombre de réactions à réaliser, en incluant au moins une

réaction supplémentaire comme réserve de pipetage. Ajouter 5 µl d’ADN échantillon à chaque réaction.

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ISO/TS 21569-3:2015(F)
Tableau 2 — Mélange réactionnel pour l’amplification
Volume réactionnel total 25 µl
ADN échantillon (jusqu’à 200 ng) ou témoins 5 µl
Solution tampon pour PCR (contenant du MgCl , des dNTP et de l’ADN polymérase à
12,5 µl
«démarrage à chaud»)
Amorce 35SP03.f et pat-7.r voir Tableau 1
Sonde GSS01.s voir Tableau 1
Eau Complément à 25 µl

Lors de l’essai interlaboratoires, en fonction des appareils de PCR en temps réel utilisés, différentes solutions tampons

PCR ont été utilisées [TaqMan Universal PCR Mastermix (Life Technologies, Darmstadt), QuantiTect Multiplex PCR NoROX

ou QuantiTect Probe PCR Mastermix (Qiagen GmbH, Hilden)]. Ces informations sont données pour le confort de l’utilisateur

du présent document, mais ne constituent aucunement une approbation de la part de l’ISO. Des produits équivalents

commercialisés par d’autres fabricants peuvent être utilisés s’ils donnent des résultats similaires ou meilleurs. Si nécessaire,

adapter les quantités de réactifs ainsi que le programme d’amplification.

Agiter le mélange de réactifs pour PCR, le centrifuger brièvement et introduire à l’aide d’une pipette

20 µl dans chaque tube de réaction. Pour le témoin de réactif pour amplification, ajouter 5 µl d’eau au

mélange réactionnel correspondant. À l’aide d’une pipette, ajouter 5 µl d’ADN échantillon ou 5 µl de la

solution témoin correspondante (témoin de blanc d’extraction, témoin positif
...

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